KR20130102990A - 항암면역우회암의 표시인자 및 무력화 표적으로서의 ａｐｉ５의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암면역우회암의 표시인자 및 항암치료내성 무력화 표적으로서 API5의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 항암면역우회암을 진단하는 병리적 마커로 API5 유전자와 이에 신호 전달 경로 관련 인자들을 표적화하거나 활성을 저해함으로써 API5에 의한 항암면역내성 및 항암면역억제를 무력화할 뿐만 아니라, 병행되는 항암치료의 치료적 효과를 높일 수 있다.

Description

항암면역우회암의 표시인자 및 무력화 표적으로서의 ＡＰＩ５의 용도{Apoptosis inhibitor 5 as biomarker associated with immune escape and resistance for cancer immunotherapy and use thereof}

본 발명은 암 치료를 위한 면역요법 후 내성과 면역억제능이 생긴 암과 관련된 병리적 마커로서 사람의 API5(Apoptosis inhibitor 5) 유전자를 이용하여 효과적으로 암을 치료할 수 있는 항암면역우회암의 표시인자 및 항암치료내성 무력화 표적으로서 API5의 용도에 관한 것이다.

암(cancer)은 아직까지도 대부분의 산업화 국가에서 사망률 제1위의 난치성 질환이다. 우리나라에서도 암은 전체 사망자의 약 25.5%를 차지하는 부동의 사망률 1위의 질환이며 이러한 경향은 지속할 것으로 전망된다. 암 완치율은 여전히 낮고 암으로 인한 사망자는 지속적으로 증가함으로써 이에 따른 가계부담 및 국가 의료비 부담 또한 많이 증가하였다.

암은 증식력이 강하며 전이성이 높아 생명을 위협하는 악성종양(malignant tumor)을 지칭한다. 지금까지의 암의 형성은 많은 유전자의 이상이 중첩되었을 경우에 세포는 증식과 사멸의 일정하게 유지하는 항상성(homeostasis)을 상실하고 비정상적으로 증식을 계속함으로써 종양(tumor)로 발전하고 이들 종양 세포가 전이능을 획득함으로써 암이라고 하는 질환으로 발전하는 것으로 이해되고 있다. 암은 유전적 변이 세포를 사멸하는 면역 기능 이상으로 발생하는 “면역 질환”으로 설정할 수 있다.

암의 치료는 1960년대 수술에 의한 치료기술에서 1970년대에는 방사선 치료 기술이 발전에 이어 1980년대부터 항암제의 개발과 역할이 큰 몫을 차지하게 되었다. 그러나, 이러한 치료들은 심각한 부작용들이 보고되고 있을 뿐만 아니라 상용화된 항암제의 약제 내성을 갖는 암세포들이 보고됨에 따라 보다 획기적이고 새로운 암 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이러한 현실에서 부작용이 상대적으로 적은 항암면역요법이 새로운 대안으로 주목 받고 있으며, 특히 최근 분자생물학의 발전으로 면역학에서도 많은 획기적인 연구 성과가 얻어지면서 새로운 항암면역치료(cancer immunotherapy)가 적극적으로 시도되고 있다. 이러한 시도는 전술한 암을 면역질환으로 설정할 때 매우 합리적인 항암요법이라 할 수 있을 것이다.

항암면역치료란 암 특이 항원(tumor specific antigen) 또는 암 관련 항원(tumor associated antigen)에 대한 면역반응을 유도하여 암 특이성 독성 면역세포(killer T cell)에 의해 암세포를 제거하는 모든 체계의 통합을 지칭하는 것이라 할 수 있다.

항암면역제제들 중 DNA 백신과 수지상세포를 기반으로 한 면역제제들이 현재 많은 주목을 받고 있으며 임상적 적용 또한 활발히 진행 중이다. 현재까지 수행된 항암면역제제들의 임상 결과들은 대체로 심각한 부작용은 유발하지 않는 매우 안전한 항암제라는 것을 증명하고 있다. 이는 환자 삶의 질적 향상이라는 현대 의학의 목적과도 일치하는 고무적인 임상 시험 결과이다. 그러나, 그 치료 효능은 아직은 다소 기대에 미치지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 추가적인 효능 개선이 지속적으로 필요한 실정이다.

가장 임상적용가능성이 높다는 평가를 받는 수지상세포 면역제제의 경우, 다양한 시도에도 여전히 임상적 실효를 낮은 원인 중의 하나는 암세포들이 가지고 있는 면역회피(immune escape) 기전 때문인 것으로 보고되고 있다. 암을 치료하고자 하기 위하여 암세포의 면역회피 기전에 대한 정확한 이해를 바탕으로 항암면역치료의 실효성을 증진시키는 방법을 모색하는 것이 무엇보다도 중요할 것으로 생각된다.

따라서, 항암면역내성 세포주에서 과발현되는 병리적 마커를 통해 암세포의 면역회피 현상을 탐색하여 암을 예방, 진단 또는 치료에 적용할 수 있는 지를 연구할 필요가 있다.

1. Premdass Ramdas et al. Cancer Genomics & Proteomics, 2011

본 발명의 목적은 항암면역내성 세포주에서 과발현되는 병리적 마커를 통해 암세포의 면역회피 현상을 탐색하여 암의 예방, 진단 또는 치료에 사용하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 내성인자를 이용하여 항암면역우회암 치료제를 스크리닝하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 저해제를 포함하고, 상기 저해제는 siRNA, 안티센스-올리고뉴클레오티드, shRNAi, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터인 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 대한 저해제를 포함하고, 상기 저해제는 상기 단백질에 대한 항체인 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 에피토프를 함유하는 면역세포를 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 항암면역우회암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 항암면역우회암의 병리적 마커로서 API5 유전자를 진단, 억제, 경감 등에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 항암면역우회암 치료제의 스크리닝에 사용할 수 있다.

또한, API5의 발현 및 관련 신호 경로의 PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6를 조절함으로써 항암면역우회암의 예방, 치료, 및 또는 보조치료 효능을 높여줄 것이다.

도 1은 다양한 인간 암세포주에서 본 발명의 인간 API5 단백질의 발현 여부를 나타낸 것이다.
도 2는 항암면역내성 세포주에서 API5 발현 여부를 나타낸 것이다.
도 3은 API5 발현에 따른 다양한 세포 신호 전달 단백질의 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 API5 발현에 따른 Bim 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 5는 API5를 과발현하는 마우스 자궁경부암 모델에서 시험관내 항암면역내성 획득을 확인한 결과이다.
도 6은 API5를 과발현하는 배아신장세포주에서 시험관내 항암면역내성 획득을 확인한 결과이다.
도 7은 API5 과발현에 따른 생체내 항암면역내성 획득을 확인한 결과이다.
도 8은 항암면역내성 세포주에서 API5 발현 저해를 통한 항암면역내성 감소를 확인한 결과이다.
도 9는 API5 발현 저하에 따른 항암제 내성 무력화를 확인한 결과이다.
도 10은 API5 발현 저하에 따른 방사선 내성을 조사한 결과이다.
도 11은 PKC 델타 저해제를 이용하여 항암면역내성 감소를 시험관내 실험으로 확인한 결과이다.
도 12는 ERK 저해제 및 PKC 델타 저해제를 이용하여 항암면역내성 감소를 확인한 결과이다.
도 13은 항암면역내성 세포주에서 면역억제능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 골수유래억제세포와 조절 T 세포의 생체 내 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 시험관 내와 생체 내 항암면역내성세포 유래의 면역억제 사이토카인의 농도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 항암면역내성세포 유래의 IL-6 의존적 골수유래억제세포의 생성을 시험관내에서 확인한 결과를 나타낸 것이다
도 17은 항암면역내성세포에서의 STAT3, ERK 의존적 IL-6 생성을 시험관 내에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 마우스 자궁경부암 모델에서 API5 유전자 과발현에 따른 STAT3, ERK 활성화와 IL-6 생성을 시험관 내에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 항암면역내성 세포주에서 API5 발현 저해를 통한 STAT3, ERK 활성화와 IL-6 생성의 감소를 시험관내에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 항암면역내성 세포주에서 API5 발현 저해를 통한 골수유래억제세포의 생성 감소를 시험관내 및 생체내에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 API5 유전자의 과발현에 의한 새로운 항암면역내성과 억제기작의 모식도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 저해제를 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서, "API5(Apoptosis inhibitor 5)"는 1997년 성장인자 없이도 세포사멸이 이루어 지지 않은 세포의 cDNA 분석을 통해 증가된 유전자로 발견되어 AAC-11이라고 명명되었다(Cancer Res . 1997, 57(18):4063-9). API5는 여러 암세포에서 암의 생존 증가에 관여한다고 보고되었는데, Acinus(ACIN1)과 물리적인 결합을 통해 Acinus 매개성 DNA 절편을 통한 세포사멸 유도를 억제하고 세포사멸 단백질인 Caspase-3의 활성을 막는다(EMBO J. 2009, 28(11):1576-88). 뿐만 아니라 E2F1에 유도되는 세포사멸을 효과적으로 억제하며 API5 발현을 저하하면 항암제의 세포독성이 증가하는 것을 확인하였다(PLoS Genet. 2006, 2(11):e196).

본 발명은 도 21을 참조하여 설명하면, 상기 API5 유전자가 PKC 델타를 통해 ERK를 활성화해 ERK의 활성화에 의해 세포사멸 단백질인 BIM의 발현을 감소하여 내성을 증가시킴으로써 항암면역우회암에서 과발현되는 항암면역내성 예측인자임을 최초로 밝혔다. 따라서, API5 및 관련 신호경로에 관여하는 인자들, 즉, API5, ERK, 또는 PKC 델타의 특이 저해제를 통해 이들을 억제하여 API5 매개성 항암치료내성을 무력화함으로써 항암면역치료의 항암효과를 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 API5 유전자가 ERK와 STAT3 활성화에 의한 IL-6 생성을 증가시켜 항암면역억제세포인 골수유래억제세포(Myeloid-derived suppressor cells)의 생성을 증가시킴으로써 항암면역우회암에서 과발현되는 항암면역억제 예측인자임을 최초로 밝혔다. 따라서, API5, STAT3 또는 IL-6 저해제를 통해 API5 유래의 항암면역우회암의 면역억제능을 무력화함으로써 항암면역치료의 항암효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 항암면역우회암의 예방, 억제 또는 경감을 포함한다.

본 명세서에서 "항암면역우회암"은 면역요법에 의한 항암치료 후 재발되어 내성이 생기고 면역억제능을 가진 암을 뜻한다. 상기 암의 종류로는 뇌종양, 척수종양, 망막 세포종, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암, 후두암, 경부암을 포함하는 두경부암, 피부암, 유방암, 갑상선암, 악성부신종양을 포함하는 유방암, 내분비암, 폐암, 흉막종양, 악성부신종양을 포함하는 호흡기암, 식도암, 위암, 소장의 악성종양, 대장암, 항문암, 간암, 담도암 또는 췌장암을 포함하는 소화기암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암 또는 음경암을 포함하는 비뇨기암, 자궁경부암, 자궁체부암, 융모상피암 또는 난소암을 포함하는 부인암, 급성 또는 만성 백혈병, 악성림프종 또는 다발성 골수증을 포함하는 혈액암, 골종양 또는 연부종양을 포함하는 골 또는 연부 종양, 및 소아 백혈병 또는 소아 고형종양을 포함하는 소아암 등일 수 있다.

본 발명의 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물은 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자의 발현 또는 그 발현 단백질의 발현을 감소시키거나, 기능 또는 활성을 감소시키는 물질을 포함할 수 있다.

상기 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자는 이들을 코딩하는 DNA 또는 이들로부터 전사되는 mRNA일 수 있다. 따라서, 유전자에 대한 저해제는 유전자 자체에 결합하여 전사를 방해하거나 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여 mRNA의 해독을 방해하는 저해제일 수 있다.

따라서, 상기 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자 저해제는 이들의 발현을 저해하는 저해제를 모두 포함한다. 이러한 저해제는 상기 유전자에 결합하는 펩타이드, 핵산 또는 화합물 등일 수 있다. 이러한 저해제는 세포 기반 스크리닝 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다.

한 구체예에서, 상기 저해제는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자에 대한 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있다. 이러한 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다.

본 명세서에서 "siRNA"는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.

상기 siRNA는 시험관내에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.

상기 siRNA는 바람직하게는 서열번호 3, 5, 7, 9 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, siRNA 서열은 표적부위로 인간 또는 마우스 유래의 API5 유전자, 예컨대, 인간 API5 유전자, GenBank Accession No. NM_006595, 즉, 서열번호 1의 서열을 표적으로 할 수 있다.

보다 구체적으로, 서열번호 3에 기재된 siRNA 서열은 서열번호 1의 134-156 nt를 표적으로 한다.

서열번호 5에 기재된 siRNA 서열은 서열번호 1의 175-197 nt를 표적으로 한다.

서열번호 7에 기재된 siRNA 서열은 서열번호 1의 1456-1473 nt를 표적으로 한다.

서열번호 9에 기재된 siRNA 서열은 서열번호 1의 1456-1473 nt를 표적으로 한다.

서열번호 11에 기재된 siRNA 서열은 서열번호 1의 1597-1615 nt를 표적으로 한다.

또한, 상기 안티센스는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 상기 암전이 유전자 또는 단편의 발현을 억제할 수 있다.

또한, 상기 shRNAi(short hairpin RNAi)는 인간 또는 마우스상의 shRNAi 공통 염기서열 부위를 표적으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "벡터"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.

본 발명의 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물은 API5 유전자가 PKC 델타 및 ERK 신호전달 경로를 통해 BIM의 합성에 관여하므로 BIM의 발현을 촉진하는 펩타이드 또는 화합물을 추가로 사용하여 항암면역우회암의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 이러한 펩타이드 또는 화합물은 단백질 구조 분석 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다.

상기 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 단백질 저해제는 상기 단백질들과 결합하여 API5와 관련된 신호 전달 경로의 신호를 조절하는 펩타이드 또는 화합물일 수 있다. 이러한 저해제는 단백질 구조 분석 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다. 예컨대, PD98059, 로트렐린(Rottlerin), SE1-201 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 단백질 저해제는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 단백질에 대한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다. 상기 항체를 이용하여 API5에 의한 신호 전달 경로의 신호 전달을 조절함으로써 항암면역우회암을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062(1995)); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다.

항체를 파파인 (papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 그 나머지인 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab ')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.

폴리클로날 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수 회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 문헌(Kohler et al.,Nature, 256:495 (1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌(Clackson et al ., Nature,352:624-628 (1991) 및 Marks et al ., J. Mol . Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본 발명에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체를 포함한다(Morrison et al ., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열) 이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간면역글로불린 영역의 일부를 포함한다 (Presta, Curr . Op . Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).

본 발명의 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 단백질 저해제는 리포솜, 바이러스, 유전자 건(gene gun), 폴리머(polymer), 초음파, 전기충격을 이용해 전달될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물은 하나 이상의 항암제 또는 당업자에게 잘 알려진 화학요법약제(chemotherapeutic agent)와 함께 사용될 수 있으며, 예를 들어, 화학요법약제는 시클로포스파미드, 아지리딘, 알킬알콘설포네이트, 나이트로소우레아, 다카르바진, 카르보플라틴, 시스플라틴 등과 같은 알킬화제(alkylating agent), 마이토마이신 C, 안트라사이클린, 독소루비신(아드리아마이신) 등과 같은 항생제, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 시타라빈 등과 같은 항대사제(antimetabolitic agent), 빈카 알칼로이드와 같은 식물유래 약제 및 호르몬 등이 될 수 있다.

본 발명의 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여 방법은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.

따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg∼10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 약학적 유효량의 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질 저해제를 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 항암면역우회암의 치료방법을 제공한다.

상기 항암면역우회암의 치료방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

한편, 상기 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.

본 발명은 또한 약학적 유효량의 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 억제제를 키토산 하이드로젤에 포함하여 종양에 직접 주입한 후 T세포의 입양전달(adoptive transfer)을 통한 면역치료를 병행하는 암 치료방법을 제공한다.

상기 ERK 억제제로 PD98059 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 PKC 델타 억제제로 로트렐린(Rottlerin) 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 STAT3 억제제로 SE1-201 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

본 발명은 또한 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 에피토프를 함유하는 면역세포를 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물은 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 단백질 또는 이의 에피토프를 함유하는 면역세포를 포함하고 있어 생체 내 면역반응을 증강하는 면역반응 증강용 조성물이거나, 면역반응을 유도함으로써 항암면역우회암을 예방 또는 경감할 수 있는 백신 조성물일 수 있다.

상기 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 단백질 또는 이의 에피토프를 포함하는 면역세포는 통상의 방법에 따라 단백질 또는 이의 에피토프를 감작시킨 것이거나, 형질전환방법을 통해 상기 단백질 또는 에피토프를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.

상기 API5 단백질은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 에피토프는 면역세포가 인식할 수 있는 펩타이드라면 특별히 제한하지 않는다. 예컨대, 서열번호 2에 기재된 아미노산 번호 49 내지 57 일 수 있다.

상기 면역세포는 수지상세포, T 세포, NK 세포, 또는 B 세포 등을 사용할 수 있다.

상기 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6는 암 조직 또는 세포에서 과발현되어 항암면역우회암의 진단 마커로 사용할 수 있으므로, 본 발명은 또한 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 항암면역우회암 진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 상기 "진단"이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 항암면역우회암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 항암면역우회암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 항암면역우회암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 항암면역우회암의 발병 여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

또한, 상기 진단용 마커(diagnosis marker)란 항암면역우회암의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상세포에 비하여 항암면역우회암 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 항암면역우회암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 항암면역우회암 세포에서 발현 양이 증가하는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자로부터 발현된 단백질일 수 있다.

상기 프로브는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질로, API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 핵산 프로브, 또는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 좋다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

상기 핵산 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O- 알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6에 특이적인 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있고, 상기 항체의 정의는 상술한 바와 같다.

본 발명의 항암면역우회암 진단용 조성물은 키트의 형태로 포함될 수 있다.

상기 키트는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있고, 이들의 정의는 상술한 바와 같다.

상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며,

상기 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명의 항암면역우회암 진단용 조성물은 마이크로어레이의 형태로 포함될 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합할 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지될 수 있고, 마이크로어레이 상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 항암면역우회암을 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 보다 구체적으로 상기 방법은, (a) 항암면역우회암 의심환자의 생물학적 시료로부터 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 항암면역우회암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성양은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 항암면역우회암 환자, 또는 항암면역우회암 의심환자에서의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 항암면역우회암의 발병여부, 진행단계 등을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 항암면역우회암의 진단방법은 본 발명에 따른 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가하였을 경우, 항암면역우회암이 유발된 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 또한 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 항암면역우회암 세포에 분석하고자 하는 후보물질을 접촉시킬 수 있다.

상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자 염기서열에서 mRNA, 단백질로의 전사, 번역을 촉진하거나 억제하는 물질 또는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 단백질의 기능 또는 활성을 증진하거나 억제하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

이후, 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소하는 것이 측정되면 상기 후보물질은 항암면역우회암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현량, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 유전자 발현을 억제하거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 후보물질 및 반대로 유전자 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 후보물질은, 전자의 경우, 항암면역우회암 치료제 후보물질이 될 수 있고, 후자의 경우는 후보물질에 대한 억제제를 개발함으로써 항암면역우회암 치료제 후보물질이 될 수 있다.

이와 같은 항암면역우회암 치료제 후보물질은 이후의 항암면역우회암 치료제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 촉진 또는 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 항암면역우회암 치료제를 개발할 수 있다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<제조예 1> 인간 API5 발현 벡터 제조

인간 자궁경부암 세포인 HeLa cDNA를 주형으로 하고, BglII-hAPI5 프라이머(5‘-GCAGATCTATGCCGACAGTAGAGGAGCT-3’), hAPI5-EcoRI(5‘- GCGAATTCCTACTTCCCCTGAAGGTC-3’)프라이머를 이용하여 변성(95℃, 30초), 어닐링(56℃, 30초), 신장(72℃, 2분) 그리고 35 사이클의 조건에서 PCR로 증폭하였다. pMSCV 벡터(clontech, USA)을 BglII과 EcoRI 제한효소(NEB, USA)로 처리하고, 상기 증폭된 후 BglII과 EcoRI 제한효소를 처리한 API5을 라이게이즈(바이오니아)으로 리게이션(ligation)하여 hAPI5를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. 상기 벡터를 pMSCV hAPI5로 명명하였다.

<제조예 2> 마우스 API5 발현 벡터 제조

TC-1 P3 A17 cDNA를 주형으로 하고, BglII-mAPI5 프라이머 (5‘-GCAGATCTATGCCGACGGTGGAGGAGC-3’), mAPI5-EcoRI(5‘- GCGAATTCGTATTTCCCCTGAAGG CTC-3’) 프라이머를 이용하여 변성(95℃, 30초), 어닐링(56℃, 30초), 신장(72℃, 2분)그리고 35 사이클의 조건에서 PCR로 증폭하였다.

pMSCV 벡터(clontech, USA)을 BglII과 EcoRI 제한효소(NEB, USA)로 처리한 후, 상기 증폭된 후 BglII과 EcoRI 제한효소를 처리한 API5을 라이게이즈(바이오니아)으로 리게이션(ligation)하여 mAPI5를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. 상기 벡터를 pMSCV mAPI5로 명명하였다.

<제조예 3> hAPI5를 발현하는 293Db 세포주 제조

제조예 1에서 제조한 각각의 벡터와 리포좀제제인 lipofectamin 2000(Invitrogen, MD, USA)을 부피비 1:2로 섞어 레트로바이러스 패키징(packaging)세포주인 피닉스 세포(phonenix, clontech)에 3시간 처리 후 혈청이 포함된 배양액을 첨가해 주어 형질도입 반응을 정지시켰다. 그 후 24시간 배양 후 퓨로마이신(Invitrogen, MD, USA)이 포함된 배양액으로 형질도입된 피닉스세포를 선택배양하였다. 선택된 세포들을 3~4일간 배양하여 배양액에서 얻은 바이러스를 amicon ultra-15 (millipore)을 이용하여 12000rpm에서 30분간 원심분리 하는 방법으로 농축한 500㎕의 농축액과 4㎍의 PEI(Polyethyleneimine; Sigma)를 혼합한 혼합액을 HEK293Db에 처리하여 형질도입시킴으로써 API5를 발현하는 HEK293Db/API5 세포주를 제조하였다.

<제조예 4> mAPI5를 발현하는 TC-1 P0 세포주 제조

제조예 2에서 제조한 각각의 벡터와 리포좀제제인 lipofectamin 2000(Invitrogen, MD, USA)을 부피비 1:2로 섞어 레트로바이러스 패키징(packaging) 세포주인 피닉스(phonenix)세포(clontech)에 3시간 처리 후 혈청이 포함된 배양액을 첨가해주어 형질도입을 정지시켰다. 그 후 24시간 배양 후 퓨로마이신(Invitrogen, MD, USA)이 포함된 배양액으로 형질도입된 피닉스세포를 선택배양하였다. 선택된 세포들을 3~4일간 배양하여 배양액에서 얻은 바이러스를 amicon ultra-15 (millipore)을 이용하여 12000rpm에서 30분간 원심분리 하는 방법으로 농축한 500㎕의 농축액과 4㎍의 PEI(Polyethyleneimine; Sigma)를 혼합한 혼합액을 TC-1 P0에 처리하여 형질도입 시킴으로써, API5 발현하는 TC-1/API5 세포주를 제조하였다.

<제조예 5> siRNA 제조

인간 API5 유전자에 대한 서열, GenBank Accession No. NM_006595에서 표적부위를 선정하고 siRNA를 제작하였다. 하기 표 1에 siRNA 서열과 표적부위를 나열하였다.

<실시예 1> 인간암세포주에서 API5 단백질 발현 조사

신장암세포주 HEK-293 세포주, 자궁경부암세포주 CaSki, HeLa, 유방암세포주 MCF7, MDA-231, 피부암세포주 A375P, A375SM 인간전립선암세포주인 Du145, PC3, 직장암세포주 SNU-C4, SNU-348, 간암세포주 HepG2, 대장암세포주 HCT116와 폐암세포주 A549를 RIPA 버퍼(Elpis, Korea)에 넣어 얼음에 30분간 정치시킨 후 냉장원심분리기에서 13000rpm 30분간 원심분리하고, 상층액만을 취하여 단백질 정량 후 30㎍의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 그 후 PVDF에 로딩된 젤을 트랜스퍼한 후 5% BSA 로 1시간 동안 블로킹한 후 API5 항체(santa cruz, USA)를 1:1000으로 희석한 후 인큐베이션 하였다. HRP가 부착된 2차 항체 반응과 세척과정을 거친 후 ECL용액을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 모든 인간 암 종에서 API5 단백질이 발현되었다.

또한, 항암면역내성 세포주인 TC-1 세포주에서 API5가 강하게 발현되었다(도 2).

<실시예 2> API5 발현에 따른 신호 전달 단백질들의 발현 조사

API5가 도입된 TC-1 세포주 HEK293Db/AP5 세포주, 인간 자궁경부암세포주인 HeLa 세포주에서 API5 발현과 관련하여 신호 전달 경로에 관여하는 단백질들의 발현 여부를 조사하였다.

이를 위해, TC-1/no insert와 TC-1/API5 세포주를 RIPA 버퍼(Elipis, Korea)에 넣어 얼음에 30분간 정치시킨 후 냉장 원심분리기에서 13000rpm 30분간 원심분리하고, 상층액만을 취하여 단백질 정량 후 50㎍의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 그 후 PVDF에 로딩된 젤을 트랜스퍼 한 후 5% BSA 로 1시간 동안 블로킹한 후 Akt, Erk, Stat3, p38 항체(Cell signaling, USA)를 1:1000으로 희석한 후 인큐베이션 하였다. HRP가 부착된 2차 항체 반응과 세척과정을 거친 후 ECL 용액을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, TC-1/API5 세포주 및 HEK293Db/AP5 세포주에서 PKC 델타, Erk 및 Stat3의 발현이 증가하였고, HeLa 세포주에서는 변화를 보이지 않았다.

<실시예 3> 단백질 생성 억제제 처리 후 Bim 단백질 확인

단백질의 생성을 억제하기 위하여 시클로헥시마이드(cycloheximide, Sigma, USA) 25μM을 TC-1/no insert와 TC-1/API5에 각각 처리한 후 0분, 5분, 15분, 30분, 60분, 90분 그리고 180분 후 RIPA 버퍼(Elipis, Korea)에 넣어 얼음에 30분간 정치시킨 후 냉장 원심분리기에서 13000rpm 30분간 원심분리하고, 상층액만을 취하여 단백질 정량 후 50㎍의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 그 후 PVDF에 로딩된 젤을 트랜스퍼 한 후 5% BSA로 1시간 동안 블로킹한 후 Bim 항체(Cell signaling, USA)를 1:1000으로 희석한 후 인큐베이션 하였다. HRP가 부착된 2차 항체 반응과 세척과정을 거친 후 ECL 용액을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, TC-1/API5 세포주에서 Bim의 발현이 적었으며 분해 또한 빠름을 확인하였다.

<실시예 4> CD8+ 세포독성 T세포의 시험관내 항암면역내성 획득 확인

API5 유전자의 항암면역 내성에 대해 조사하기 위해 상기 제조예 3 및 제조예 4에서 제조한 TC-1/API5 및 293Db/SCP3 세포주를 이용하여 항암면역내성 실험을 수행하였다.

먼저 CFSE(Carvoxyfluorescein succinimidyl ester)를 이용하여 TC-1/no insert, TC-1/API5 세포주에 표식한 후, E7 특이적인 CTL(cytotoxic T-lymphocyte)을 1:1 비율로 섞어준 후 CFSE 표식이 된 TC-1/no insert, TC-1/API5 세포주에서의 활성 카스파제-3(active-caspase-3)를 FACS를 통해 관찰하였다.

CFSE 표식이 된 293Db/no insert와 293Db/API5는 1㎍/mL의 E7 펩타이드(서열번호 2에 기재된 아미노산 번호 49-57, RAHYNIVTF)를 1시간 동안 자극을 준 후 E7 특이적인 CTL을 1:5 비율로 섞어 주었다. CFSE 표식이 된 293Db/no insert와 293Db/API5를 활성 카스파제-3(active-caspase-3)를 FACS를 통해 관찰하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, API5를 과발현하는 자궁경부암 세포주는 T세포의 공격에 대해 내성을 가짐을 알 수 있었다. 또한, API5를 과발현하는 인간배아신장세포 293Db 세포주 역시 T세포의 공격에 대해 내성을 가짐을 알 수 있었다(도 6).

<실시예 5> CD8+ 세포독성 T세포를 이용한 생체내 항암면역내성 획득 확인

TC-1/no insert와 TC-1/API5를 C57BL/6 생쥐군(암컷, 5주령, n=5, 대한바이오링크) 각각의 복부 표피에 1×10⁵개씩 주입하고, 주입 7일째에 E7 특이적인 CD8+ T세포를 IL-2와 함께 정맥주사하여 면역하였다. 각각의 생쥐에 대하여 종양체적을 종양세포 주입 7일, 11일, 13일, 15일, 18일, 20일 그리고 22일째에 캘리버(caliber; Mitutoyo, Japan)으로 측정하여, 종양체적은 (단축×장축²)/2의 식으로 구하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, E7 특이적인 CD8+ T세포가 주입된 (-▽-) 그룹과 같이 API5 종양이 생체내 항암면역 내성을 획득함을 확인하였다.

<실시예 6> siRNA를 처리에 따른 항암면역내성 무력화 확인

항암면역내성 세포주에서 siRNA를 처리에 따른 항암면역내성 무력화를 확인하기 위해, 서열번호 9에 기재된 siRNA를 100pmol 농도로 처리한 후 활성 카스파제-3(active-caspase-3)를 FACS를 통해 관찰하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, siAPI5 처리 시 활성 카스파제-3의 활성이 증가하여 항암면역내성이 무력화되었음을 알 수 있었다.

<실시예 7> siRNA를 처리한 후 항암제 내성에 대한 조사

본 발명의 API5 유전자가 항암제 내성을 무력화하는지를 조사하기 위해 HeLa 인간 자궁경부암 세포주를 이용하여 항암제 내성 실험을 수행하였다. siRNA로 인간 API5 표적부위 1597-1615의 센스 siRNA(서열번호 11)를 사용하고, 항암제 시스플라틴을 3.75, 15, 50μM 농도로 처리하고, 싸이클로포스파마이드(Cyclophosphamide, CTX)를 0.43, 1.75, 7μM 농도로 각각 처리한 후 24시간 후에 MTT 시약을 첨가하고 4시간 후 450nm의 파장에서 ELISA를 통해 그 수치를 확인하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, siRNA를 처리하여 API5의 발현을 저하시킨 경우 대조군인 녹색형광단백질(GFP)의 siRNA를 처리한 인간 자궁경부암 세포주는 항암제 처리 시 생존능에는 거의 영향을 미치지 않았으나, API5의 siRNA를 처리한 경우에는 항암제 농도 의존적으로 항암제 내성이 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 8> siRNA를 처리한 후 방사선 내성 조사

본 발명의 API5 유전자가 방사선 내성을 무력화하는지를 조사하기 위해 HeLa 인간 자궁경부암 세포주를 이용하여 방사선 내성 실험을 수행하였다. siRNA로 인간 API5 표적부위 1597-1615의 센스 siRNA(서열번호 11)를 사용하고, 방사선을 2,4,8 그래이(Gray)로 각각 조사한 후 24시간 후 MTT 시약을 첨가한 후 4시간 경과 후 450nm의 파장에서 ELISA를 통해 그 수치를 확인하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, siAPI5 처리에 따른 방사선 내성 무력화 효과는 거의 나타나지 않았다.

<실시예 9> PKC 델타 억제제를 처리한 후 시험관내 항암면역내성 무력화 확인

TC-1/API5 세포주를 이용하여 PKC 델타 억제제(Rottlerin)를 처리한 후 항암면역내성 무력화 여부를 실험하였다. 이를 위해, CFSE(Carvoxyfluorescein succinimidyl ester)를 이용하여 TC-1/no insert, TC-1/API5 세포주에 표식한 후, 농도 별 PKC 델타 억제제(Rottlerin)(10, 100, 1000nM)하에서 E7 특이적인 CTL(cytotoxic T-lymphocyte)을 1:1 비율로 섞어준 후 CFSE 표식이 된 TC-1/no insert, TC-1/API5 세포주에서의 활성 카스파제-3(active-caspase-3)를 FACS를 통해 관찰하였다.

대조군으로 siAPI5 처리한 HeLa 세포주를 사용하여 SCT-E7 특이적인 CTL과 반응시킨 후 CFSE 표식이 된 HeLa 세포주에서의 활성 카스파제-3를 관찰하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, PKC 델타 억제제의 농도 의존적으로 활성 카스파제-3를 발현하는 세포사멸성 종양세포 수가 증가하였다.

<실시예 10> 생체내 항암면역내성 무력화 확인

TC-1/API5를 C57BL/6 생쥐군(암컷, 5주령, n=5, 대한바이오링크) 각각의 복부 표피에 1×10⁵개씩 주입하고, 주입 7일째에 ERK 억제제(PD98059), PKC 델타 억제제(Rottlerin)를 포함한 키토산 하이드로젤을 종양 내에 직접 주입하고 3일 후 E7 특이적인 CD8+ T세포를 IL-2와 함께 정맥주사하여 면역하였다. 각각의 생쥐에 대하여 종양체적을 캘리버(caliber; Mitutoyo, Japan)으로 측정하여, 종양체적은 (단축×장축²)/2의 식으로 구하였다.

도 12에서 나타난 바와 같이 ERK 억제제와 PKC 델타 억제제를 처리하고 E7 특이적인 CD8+ T세포를 함께 주입하였을 때 종양체적이 감소하여 항암면역내성이 무력화되는 것을 확인하였다.

<실시예 11> 항암면역내성 세포주에서 면역억제능의 증가를 확인

본 발명은 항암면역내성 세포주의 면역억제능에 대해 조사하기 위해 Tc-1 P0와 TC-1 A17을 C57BL/6 생쥐군(암컷, 6주령, n=5, 대한바이오링크) 각각의 복부 표피에 1×10⁵개씩 주입하고 1주, 2주째에 생쥐 골수 유래의 수지상 세포 1×10⁶개를 1㎍/mL 농도의 OVA 펩타이드(RAHYNIVTF, Peptron, seoul, Korea)에 감작시킨 후 50㎕의 OPTI-MEM 배지(Invitrogen, MD, USA)에 현탁하여 발바닥에 주사하였다. 3주째에 생쥐의 비장세포 내 OVA 특이적 CD8+ T 세포의 개수를 OVA-테트라머와 IFN 항체를 이용하여 FACS 로 분석하였다.

도 13에 나타난 바와 같이, OVA 특이 사이토카인의 함량은 대조군에 비해 낮았고, 세포독성 T 세포 수 역시 낮았다.

<실시예 12> 항암면역억제세포(골수유래억제세포(MDSC), 조절 T 세포(Treg))의 생체내 증가 확인

TC-1 P0와 TC-1 A17(TC-1P3) 그리고 TC-1 no insert와 TC-1 API5를 실시예 11과 같이 주입한 후 2주째에 생쥐의 비장, 림프절, 종양조직에 존재하는 골수유래억제세포(MDSC)와 조절 T 세포(Treg)를 Gr1/CD11b 와 CD4/Foxp3 항체를 각각 이용해 FACS로 확인하였다.

도 14에 나타난 바와 같이, TC-1 A17(TC-1P3) 세포주는 비장과 종양조직에서 골수유래억제세포(MDSC) 수가 증가하였고, 조절 T 세포(Treg)는 비장에서는 감소하였고, 종양조직에서는 약간 높았다.

<실시예 13> 시험관 내와 생체 내 사이토카인의 정량

TC-1 P0와 TC-1 A17 그리고 TC-1 no insert와 TC-1 API5를 실시예 10의 방법으로 주입 후 3주째에 생쥐의 혈액으로부터 얻은 혈청(Serum) 내 사이토카인의 농도를 mouse inflammation CBA kit(BD bioscience USA)를 이용하여 측정하였다. 시험관 내 사이토카인의 농도 측정은, TC-1 P0와 TC-1 A17 2×10⁵씩 60m 배양접시에 24시간 배양 후 OPTI-MEM 배지 2mL로 교환 후 16시간 배양한 배지를 1500rpm 5분간 원심분리한 후 얻은 상등액을 inflammation CBA kit를 이용하여 사이토카인의 농도를 측정하였다.

도 15에 나타난 바와 같이, TC-1 A17 세포주에서 시험관 내 및 생체 내에서 면역억제 사이토카인인 IL-6 및 IL-10의 높은 함량을 나타냈다.

<실시예 14> 항암면역내성 세포주 유래 IL-6 의존적 골수유래세포 형성 증가 확인

생쥐의 비장을 분리한 후, RBC 라이시스 완충액을 넣어 2분간 처리한 후 원심분리하여 5×10⁵씩 GM-CSF 20ng, IL-4 20ng, FBS 10%, 그리고 TC-1 A17를 2×10⁵씩 60m 배양접시에 24시간 배양 후 OPTI-MEM 배지 2mL로 교환 후 16시간 배양한 배지를 1500rpm 5분간 원심분리한 후 얻은 상등액이 포함된 RPMI 배지를 첨가하여 60m 배양접시에 4일간 배양한다 4일째 IL-6 중화항체 100ng을 넣고(BD bioscience) 1일간 배양 후 골수유래억제세포의 형성을 FACS로 확인하였다.

도 16에 나타난 바와 같이 TC-1 A17 유래의 상등액의 IL-6를 중화시킴에 따라 골수유래억제세포의 형성이 감소하였다.

<실시예 15> 항암면역내성 세포주 유래 IL-6 의존적 골수유래세포 형성 증가 확인

ERK 억제제(PD98059)와 STAT3 억제제(SE1-201)에 의해서 항암면역내성세포에서의 IL-6의 형성이 조절되는지 확인하였다. TC-1 API5를 2×10⁵씩 60mm 배양접시에 24시간 배양 후 농도별 ERK 와 STAT3 억제제(0, 10, 50μM)하에서 상등액내의 IL-6의 농도를 inflammation CBA kit를 이용하여 사이토카인의 농도를 측정하였다.

도 17에 나타난 바와 같이 항암면역내성세포에서 ERK 와 STAT3 억제에 의해 IL-6의 형성이 감소함을 확인하였다.

<실시예 16> API5 과발현 자궁경부암 모델에서의 IL-6 의 형성 증가 확인

시험관 내 사이토카인의 농도 측정은, TC-1 no insert와 TC-1 API5 2×10⁵씩 60m 배양접시에 24시간 배양 후 OPTI-MEM 배지 2mL로 교환 후 16시간 배양한 배지를 1500rpm 5분간 원심분리한 후 얻은 상등액을 inflammation CBA kit를 이용하여 사이토카인의 농도를 측정하였다.

도 18에 나타난 바와 같이, TC-1 API5 자궁경부암 모델에서 시험관 내 IL-6가 높은 함량을 나타냈다.

<실시예 17> API5 발현 억제제에 의한 ERK 및 STAT3의 활성 저해와 IL-6 형성 감소 확인

본 발명의 API5 유전자가 ERK 및 STAT3 활성화를 조절하여 IL-6 형성에 관여하는지 조사하기 위해 항암면역내성세포주 TC-1 A17을 이용하여 실험을 수행하였다. siRNA로 인간 API5 표적부위 1597-1615의 센스 siRNA(서열번호 11)를 사용하였다.

TC-1 A17 세포주를 RIPA 버퍼(Elipis, Korea)에 넣어 얼음에 30분간 정치시킨 후 냉장 원심분리기에서 13000rpm 30분간 원심분리하고, 상층액만을 취하여 단백질 정량 후 50㎍의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 그 후 PVDF에 로딩된 젤을 트랜스퍼 한 후 5% BSA로 1시간 동안 블로킹한 후 활성 Erk, 활성 Stat3 항체(Cell signaling, USA)를 1:1000으로 희석한 후 인큐베이션 하였다. HRP가 부착된 2차 항체 반응과 세척과정을 거친 후 ECL 용액을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하였다 그리고 IL-6의 형성을 inflammation CBA kit를 이용하여 사이토카인을 측정하였다.

도 19에 나타난 봐와 같이 API5의 발현 억제에 의해서 ERK와 STAT3의 활성이 감소하였다. 또한 IL-6의 형성이 감소하였다.

<실시예 18> API5 발현 억제에 의한 골수유래억제세포의 형성 감소 확인

본 발명의 API5 유전자가 골수유래억제세포의 형성을 조절하는지 조사하기 위해 항암면역내성세포주 TC-1 A17을 이용하여 시험관 내 그리고 생체 내 실험을 수행하였다. 그리고 API5의 발현억제는 siRNA로 인간 API5 표적부위 1597-1615의 센스 siRNA(서열번호 11)를 사용하였다. 시험관내 실험을 위해 TC-1 A17을 2×10⁵씩 60m 배양접시에 24시간 배양 후 서열번호 9에 기재된 siRNA를 100pmol 농도로 처리한 후 48시간 배양 후 OPTI-MEM 배지 2mL로 교환 후 16시간 배양한 배지를 1500rpm 5분간 원심분리한 후 얻은 상등액을 실시예 14의 실험과 같이 골수유래세포 형성을 유도한 후 FACS로 확인하였다. 생체내 API5 의존적 골수유래세포의 형성을 확인하기 위하여 TC-1 A17을 C57BL/6 생쥐군(암컷, 6주령, n=5, 대한바이오링크) 각각의 복부 표피에 1×10⁵개씩 주입하고 1주 후 키토산 2mg/ml용액 100ml에 API5 표적부위 1697-1615의 siRNA 7ug을 혼합하여 만든 나노파티클(nanoparticle)를 꼬리정맥으로 3일 간격으로 3번 주입하였다.

도 20에서 나타난 바와 같이 API5 발현 저하로 인한 생체 내 및 시험관 내 골수유래억제세포의 형성이 감소하였다.

<110> Korea University Industrial & Academic Collaboration Foundation <120> Apoptosis inhibitor 5 as biomarker associated with immune escape and resistance for cancer immunotherapy and use thereof <130> P111016 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1515 <212> DNA <213> Homo sapiens Apoptosis inhibitor 5 <400> 1 atgccgacag tagaggagct ttaccgcaat tatggcatcc tggccgatgc cacggagcaa 60 gtgggccagc ataaagatgc ctatcaagtg atattggatg gtgtgaaagg tggtactaag 120 gaaaagcgat tagcagctca atttattccg aaattcttta agcattttcc agaattggct 180 gattctgcta tcaatgcaca gttagacctc tgtgaggatg aagatgtatc tattcgacgt 240 caagcaatta aagaactgcc tcaatttgcc actggagaaa atcttcctcg agtggcagat 300 atactaacgc aacttttgca gacagatgac tctgcagaat ttaacctagt gaacaatgcc 360 ctattaagta tatttaaaat ggatgcaaaa gggactttag gtgggttgtt cagccaaata 420 cttcaaggag aggacattgt tagagaacga gcaattaaat tcctttctac aaaacttaag 480 actttaccag atgaagtctt aacaaaggaa gtggaagagc ttatactaac tgaatccaaa 540 aaggtcctag aagatgtgac tggtgaagaa tttgttctat ttatgaagat actgtctggg 600 ttaaaaagct tacagacagt gagtggaaga cagcaacttg tagagttggt ggctgaacag 660 gccgacctag aacagacctt caatccctcg gatcctgact gtgtggacag gctcttacag 720 tgcactcggc aggcagtacc cctcttctct aaaaatgtcc attccacaag gtttgtgaca 780 tatttctgtg agcaggttct ccctaacctc ggtaccttga ctaccccagt ggaaggtctt 840 gatatacagt tggaggtatt gaaattgttg gcggagatga gttcattttg tggtgacatg 900 gaaaaactag aaacaaattt aaggaaacta tttgataagt tattggaata catgcccctc 960 cctccagaag aggcagaaaa tggagagaat gctggtaatg aagaacccaa gctacagttc 1020 agttatgtgg aatgtttgtt gtacagtttt caccagttgg gccgaaaact tccagatttc 1080 ttaacagcca aactgaatgc agaaaagctc aaagatttca aaatcaggct gcagtacttt 1140 gcacggggcc tgcaagttta tatcagacaa cttcgcttag ctctccaggg taaaacgggt 1200 gaggccttaa aaacagaaga gaacaagatt aaagtcgttg cattgaaaat aacaaacaat 1260 atcaatgttt taatcaagga tctcttccac attcctcctt cttataagag cacagtaaca 1320 ctatcctgga aacctgtaca aaaggttgag attgggcaaa agagagccag tgaagataca 1380 acttcaggtt caccacccaa gaaatcttca gcaggaccaa aaagagatgc caggcagatt 1440 tataaccctc ccagtgggaa atatagcagc aatttgggca actttaatta tgagaggagc 1500 cttcagggga agtag 1515 <210> 2 <211> 504 <212> PRT <213> Homo sapiens Apoptosis inhibitor 5 <400> 2 Met Pro Thr Val Glu Glu Leu Tyr Arg Asn Tyr Gly Ile Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Thr Glu Gln Val Gly Gln His Lys Asp Ala Tyr Gln Val Ile Leu 20 25 30 Asp Gly Val Lys Gly Gly Thr Lys Glu Lys Arg Leu Ala Ala Gln Phe 35 40 45 Ile Pro Lys Phe Phe Lys His Phe Pro Glu Leu Ala Asp Ser Ala Ile 50 55 60 Asn Ala Gln Leu Asp Leu Cys Glu Asp Glu Asp Val Ser Ile Arg Arg 65 70 75 80 Gln Ala Ile Lys Glu Leu Pro Gln Phe Ala Thr Gly Glu Asn Leu Pro 85 90 95 Arg Val Ala Asp Ile Leu Thr Gln Leu Leu Gln Thr Asp Asp Ser Ala 100 105 110 Glu Phe Asn Leu Val Asn Asn Ala Leu Leu Ser Ile Phe Lys Met Asp 115 120 125 Ala Lys Gly Thr Leu Gly Gly Leu Phe Ser Gln Ile Leu Gln Gly Glu 130 135 140 Asp Ile Val Arg Glu Arg Ala Ile Lys Phe Leu Ser Thr Lys Leu Lys 145 150 155 160 Thr Leu Pro Asp Glu Val Leu Thr Lys Glu Val Glu Glu Leu Ile Leu 165 170 175 Thr Glu Ser Lys Lys Val Leu Glu Asp Val Thr Gly Glu Glu Phe Val 180 185 190 Leu Phe Met Lys Ile Leu Ser Gly Leu Lys Ser Leu Gln Thr Val Ser 195 200 205 Gly Arg Gln Gln Leu Val Glu Leu Val Ala Glu Gln Ala Asp Leu Glu 210 215 220 Gln Thr Phe Asn Pro Ser Asp Pro Asp Cys Val Asp Arg Leu Leu Gln 225 230 235 240 Cys Thr Arg Gln Ala Val Pro Leu Phe Ser Lys Asn Val His Ser Thr 245 250 255 Arg Phe Val Thr Tyr Phe Cys Glu Gln Val Leu Pro Asn Leu Gly Thr 260 265 270 Leu Thr Thr Pro Val Glu Gly Leu Asp Ile Gln Leu Glu Val Leu Lys 275 280 285 Leu Leu Ala Glu Met Ser Ser Phe Cys Gly Asp Met Glu Lys Leu Glu 290 295 300 Thr Asn Leu Arg Lys Leu Phe Asp Lys Leu Leu Glu Tyr Met Pro Leu 305 310 315 320 Pro Pro Glu Glu Ala Glu Asn Gly Glu Asn Ala Gly Asn Glu Glu Pro 325 330 335 Lys Leu Gln Phe Ser Tyr Val Glu Cys Leu Leu Tyr Ser Phe His Gln 340 345 350 Leu Gly Arg Lys Leu Pro Asp Phe Leu Thr Ala Lys Leu Asn Ala Glu 355 360 365 Lys Leu Lys Asp Phe Lys Ile Arg Leu Gln Tyr Phe Ala Arg Gly Leu 370 375 380 Gln Val Tyr Ile Arg Gln Leu Arg Leu Ala Leu Gln Gly Lys Thr Gly 385 390 395 400 Glu Ala Leu Lys Thr Glu Glu Asn Lys Ile Lys Val Val Ala Leu Lys 405 410 415 Ile Thr Asn Asn Ile Asn Val Leu Ile Lys Asp Leu Phe His Ile Pro 420 425 430 Pro Ser Tyr Lys Ser Thr Val Thr Leu Ser Trp Lys Pro Val Gln Lys 435 440 445 Val Glu Ile Gly Gln Lys Arg Ala Ser Glu Asp Thr Thr Ser Gly Ser 450 455 460 Pro Pro Lys Lys Ser Ser Ala Gly Pro Lys Arg Asp Ala Arg Gln Ile 465 470 475 480 Tyr Asn Pro Pro Ser Gly Lys Tyr Ser Ser Asn Leu Gly Asn Phe Asn 485 490 495 Tyr Glu Arg Ser Leu Gln Gly Lys 500 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense sequence for targetting API5 399-421 nt <400> 3 guggguuguu cagccaaauu u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense sequence for targetting API5 134-156 nt <400> 4 uucacccaac aagucgguuu a 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense sequence for targetting API5 134-156 nt <400> 5 gcucaauuua uuccgaaauu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense sequence for targetting API5 134-156 nt <400> 6 uucgaguuaa auaaggcuuu a 21 <210> 7 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense sequence for targetting API5 175-197 nt <400> 7 uuacugugcu cuuauaagga gguu 24 <210> 8 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense sequence for targetting API5 175-197 nt <400> 8 uuccuccuua uaagagcaca guaa 24 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense sequence for targetting API5 1285-1307 nt <400> 9 ccacauuccu ccuucuuauu u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense sequence for targetting API5 1285-1307 nt <400> 10 uugguguaag gaggaagaau a 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense sequence for targetting API5 237-257 nt <400> 11 gagagccagu gaagauacau u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA antisense sequence for targetting API5 237-257 nt <400> 12 uuuguaucuu cacuggcucu c 21

Claims (10)

1. API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 저해제를 포함하고, 상기 저해제는 siRNA, 안티센스-올리고뉴클레오티드, shRNAi, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터인 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   siRNA는 서열번호 3, 5, 7, 9 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물.
   
3. API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 대한 저해제를 포함하고, 상기 저해제는 상기 단백질에 대한 항체인 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물.
   
4. API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 에피토프를 함유하는 면역세포를 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   면역세포는 단백질 또는 이의 에피토프로 감작된 면역세포이거나, 단백질 또는 이의 에피토프를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 면역세포인 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물.
   
6. 제4항에 있어서,
   면역세포는 수지상세포, T 세포, NK 세포 및 B 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 조성물.
   
7. API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 항암면역우회암 진단용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   프로브는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 물질로, 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 핵산 프로브, 또는 API5, PKC 델타, ERK, STAT3 또는 IL-6에 특이적인 항체를 포함하는 항암면역우회암 진단용 조성물.
   
9. API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
   
10. API5((Apoptosis Inhibitor 5), PKC 델타(Protein Kinase C delta), ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase), STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 IL-6(Interleukin-6)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암면역우회암의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.

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