CN114917344B - Wdr67抑制剂及其在抑制肝癌细胞生长和转移中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了WDR67抑制剂及其在抑制肝癌细胞生长和转移中的应用。具体地公开了WDR67抑制剂在制备治疗或预防肝癌的药物中的应用，所述WDR67抑制剂可为抑制WDR67基因表达、沉默或敲除WDR67基因的物质，和/或，抑制WDR67蛋白含量和/或活性的物质。本发明首次发现通过降低WDR67基因的表达或活性可以显著地抑制肝癌细胞的生长，根据RNAi原理，通过设计短发卡RNA(shRNA)序列，将其克隆到慢病毒载体载体中包装成慢病毒感染肝癌细胞构建了稳定敲低WDR67基因的肝癌细胞株，体外和体内实验结果均表明，敲低WDR67会显著抑制肝癌细胞的生长，并对肝癌细胞的增殖和迁移具有很强的抑制作用。

Description

WDR67抑制剂及其在抑制肝癌细胞生长和转移中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及WDR67抑制剂及其在抑制肝癌细胞生长和转移中的应用。
背景技术
原发性肝癌(Primary liver cancer，PLC)是指发生于肝细胞和肝内胆管上皮细胞的癌，是一种死亡率较高的恶性肿瘤。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC；以下简称肝癌)起源于肝脏上皮细胞(即肝细胞)，约占PLC的90％，具有起病隐匿，治疗效果差和预后恶劣的特点。解析肝癌发生发展的分子机制对肝癌的早期诊断及制定新的治疗策略具有十分重要的意义。
表皮生长因子受体(Epidergrowth factor receptor，EGFR)是受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinases，RTK)家族成员之一，已被证明在细胞恶性转化和肿瘤转移中发挥重要作用。大规模的基因组研究表明，在多种类型的癌症中，EGFR常因基因组变异而受到激活。相比之下，肝癌患者中只有不到5％的个体携有致瘤性EGFR突变或拷贝数扩增。然而，EGFR蛋白在60％的肝癌患者肿瘤中普遍高表达，并与肿瘤的侵袭性密切相关。这种不一致性表明在肝癌中存在替代机制来解释EGFR蛋白异常高表达。越来越多的证据表明，RabGTPases介导的EGFR内吞及胞内转运异常是调节EGFR表达和活性的一种新机制。然而，在肝癌细胞中，EGFR异常的胞内转运仍然未得到全面解析。因此鉴定可靶向参与调控EGFR异常转运和激活的TBC-Rab信号轴可作为抗肿瘤药物筛选的一个重要切入点。
本发明利用了从超过800名肝癌患者中收集的转录组数据集，通过生物信息学分析，鉴定发现了15个与肝癌相关的显著体细胞拷贝数变异(Copy number alteration，CNA)。其中，染色体8q24.13区域的拷贝数扩增与患者不良预后显著相关。结合高内涵功能筛查和后续功能分析，发现位于该扩增区域的WDR67是一种新的癌基因。机制上，WDR67可以水解Rab22A，将GTP形式的Rab22A水解为无转运活性的GDP形式的Rab22A，延迟其介导的EGFR从早期胞内体转运至溶酶体的过程，从而持续激活EGFR信号通路，促进肝癌生长和转移。综上，靶向WDR67的策略可以通过抑制肝癌细胞中的EGFR活性实现对肝癌细胞生长和转移的抑制。
发明内容
本发明的目的是提供一种WDR67抑制剂在制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。本发明所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为实现上述目的，本发明首先提供了WDR67抑制剂在制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。
上述应用中，所述治疗或预防肝癌的药物可具有下述至少一种功能：
A1)抑制肝癌细胞生长或增殖；
A2)抑制肝癌细胞侵袭和/或迁移；
A3)抑制肝癌细胞的成瘤能力；
A4)抑制依赖于Rab22A的GTP水解酶活性；
A5)在肝癌细胞中抑制EGFR信号通路的活性，并特异抑制其下游的MEK-ERK通路和PI3K-AKT通路；
A6)降低肝癌细胞对MEK抑制剂的耐药性。
所述WDR67抑制剂可用于防止对MEK抑制剂的原发性耐药性。
上述应用中，所述WDR67抑制剂可为抑制WDR67基因表达、沉默或敲除WDR67基因的物质，和/或，抑制(降低)WDR67蛋白含量和/或活性的物质。
所述WDR67基因的核苷酸序列是NCBI Reference Sequence:NM_145647.4的第1-3201位(Update Date 2022-04-01)，即WDR67基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
进一步地，所述抑制WDR67基因表达、沉默或敲除WDR67基因可通过本领域技术人员所熟知的基因突变、基因沉默、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术实现。如利用RNA干扰(RNAi)技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达；利用基因编辑技术的工具可以是CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶(ZFNs)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术等，但不限于此。
利用基因敲减(基因敲低，gene knock-down)技术从转录后水平或翻译水平使WDR67基因表达失活或基因沉默的技术为本领域技术人员所熟知。所述基因敲减技术包括RNA干扰、Morpholino干扰、反义核酸、核酶或显性负抑制突变但不限于此。
利用病毒(如慢病毒、腺相关病毒)表达的shRNA或siRNA抑制WDR67基因的表达，进行WDR67基因的沉默是本领域技术人员所熟知的。
上述应用中，所述WDR67抑制剂可为核酸分子、碳水化合物、脂、小分子化合物、抗体、多肽、蛋白、基因编辑载体、慢病毒或腺相关病毒中的一种或多种。
上述应用中，所述核酸分子可为microRNA、siRNA、shRNA和/或反义寡核苷酸。
所述microRNA、siRNA、shRNA和/或反义寡核苷酸(如反义RNA)用于抑制WDR67基因的表达。
上述应用中，所述抗体可为抗WDR67蛋白的抗体或其功能性片段。
上述应用中，所述shRNA靶向干扰WDR67基因的表达。
上述应用中，所述shRNA的靶序列可为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2，所述肝癌可为肝细胞癌。
本文任一所述shRNA，编码所述shRNA的DNA分子，或含有所述DNA分子的慢病毒或腺相关病毒均在本发明的保护范围内。
所述慢病毒可为表达用于敲低WDR67基因的shRNA的重组慢病毒。
所述重组慢病毒是将干扰shRNA的编码DNA分子克隆构建到慢病毒表达载体pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro上，利用慢病毒包装系统包装获得慢病毒颗粒，得到的表达所述干扰shRNA的重组慢病毒。
本文中，所述肝癌可为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。
进一步地，所述肝细胞癌可为EGFR突变和/或过表达的肝细胞癌。
本发明还提供了一种预防或治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括本文任一所述WDR67抑制剂和EGFR抑制剂。
进一步地，所述EGFR抑制剂可为吉非替尼。
本发明还提供了WDR67在筛选肝癌治疗药物中的应用，所述筛选肝癌治疗药物可为以WDR67为靶标对药物或制剂进行筛选，以能降低肝癌细胞内WDR67的表达水平的药物或制剂作为肝癌治疗的候选药物。
进一步地，本发明提供了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗肝癌，所述方法包括：将候选药物与肝癌细胞进行接触；以及检测所述接触前后，癌细胞中WDR67的表达量，其中，所述接触后癌细胞中WDR67的表达量低于所述接触前癌细胞中WDR67的表达量，是候选药物为目标药物的指示。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：
申请人前期产生和收集了6套基于肝癌组织样本的mRNA表达谱数据(共计809例配对的肝癌组织及癌旁组织)，采用ACE方法(Analysis of CNAs by expression data)确定了多个在肝癌组织中发生拷贝数变异(CNA)的基因组区域。其中，8q24.13区域的拷贝数扩增与患者不良预后显著相关，与肝癌患者较短的总体生存期和无病生存期显著相关。然后通过高内涵实验对该区域覆盖的编码基因进行了初步的功能筛选，发现WDR67基因是一个肝癌候选“癌基因”。
发明人在大样本人群中对8q24.13的拷贝数状态进行了检测，发现在肿瘤细胞中WDR67的拷贝数增多，WDR67与Rab22A相互作用，促进了Rab22A的GTP水解酶活性，促进细胞迁移及依赖于Rab22A的EGFR信号通路激活，并特异激活其下游的MEK-ERK通路和PI3K-AKT通路，最终促进肝癌的侵袭和迁移能力。进而用于沉默WDR67的试剂在抑制肝癌细胞的生长能力；抑制肝癌细胞侵袭和迁移能力；抑制依赖于Rab22A调节的EGFR信号通路的GTP水解酶活性；在肝细胞癌细胞中抑制EGFR信号通路的活性，并特异抑制其下游的MEK-ERK通路和PI3K-AKT通路方面效果显著。
本文所述沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一实现的。上述方式的至少之一可有效实现WDR67的特异性沉默。
本发明提出了一种指导用药的方法，所述药物用于治疗癌症。根据本发明的实施例，所述方法包括：采集肝癌患者癌组织样本并采用qPCR检测8q24.13区域拷贝数；其中，8q24.13发生拷贝数扩增是候选药物MEK抑制剂耐药的指示，8q24.13发生拷贝数非扩增是候选药物MEK抑制剂敏感的指示。根据本发明的实施例，癌组织中8q24.13拷贝数的扩增状态，利用根据本发明实施例的拷贝数检测方法，建立指导肝癌患者接受MEK抑制剂治疗的伴随诊断标志物，有效用于肝癌个体化治疗。
根据本发明的实施例，所述癌症为肝癌。利用根据本发明实施例的上述方法筛选获得的药物可用于治疗肝癌。
本发明经过广泛而深入的研究，首次发现了通过降低WDR67基因的表达或活性可以显著地抑制肝癌细胞的生长，本发明根据RNAi原理，设计短发卡RNA(shRNA)序列，将其克隆到慢病毒载体载体(pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro)中，包装获得慢病毒颗粒后感染肝癌细胞，构建了稳定敲低WDR67基因的肝癌细胞株，进一步检测了WDR67基因的表达变化对肝癌细胞生长的影响。结果表明，敲低WDR67基因的肝癌细胞生长能力受到显著抑制，并且敲低WDR67基因能明显抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。进一步采用裸鼠皮下成瘤模型分析WDR67对肝癌细胞体内生长能力的影响，结果验证了无论是体内还是体外实验，均表明敲低WDR67会显著抑制肝癌细胞的生长，并对肝癌细胞的增殖和迁移具有很强的抑制作用。
附图说明
图1为根据本发明实施例的染色体8q24.13处的基因组扩增与肝癌患者显著相关结果图。
图2为根据本发明实施例的敲低WDR67显著抑制肝癌细胞体外生长、迁移和侵袭能力，体内皮下成瘤和肺转移能力的结果图。B-E的柱状图中，每种肿瘤细胞的左一为对照LV-shCtrl，左二和左三分别为转染干扰慢病毒LV-shWDR67-1(敲低WDR67-1)的细胞、转染干扰慢病毒LV-shWDR67-2(敲低WDR67-2)的细胞。
图3为根据本发明实施例的WDR67通过激活EGFR信号通路促进肝癌进展的结果图。
图4为根据本发明实施例的WDR67通过减少EGFR的溶酶体转运来延迟EGFR降解的结果图。
图5为根据本发明实施例的WDR67通过水解Rab22A减少EGFR的溶酶体转运的结果图。
图6为根据本发明实施例的WDR67高表达与肝癌患者的不良预后显著相关的结果图。
图7为根据本发明实施例的敲低WDR67显著增加肝癌细胞对MEK抑制剂的敏感性的结果图。
图8为根据本发明实施例的WDR67发挥促癌作用的机制图。
图9为质粒pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的慢病毒载体pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro为汉恒生物科技(上海)有限公司产品。
实施例1、8q24.13的拷贝数扩增与肝癌患者的不良预后显著相关
肝癌的发生是一个渐进积累遗传变异并最终导致肝细胞恶性转变的过程。基因的拷贝数变异(CNA)是肿瘤中一种常见的体细胞变异，可改变基因的表达剂量或编码蛋白的结构，并使基因的功能发生变化。高通量技术的出现和发展使得全面解析癌症中的CNA状态成为可能，目前已有多个肝癌的CNA区域被报道。此外，大量研究证实肿瘤中高频的CNA区域中通常包含具有“驱动”特性的肿瘤相关基因，影响肝癌的发生与发展。因此，与肝癌相关的CNA及基因的发掘可以帮助发明人开发新的肝癌诊断标志物、靶向治疗方法和预后评估指标。为了发现与肝癌相关的CNA，采用生物信息学方法利用肝癌组织的mRNA表达谱数据推算肝癌中的拷贝数变异。
收集来自六个独立的肝癌患者队列的814对肿瘤组织和相邻的非肿瘤肝组织的公开可用基因表达数据集(发掘队列1～6；表1)。然后，通过ACE算法对CNA进行分析。该算法使用基于基因表达变化的几何加权邻域评分(NSs)来推断CNA。最终，在这814名肝癌患者中共鉴定出15个共有的CNA，包括8个扩增和7个缺失。这15个CNA的基因组大小介于0.7到15.9兆碱基(Mb)之间，影响427个基因。
表1用于肝癌CNA计算的6个队列的基本信息
注：GEO，Gene Expression Omnibus(基因表达综合数据库)；TCGA，The CancerGenome Atlas Program(癌症基因组图谱)；LIHC，liver hepatocellular carcinoma(肝细胞癌)。
接下来，发明人在三个具有长期随访信息的发掘队列(发掘队列4、5和6)中评估了这15个CNA的临床相关性。发明人观察到，只有8q24.13扩增在三个队列中与较短的总体生存期(OS)相关(发掘队列4～6中的Log-rank P＝0.0077，0.0090和0.0041；图1中A)。同时，8q24.13扩增在两个队列中与较短的无病生存期(DFS)显著相关(发掘队列4和6中的Log-rank P＝0.0078和0.040；图1中B)。因此，这些发现表明8q24.13扩增是肝癌不良患者预后的重要标志物，值得进一步研究。
发明人进一步在另一个独立的肝癌队列中评估了8q24.13扩增的临床相关性。该队列由212个肝癌组织组成(验证队列，表2)。定量PCR(qPCR)分析显示，212个肝癌组织中有96个(45.3％)肿瘤发生8q24.13拷贝数扩增(图1中D)。Kaplan-Meier生存分析显示，与无8q24.13扩增的患者相比，发生8q24.13扩增的肝癌患者的OS和DFS率降低(P＝0.0084和0.0020；图1中E)。多元Cox比例风险回归分析表明，8q24.13扩增是较低OS和DFS的独立预测指标(P＝0.045和0.016；图1中F)。
表2验证队列社会人口学资料及8q24.13拷贝数的扩增比例
实施例2、WDR67是8q24.13扩增中潜在的功能靶基因
8q24.13扩增的最小共有区域大约为1.91Mb(从124，154，100到126，060，811个碱基对[bp]，基于国家生物技术信息中心[NCBI]人类基因组版本36(图1中A)，其中总共存在16个蛋白质编码基因(图1中C)。对基因组和转录数据(发掘队列1、4和6)的整合分析表明，8q24.13扩增对这16个基因的表达水平呈现出较强的顺式调控作用。其中，与非肿瘤肝组织相比，在肝癌组织中有12个基因在至少一半的发掘队列中一致上调，表明它们在肝癌中的潜在功能性。
然后，发明人使用高内涵筛选(HCS)实验评估了这12个基因对两种肝癌细胞系增殖和迁移的影响。细胞计数分析表明，shRNA介导的三个基因(WDR67，TMEM65和TRMT12)的敲低显著抑制了HepG2和SMMC-7721细胞的增殖。划痕实验表明，敲除三个基因(WDR67，ATAD2和FAM91A1)显著抑制了HepG2和SMMC-7721细胞的迁移能力。综上，发明人观察到敲低WDR67对肝癌细胞的增殖和迁移均具有最强的抑制作用(图1中G)。因此，这些结果表明WDR67是8q24.13扩增区域的候选功能靶标。
实施例3、构建稳定敲低WDR67的肝癌细胞株
受试细胞：肝癌细胞SMMC-7721、HCCLM3、HepG2、Bel-7402为中国典型培养物保藏中心(武汉)公司产品。
为了研究WDR67在肝癌中的生物学行为及其相应的分子机制，首先发明人针对WDR67基因选择2个不同的靶位点，设计了两对shRNA序列(shWDR67-1和shWDR67-2)，为了全面分析WDR67的功能，构建稳定敲低WDR67的肝癌细胞株。
WDR67基因的核苷酸序列是NCBI Reference Sequence:NM_145647.4的第1-3201位(Update Date 2022-04-01)，即WDR67基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
干扰慢病毒构建：将2种干扰shRNA的编码DNA分子分别构建到慢病毒表达载体pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro上，利用慢病毒包装系统包装获得慢病毒颗粒，得到干扰慢病毒LV-shWDR67-1(含有shWDR67-1的编码DNA分子，简称敲低WDR67-1)和LV-shWDR67-2(含有shWDR67-1的编码DNA分子，简称敲低WDR67-2)，用来转染细胞建立细胞系。将对照慢病毒LV-shCtrl、干扰慢病毒LV-shWDR67-1和LV-shWDR67-2分别感染肝癌细胞(SMMC-7721与HCCLM3)，经过Puro抗性筛选后，获得稳定敲低WDR67基因的细胞系，名称分别为SMMC-7721/LV-shCtrl、SMMC-7721/LV-shWDR67-1(含有shWDR67-1的编码DNA分子)、SMMC-7721/LV-shWDR67-2(含有shWDR67-2的编码DNA分子)、HCCLM3/LV-shCtrl、HCCLM3/LV-shWDR67-1(含有shWDR67-1的编码DNA分子)、HCCLM3/LV-shWDR67-2(含有shWDR67-2的编码DNA分子)。
提取上述稳定敲低WDR67基因的细胞系的总蛋白进行电泳，分别以SMMC-7721/LV-shCtrl与HCCLM3/LV-shCtrl为对照，使用如下抗体进行Western Blot蛋白印迹法检测WDR67、GAPDH(作为内参)表达量：WDR67抗体(Sigma公司产品，货号：HPA023710)、GAPDH抗体(Cwbiotech公司产品，货号：CW0100)。
通过WB的检测后发现敲低效果均在50％以上(图2中A)，可用于后续实验，shRNA的靶序列如表3所示。
表3：敲低WDR67的shRNA靶序列
上述干扰慢病毒构建方法：
根据WDR67的序列设计靶向WDR67的shRNA干扰片段，通过分子生物学手段将该干扰片段构建到慢病毒表达载体(pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro)的U6启动子下游，该载体可以实现在干扰目的基因的同时表达Luciferase蛋白和puromycin抗性基因，前者用于观察载体工作状态，后者方便筛选目的基因干扰的稳定细胞株。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于目的基因的干扰，还可以用于包装慢病毒，用于稳定株的筛选以及在动物水平干扰目的基因的表达。
所选用的干扰载体pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro(图谱如图9所示)用BamHI和EcoRI酶切形成粘性末端，插入待构建的shRNA的编码基因序列。将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切后含有粘性末端的RNA干扰载体。挑选菌落进行扩增，提取质粒之后进行测序验证。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。
具体方法如下：
一、干扰靶点设计
根据shRNA设计的一般原则设计靶点，安排引物合成。
针对人的WDR67基因设计的shWDR67-1的编码DNA分子的靶向序列为：5’-GCTGAATATTCGCCAGTCT-3’(SEQ ID NO：1)；针对人的WDR67基因设计的shWDR67-1的编码DNA分子的靶向序列为：5’-GACGGTACATTGCATCTAT-3’(SEQ ID NO：2)。根据靶序列及要插入的目的载体设计引物。
二、引物退火形成带粘性末端的双链片段
将靶向WDR67第一个序列的正向和反向引物退火，成带粘性末端的双链片段，命名为1F+1R；将靶向WDR67第二个序列的正向和反向引物退火，成带粘性末端的双链片段，命名为2F+2R。
三、干扰载体的构建
用BamHI和EcoRI对pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro(汉恒生物)进行双酶切，割胶回收酶切后的载体片段。将退火产物1F+1R与酶切后的载体片段加入T4连接酶进行连接；将退火产物2F+2R与酶切后的载体片段加入T4连接酶进行连接。分别将两份连接产物转化感受态细菌DH5α，挑取单菌落，进行扩增后送公司进行测序验证。用DNAMAN软件比对测序结果，验证引物序列插入到目的载体上。将插入退火产物1F+1R，并且pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro的其它序列不变得到的重组表达载体命名为shWDR67-1(干扰载体)；将插入退火产物2F+2R，并且pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro的其它序列不变得到的重组表达载体命名为shWDR67-2(干扰载体)。
四、重组慢病毒的制备及感染细胞
将shWDR67与其包装质粒(pSPAX2、pMD2G)共同转染293T细胞，转染6小时后换成完全培养基培养继续培养48小时，收集含病毒的上清，并通过超离心浓缩，得到表达干扰人WDR67基因的shRNA的重组慢病毒，将其命名为表达shWDR67的重组慢病毒。将包装好的重组慢病毒分别感染SMMC-7721与HCCLM3细胞，具体操作如下：将SMMC-7721或HCCLM3细胞按2×105个/cm2的密度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养约24小时，待细胞密度达到60％时，加入重组慢病毒液(MOI＝100)和终浓度为8μg/mL polybrene，12小时后换液。细胞培养48小时后用2μg/mL嘌呤霉素筛选并维持培养，最终得到表达WDR67-shRNA的重组慢病毒感染的SMMC-7721或HCCLM3细胞。用嘌呤霉素筛选一周后，用免疫印迹法或RT-qPCR检测WDR67的表达。
实施例4、敲低WDR67显著抑制肝癌细胞的生长
发明人利用实施例3建立的4种稳定敲低WDR67基因的细胞系SMMC-7721/LV-shWDR67-1、HCCLM3/LV-shWDR67-1、HCCLM3/LV-shWDR67-2和SMMC-7721/LV-shWDR67-2，检测了WDR67的表达变化对肝癌细胞生长的影响。CCK-8实验结果显示，与对照组细胞(SMMC-7721/LV-shCtrl与HCCLM3/LV-shCtrl)相比，敲低WDR67的肝癌细胞生长速度显著减慢(图2中A)。平板克隆形成及软琼脂克隆形成实验结果一致地显示，在敲低WDR67之后，肝癌细胞的克隆形成能力显著减弱(图2中B、C)。上述结果表明，在稳定敲低WDR67基因的表达后，肝癌细胞生长能力受到显著抑制，说明WDR67基因影响肝癌细胞的增殖，可以作为肝癌治疗的潜在药物靶点。
其中，平板克隆实验方法如下：
取对数生长期的4种稳定敲低WDR67基因的细胞系SMMC-7721/LV-shWDR67-1、HCCLM3/LV-shWDR67-1、HCCLM3/LV-shWDR67-2和SMMC-7721/LV-shWDR67-2按照1×103个细胞/孔的接种量分别接种在6孔板中，2-3天换一次液，用DMEM完全培养基培养至肉眼可见的集落时，终止培养。弃去培养基，用PBS洗2-3次，加入4％多聚甲醛固定30min，弃去固定液，加入用0.1％结晶紫染色30min，用清水冲净，自然条件下晾干，拍照并统计克隆数。用GraphPad8.0统计软件分析数据。结果用(平均值±标准差)表示，两两之间的比较采用秩合检验进行检验，P＜0.001表示与对照组相比具有极显著性差异。
其中，软琼脂克隆实验方法如下：
1)将基础琼脂制备至42℃(1.2％琼脂糖:2×DMEM＝1:1)，加入6孔培养皿(2mL/盘)中，使其凝固。
2)将上层琼脂在2×DMEM的水浴中冷却至37℃(0.7％琼脂糖:2×DMEM＝1:1)。
3)然后，将细胞置入上层琼脂中。
4)将此混合物(1mL)加入6孔培养皿(1×103个细胞/mL/培养皿)，待其凝固。
5)孵育3-4周后，扫描并计数克隆数量。
6)实验设三次重复。用GraphPad8.0统计软件分析数据。结果用(平均值±标准差)表示，两两之间的比较采用秩合检验进行检验，P＜0.001表示与对照组相比具有极显著性差异。
实施例5、敲低WDR67显著抑制肝癌细胞的迁移和侵袭
敲低中等转移能力的SMMC-7721细胞中的WDR67之后，采用Transwell实验进行检测4种稳定敲低WDR67基因的细胞系SMMC-7721/pLV-shWDR67-1、HCCLM3/pLV-shWDR67-1HCCLM3/pLV-shWDR67-2和SMMC-7721/pLV-shWDR67-2的迁移和侵袭能力，结果显示敲低WDR67会抑制细胞的迁移和侵袭，如图2中D、E所示。在高转移能力的HCCLM3细胞中也得到了一致结果(图2中D、E)。上述结果表明敲低WDR67能明显抑制肝癌细胞的迁移和侵袭，说明WDR67基因能影响肝癌细胞的迁移，可以作为肝癌治疗的潜在药物靶点。
Transwell法检测肝癌细胞的迁移实验方法如下：
1)将6孔板里的细胞培养贴壁后，换成无血清培养液，继续培养12小时后用无血清培养液重悬备用。
2)准备好Transwell小室，将上述细胞种入小室，小室接种细胞数为5×104个细胞，下室放置500μl含10％FBS的培养基，注意消除气泡。
3)24小时后将下室中培养液吸净弃去，用棉签轻轻擦去小室内未穿过的细胞，加入500μl的0.5mg/ml的0.1％的结晶紫染色。
4)20分钟后，将上层小室流水冲洗5-10min，注意不要对膜冲洗。
5)在显微镜下观察、拍照。200倍光镜下选择上下左右中5个不同视野的穿过膜的细胞数，求平均值，按下式计算肿瘤细胞的迁移能力。
6)实验设三次重复。用GraphPad8.0统计软件分析数据。结果用(平均值±标准差)表示，两两之间的比较采用秩合检验进行检验，P＜0.001表示与对照组相比具有极显著性差异。
Transwell法检测肝癌细胞的侵袭实验方法如下：
1)Matrigel胶(BD公司产品)储存在-20℃，使用前12-24小时转移至4℃冻融。使用时，用无血清DMEM培养液稀释(Matrigel胶与无血清培养液按1：2稀释)，此步冰上操作。吸取20ml上述配制的Matrigel胶均匀滴在膜上，在37℃放30min后，在紫外下照30min。
2)在重悬细胞之前，要使细胞饥饿处理12小时，将细胞用胰酶消化，用无血清DMEM重悬。计数吸取2×105个细胞(体积不能超过200μl)，加入Transwell上室中。下室中加入500μl含10％FBS的DMEM。
3)将上室放到下室中，在DMEM与上室膜交界的地方，注意有无气泡产生，气泡会影响实验进行。
4)48小时后，将上室从下室中拿出，把膜上的细胞用棉签轻轻擦去，略微风干，将其放入结晶紫中染色，时间要控制，染色10-15min，观察着色情况，不行再延长染色时间。用流水轻轻冲洗，拍照。在高倍镜下(×200)随机取5个视野计数，取平均数。按下式计算对肿瘤细胞的侵袭能力。
5)实验设三次重复。用GraphPad8.0统计软件分析数据。结果用(平均值±标准差)表示，两两之间的比较采用秩合检验进行检验，P＜0.001表示与对照组相比具有极显著性差异。
实施例6、敲低WDR67抑制肝癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力
为了进一步证实WDR67的促进肝癌细胞生长的功能，发明人采用裸鼠皮下成瘤模型来分析WDR67对肝癌细胞体内生长能力的影响。发明人一共准备了16只裸鼠(BALB/c)，体重为20g±3g，将其随机分成2组，每组8只：对照-1组和敲低WDR67-1组为同一组老鼠的背部左右两侧、对照-2组和敲低WDR67-2组为同一组老鼠的背部左右两侧。
对照-1组和敲低WDR67-1组：在每只裸鼠(BALB/c)的背部左右两侧皮下分别注射实施例3中的HCCLM3/LV-shCtrl细胞和HCCLM3/LV-shWDR67-1细胞，注射剂量为1×106个/只；
对照-2组和敲低WDR67-2组：在每只裸鼠(BALB/c)的背部左右两侧皮下分别注射实施例3中的HCCLM3/LV-shCtrl细胞和HCCLM3/LV-shWDR67-2细胞，注射剂量为1×106个/只。
各组注射完成后，从形成肉眼可见的肿瘤开始第一次观测，以后每三天观测一次，记录瘤块的长径和短径，裸鼠体重，观察是否有异常。3周后，切下肿瘤，记录肿瘤的重量。根据各时点记录的肿瘤长短径，按公式计算肿瘤体积(体积＝1/2×长径×短径2)，绘制出生长曲线。用GraphPad8.0计软件分析数据。结果用(平均值±标准差)表示，两两之间的比较采用秩合检验进行检验，P＜0.001表示与对照组相比具有极显著性差异。
结果如图2中F所示，敲低WDR67后，肝癌细胞在裸鼠体内的生长速度明显减慢(P＜0.001，P＜0.01)；敲低WDR67组的瘤块体积和重量也明显低于对照组(P＜0.001，P＜0.01；图2中G)。此外，发明人还利用免疫组织化学染色的方法检测了癌巢中Ki-67和CD31的表达水平，结果显示敲低WDR67组中Ki-67和CD31的表达水平明显低于对照组，说明敲低WDR67组所形成癌巢的增殖能力和血管形成能力弱于对照组(图2中H)。以上结果提示，敲低WDR67的表达会减弱肝癌细胞在裸鼠体内的生长能力。
实施例7、敲低WDR67抑制肝癌细胞在裸鼠体内的转移
为了进一步证实WDR67的促进肝癌细胞迁移和侵袭，发明人采用裸鼠尾静脉注射模型来分析WDR67对肝癌细胞体内转移能力的影响。发明人一共准备了32只裸鼠(BALB/c)，体重为20g±3g，将其随机分成3组，每组10～11只。分别为如下：
对照组(shCtrl)：从每只裸鼠的尾静脉中注射实施例3中的HCCLM3/LV-shCtrl细胞(1.25×106个/只)(1.25×106个/只)。
敲低WDR67-1组:从每只裸鼠的尾静脉中注射实施例3中的HCCLM3/LV-shWDR67-1细胞(1.25×106个/只)；
敲低WDR67-2组:从每只裸鼠的尾静脉中注射实施例3中的HCCLM3/LV-shWDR67-2细胞(1.25×106个/只)。
注射2小时后，采用活体成像观察裸鼠体内细胞的情况，结果显示注入的细胞数量基本一致。以后每周采用活体成像观察裸鼠体内细胞的变化，记录裸鼠体重，观察是否有异常，如发生死亡，则记录死亡时间，并留存裸鼠的主要脏器，连续观察14周后处死统计。
荧光成像结果显示，敲低WDR67之后，裸鼠肺部的肝癌细胞明显少于对照组(图2中I)；并且敲低WDR67后裸鼠的生存期显著延长了至少2-5周的时间(图2中J)。对裸鼠进行处死后观察其肺部组织的成瘤情况，发现敲低WDR67的HCCLM3细胞在肺组织中形成癌巢的发生率不超过10％，而对照组的发生率是100％(图2中K、L)；对肺组织进行HE染色后发现，敲低WDR67组在裸鼠肺部组织形成癌巢的数目也明显少于对照组(图2中M)。综合上述实验结果，发明人确定敲低WDR67能明显抑制肝癌细胞在裸鼠体内的肿瘤转移能力。
实施例8、WDR67通过激活EGFR途径发挥其致癌功能
进一步，发明人解析了WDR67致癌作用的潜在分子机制。首先基于来自四个发掘队列(发掘队列1、2、3和4)的肿瘤组织的基因表达谱进行了基因集富集分析(GSEA)。结果显示其中EGFR通路在所有四个队列中一致显著(图3中A)。同时，发明人在全基因组shRNA筛选数据库(DepMap)的600株癌细胞系中分析WDR67基因的功能依赖性基因。发明人发现与WDR67相关依赖的基因富集于“ErbB1(EGFR)内吞”信号通路(图3中B)。EGFR通路已被证明在包括肝癌的多种癌症的发展中起着至关重要的作用。因此，发明人假设：WDR67通过EGFR信号通路发挥致癌作用。
实际上，发明人观察到在EGF刺激后，敲低WDR67显著降低HCCLM3细胞中总EGFR和磷酸化EGFR(p-EGFR，Tyr1068)的蛋白质水平(图3中C)。相反，HepG2细胞中过表达WDR67显著增加EGFR和p-EGFR蛋白质水平(图3中D)。同时，在EGFR的几个关键下游级联通路中，WDR67显著诱导了AKT和ERK的活化：p-AKT(Ser473)和p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)水平升高(图3中E、F)。同时，发明人在168名验证队列患者的肝癌组织中采用免疫组织化学(IHC)分析表明WDR67蛋白水平与EGFR，p-EGFR，p-ERK和p-AKT的水平显著正相关(图3中G)。
接下来，发明人进一步证实WDR67对肝癌细胞恶性表型以及ERK和AKT活性的影响是否依赖于EGFR。首先，发明人发现siRNA诱导的EGFR敲低显著降低了肝癌细胞中软琼脂菌落形成，迁移和侵袭的能力以及p-ERK和p-AKT的水平(图3中H)。其次，当在肝癌细胞中敲低EGFR时，WDR67过表达对软琼脂集落形成，迁移和侵袭能力，以及p-ERK和p-AKT的水平的促进作用显着降低(图3中H)。EGFR抑制剂吉非替尼处理得到类似的结果(图3中I)。综上所述，这些发现表明WDR67以EGFR依赖性方式发挥其致癌作用。
实施例9、WDR67通过减少EGFR的溶酶体转运和降解增加EGFR通路活性
发明人进一步研究了WDR67如何诱导EGFR表达水平并激活EGFR信号通路。发明人发现过表达或敲低WDR67后，EGFR mRNA水平保持不变(图4中A)。但是，环己酰亚胺(CHX)处理后，在HCCLM3细胞中敲低WDR67显著缩短EGFR蛋白的半衰期(图4中B)。相反地，在HepG2细胞中过表达WDR67显著延长EGFR蛋白的半衰期(图4中B)。这些结果表明WDR67对EGFR丰度的调控主要是通过增加其蛋白稳定性，而非转录调控。
WDR67是包含Tre2/Bub2/Cdc16(TBC)结构域的蛋白质家族成员，通常具有RabGTPase活化蛋白(GAP)活性。已发现几种GAP可以催化Rab GTPases从结合GTP的活性状态转变为GDP结合的非活性状态。因此，发明人假设WDR67可能通过影响EGFR胞内转运来调节EGFR的蛋白水平。
为了研究WDR67对EGFR转运的调控作用，发明人进行了免疫荧光实验(IF)来观察EGFR与胞内体标志物分子的共定位。发明人发现在EGF处理5分钟后，敲低WDR67不影响EGFR和早期胞内体标志物EEA1的共定位，这表明WDR67不影响EGFR的初始内吞过程(图4中C)。然而，发明人观察到在EGF处理15或30分钟后，WDR67的敲低减弱了EGFR和EEA1的共定位(图4中C)。此外，EGF处理30、60或120分钟后，大量的EGFR主要与HCCLM3细胞中的溶酶体标志物LAMP1共定位(图4中C)。该时间点对应于内吞的EGFR从早期胞内体向晚期内体转运的过程，最后到溶酶体的被降解。值得注意的是，敲低WDR67诱导的EGFR降解可以被溶酶体抑制剂氯喹(CQ)阻断，但未被蛋白酶体抑制剂MG132阻断(图4中D)。总体而言，这些发现表明WDR67介导的EGFR失调至少部分依赖于溶酶体介导的降解途径，而不是转录作用或泛素-蛋白酶体途径。
此外，发明人分析了WDR67对EGFR回收至细胞膜的影响。发明人进行了质膜分离实验，观察到敲低WDR67显著降低HCCLM3细胞中膜结合的EGFR；而在HepG2细胞中过表达WDR67显示相反的效果(图4中E)。同时，发明人通过流式细胞分析在HCCLM3细胞中得到了相似的结果(图4中F)。总体而言，这些结果表明WDR67通过抑制EGFR从早期胞内体到晚期的胞内体/溶酶体的转运和降解，从而间接提高了再循环至细胞膜的EGFR的比例。
实施例10、WDR67通过水解Rab22A减少EGFR的溶酶体转运
WDR67属于Tre2/Bub2/Cdc16(TBC)结构域家族，该结构域具有Rab-GTP水解酶激活活性，能促进特异Rab-GTP蛋白水解为Rab-GDP，从而参与特异胞内受体的转运过程。接下来，发明人阐明WDR67如何减少EGFR向溶酶体转运。研究表明，包括Rab4A，Rab5A，Rab7A，Rab11A，Rab21A和Rab22A在内的几种经过深入研究的Rab GTPases与EGFR转运相关。因此，发明人在HEK293细胞中采用免疫共沉淀(co-IP)分析方法验证了这些Rab与WDR67的潜在相互作用。发明人观察到Flag-WDR67可以与Myc-Rab22A结合，但不能与其他Rab结合(图5中A)。此外，发明人在HepG2细胞中通过co-IP分析证实了Flag-WDR67与内源性Rab22A的相互作用(图5中B)。一致地，GST pulldown实验显示WDR67在体外可与Rab22A直接结合(图5中C)。免疫荧光实验证明了WDR67与Rab22A在HepG2细胞中共定位于细胞质(图5中D)。
然后，发明人评估了WDR67是否通过Rab22A发挥其对EGFR的调节作用。首先，发明人观察到WDR67以浓度依赖性方式增强Rab22A GTPase活性，从而抵消了Rab22A的功能(图5中E)。发明人进一步验证敲低Rab22A是否可以回复由敲低WDR67诱导的抑癌功能。结果表明敲低Rab22A可以显著消除WDR67敲低对肝癌细胞恶性表型以及EGFR的表达和活性的抑制作用(图5中F、G)。共聚焦分析表明敲除Rab22A可以显著消除敲低WDR67诱导的对EGFR和EEA1共定位的抑制效果和对EGFR和LAMP1的共定位的促进效果(图5中H)。流式细胞分析一致地证明，Rab22A敲除还消除了WDR67敲低对HCCLM3细胞中膜结合EGFR的抑制作用(图5中I)。综上所述，这些发现表明Rab22A是WDR67的一个新底物，WDR67至少部分地通过Rab22A促进EGFR信号转导。
实施例11、WDR67的高表达与肝癌患者的不良预后显著相关
接下来，发明人评估了WDR67表达水平是否与肝癌的进展相关。对来自验证队列(n＝168)的样本进行IHC(免疫组化)分析表明，肝癌组织中WDR67的蛋白质水平显著高于配对的非肿瘤肝组织(图6中A)。一致地，在有8q24.13扩增的肝癌组织中，WDR67蛋白水平高于没有8q24.13扩增的肝癌组织(图6中B)。此外，发明人发现男性或无肿瘤包膜的患者，或处于较高TNM分期的患者肿瘤组织中呈现出比其他患者更高的WDR67表达水平(图6中C)。Kaplan-Meier生存分析显示，肝癌组织中较高的WDR67水平与较低的OS和DFS率显著相关(P＝0.00087和0.012，图6中D)。多变量Cox比例风险回归分析表明，较高的WDR67表达是较低的OS和DFS率的独立预测因子(P＝0.0078和0.077)。发明人在三个发掘队列中观察到了相似的结果(发掘队列4-6；图6中E)。
实施例12、抑制WDR67显著降低肝癌细胞对MEK抑制剂的耐药性
为了确定WDR67的过表达是否与特定抗癌药物的耐药性相关，发明人采用来自LIMORE计划中针对32种肝癌细胞系的81种药物处理的药物基因组数据集进行整合分析。通过计算WDR67的表达水平与药物活性(包括活性区域，IC50和Emax)之间的相关性，发明人发现所有3种被测试的MEK抑制剂(MEKi；包括AZD6244[也称为Selumetinib]，Trametinib和Cobimetinib)均呈现显著相关性(r分别为-0.31、-0.29和-0.26；P分别为0.0051、0.0093和0.019；图7中A；)。
然后，发明人评估了肝癌细胞系中WDR67表达水平与MEKi活性之间的相关性。与WDR67野生型的HepG2或SMMC-7721细胞相比，WDR67扩增的HCCLM3细胞对AZD6244和Trametinib药物呈现出较高的耐药性(图7中B)。在HepG2和SMMC-7721细胞中过表达WDR67显著增加了对AZD6244和Trametinib的耐药性(图7中C)。相反，在HCCLM3细胞种敲低WDR67显著降低其对AZD6244和Trametinib的耐药性(图7中D)。发明人进一步在体内证实了这些发现。发明人首先构建了Doxycycline诱导敲低WDR67的HCCLM3细胞系。在裸鼠移植皮下瘤19天后，开始采用Doxycycline诱导移植细胞中靶向WDR67的shRNA表达，实现敲低WDR67的表达水平。结果表明，与AZD6244单药处理相比，敲低WDR67可以显著增加AZD6244药物抑制肿瘤生长的效果(图7中E-G)。Ki67免疫组化分析显示敲低WDR67显著增加了AZD6244的抗增殖作用(图7中H)。
此外，发明人发现，EGFR抑制剂吉非替尼可增强AZD6244对WDR67扩增的HCCLM3细胞的抗肿瘤作用(图7中I)。与敲低WDR67的效果类似，吉非替尼也可以显著阻断AZD6244处理后ERK和AKT的磷酸化(图7中J)。总体而言，这些结果表明靶向WDR67或EGFR均增加WDR67扩增的肝癌细胞对MEKi的敏感性，表明该组合可能在治疗WDR67扩增的肝癌具有潜在应用价值。
总结以上实施例，参考图8，WDR67由8q24.13拷贝数扩增激活，作为一种rabbGTPase激活蛋白(GAP)，通过抑制Rab22A介导的EGFR从早期核内体(EE)到晚期核内体(LE)/溶酶体降解的胞内转运，因此导致下游级联的延长激活，促进肝癌细胞的生长和转移。因此，通过靶向WDR67 shRNA可以通过抑制WDR67介导的EGFR持续激活，实现抑制肝癌细胞生长和转移的目的。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> WDR67抑制剂及其在抑制肝癌细胞生长和转移中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gctgaatatt cgccagtct 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gacggtacat tgcatctat 19
<210> 3
<211> 3201
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgcagagca ctgacctagg caacaaggag agcggcaaga tatggcaccg caagccgtcc 60
ccggccacgc gggacggaat tatagtgaac attattcaca acacttccga ttaccatcca 120
aaagttttgc gatttttgaa tgtggctttt gatggcacag gcgactgctt aattgctggg 180
gaccaccaag gaaatattta tgtttttgac ttacatggaa acaggttcaa tcttgttcag 240
cgaacagcac aagcttgcac agctctggcc tttaatcttc gtaggaaatc tgaattcctt 300
gtggcattag ctgattattc tattaaatgt tttgatacag tcaccaagga gctagttagc 360
tggatgagag gacatgaatc atcagtattt tcgatctctg tgcatgcatc agggaaatat 420
gccatcacaa cttcttctga tacagcacaa ttatgggact tggatacctt tcagagaaaa 480
agaaagctga atattcgcca gtctgtgggt atacagaagg ttttctttct accattaagt 540
aataccatcc tcagctgttt taaagataat tccatttttg cctgggaatg tgacacactt 600
ttttgcaaat atcaattgcc agctccacct gaaagctcta gtatattata caaagtgttt 660
gctgtaacca gagatggccg aatcctggct gctggaggca agtcaaatca tcttcatttg 720
tggtgcttgg aagctaggca gctctttaga attatccaga tgcccactaa agttcgagcc 780
attcgccatc tggaatttct tcctgatagt tttgatgctg gttctaatca ggttcttgga 840
gtactaagtc aagatggtat tatgagattt atcaatatgc agacttgtaa acttctcttt 900
gagattggga gcctcgatga aggaattagc tcatcagcaa ttagcccaca tggacggtac 960
attgcatcta ttatggaaaa tggaagtcta aacatatatt cagttcaggc tttaacacaa 1020
gaaataaata agccacctcc gcctttagtg aaagttattg aagatttgcc caagaataaa 1080
ctgagttcca gtgatcttaa gatgaaagta acatcaggga gagtacagca gccagcaaaa 1140
tctagggaaa gcaaaatgca aactagaata ttaaaacaag acctgactgg tgattttgaa 1200
agtaaaaaga atgaattacc agatggatta aacaaaaagc gtttacaaat cttattaaaa 1260
ggctatggtg aatatccaac aaaatacaga atgttcattt ggcgctctct gctacaactg 1320
cctgaaaatc atactgcgtt tagtaccctc atagataagg ggactcatgt ggcatttctc 1380
aaccttcaga agaaataccc catcaaaagt aggaagctac tcagagtatt acagagaacc 1440
ttatctgcat tagctcactg gtctgtcatt tttagtgaca caccatatct tccactcttg 1500
gcatttccat ttgtaaaatt attccagaac aaccaactca tctgttttga agttattgct 1560
actctcataa tcaattggtg tcaacactgg tttgaatatt ttcctaatcc tcctatcaat 1620
attcttagca tgatagaaaa tgttttggca tttcatgaca aggaactgct gcaacacttc 1680
atagatcatg atataacctc ccagctatat gcatggcctc ttcttgaaac tgtgttctca 1740
gaagtgctga caagagagga gtggctgaaa ttgttcgata atatcttttc caaccatcct 1800
tccttccttc tgatgactgt tgtagcctac aacatatgtt ctagaacgcc tctgctcagc 1860
tgtaatctta aagatgactt tgagtttttt tttcaccatc ggaataacct ggatataaat 1920
gttgtgatta gacaagttta tcatctcatg gagaccacgc ctactgacat tcatccagac 1980
agcatgctta atgtttttgt tgcactgaca aaagggcagt atccagtatt taatcaatat 2040
ccaaagttta ttgtggacta tcaaacacag gaacgagaaa gaataaggaa tgatgaattg 2100
gattacttaa gagagaggca gacagttgaa gatatgcaag ctaaagtcga ccagcaaaga 2160
gttgaagatg aagcttggta ccagaaacag gagctgcttc gtaaagctga agaaacaaga 2220
agagaaatgc tcttacaaga ggaggagaaa atgatacaac aaagacagag gctagctgct 2280
gtgaaaagag agctgaaagt aaaggaaatg cacttacaag atgctgcaag aaggcgtttt 2340
ctgaagcttc agcaagatca acaggaaatg gaactaagaa gactggatga tgaaattggg 2400
agaaaggtat atatgagaga tcgagaaatt gctgccacag ccagagacct agaaatgaga 2460
cagctggaac tcgaatcaca aaagagactt tatgagaaga atcttactga aaatcaagaa 2520
gctcttgcaa aagaaatgcg agcagatgca gatgcctata gacgaaaagt ggatcttgaa 2580
gaacacatgt ttcataagct gatagaagca ggtgaaaccc agagccagaa aactcagaag 2640
gtgattaaag aaaatttggc aaaggctgaa caagcatgcc taaataccga ctggcagatt 2700
cagtctttac ataaacaaaa atgtgatgat ctacaacgaa acaaatgtta ccaggaagta 2760
gccaaactcc ttagggaaaa cagaaggaaa gaaatagaga taataaatgc aatggtggag 2820
gaggaagcca agaagtggaa ggaagctgaa ggaaaagagt tccgtttgag atcagcaaag 2880
aaagcttctg ctctttcaga tgcgtctaga aagtggtttt taaagcaaga gataaatgcg 2940
gctgtagaac atgctgaaaa tccatgtcat aaagaagaac ccaggttcca aaatgaacag 3000
gactcaagct gtttgcctag aacctcacaa ttaaatgact cttctgaaat ggatccctca 3060
acacagattt ctttaaatag aagagcagta gaatgggaca ccacgggaca gaatcttatt 3120
aagaaagtga gaaatcttcg ccagagactc actgcccggg ctcgtcacag atgtcaaacc 3180
cctcatcttt tggctgcata g 3201

Claims (4)

1.WDR67抑制剂在制备降低肝癌细胞对MEK抑制剂的耐药性的药物中的应用，所述WDR67抑制剂为核酸分子，所述核酸分子为shRNA，所述shRNA的靶序列为SEQ ID No.1或SEQID No.2，所述MEK抑制剂为AZD6244或Trametinib。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述耐药性为原发性耐药性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌为肝细胞癌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝细胞癌为EGFR突变和/或过表达的肝细胞癌。
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kun Zhao等.A Panel of Genes Identified as Targets for 8q24.13-24.3 Gain Contributing to Unfavorable Overall Survival in Patients with Hepatocellular Carcinoma.Current Medical Science.2018,第38卷(第4期),第590-596页. *
施梦婷.肝癌细胞系中TBC1D31基因的异常表达与药物敏感性的关系.中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑.2019,(第8期),第18页，第27-43页. *
曹鹏博.肝癌的整合组学研究以及新发种系拷贝数变异研究.中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑.2015,(第1期),第47-56页. *

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