CN115725729A

CN115725729A - 长非编码rna cctt的敲低或敲除在抑制肿瘤生长中的应用

Info

Publication number: CN115725729A
Application number: CN202111019967.0A
Authority: CN
Inventors: 杨晓; 滕艳; 张翀; 陈润生; 王东鹏; 郝亚静
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-09-01
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开了长非编码RNA CCTT的敲低或敲除在抑制肿瘤生长中的应用。本发明提供了能够抑制lncRNA CCTT表达的物质在如下任一中的应用：制备用于抑制肿瘤细胞增殖和/或生长的产品；制备用于降低肿瘤细胞致瘤性的产品。LncRNA CCTT在体内外水平均展现出强大的促癌功能，且抑制lncRNA CCTT的抑癌效果明显，其高表达导致病人不良预后的临床意义也十分显著。因此，lncRNA CCTT敲低/敲除抑制肿瘤细胞生长可能为肿瘤靶向治疗提供新策略。

Description

长非编码RNA CCTT的敲低或敲除在抑制肿瘤生长中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种长非编码RNA(lncRNA)CCTT的敲低或敲除在抑制肿瘤生长中的应用。

背景技术

肺癌是世界上致死率最高的癌症，每年因肺癌死亡的人数超过一百万人，而肺癌进展过程中的侵袭转移和肿瘤复发是主要的致死原因。肺癌在组织学上可以分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)两种，SCLC约占15％，NSCLC约占85％，其中腺癌最常见。长非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA，其在包括肺癌在内的多种人类肿瘤中的异常表达普遍存在。

LncRNA在多种生物学过程中发挥重要作用，包括应激反应、发育、干细胞多能性、选择性剪接、染色质重塑和mRNA降解等。此外，lncRNA参与调控许多细胞行为和功能，如细胞周期、细胞存活、细胞迁移和细胞代谢等。越来越多的证据表明，在多种人类肿瘤中异常表达的lncRNA可以作为抑癌基因或致癌基因发挥功能。虽然大多数lncRNA的功能机制仍然不明确，但其已成为继microRNA后肿瘤发生发展的新调控者，并且在临床诊断和治疗中显示出了潜在的应用价值。

筛选合适的分子靶标是肿瘤靶向治疗的前提和基础。如何筛选、筛选何种分子是相关研究的首要问题。尽管靶向蛋白编码基因的肿瘤治疗策略已有较多报道，但由于蛋白编码基因保守性高，功能广泛，特异性难以保证，很可能导致较严重的副作用。与之相比，非编码基因由于保守性低，功能特异性较强，具有相应优势。RNA分子量小，易于检测和靶向干涉，也是其作为肿瘤靶向治疗良好靶点的优势。随着lncRNA研究不断深入以及一批促癌lncRNA的发现，其已经成为具有潜力的肿瘤治疗新靶点。例如利用反义寡核苷酸(ASO)特异性靶向lncRNA SAMMSON能够特异性提高黑素瘤细胞脆性，进而易于杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种lncRNA CCTT的敲低或敲除在抑制肿瘤生长中的应用。

第一方面，本发明要求保护能够抑制lncRNA CCTT表达的物质在如下任一中的应用：

P1、制备用于抑制肿瘤细胞生长和/或增殖的产品；

P2、制备用于降低肿瘤细胞致瘤性的产品。

在本发明的具体实施方式中，具体可体现为：1)促进肿瘤细胞周期阻滞于G0/G1期(降低S期细胞比例)；2)抑制肿瘤细胞克隆形成；3)抑制裸鼠体内成瘤。

第二方面，本发明要求保护能够抑制lncRNA CCTT表达的物质在制备用于抑制肿瘤生长的产品中的应用。

在上述两方面中，所述能够抑制lncRNA CCTT表达的物质可为任何能够敲低或敲除所述lncRNA CCTT表达的物质，如靶向所述lncRNA CCTT的siRNA、shRNA、ASO或者用于敲除能够转录为所述lncRNA CCTT的DNA的基因编辑系统(如CRISPR/Cas9)等。

进一步地，靶向所述lncRNA CCTT的siRNA可如SEQ ID No.1所示。

进一步地，靶向所述lncRNA CCTT的ASO可如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

进一步地，靶向所述lncRNA CCTT的shRNA可如SEQ ID No.4所示。

进一步地，用于敲除能够转录为所述lncRNA CCTT的DNA的CRISPR/Cas9系统及敲除策略包括gRNA，所述gRNA的靶序列可为SEQ ID No.5，SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。

第三方面，本发明要求保护lncRNA CCTT作为靶点在制备用于治疗肿瘤的产品中的应用。

第四方面，本发明要求保护能够用于检测lncRNA CCTT的物质在制备用于评估肿瘤患者预后的产品中的应用。

在所述应用中，所述lncRNA CCTT低表达肿瘤患者的预后显著好于所述lncRNACCTT高表达的肿瘤患者。低表达是指所述lncRNA CCTT在肿瘤组织中的表达水平低于正常癌旁组织；高表达是指所述lncRNA CCTT在肿瘤组织中的表达水平高于正常癌旁组织。其中，预后的好坏体现在总体生存率和生存期上。

在上述各方面中，所述产品具体可为药品。

在上述各方面中，所述lncRNA CCTT具体为SEQ ID No.8所示的RNA。

在上述各方面中，所述肿瘤细胞为所述lncRNA CCTT高表达的肿瘤细胞；所述肿瘤为所述lncRNA CCTT高表达的肿瘤。所述lncRNA CCTT高表达是指所述lncRNA CCTT在肿瘤组织中的表达水平高于正常癌旁组织。

在上述各方面中，所述肿瘤细胞可为肺癌细胞或宫颈癌细胞；所述肿瘤可为肺癌或宫颈癌。

进一步地，所述肺癌细胞可为肺腺癌细胞；所述肺癌可为肺腺癌。

在本发明的具体实施方式中，所述肺腺癌细胞为A549细胞或H1299细胞；所述宫颈癌细胞为HeLa细胞。

实验证明：细胞实验显示，敲低/敲除lncRNA CCTT能够抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤细胞增殖、降低肿瘤细胞致瘤性。裸鼠成瘤实验显示，接种3周后，lncRNA CCTT敲低细胞形成的瘤灶体积和质量均显著小于对照细胞，从体内水平证实lncRNA CCTT促进肿瘤生长。敲低lncRNA CCTT显著抑制肿瘤在体生长，表明lncRNA CCTT是靶向抑制肺癌的潜在靶点。临床上，利用TCGA数据库分析CCTT表达水平与肺癌病人预后发现lncRNA CCTT高表达病人预后差。类似地，在26种肿瘤类型中，约2/3展现出lncRNA CCTT高表达与不良预后成正相关，提示靶向lncRNA CCTT具有广泛的临床意义。

附图说明

图1为靶向敲低A549细胞中的lncRNA CCTT。将50mM靶向lncRNA CCTT的siRNA(A)或ASO(B)及相应对照(NC)转染人肺癌细胞系A549，48h后通过qRT-PCR检测lncRNA CCTT表达水平。通过qRT-PCR检测lncRNACCTT稳定敲低A549细胞中lncRNA CCTT表达水平，以空载体病毒感染A549细胞作为对照(C)。非配对t检验，**p<0.01。

图2为CRISPR/Cas9建立lncRNA CCTT敲除HeLa细胞。A为CRISPR/Cas9建立CCTT敲除HeLa细胞策略示意图；B为PCR/RT-PCR检测筛选单克隆CCTT^+/-和CCTT^-/-细胞；C为免疫荧光原位杂交(FISH)检测CCTT^-/-细胞中lncRNA CCTT表达水平；D为Northern blot检测CCTT^-/-细胞中lncRNA CCTT表达水平。

图3为lncRNA CCTT敲低/敲除抑制肿瘤细胞生长。LncRNA CCTT敲低A549细胞(A)和lncRNA CCTT敲除HeLa细胞(B)生长曲线。非配对t检验，**p<0.01，***p<0.001。

图4为lncRNA CCTT敲低导致细胞周期阻滞。在A549细胞中敲低lncRNA CCTT，通过PI单染流式分析统计G0/G1、S、G2/M期中细胞比例。非配对t检验，*p<0.05。

图5为lncRNA CCTT敲低/敲除抑制肿瘤细胞克隆形成。LncRNA CCTT敲低A549细胞(A)和lncRNA CCTT敲除HeLa细胞(B)克隆形成。非配对t检验，**p<0.01。

图6为lncRNA CCTT敲低抑制裸鼠成瘤。LncRNA CCTT敲低A549细胞裸鼠成瘤。接种细胞22d取材，测量肿瘤体积(中)、质量(右)，n＝10。配对t检验，**p<0.01。

图7为lncRNA CCTT敲低抑制体内肿瘤生长。H1299细胞双侧接种裸鼠，成瘤后向两侧原位注射靶向lncRNA CCTT的siRNA和对照siRNA(NC)。15pmols/次，每隔1天注射1次，连续注射5次。期间连续测量肿瘤直径，当肿瘤直径达到1cm后取材，n＝3。配对t检验，**p<0.01。

图8为lncRNA CCTT高表达肺癌病人预后不良。分析TCGA数据库人肺癌样本中肿瘤和癌旁组织CCTT相对表达水平与预后的关系。通过Logrank检验分析统计学差异，n＝378。图中CCTT高/低是指lncRNA CCTT在肿瘤与癌旁组织中的相对表达水平。

图9为lncRNA CCTT高表达与多种肿瘤不良预后正相关。利用Cox proportionalhazards model分析26种肿瘤病人(例数大于50)预后与lncRNA CCTT表达水平的相关性。通过Logrank检验分析统计学差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的lncRNA CCTT的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

下述实施例中所涉及的常规试验方法如下：

1、细胞培养

人肺癌细胞系A549、H1299和人宫颈癌细胞系HeLa培养于含有10％FBS的DMEM高糖培养基(Hyclone)中，培养条件：37℃，5％CO₂浓度。

2、细胞传代

(1)用真空泵吸弃培养基；

(2)沿培养皿壁加入2ml PBS，清洗残留培养基；

(3)加入1.5ml 0.25％胰蛋白酶(含EDTA)，37℃放置5min，消化细胞；

(4)加入2ml完全培养基终止消化，轻柔吹打后转移细胞悬液于15ml移液管，1000rpm，离心3min；

(5)用真空泵吸弃上清，用完全培养基2ml重悬细胞；

(6)取细胞悬液计数：在测量杯中加入10ml稀释液，取100μl细胞悬液加入测量杯，上下左右混匀，放入细胞计数仪计数，所测读数为每毫升的细胞数，重复一次减小误差；

(7)接种合适的细胞培养皿或培养板，接种密度根据不同细胞类型及实验要求确定。

3、细胞转染

(1)根据说明书用适量jetPRIME buffer稀释质粒或siRNA，质粒终浓度为500ng/ml，siRNA/ASO终浓度为50-100nM(根据实验要求确定)；

(2)加入相应jetPRIME转染试剂后震荡10s，快速离心；

(3)室温孵育10-15min；

(4)将转染混合液体加入细胞中(提前更换完全培养基)；

(5)上下左右摇动混匀，37℃，5％CO₂浓度孵育；

(6)转染4h后换液(可选)，合适时间点进行下一步实验。

4、细胞总RNA提取

(1)用真空泵吸去培基，每孔加入1ml TRIzol，吸入1.5ml EP管，冰上放置；

(2)向EP管中加入200μl三氯甲烷，上下颠倒混匀，室温静置3min；

(3)4℃，12000rpm离心15min；

(4)将上层液小心转移到新的无RNA酶EP管中(切勿吸及下层液)，每管加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；

(5)4℃，12000rpm离心10min；

(6)弃去上清，每管加入1ml 75％乙醇(无RNA酶，DEPC水配制)，重悬管底RNA沉淀，4℃，7500rpm离心5min；

(7)弃去上清，将EP管倒置，自然晾干(约2min)；

(8)根据RNA沉淀量加入适量无RNA酶水溶解沉淀，置于55℃恒温水浴10min，充分溶解RNA；

(9)用NanoDrop 2000测定RNA浓度，进行后续实验或长期保存于-80℃。

5、RNA反转录

用除基因组DNA反转录试剂盒(Toyobo FSQ-301)，将RNA反转录成cDNA。

(1)反应体系(20μl，冰上操作)：

5×RT mix 4μl；RNA 2μg(根据浓度计算体积)；无RNA酶水补至16μl。

(2)反应程序：

37℃15min；50℃5min；98℃5min；4℃保存。

反应结束后，加入30μl无菌水稀释cDNA，进行下一步实验或-20℃保存。

6、Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR)

(1)将cDNA模板及Master Mix(

Green Realtime PCR Master MixToyobo，避光保存)置于冰上融化；

(2)反应体系(10μl)：

cDNA模板1μl；上游引物0.5μl；下游引物0.5μl；

Green Realtime PCRMaster Mix 4.5μl；去离子水3.5μl。

上下游引物序列通过Primer Premier 5软件设计，主要引物如下：

CCTT-F：5’-CTAAGGATTCGGTGTTGG-3’；

CCTT-R：5’-CCTGCCAGGTTAGAGGG-3’。

GAPDH-F：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’；

GAPDH-R：5’-CAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’。

(3)将上述配制好的反应混合液放入实时荧光定量PCR仪(ABI 7500Fast)中反应，程序如下：

95℃60s；

95℃15s，60℃15s，72℃45s，40个循环。

(4)反应结束，根据2^-△△CT公式分析目标RNA表达水平。每次实验需要2-3个副孔，利用3次独立重复实验结果进行统计学分析。

7、本发明中人肿瘤及癌旁组织样本数据来自TCGA数据库，通过cBioPortal(http://www.cbioportal.org)进行分析。生存曲线、柱状图及差异显著性分析利用GraphPad Prism 5软件进行。定量数据表示方式：平均值±标准误，两组数据检验使用双尾TTEST，差异显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，有统计学意义；ns：p>0.05，无统计学意义。

实施例1、靶向敲低A549细胞中的lncRNA CCTT

1、瞬时敲低

利用jetPRIME(polyplus公司，货号：114-15)转染试剂将靶向lncRNA CCTT的siRNA或ASO(#1或#2)转染人肺癌细胞系A549(具体方法参见上文“细胞转染”)，48h后通过qRT-PCR检测敲低效率(具体方法参见上文“细胞总RNA提取”、“RNA反转录”和“qRT-PCR”)。

其中，靶向lncRNA CCTT的siRNA序列如下：

5’-CCAGAUGUCUUCAGCUCCA-3’(SEQ ID No.1)。

作为对照的NC siRNA为商业化产品(货号：siN0000002-1-5)。

靶向lncRNA CCTT的两个ASO序列如下：

#1：5’-GCTACCAGAAGGGAGCACCA-3’(SEQ ID No.2)；

#2：5’-CCAGATGTCTTCAGCTCCAA-3’(SEQ ID No.3)。

作为对照的NC ASO为商业化产品(货号：lnc6N0000001-1-10)。

以上均为广州锐博生物技术有限公司(锐博生物)产品。

2、稳定敲低(稳转细胞系构建)

(1)利用逆转录病毒表达载体pQCXIP(Biovector，货号：3558629)包装lncRNACCTT shRNA(SEQ ID No.4)的逆转录病毒pQCXIP-sh-CCTT。

其中，靶向lncRNA CCTT的shRNA序列如下：5’-CCAGATGTCTTCAGCTCCATTCAAGAGAACCTCGACTTCTGTAGACCTTTTTT-3’(SEQ ID No.4)。

(2)接种2×10⁵A549细胞至6孔板，贴壁生长至70％融合度。

(3)利用pQCXIP-sh-CCTT逆转录病毒感染细胞，以空病毒作为对照(1ml病毒液+1ml DMEM培养基孵育12h后换成DMEM完全培养基)。

(4)48h后加入嘌呤霉素(Puromycin，3μg/ml)筛选，3d后扩增存活细胞建系。

(5)通过细胞RNA qRT-PCR检测lncRNA CCTT敲低效率。

结果显示：在人肺癌A549细胞中敲低lncRNA CCTT，靶向lncRNA CCTT的特异性siRNA或ASO导致其表达水平下调至30～40％，lncRNA CCTT稳定敲低A549细胞系构建成功(图1)，可进行后续功能评价。

实施例2、利用CRISPR/Cas9建立lncRNA CCTT敲除HeLa细胞

由于lncRNA CCTT完全缺失显著抑制细胞生长和存活，通过CRISPR/Cas9和Cre-Loxp系统建立lncRNA CCTT可诱导敲除HeLa细胞系，其策略分为三步：

第一步，建立lncRNA CCTT单等位基因大片段删除杂合子细胞。通过慢病毒pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9(和元生物，货号：H7548)感染建立稳定表达Cas9的HeLa细胞。设计靶向lncRNA CCTT基因上下游的gRNA(5’-GATGGGGCTAGCAGAGGCCTTGG-3’(SEQ ID No.5)；5’-GGCTGCCTTCACCCCC ACCAAGG-3’(SEQ IDNo.6))，体外转录后转染(Lipofectamine 2000,Thermofisher公司，货号：11668-027)表达Cas9的HeLa细胞，介导lncRNA CCTT基因大片段删除。通过单克隆筛选，PCR及测序鉴定获得lncRNA CCTT单等位基因大片段删除杂合子细胞(CCTT^+/-，图2中A和B)。

第二步，建立Loxp锚定lncRNA CCTT剩余等位基因第一外显子的条件敲除细胞。构建载体(Loxp锚定lncRNA CCTT第一外显子和同源臂)，通过gRNA(5’-GGGACTCCTGAATCTAGGAGGAG-3’(SEQ ID No.7))靶向敲入lncRNA CCTT另一条等位基因，建立Cre重组酶介导的条件敲除细胞。通过单克隆筛选，PCR及测序鉴定获得lncRNA CCTT条件敲除细胞(CCTT^flox/-，图2中A和B)。

第三步，通过腺病毒Cre介导lncRNA CCTT完全敲除。用腺病毒Cre(pADV-CMV-Cre，和元生物，货号：K0024)处理lncRNA CCTT条件敲除细胞12-24h，获得lncRNA CCTT完全敲除细胞。通过RT-PCR、原位杂交、Northern blot验证lncRNA CCTT表达缺失(CCTT^-/-，图2中A-D)。

图2中涉及到的5个引物具体信息如下：

引物1为筛选lncRNA CCTT完全敲除细胞5’端引物：

F：5’-CCTGGCTCTTGCTCTTCC-3’；

R：5’-CTTGGTGCTCCCTTCTGG-3’。

引物2为筛选lncRNA CCTT完全敲除细胞3’端引物：

F：5’-CGAGGAACATGGCGAAAC-3’；

R：5’-GCCCTGCAACACGTCAGT-3’。

引物3为筛选lncRNA CCTT完全敲除细胞大片段删除引物：

F：5’-CCACATTTACCCACCCACG-3’；

R：5’-CCCAGTGCCTACTTGCTTCTA-3’。

引物4为筛选lncRNA CCTT可诱导敲除细胞大片段引物：

F：5’-ACACCCTACCCACTCTGTAC-3’；

R：5’-GCTTCTCCACCTTCTGACACT-3’。

引物5为鉴定lncRNA CCTT转录本qRT-PCR引物：

F：5’-CTAAGGATTCGGTGTTGG-3’；

R：5’-CCTGCCAGGTTAGAGGG-3’。

实施例3、敲低/敲除lncRNA CCTT导致肿瘤细胞生长阻滞

供试细胞：实施例1制备的lncRNA CCTT敲低A549细胞(导入SEQ ID No.1所示siRNA，设置转染阴性对照siRNA的对照细胞)和实施例2制备的lncRNA CCTT敲除HeLa细胞(设置lncRNA CCTT野生型对照细胞)。

1、根据不同细胞类型选择合适的密度接种细胞于24孔板中，37℃，5％CO₂浓度培养，记录初始细胞数(0d)。

2、分别于合适时间点(如1d、2d、3d等)用细胞计数仪记录对照组和实验组细胞数。

3、根据各时间点细胞数绘制细胞生长曲线，三次独立重复实验，进行统计学分析。

细胞生长曲线分析显示：敲低/敲除lncRNA CCTT导致细胞生长阻滞(图3)。

实施例4、LncRNA CCTT敲低导致肿瘤细胞周期阻滞

供试细胞：实施例1制备的lncRNA CCTT敲低A549细胞(导入SEQ ID No.1所示siRNA，设置转染阴性对照siRNA的对照细胞)。

通过PI单染流式分析统计G0/G1、S、G2/M期中细胞比例。具体操作如下：

1、准备lncRNA CCTT敲低的A549细胞，以相应NC siRNA转染细胞作为对照，48h后0.25％胰酶消化；

2、1×PBS洗三次，重悬为单细胞悬液，密度调整为5×10⁶/ml；

3、离心弃去上清，加入预冷乙醇于4℃过夜；

4、离心弃去乙醇，1×PBS洗；

5、加入RNA酶，37℃水浴30min；

6、加入PI染液，4℃避光孵育30min；

7、流式分析仪上机检测，分析统计G0/G1、S、G2/M期中细胞比例；

8、重复三次实验，进行统计学分析。

结果显示：流式分析证实敲低lncRNA CCTT导致G0/G1期细胞比例由78.0％上升到87.1％，而S期细胞比例由18.0％下降到9.7％，表明敲低lncRNA CCTT抑制细胞增殖(图4)。

实施例5、LncRNA CCTT敲低抑制肿瘤细胞细胞克隆形成

供试细胞：实施例1制备的lncRNA CCTT稳转敲低A549细胞(以空病毒感染细胞作为对照细胞)和实施例2制备的lncRNA CCTT敲除HeLa细胞。

1、取对数生长期的各组细胞，胰酶消化并吹打成单个细胞，离心，用含血清培养基重悬。

2、细胞计数，分别以每皿50、100、200个细胞的密度梯度接种至10cm培养皿中，使细胞分散均匀，置于37℃，5％CO₂浓度培养2-3周。

3、定期观察换液，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃上清，用PBS小心洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞，室温15min。

4、弃去固定液，加适量结晶紫染液室温染色20min后，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

5、将平皿倒置，计各组克隆数，并计算克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。

结果显示：利用平板克隆形成实验考察lncRNA CCTT对细胞增殖的长期影响。单细胞接种3周后，lncRNA CCTT敲低A549细胞的克隆数比对照细胞低38.4％，证实lncRNA CCTT促进A549细胞长期增殖(图5)。

实施例6、LncRNA CCTT敲低肿瘤细胞的裸鼠成瘤能力降低

供试细胞：实施例1制备的lncRNA CCTT稳转敲低A549细胞(以空病毒感染细胞作为对照细胞)。

1、准备6-8周龄BALB/c雄性裸鼠(维通利华公司)，饲养于SPF级动物房中。

2、于15cm皿中培养稳转细胞系(即供试细胞)，包括对照组和实验组，生长至合适密度。

3、消化细胞，用1×PBS重悬细胞制成1×10⁷/ml密度悬液。

4、用预冷的枪头吸取100μl细胞悬液，同时加入100μl Matrigel稀释，混匀。

5、将裸鼠麻醉，正置于操作台上，用微量注射器将对照组和实验组细胞悬液注射到裸鼠背侧左右腋下对称位置皮下，见鼓包隆起，防止液体流出。

6、观察裸鼠状态：接种1周内，鼓包被吸收，2-3周开始成瘤，定期测量肿瘤直径。

7、在合适时间点(裸鼠状态差或肿瘤直径达1cm)处死裸鼠，解剖观察瘤灶大小，取材拍照。

结果显示：接种3周后，lncRNA CCTT敲低细胞形成的瘤灶体积和质量均显著小于对照细胞，从体内水平证实lncRNA CCTT促进肿瘤生长(图6)。

实施例7、LncRNA CCTT敲低抑制体内肿瘤生长

在BALB/c裸鼠左右背侧对称位置接种5×10⁵人肺癌细胞H1299，约1周后两侧瘤块形成且大小均一时，分别向两侧瘤体内原位注射靶向lncRNA CCTT的siRNA(SEQ ID No.1)和阴性对照siRNA(锐博生物，货号：siN0000002-1-5)。15pmols/次，每隔1天注射1次，连续注射5次。期间连续测量肿瘤直径，当肿瘤直径达到1cm后取材。

结果显示：敲低lncRNA CCTT显著抑制肿瘤在体生长，表明lncRNA CCTT是靶向抑制肺癌的潜在靶点(图7)。

实施例8、肺癌临床生存曲线分析

肺癌病人肿瘤及癌旁组织lncRNA CCTT表达水平从TCGA数据库获取(n＝378)，通过Cox proportional hazards模型进行生存曲线分析，通过Logrank检验分析统计学差异。

结果显示：临床上利用TCGA数据库分析lncRNA CCTT表达水平与肺癌病人预后发现lncRNA CCTT高表达病人预后差(图8)。

实施例9、LncRNA CCTT高表达与多种肿瘤不良预后正相关

利用Cox proportional hazards model分析26种肿瘤病人(例数大于50)预后与lncRNA CCTT表达水平的相关性。通过Logrank检验分析统计学差异。

结果显示：在26种肿瘤类型中，约2/3展现出lncRNA CCTT高表达(指与癌旁组织相比lncRNA CCTT在肿瘤中的表达水平相对更高)与不良预后成正相关(图9)，提示靶向lncRNA CCTT具有潜在的临床意义。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院；中国科学院生物物理研究所

<120> 长非编码RNA CCTT的敲低或敲除在抑制肿瘤生长中的应用

<130> GNCLN212031

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ccagaugucu ucagcucca 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gctaccagaa gggagcacca 20

<210> 3

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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ccagatgtct tcagctccaa 20

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ccagatgtct tcagctccat tcaagagaac ctcgacttct gtagaccttt ttt 53

<210> 5

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gatggggcta gcagaggcct tgg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

ggctgccttc acccccacca agg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gggactcctg aatctaggag gag 23

<210> 8

<211> 730

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cuuuuugagg cagcuaccag aagggagcac caagcagaug cagcuccccu ucccucccau 60

uccaccaucc acugucccca gcaagaaccu gcgggagggu ggcccaaugg ggagaaaacu 120

aaggauucgg uguugggacc acuccugccc ugaccugccc ugugacuccg ucauacucuc 180

caaaggccag acccuccuag accagcugga accaccauca agaugucccc agccauguca 240

gacucugggg ccccaggcgg agggcaacca gaugucuuca gcuccaaguc uggccucucc 300

ucccagcaag cagccaacug cagagaccuu ggaaaggauc aaccauauac aauguccauu 360

uccugcccuc uaaccuggca ggggagcaag gcccagccaa ggaguuacag aaacugaggc 420

uuggccaggc gugguggcuc acaccugcaa ucucagcacu gggaggccaa ggugggcaga 480

ucgcuugagc ccaggaguuu gagaccagcc cgaggaacau ggcgaaaccc caucucuaca 540

aaaaauacag aaauuagcca aguguggugg cacgugucug uaguuucagc uacucaggag 600

gcuuaggugg gaggaucacc ugagccuggg agguagaggu ugcaaugagc agagauugcu 660

cuccagccag ggagacagag ugagacccug ucccaaaaua aauaaauaaa uaagaauaaa 720

auuuaaaaaa 730

Claims

1.能够抑制lncRNA CCTT表达的物质在如下任一中的应用：

P1、制备用于抑制肿瘤细胞生长和/或增殖的产品；

P2、制备用于降低肿瘤细胞致瘤性的产品。

2.能够抑制lncRNA CCTT表达的物质在制备用于抑制肿瘤生长的产品中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述能够抑制lncRNA CCTT表达的物质为靶向所述lncRNA CCTT的siRNA、ASO、shRNA或者用于敲除能够转录为所述lncRNA CCTT的DNA的基因编辑系统。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：靶向所述lncRNA CCTT的siRNA如SEQ IDNo.1所示；

靶向所述lncRNA CCTT的ASO如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示；

靶向所述lncRNA CCTT的shRNA如SEQ ID No.4所示；

用于敲除能够转录为所述lncRNA CCTT的DNA的基因编辑系统为CRISPR/Cas9系统，包括gRNA，所述gRNA的靶序列为SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7。

5.LncRNA CCTT作为靶点在制备用于治疗肿瘤的产品中的应用。

6.能够用于检测lncRNA CCTT的物质在制备用于评估肿瘤患者预后的产品中的应用。

7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药品。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于：所述lncRNA CCTT为SEQ ID No.8所示的RNA。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为所述lncRNACCTT高表达的肿瘤细胞；或，所述肿瘤细胞为肺癌细胞或宫颈癌细胞；

所述肿瘤为所述lncRNA CCTT高表达的肿瘤；或，所述肿瘤为肺癌或宫颈癌；

进一步地，所述肺癌细胞为肺腺癌细胞；所述肺癌为肺腺癌。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述肺腺癌细胞为A549细胞或H1299细胞；所述宫颈癌细胞为HeLa细胞。