TW201632207A - 細胞穿透抗體 - Google Patents
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Abstract
本文中提供細胞穿透結合物。該等結合物包括非細胞穿透蛋白質,其係經由包括生物素結合結構域及生物素結構域之非共價連接子連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架,其中,該硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架增強該非細胞穿透蛋白質之細胞內遞送。亦提供包含該等結合物之組成物及套組。
Description
本申請案主張2015年1月16日申請之美國專利申請案第62/104,653號之權益,該專利申請案係以全文引用之方式併入在此。
本發明係使用由國立衛生研究院授予之許可號CA122976之支援來進行。政府享有本發明之某些權利。
已證明相對於諸如小分子藥物之其他類型藥物,抗體因其容易生產、特異性及生物持久性而成為有效藥物形態。當前之抗體療法僅可靶向細胞外分子。然而,許多用於疾病治療及疾病診斷之重要標靶在細胞內。舉例而言,許多轉錄因子,諸如STAT3,對於癌症療法而言為最關鍵卻具挑戰性之標靶。本文中提供針對此技術領域中之此等及其他需要之解決方案。
在一個態樣中,提供一種細胞穿透結合物。該細胞穿透結合物包括(i)非細胞穿透蛋白質;(ii)硫代磷酸酯核酸;及(iii)連接該硫代磷酸酯核酸與該非細胞穿透蛋白質之非共價連接子。該非共價連接子包括非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域,且該硫代磷酸酯核酸增強該非細胞穿透蛋白質之細胞內遞送。
在另一態樣中,提供一種形成細胞穿透結合物之方法。該方法包括使非細胞穿透蛋白質與硫代磷酸酯核酸接觸,其中該非細胞穿透蛋白質連接於生物素結合對之第一成員且該硫代磷酸酯核酸連接於該生物素結合對之第二成員,從而形成細胞穿透結合物,該細胞穿透結合物包括位於生物素結構域與生物素結合結構域之間的非共價鍵。
在另一態樣中,提供一種細胞,其包括本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)。
在另一態樣中,提供一種醫藥組成物,其包括本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中,提供一種套組,其包括本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)或如本文中所提供之醫藥組成物(包括其實施例)及使用說明。
在另一態樣中,提供一種向細胞中遞送非細胞穿透蛋白質之方法。該方法包括使該細胞與如本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)接觸。
在另一態樣中,提供一種治療有需要之個體之疾病的方法。該方法包括向個體投與有效量之如本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例),從而威脅該個體之該疾病。
第1圖:結合方案:抗生物素蛋白(avidin)與抗體/肽及生物素-寡聚物與抗生物素蛋白。(1)IgG之抗生物素蛋白化;(2)添加生物素化遞送實體(亦即,PS-寡聚物)。作為抗生物素蛋白之替代物,可使用鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)(或抗生物素蛋白衍生物);鏈黴抗生物素蛋白提供接受4個生物素之機會,而抗生物素蛋白僅接受1個生物素。PS:硫代磷酸酯。
第2圖:純化方案:抗生物素蛋白/生物素驅動之結合增加分子量,從而使得能夠純化經修飾之抗體
第3圖:DNA-寡聚物經由抗生物素蛋白-生物素與抗體蛋白質非共價鍵聯,使得抗體/蛋白質能夠進行細胞穿透/抗原識別。將人類神經膠質瘤U251細胞與如所指示之經修飾之抗STAT3抗體一起以10mg/ml培育1h。製備全細胞溶解產物且清除其中之細胞碎片,隨後添加瓊脂糖珠粒且與溶解產物一起在4℃振盪培育隔夜。藉由SDS-PAGE分離蛋白質,轉移至硝化纖維膜上,且用抗體探測STAT3蛋白。Av:抗生物素蛋白;SAv:鏈黴抗生物素蛋白;B:生物素;PO:磷酸酯;PS:硫代磷酸酯。
第4A圖和第4B圖:直接比較硫代磷酸酯
化DNA-寡聚物相對於PEG化經由生物素-抗生物素蛋白/鏈黴抗生物素蛋白與抗體蛋白質連接之細胞穿透及細胞內標靶識別。DNA-寡聚物經由抗生物素蛋白-生物素與抗體蛋白質非共價鍵聯,其優於抗體PEG化。人類神經膠質瘤U251細胞與如所指示之經修飾之抗STAT3抗體(兔)一起以10mg/ml培育1h。第4A圖製備單細胞懸浮液且藉由以流式細胞測量術進行分析之細胞內染色程序來評估兔IgG。第4B圖製備全細胞溶解產物且清除其中之細胞碎片,隨後添加瓊脂糖珠粒且與溶解產物一起在4℃振盪培育隔夜。藉由SDS-PAGE分離蛋白質,轉移至硝化纖維膜上且探測S'TAT3蛋白。PEG:聚乙二醇。
第5A圖及第5B圖:DNA-寡聚物與抗體非DNA寡聚物蛋白之非共價鍵聯優於由乙烯碸化學性質驅動之共價鍵聯。將如所指示之10μg/ml抗體與U251細胞(A:6孔板;BC:12孔板)一起培育1h,用PBS洗滌且製備溶解產物;向澄清溶解產物中添加瓊脂糖珠粒且進行WB。
第6圖:經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-DNA寡聚物結合之經修飾之抗STAT3抗體能夠進行細胞穿透及標靶識別。
第7A圖及第7B圖:經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-DNA寡聚物(20聚體)結合之經修飾之抗STAT3抗體在細胞穿透方面最有效。
第8A圖及第8B圖:經由鏈黴抗生物素蛋
白/生物素與PS-DNA寡聚物(20聚體)結合之經修飾之抗STAT3抗體能夠進行細胞穿透。
第9A圖及第9B圖:經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-DNA寡聚物(20聚體)結合之經修飾之抗STAT3抗體能夠進行細胞穿透。
第10圖:小鼠B16黑素瘤在用經修飾之抗T-Bet抗體治療後之腫瘤生長。在第0天將1×105個B16腫瘤細胞經皮下注入C57/BL6小鼠中,隨後自第7天開始局部投與媒劑(PBS)、經修飾之對照(IgG)及T-bet抗體(10ug/劑量)。每隔一天給與抗體治療。以SD顯示;T檢驗:***)P<0.001。
第11圖:經修飾之T-Bet抗體增強腫瘤中表現IFNγ之CD4+及CD8+ T細胞。藉由流式細胞測量術分析B16腫瘤相關淋巴細胞之CTL成熟及Th1群體以及CD4+ T細胞之T-bet表現。
第12A圖及第12B圖:T-Bet抗體促進腫瘤部位之DC功能。以流式細胞測量術分析用PBS、未經修飾之T-Bet、經PO或PS修飾之T-Bet抗體治療之CD3+或CD3-腫瘤相關淋巴細胞中之T-Bet抗體吸收(第12A圖)及此等群組中之CD11c+ DC中的CD86、MHC II表現(第12B圖)。
第13圖:細胞穿透FoxP3抗體之特異性。將10μg/ml經修飾之抗體(同型或α Foxp3)與自Foxp3-GFP轉殖基因小鼠中新分離之脾細胞(2×106個/ml)一起培養2
小時,並且收集所有細胞且進行流式細胞測量術分析。
第14圖:藉由細胞穿透抗體靶向FoxP3減少腫瘤相關之Tregs及腫瘤生長。經皮下注入20萬個B16腫瘤細胞,隨後在一天後經靜脈內投與經修飾之對照(IgG)及Foxp3抗體(10ug/小鼠)。每隔一天再經全身給與四次抗體治療直至第11天(注意:第11天之後不再進行治療)。在第20天,對所有動物施以安樂死且藉由梯度離心來分離腫瘤淋巴細胞。隨後固定腫瘤浸潤淋巴細胞並且通透化以便對FoxP3及CTLA4進行細胞內染色。
定義
儘管本文中顯示並描述本發明之各種實施例及態樣,但熟習此技術領域者將顯而易見地瞭解該等實施例及態樣僅以實例方式提供。熟習此技術領域者將在不背離本發明之情況下想到許多變更、變化及取代。應理解,本文中所描述之本發明實施例之各種替代方案可用於實施本發明。
本文中所使用之章節標題僅出於組織目的且不應被視為限制所描述之標的物。本申請案中所引用之所有文件或文件之部分,包括,但不限於,專利、專利申請案、論文、書籍、手冊及專著係出於任何目的以全文引用之方式明確併入在此。
本文中所使用之縮寫具有其在化學及生物學技術內之習知含義。本文中所闡述之化學結構及化學式
係根據化學技術中已知的化學價的標準規則而構建。
除非另外定義,否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與熟習此技術領域者所理解之含義相同的含義。參見例如Singleton等,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY第2版,J.Wiley & Sons(New York,NY 1994);Sambrook等,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。與本文中所描述者類似或等效之任何方法、裝置及材料均可用於實施本發明。提供以下定義以有助於理解本文中頻繁使用之某些術語而非意在限制本發明之範疇。
本文中所使用之「核酸」或「寡核苷酸」或「聚核苷酸」或語法等效物意謂共價連接在一起之至少兩個核苷酸。術語「核酸」係指呈單股或雙股形式之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物,或其互補序列。術語「聚核苷酸」係指核苷酸之線性序列。術語「核苷酸」典型地係指聚核苷酸之單一單元,亦即,單體。核苷酸可為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或其經修飾型式。本文中所涵蓋之聚核苷酸之實例包括單股及雙股DNA、單股及雙股RNA(包括siRNA)以及具有單股及雙股DNA及RNA之混合物的雜合分子。該術語亦涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾骨架殘基或鍵聯之核酸,其為合成、天然存在及非天然存在的,其具有與參考核酸類似之結合性質且其係以類似於參考核苷酸之方式代謝。該等類似物之實例包括,但不限於,硫
代磷酸酯、磷醯胺脂、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯及2-O-甲基核糖核苷酸。
術語「硫代磷酸酯核酸」係指其中一或多個核苷酸間鍵聯係經由硫代磷酸酯部分(硫代磷酸部分)進行之核酸。硫代磷酸酯部分可為單硫代磷酸酯(-P(O)3(S)3--)或二硫代磷酸酯(-P(O)2(S)2 3--)。在諸多實施例中,硫代磷酸酯部分為單硫代磷酸酯(-P(O)3(S)3--)。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸為單硫代磷酸酯核酸。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸之核苷中之一或多者係由硫代磷酸酯部分(例如單硫代磷酸酯部分)連接,且其餘核苷係由磷酸二酯部分(-P(O)4 3--)連接。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸之核苷中之一或多者係由硫代磷酸酯部分(例如單硫代磷酸酯部分)連接,且其餘核苷係由甲基膦酸酯鍵聯連接。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸之所有核苷均由硫代磷酸酯部分(例如單硫代磷酸酯部分)連接。
硫代磷酸酯寡核苷酸(硫代磷酸酯核酸)之長度典型地為約5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或更多個核苷酸,至多約100個核苷酸長。硫代磷酸酯核酸之長度亦可更長,例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等。如以上所描述,在某些實施例中,本文中之硫代磷酸酯核酸含有一或多個磷酸二酯鍵。在其他實施例中,硫代磷酸酯核酸包括替代骨架(例如,如此技術領域中已知的磷酸二酯模擬物或類似物,諸如硼烷磷酸酯、甲基膦酸酯、磷醯胺酯或O-甲基亞磷醯胺
酯鍵聯(參見Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press)。硫代磷酸酯核酸亦可包括此技術領域中已知的一或多種核酸類似物單體,諸如肽核酸單體或聚合物、鎖核酸(locked nucleic acid)單體或聚合物、 啉基單體或聚合物、二醇核酸單體或聚合物、或蘇糖核酸單體或聚合物。其他類似物核酸包括具有帶正電骨架、非離子骨架及非核糖骨架者,包括以下文獻中所描述者:美國專利第5,235,033號及第5,034,506號,及ASC Symposium Series 580,Carbohydrate Modifications in Antisense Research,Sanghui & Cook編,第6章及第7章。含有一或多個碳環糖之核酸亦包括在核酸之一種定義內。可出於多種理由對核糖磷酸酯骨架進行修飾,例如旨在增加該等分子在生理環境中或作為生物晶片上之探針的穩定性及半衰期。可製造天然存在之核酸及類似物之混合物;或者,可製造不同的核酸類似物之混合物以及天然存在之核酸及類似物之混合物。硫代磷酸酯核酸及硫代磷酸酯聚合物骨架可為線性或分枝的。舉例而言,分枝核酸重複分枝以形成更高階結構,諸如樹枝狀聚合物等。
如本文中所使用,「硫代磷酸酯聚合物骨架」為具有至少兩個硫代磷酸酯鍵聯(例如單硫代磷酸酯)(例如,將糖次單元、環狀次單元或烷基次單元連接在一起)之化學聚合物。硫代磷酸酯聚合物骨架可為硫代磷酸酯糖聚合物,其為其中之戊糖鏈中之一或多者(或所有)缺乏正常情況下存在於核酸中之鹼基(核鹼基)的硫代磷酸酯核
酸。硫代磷酸酯聚合物骨架可包括兩個或更多個硫代磷酸酯鍵聯。硫代磷酸酯聚合物骨架可包括5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50或更多個鍵聯且可含有至多約100個硫代磷酸酯鍵聯。硫代磷酸酯聚合物骨架亦可含有更多鍵聯,例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等。
硫代磷酸酯核酸及硫代磷酸酯聚合物骨架可部分或完全硫代磷酸酯化。舉例而言,硫代磷酸酯核酸之核苷酸間鍵聯中50%以上可為硫代磷酸酯鍵聯。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸之核苷酸間鍵聯中5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%為硫代磷酸酯鍵聯。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸之核苷酸間鍵聯中50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%為硫代磷酸酯鍵聯。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸之核苷酸間鍵聯中75%、80%、85%、90%、95%或99%為硫代磷酸酯鍵聯。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸之核苷酸間鍵聯中90%、95%或99%為硫代磷酸酯鍵聯。在諸多實施例中,其餘核苷酸間鍵聯為磷酸二酯鍵聯。在諸多實施例中,其餘核苷酸間鍵聯為甲基膦酸酯鍵聯。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸之核苷酸間鍵聯中100%為硫代磷酸酯鍵聯。類似地,硫代磷酸酯聚合物骨架中之糖間鍵聯中5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、
90%、95%或99%可為硫代磷酸酯鍵聯。在諸多實施例中,硫代磷酸酯聚合物骨架中之糖間鍵聯中50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%可為硫代磷酸酯鍵聯。在諸多實施例中,硫代磷酸酯聚合物骨架中之糖間鍵聯中75%、80%、85%、90%、95%或99%可為硫代磷酸酯鍵聯。在諸多實施例中,硫代磷酸酯聚合物骨架中之糖間鍵聯中90%、95%或99%可為硫代磷酸酯鍵聯。在諸多實施例中,其餘核苷酸間鍵聯為磷酸二酯鍵聯。在諸多實施例中,其餘核苷酸間鍵聯為甲基膦酸酯鍵聯。在諸多實施例中,硫代磷酸酯聚合物骨架之糖間鍵聯中100%為硫代磷酸酯鍵聯。
核酸可包括非特異性序列。如本文中所使用,術語「非特異性序列」係指含有未設計成與任何其他核酸序列互補或僅部分互補之一系列殘基的核酸序列。舉例而言,非特異性核酸序列為當與細胞或生物體接觸時,不充當抑制性核酸之核酸殘基序列。「抑制性核酸」為能夠結合標靶核酸(例如可轉譯成蛋白質之mRNA)且減少標靶核酸轉錄(例如,自DNA至mRNA)或減少標靶核酸(例如mRNA)轉譯或改變轉錄產物剪接(例如單股 啉基寡核苷酸)的核酸(例如DNA、RNA、核苷酸類似物之聚合物)。
「經標記之核酸或寡核苷酸」為經由連接子或化學鍵共價結合或經由離子鍵、凡得瓦爾鍵、靜電鍵或氫鍵非共價結合標記,使得可藉由偵測與核酸結合之可偵測標記之存在來偵測核酸之存在的核酸或寡核苷酸。或
者,使用高親和力相互作用之方法可達成相同結果,其中一對結合搭配物中之一者與另一者結合,例如生物素、鏈黴抗生物素蛋白。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架包括如本文中所揭示且此技術領域中一般已知的可偵測標記。
字彙「互補」或「互補性」係指聚核苷酸中之核酸與第二聚核苷酸中之另一核酸形成鹼基對的能力。舉例而言,序列A-G-T與序列T-C-A互補。互補性可為部分的,其中僅一些核酸根據鹼基配對相匹配,或為完全的,其中所有核酸均根據鹼基配對相匹配。
當核酸與另一核酸序列具有功能關係時,其為「可操作地連接」。舉例而言,若前驅序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽之分泌的前驅蛋白質,則其可操作地連接於該多肽之DNA;若啟動子或增強子影響序列之轉錄,則其可操作地連接於編碼序列;或若核糖體結合位點經安置以促進轉譯,則其可操作地連接於編碼序列。一般而言,「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列彼此接近,且就分泌前導序列而言為連續的且呈閱讀相。然而,增強子不必是連續的。連接係藉由在適宜限制位點處接合來實現。若該等位點不存在,則根據習知實務使用合成寡核苷酸銜接子(adaptor)或連接子。
術語「基因」意謂涉及產生蛋白質之DNA節段;其包括編碼區前後之區域(前導序列及尾隨序列(trailer))以及位於個別編碼節段(外顯子)之間的插入序列
(內含子)。前導序列、尾隨序列以及內含子包括基因轉錄及轉譯期間所必需的調節元件。此外,「蛋白質基因產物」為由特定基因表現之蛋白質。
如本文中在與基因有關時所使用之字彙「表現」意謂該基因之轉錄及/或轉譯產物。DNA分子在細胞中之表現水準可基於該細胞內所存在之相應mRNA的量或由該細胞產生之由該DNA編碼之蛋白質的量來確定。非編碼核酸分子(例如siRNA)之表現水準可藉由此技術領域中所熟知的標準PCR或北方點漬法來偵測。參見Sambrook等,1989 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,18.1-18.88。
術語「重組」當使用於與例如細胞或核酸、蛋白質或載體有關時,指示該細胞、核酸、蛋白質或載體已藉由引入異源核酸或蛋白質或使天然核酸或蛋白質變化而得以修飾,或該細胞衍生於經如此修飾之細胞。因而,舉例而言,重組細胞表現天然(非重組)形式之細胞內未發現之基因,或表現將為異常表現、表現不足或完全不表現之天然基因。轉殖基因細胞及植物為典型地由於重組法而表現異源基因或編碼序列者。
術語「異源」當使用於與核酸之部分有關時,指示該核酸包含兩個或更多個在自然界中發現彼此不處於同一關係中之子序列。舉例而言,核酸典型地以重組方式產生,其具有來自於不相關基因之經排列以產生新功能核酸之兩個或更多個序列,例如來自於一來源之啟動子
及來自於另一來源之編碼區。類似地,異源蛋白指示包含兩個或更多個在自然界中發現彼此不處於同一關係中之子序列的蛋白質(例如融合蛋白)。
術語「外源」係指源於指定細胞或生物體外之分子或物質(例如化合物、核酸或蛋白質)。舉例而言,如本文中所提及之「外源啟動子」為並非源於表現其之植物的啟動子。反之,術語「內源」或「內源啟動子」係指原生於或源於指定細胞或生物體內之分子或物質。
術語「分離」當應用於核酸或蛋白質時,表示該核酸或蛋白質基本上不含在天然狀態下與其締合之其他細胞組分。其可例如呈均質狀態且可呈乾燥或水溶液形式。純度及均質性典型地使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析之分析化學技術來測定。作為製劑中所存在之主要物質的蛋白質實質上係經純化。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換用於指胺基酸殘基之聚合物,其中在諸多實施例中,該聚合物可與並非由胺基酸組成之部分結合。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸聚合物,以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。「融合蛋白質」係指編碼重組表現成單一部分之兩個或更多個單獨蛋白質序列的嵌合蛋白質。
術語「肽基」及「肽基部分」意謂單價肽。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基
酸,以及以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼者以及稍後經修飾之彼等胺基酸,例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指具有與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構的化合物,亦即,α碳與氫、羧基、胺基及R基團結合,例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架,但保留與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之一般化學結構不同的結構,但以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用的化學化合物。術語「非天然存在之胺基酸」及「非天然胺基酸」係指自然界中未發現之胺基酸類似物、合成胺基酸及胺基酸模擬物。
胺基酸在本文中可藉由其通常已知的三個字母符號或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會所推薦之單字母符號加以提及。同樣,核苷酸可藉由其通常接受之單字母代碼加以提及。
「經保守修飾之變異體」適用於胺基酸及核酸序列。關於特定核酸序列,「經保守修飾之變異體」係指編碼一致或基本上一致之胺基酸序列的彼等核酸。由於遺傳密碼之簡併,許多核酸序列將編碼任何指定蛋白質。舉例而言,密碼子GCA、GCC、GCG及GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因而,在由密碼子規定丙胺酸之每個位置上,該密
碼子可改變成所描述之任何相應密碼子而不改變所編碼之多肽。該等核酸變異為「沈默變異」,其為保守修飾變異之一個種類。本文中編碼多肽之每個核酸序列亦描述該核酸之每種可能之沈默變異。熟習此技術領域者應認識到,核酸中之各密碼子(除了AUG,其一般為甲硫胺酸之唯一密碼子,及TGG,其一般為色胺酸之唯一密碼子)可經修飾以產生功能一致之分子。因此,各所描述之序列中牽涉編碼多肽之核酸之各沈默變異。
關於胺基酸序列,熟習此技術領域者應認識到,對核酸、肽、多肽或蛋白質序列於編碼序列中進行改變、添加或缺失單一胺基酸或小百分比之胺基酸的個別取代、缺失或添加為「經保守修飾之變異體」,其中該變化導致胺基酸經化學上相似之胺基酸取代。提供功能相似之胺基酸的保守取代表在此技術領域中為熟知的。該等經保守修飾之變異體涵蓋且不排除本發明之多形變異體、種間同系物及對偶基因。
以下八組各自含有彼此為保守取代之胺基酸:1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G);2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E);3)天冬醯胺(N)、麩醯胺(Q);4)精胺酸(R)、離胺酸(K);5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V);6)苯基丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W);
7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T);及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如Creighton,Proteins(1984))。
術語「一致」或「一致性」百分比用在兩個或更多個核酸或多肽序列之情形下,係指相同或有規定百分比之胺基酸殘基或核苷酸相同(亦即,在規定區域上具有約60%一致性,較佳65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)的兩個或更多個序列或子序列,其係如使用BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法利用以下所描述之默認參數或藉由人工比對及目測檢查所量測(參見例如NCBI網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/或其類似網站)。該等序列則稱為「實質上一致」。此定義亦係指或可適用於測試序列之互補序列。該定義亦包括具有缺失及/或添加之序列以及具有取代之彼等序列。如以下所描述,較佳演算法可算出間隙等。較佳地,一致性存在於長度至少約25個胺基酸或核苷酸之區域上,或更佳地在長度約50至100個胺基酸或核苷酸之區域上。
「抗體」係指包含來自於免疫球蛋白基因或其片段之架構區且特異性結合並識別抗原的多肽。所識別之免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因,以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε,其又分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。典型地,
抗體之抗原結合區在特異性及結合親和力方面將為最重要的。在一些實施例中,抗體或抗體片段可衍生於不同的生物體,包括人類、小鼠、大鼠、倉鼠、駱駝等。本發明之抗體可包括已在一或多個胺基酸位置上經修飾或突變以改良或調節抗體之所欲功能(例如糖基化、表現、抗原識別、效應功能、抗原結合、特異性等)之抗體。
例示性免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體。各四聚體由兩對一致之多肽鏈構成,各對具有一個「輕」鏈(約25kD)及一個「重」鏈(約50至70kD)。各鏈之N末端定義為具有約100至110或更多個胺基酸且主要負責抗原識別之可變區。術語可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)分別係指此等輕鏈及重鏈。Fc(亦即片段可結晶區)為免疫球蛋白之「基部」或「尾部」且典型地視抗體類別而定由貢獻兩個或三個恆定域之兩個重鏈構成。藉由結合特定蛋白質,Fc區確保各抗體對指定抗原產生適當免疫反應。Fc區亦結合各種細胞受體,諸如Fc受體,及其他免疫分子,諸如補體蛋白。
舉例而言,抗體係以作為完整免疫球蛋白或作為藉由用各種肽酶消化而產生之許多經充分表徵之片段而存在。因而,舉例而言,胃蛋白酶在鉸鏈區中之二硫鍵聯下消化抗體以產生F(ab)'2,其本身為經由二硫鍵連接於VH-CH1之輕鏈的Fab二聚體。可在溫和條件下還原F(ab)'2以破壞鉸鏈區中之二硫鍵聯,從而將F(ab)'2二聚體轉化成Fab'單體。Fab'單體基本上為具有鉸鏈區之一部分
的抗原結合部分(參見Fundamental Immunology(Paul編,第3版,1993))。儘管各種抗體片段定義為完整抗體之消化物,但熟習此技術領域者應瞭解,可用化學方式或藉由使用重組DNA方法重新合成該等片段。因而,如本文中所使用之術語抗體亦包括藉由修飾完整抗體而產生或使用重組DNA方法重新合成(例如單鏈Fv)或使用噬菌體呈現文庫鑑別之抗體片段(參見例如McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990))。
單鏈可變片段(scFv)典型地為用10至約25個胺基酸之短連接子肽連接之免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之融合蛋白質。連接子通常可富含甘胺酸以達成可撓性,以及絲胺酸或蘇胺酸以達成溶解度。連接子可連接VH之N末端與VL之C末端,或連接VH之C末端與VL之N末端。
為了製備適合之本發明抗體且為了根據本發明使用,例如,重組、單株或多株抗體,可使用此技術領域中已知的許多技術(參見例如Kohler及Milstein,Nature 256:495-497(1975);Kozbor等人,Immunology Today 4:72(1983);Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),第77-96頁;Coligan,Current Protocols in Immunology(1991);Harlow及Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988);及Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版,1986))。可自細胞選殖編碼有興趣之抗體之重鏈及輕鏈的基因,例如,可
自融合瘤選殖編碼單株抗體之基因且用於產生重組單株抗體。亦可由融合瘤或漿細胞製造編碼單株抗體之重鏈及輕鏈的基因文庫。重鏈及輕鏈基因產物之隨機組合產生具有不同的抗原特異性的大抗體池(參見例如Kuby,Immunology(第3版,1997))。用於產生單鏈抗體或重組抗體之技術(美國專利4,946,778、美國專利第4,816,567號)可適於產生針對本發明多肽之抗體。此外,轉殖基因小鼠或其他生物體,諸如其他哺乳動物,可用於表現人類化或人類抗體(參見例如美國專利第5,545,807號;第5,545,806號;第5,569,825號;第5,625,126號;第5,633,425號;第5,661,016號;Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-13(1994);Fishwild等人,Nature Biotechnology 14:845-51(1996);Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996);以及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。或者,可使用噬菌體呈現技術來鑑別特異性結合所選抗原之抗體及異聚Fab片段(參見例如McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990);Marks等人,Biotechnology 10:779-783(1992))。亦可使抗體具有雙特異性,亦即,能夠識別兩個不同的抗原(參見例如WO 93/08829;Traunecker等人,EMBO J.10:3655-3659(1991);及Suresh等人,Methods in Enzymology 121:210(1986))。抗體亦可為異源結合物,例如,兩個共價連接之抗體,或免疫毒素(參見例如美國專利第4,676,980號;WO 91/00360;WO 92/200373;及EP
03089)。
用於人類化或靈長類化非人類抗體之方法在此技術領域中為熟知的(例如美國專利第4,816,567號;第5,530,101號;第5,859,205號;第5,585,089號;第5,693,761號;第5,693,762號;第5,777,085號;第6,180,370號;第6,210,671號;及第6,329,511號;WO 87/02671;EP專利申請案0173494;Jones等人(1986)Nature 321:522;及Verhoyen等人(1988)Science 239:1534)。人類化抗體進一步描述於例如Winter及Milstein(1991)Nature 349:293中。一般而言,人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為輸入殘基,其典型地取自輸入可變域。人類化可基本上按照Winter及同事之方法(參見例如Morrison等人,PNAS USA,81:6851-6855(1984);Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988);Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988);Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992);Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991);Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)),藉由以嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行。因此,該等人類化抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號),其中實質上小於完整人類可變域已由來自於非人類物種之相應序列取代。實際上,人類化抗體典型地為其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基經來自於嚙齒
動物抗體中之類似位點之殘基取代的人類抗體。舉例而言,可用合成方式或藉由組合適當之cDNA及基因組DNA節段來產生包含編碼人類化免疫球蛋白架構區之第一序列及編碼所欲免疫球蛋白互補性決定區之第二序列集的聚核苷酸。可根據熟知程序自多種人類細胞中分離人類恆定區DNA序列。
「嵌合抗體」為抗體分子,其中:(a)恆定區或其部分經改變、置換或交換以使得抗原結合位點(可變區)連接於不同或經改變之類別、效應功能及/或物種恆定區,或連接於可賦予嵌合抗體新性質的完全不同的分子,例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等;或(b)可變區或其部分經具有不同或經改變之抗原特異性的可變區改變、置換或交換。根據本發明及根據本發明使用之較佳抗體包括人類化及/或嵌合單株抗體。
用於結合治療劑與抗體之技術為熟知的(參見例如Arnon等人,「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編),第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom等人,「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等人(編),第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review」,Monoclonal Antibodies‘84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編),第475-506頁
(1985);及Thorpe等人,「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」,Immunol.Rev.,62:119-58(1982))。如本文中所使用,術語「抗體-藥物結合物」或「ADC」係指與抗體結合或以其他方式共價結合之治療劑。如本文中所提及之「治療劑」為可用於治療或預防諸如癌症之疾病的組成物。
片語「特異性(或選擇性)結合」抗體或「具有特異性(或選擇性)免疫活性」當係指蛋白質或肽時,係指通常於異源蛋白質及其他生物學物質群體中之蛋白質之存在的可確定的結合反應。因而,在指定免疫分析條件下,特異性抗體與特定蛋白質之結合為背景之至少兩倍且更典型地為背景之多於10至100倍。在該等條件下與抗體特異性結合需要所選抗體對特定蛋白質具有特異性。舉例而言,可選擇多株抗體以便僅獲得與所選抗原具有特異性免疫活性而與其他蛋白質則不具特異性免疫活性的抗體子集。此選擇可藉由減去與其他分子交叉反應之抗體來達成。可使用多種免疫分析形式來選擇與特定蛋白質具有特異性免疫活性之抗體。舉例而言,慣例使用固相ELISA免疫分析法來選擇與蛋白質具有特異性免疫活性之抗體(關於可用於測定特異性免疫反應性之免疫分析法形式及條件的描述,參見例如Harlow及Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998))。
「配體」係指能夠結合受體之藥劑,例如多肽或其他分子。
「標記」或「可偵測部分」為可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理手段偵測之組成物。舉例而言,適用之標記包括32P、螢光染料、電子緻密試劑、酶(例如,如通常用於ELISA中)、生物素、毛地黃素或經人為而可偵測之半抗原及蛋白質或其他實體,例如藉由向與標靶肽具有特異性反應性之肽或抗體中併入放射性標記。此技術領域中已知的用於結合抗體與標記之任何適當方法均可採用,例如,使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego中所描述之方法。
如本文中所提供之術語「生物素」係指以與四氫噻吩環稠合之脲基(四氫咪唑酮)環為特徵的化合物。如本文中所提供之「生物素」係指5-[(3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸,且在慣用意義上係指CAS註冊號58-85-5。如本文中所使用之「生物素結合結構域」為能夠結合生物素之蛋白質結構域。生物素結合結構域之非限制性實例包括抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白及中性抗生物素蛋白。
如本文中所提供之術語「抗生物素蛋白」或「鏈黴抗生物素蛋白」包括維持天然存在形式之活性(例如,與天然蛋白質相比在至少50%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%活性內)的任何抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白天然存在形式、同系物、變異體或衍生物(例如中性抗生物素蛋白)。在一些實施例中,變異體與天
然存在形式相比在整個序列或序列之一部分(例如50、100、150或200個連續胺基酸部分)上具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。
「接觸」係根據其普通含義使用且係指允許至少兩種不同的物質(例如化學化合物,包括生物分子或細胞)足夠接近以便反應、相互作用或發生物理接觸之過程。然而,應理解,所得反應產物可由所添加之試劑之間的反應直接產生或由反應混合物中可能產生之得自於一或多種所添加試劑之中間物產生。
術語「接觸」可包括允許兩種物質反應、相互作用或發生物理接觸,其中該兩種物質可為例如本文中所描述之生物素結構域及生物素結合結構域。在諸多實施例中,接觸包括例如允許如本文中所描述之生物素結構域與生物素結合結構域相互作用。
「對照」樣品或值係指充當參考(通常為已知參考)以便比較測試樣品之樣品。舉例而言,測試樣品可取自測試條件(例如,在存在測試化合物之情況下),且與得自已知條件(例如,在不存在測試化合物之情況下(負對照)或在存在已知化合物之情況下(正對照))之樣品相比較。對照亦可表示自許多測試或結果收集之平均值。熟習此技術領域者應認識到,可設計對照以評估任何數目之參數。舉例而言,可基於藥理學資料(例如半衰期)或治療量度(例如副作用之比較)設計對照以比較治療利益。熟習此技術領域者應理解,何種對照在指定情形下有價值且能夠基於與對
照值之比較來分析資料。對照對於確定資料之顯著性亦為有價值的。舉例而言,若指定參數之值在對照中廣泛變化,則在測試樣品中之偏差將被視為不顯著。
「患者」或「有需要之個體」係指罹患或傾向於可藉由投與如本文中所提供之組成物或醫藥組成物加以治療之疾病或病狀的活生物體。非限制性實例包括人類、其他哺乳動物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、綿羊、乳牛、鹿及其他非哺乳動物。在一些實施例中,患者為人類。
術語「疾病」或「病狀」係指患者或個體能夠用本文中所提供之化合物、醫藥組成物或方法加以治療之存在狀態或健康狀態。在諸多實施例中,疾病為癌症(例如肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌(例如莫克爾氏細胞癌(Merkel cell carcinoma))、睪丸癌、白血病、淋巴瘤、頭頸癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑素瘤、乳癌、神經母細胞瘤)。疾病可為自體免疫疾病、炎性疾病、癌症、感染性疾病、代謝疾病、發育疾病、心血管疾病、肝病、腸病、內分泌疾病、神經學疾病或其他疾病。
如本文中所使用,術語「癌症」係指在哺乳動物中發現之所有類型之癌症、贅瘤或惡性腫瘤,包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神經內分泌腫瘤、癌瘤及肉瘤。可用本文中所提供之化合物、醫藥組成物或方法加以治療之例示性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、腦腫瘤、
子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、骨髓瘤、甲狀腺癌、白血病、前列腺癌、乳癌(例如三陰性、ER陽性、ER陰性、化學療法抗性、賀癌平(herceptin)抗性、HER2陽性、多柔比星抗性、他莫西芬(tamoxifen)抗性、導管癌、小葉癌、原發性、轉移性)、卵巢癌、胰臟癌、肝癌(例如肝細胞癌)、肺癌(例如非小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌、腺癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、類癌瘤、肉瘤)、多形性膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、黑素瘤、前列腺癌、性腺閹割抗性前列腺癌、乳癌、三陰性乳癌、膠質母細胞瘤、卵巢癌、肺癌、鱗狀細胞癌(例如頭、頸或食道)、結腸直腸癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B細胞淋巴瘤或多發性骨髓瘤。其他實例包括甲狀腺癌、內分泌系統癌、腦癌、乳癌、頸癌、結腸癌、頭頸癌、食道癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細胞肺癌、黑素瘤、間皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宮癌或髓母細胞瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血病、原發性腦腫瘤、癌症、惡性胰臟胰島素瘤、惡性類癌瘤、膀胱癌、惡變前皮膚病變、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性血鈣過多、子宮內膜癌、腎上腺皮層癌、內分泌或外分泌胰臟贅瘤、髓樣甲狀腺癌、髓樣甲狀腺癌瘤、黑素瘤、結腸直腸癌、乳頭狀甲狀腺癌、肝細胞癌、乳頭柏
哲德氏病(Paget’s Disease of the Nipple)、葉狀腫瘤、小葉癌瘤、導管癌瘤、胰臟星形細胞癌、肝星形細胞癌或前列腺癌。
術語「白血病」廣義上係指血液形成器官之漸進性惡性病且一般以血液及骨髓中之白血球及其前驅細胞之畸態增殖及發育為特徵。白血病在臨床上一般基於以下各項加以分類:(1)疾病之持續時間及特徵:急性或慢性;(2)所涉及之細胞類型:骨髓(骨髓原性)、淋巴(淋巴原)或單核細胞;及(3)血液中之異常細胞數目增加或不增加:白血性或非白血性(亞白血性)。可用本文中所提供之化合物、醫藥組成物或方法治療之例示性白血病包括例如急性非淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病、急性早幼粒細胞性白血病、成人T細胞白血病、非白血性白血病、白血球性白血病、嗜鹼性粒細胞性白血病、母細胞白血病、牛白血病、慢性粒細胞性白血病、皮膚白血病、幹細胞性白血病、嗜酸性粒細胞性白血病、格羅斯氏白血病(Gross' leukemia)、毛細胞性白血病、血母細胞性白血病、血母細胞性白血病、組織細胞性白血病、幹細胞性白血病、急性單核細胞性白血病、白血球減少性白血病、淋巴細胞性白血病、淋巴母細胞性白血病、淋巴細胞性白血症、淋巴源性白血病、淋巴細胞樣白血病、淋巴肉瘤細胞性白血病、肥大細胞性白血病、巨核細胞性白血病、小骨髓母細胞性白血病、單核細胞性白血病、骨髓母細胞性白血病、骨髓性白血病、骨
髓性粒細胞性白血病、單核細胞性白血病、內格利(Naegeli)氏白血病、漿細胞性白血病、多發性骨髓瘤、漿細胞性白血病、早幼粒細胞性白血病、裡德(Rieder)細胞白血病、席林氏白血病(Schilling's leukemia)、幹細胞性白血病、亞白血性白血病或未分化細胞性白血病。
術語「肉瘤」一般係指由胚性結締組織樣物質組成之腫瘤且一般包含嵌入纖絲狀或均質物質中之緊密堆積之細胞。可用本文中所提供之化合物、醫藥組成物或方法加以治療之肉瘤包括軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy氏肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、泡狀軟部肉瘤、釉母細胞肉瘤、葡萄樣肉瘤、綠色肉瘤、絨膜癌、胚胎性肉瘤、威爾姆斯瘤肉瘤(Wilms' tumor sarcoma)、子宮內膜肉瘤、基質肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、纖維母細胞肉瘤、巨細胞肉瘤、粒細胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤、自發多發性有色出血性肉瘤、B細胞免疫母細胞肉瘤、淋巴瘤、T細胞免疫母細胞肉瘤、Jensen氏肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、枯氏細胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間葉瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、網狀細胞肉瘤、勞斯氏肉瘤(Rous sarcoma)、漿液囊性肉瘤、滑膜肉瘤或毛細管擴張肉瘤。
術語「黑素瘤」被視為意謂由皮膚及其他器官之黑素細胞系統產生之腫瘤。可用本文中所提供之化合物、醫藥組成物或方法加以治療之黑素瘤包括例如肢端雀
斑樣痣黑素瘤、無黑素性黑素瘤、良性青少年性黑素瘤、Cloudman氏黑素瘤、S91黑素瘤、哈-帕二氏黑素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年性黑素瘤、惡性雀斑樣痣黑素瘤、惡性黑素瘤、結節性黑素瘤、甲下黑素瘤或淺表擴散性黑素瘤。
術語「癌瘤(carcinoma)」係指傾向於浸潤周圍組織且引起轉移之由上皮細胞組成之惡性新生物。可用本文中所提供之化合物、醫藥組成物或方法加以治療之例示性癌瘤包括例如髓樣甲狀腺癌、家族性髓樣甲狀腺癌、腺泡癌、腺泡狀癌、腺囊癌、腺樣囊性癌、腺瘤癌、腎上腺皮質癌、肺泡癌、肺泡細胞癌、基底細胞癌(basal cell carcinoma)、基底細胞癌(carcinoma basocellulare)、基底樣癌、基底鱗狀細胞癌、細支氣管肺泡癌、支氣管癌、支氣管源性癌、腦狀癌、膽管細胞癌、絨毛膜癌、膠樣癌、痤瘡癌、子宮體癌、篩狀癌、胸廓癌、皮膚癌、柱狀癌、柱狀細胞癌、導管癌(duct carcinoma)、導管癌(ductal carcinoma)、導管癌(carcinoma durum)、胚性癌、腦樣癌、表皮樣癌(epiermoid carcinoma)、腺樣上皮細胞癌、外植體性癌、潰瘍性癌、纖維癌、膠狀癌、膠體癌、巨細胞癌、巨細胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒層細胞癌、毛囊基質癌、血樣癌、肝細胞癌、Hurthle氏細胞癌、透明癌(hyaline carcinoma)、腎上腺樣癌、幼稚型胚性癌、原位癌、表皮內癌、上皮內癌、Krompecher氏癌、Kulchitzky細胞癌、大細胞癌、豆狀癌、豆樣癌(carcinoma lenticulare)、
脂肪瘤癌、小葉癌、淋巴上皮癌、髓樣癌、髓樣癌(medullary carcinoma)、黑素癌、軟癌、黏液癌(mucinous carcinoma)、黏液癌(carcinoma muciparum)、黏液細胞癌、黏液表皮樣癌、黏液癌(carcinoma mucosum)、黏液癌(mucous carcinoma)、黏液瘤樣癌、鼻咽癌、燕麥細胞癌、骨化性癌、骨樣癌、乳頭狀癌、門靜脈周癌、浸潤前癌、棘細胞癌、軟糊狀癌(pultaceous carcinoma)、腎臟之腎細胞癌、儲備細胞癌、肉瘤性癌、Schneiderian癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印環狀細胞癌(signet-ring cell carcinoma)、單純癌、小細胞癌、馬鈴薯狀癌、球狀細胞癌、梭狀細胞癌、海綿體癌、鱗狀癌、鱗狀細胞癌、繩捆癌、毛細血管性癌、毛細血管性癌(carcinoma telangiectodes)、移行細胞癌、結節性皮癌(carcinoma tuberosum)、小管癌、結節性皮膚癌(tuberous carcinoma)、疣狀癌或絨毛狀癌。
如本文中所使用,術語「轉移」、「轉移性」及「轉移性癌」可互換使用且係指增殖性疾病或病症(例如癌症)自一個器官或另一非相鄰器官或身體部分之擴散。癌症發生在起始部位,例如乳房,該部位被稱為原發性腫瘤,例如原發性乳癌。原發性腫瘤或起始部位中之一些癌細胞獲得穿透並浸潤局部區域中之周圍正常組織的能力及/或穿透淋巴系統或血管系統之壁的能力,從而經由該系統循環至體內之其他部位及組織。由原發性腫瘤之癌細胞形成的第二臨床上可偵測腫瘤被稱為轉移性或繼發性腫瘤。當癌細胞轉移時,假定轉移性腫瘤及其細胞類似於原始腫瘤
之細胞。因而,若肺癌轉移至乳房,則乳房之繼發性腫瘤由異常肺細胞而非異常乳房細胞組成。乳房中之繼發性腫瘤被稱為轉移性肺癌。因而,片語轉移性癌症係指個體患有或曾患有原發性腫瘤且具有一或多個繼發性腫瘤之疾病。片語非轉移性癌症或患有非轉移性癌症之個體係指個體患有原發性腫瘤而非一或多個繼發性腫瘤之疾病。舉例而言,轉移性肺癌係指患有原發性肺腫瘤或有原發性肺腫瘤病史且在第二位置或多個位置(例如在乳房中)具有一或多個繼發性腫瘤之個體的疾病。
如本文中所使用,「自體免疫性疾病」係指由個體之免疫系統產生之例如針對個體之體內正常情況下存在之物質、組織及/或細胞之免疫反應改變所致的疾病或病症。自體免疫性疾病包括,但不限於,關節炎、變形性關節炎、牛皮癬關節炎、青少年特發性關節炎、硬皮病、系統性硬皮病、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、青少年發作糖尿病、1型糖尿病、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏腦炎、橋本氏甲狀腺炎、強直性脊柱炎、牛皮癬、修格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、血管炎、腎小球性腎炎、自體免疫性甲狀腺炎、白塞病(Behcet's disease)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、大皰性類天皰瘡、類肉瘤病、牛皮癬、鱗癬、葛雷氏眼病(Graves ophthalmopathy)、炎性腸病、愛迪生氏病(Addison's disease)、白癲風、氣喘及過敏性哮喘。
如本文中所使用,「炎性疾病」係指與異常
或改變之發炎相關的疾病或病症。發炎為由免疫系統響應於病原體、受損細胞或組織或刺激物引發之作為痊癒過程之一部分的生物反應。慢性發炎可造成多種疾病。炎性疾病包括,但不限於,動脈粥樣硬化、過敏、氣喘、變形性關節炎、移植物排斥反應、乳糜瀉(celiac disease)、慢性前列腺炎、炎性腸病、骨盆炎性疾病及炎性肌病。
如本文中所使用,「代謝病症」係指涉及多種分子及物質(包括例如碳水化合物、胺基酸、有機酸)之異常代謝的疾病或病症。代謝病症包括,但不限於,碳水化合物代謝病症,例如糖原儲積病;胺基酸代謝病症,例如苯丙酮酸尿症、楓糖漿尿病、第1型戊二酸血症;尿循環異常或尿循環缺陷,例如胺基甲醯磷酸酯合成酶I缺陷;有機酸代謝病症(有機酸性尿),例如黑酸尿症;脂肪酸氧化及粒線體代謝病症,例如中鏈脂醯輔酶A脫氫酶缺陷;卟啉代謝病症,例如急性間歇性血紫質病;嘌呤或嘧啶代謝病症,例如萊納二氏症候群(Lesch-Nyhan syndrome);類固醇代謝病症,例如類脂先天性腎上腺增生症先天性腎上腺增生症;粒線體功能病症,例如卡恩斯-塞爾症候群(Kearns-Sayre syndrome);過氧化體功能病症,例如柴爾維格氏症候群(Zellweger syndrome);及溶小體儲積病症,例如高雪氏病(Gaucher's disease)及尼曼匹克病(Niemann Pick disease)。
如本文中所使用,「發育病症」係指通常起源於兒童期之與語言障礙、學習障礙、運動障礙及神經發
育障礙相關之疾病或病症。實例包括,但不限於,自閉症類障礙及注意力不足障礙。
如本文中所使用,「心血管疾病」係指與心臟、血管或兩者相關之疾病。心血管疾病包括,但不限於,冠狀動脈性心臟病、心肌病、高血壓性心臟病、心臟衰竭、心臟節律障礙、炎性心臟病、周邊動脈病、腦血管疾病及炎性心臟病。
如本文中所使用,「肝病」係指與肝臟及/或肝功能異常相關之疾病。肝病包括,但不限於,肝炎、酒精性肝病、脂肪肝病、肝硬化、Budd-Chiari氏徵候群、吉伯特氏症候群(Gilbert's syndrome)及癌症。
如本文中所使用,術語「腸病」係指與腸(小腸或大腸)中異常相關之疾病或病症。腸病包括,但不限於,腸胃炎、結腸炎、回腸炎、闌尾炎、腹腔病、克羅恩氏病、腸道病毒、易激性腸症候群及憩室病。
如本文中所使用,術語「內分泌病」係指內分泌系統之疾病或病症,包括內分泌腺分泌不足、內分泌腺分泌過多及腫瘤。內分泌疾病包括,但不限於,愛迪生氏病、糖尿病、康氏症候群(Conn’s syndrome)、庫欣氏症候群(Cushing's syndrome)、糖皮質激素可治療性醛固酮過多症、低血糖症、甲狀腺功能亢進症、甲狀腺功能減退症、甲狀腺炎、垂體功能減退症、性腺功能減退症及副甲狀腺病症。
如本文中所使用,術語「神經系統病症」係
指體神經系統之疾病或病症,包括結構、生物化學或電學異常。神經系統病症包括,但不限於,腦損傷、腦功能障礙、脊髓病症、周邊神經病、腦神經病症、自主神經系統病症、癲癇發作病症、運動障礙(例如帕金森氏症及多發性硬化症)及中樞神經病。
如本文中所使用,術語「感染性疾病」係指與宿主個體中之病原體之感染、存在及/或生長相關之疾病或病症。感染性病原體包括,但不限於,病毒、細菌、真菌、原蟲、多細胞寄生蟲及異常蛋白質,例如普昂蛋白。與感染性疾病相關之病毒包括,但不限於,單純皰疹病毒、巨細胞病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、水痘-帶狀皰疹病毒、皰疹病毒、水泡性口膜炎病毒、肝炎病毒、鼻病毒、冠狀病毒、流感病毒、麻疹病毒、多瘤病毒、人類乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯薩奇病毒(Coxsackie virus)、登革熱病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、勞氏肉瘤病毒、黃熱病毒、伊波拉病毒(Ebola virus)、猿免疫缺乏病毒、人類免疫缺乏病毒。與感染性疾病相關之細菌包括,但不限於,結核分枝桿菌、沙門氏菌屬、大腸桿菌、披衣菌屬、葡萄球菌屬、桿菌屬及假單胞菌屬。
術語「相關」或「與……相關」用在與疾病(例如糖尿病、癌症(例如前列腺癌、腎癌、轉移性癌症、黑素瘤、閹割抗性前列腺癌、乳癌、三陰性乳癌、膠質母細胞瘤、卵巢癌、肺癌、鱗狀細胞癌(例如頭、頸或食道)、結
腸直腸癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B細胞淋巴瘤或多發性骨髓瘤))相關之物質或物質活性或功能之情形下,意謂該疾病(例如肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌(例如莫克爾氏細胞癌)、睪丸癌、白血病、淋巴瘤、頭頸癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑素瘤、乳癌、神經母細胞瘤)(完全或部分)由該物質或物質活性或功能造成,或該疾病之症狀(完全或部分)由該物質或物質活性或功能造成。
如本文中所使用之術語「異常」係指與正常不同。當用於描述酶活性時,異常係指活性大於或小於正常對照或正常未患病對照樣品之平均值。異常活性可能係指導致疾病之活性量,其中使異常活性返回正常或非疾病相關量(例如藉由使用如本文中所描述之方法)可減輕該疾病或一或多種疾病症狀。
如本文中所使用,術語「細胞穿透」係指分子(例如蛋白質)能夠以顯著或有效量自細胞外環境傳遞至細胞中。因而,細胞穿透結合物為自細胞外環境傳遞、通過膜且進入細胞中之分子。
如本文中所使用,術語「非細胞穿透(non-cell penetrating或non-cell penetration)」係指分子不能夠以顯著或有效量自細胞外環境傳遞至細胞中。因而,非細胞穿透肽或蛋白質一般不能夠自細胞外環境傳遞、通過細胞膜且進入細胞中對細胞群體、器官或生物體達成顯著生物效應。該術語不排除少量肽或蛋白質中之一或多者可
能進入細胞之可能性。然而,該術語係指一般不能夠自細胞外環境進入細胞達顯著程度之分子。非細胞穿透分子及物質之實例包括,但不限於,大分子,舉例而言,諸如高分子量蛋白質。可使用熟習此技術領域者已知的方法確定肽或蛋白質為非細胞穿透的。舉例而言,可對肽或蛋白質進行螢光標記,且可藉由流式細胞測量分析術或共焦顯微術在活體外測定該肽或蛋白質自細胞外環境傳遞至細胞中之能力。在一些實施例中,「非細胞穿透蛋白質」係指穿透細胞之程度比連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架之同一蛋白質少至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、10,000或100,000倍的蛋白質。在一些實施例中,「非細胞穿透蛋白質」係指不會可量測地穿透細胞之蛋白質。
如本文中所使用,「分子量」(M.W.)或「分子質量」係指分子中所有原子之原子量的總和。就分子而言,具有高分子量之分子典型地具有25kDa以上之分子量。舉例而言,高分子量蛋白質可具有約25kDa至1000kDa以上之M.W.。
如本文中所使用,術語「細胞內」意謂在細胞內部。如本文中所使用,「細胞內標靶」為位於細胞內部且作為本文中所提供之非細胞穿透蛋白質結合之標靶的標靶,例如核酸、多肽或其他分子(例如碳水化合物)。結合可為直接或間接的。在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質
選擇性結合細胞內標靶。選擇性結合或特異性結合係指藥劑(例如,非細胞穿透蛋白質)結合一種藥劑(例如,細胞內標靶)以部分或完全排除其他藥劑。結合意謂可偵測之結合為分析法之背景的至少約1.5倍。對於選擇性或特異性結合,可偵測之結合可以指定藥劑而非對照藥劑偵測。或者或額外地,可藉由分析下游分子或事件之存在來確定對結合之偵測。
如本文中所使用,術語「結合物」係指原子或分子之間的締合。締合可為直接或間接的。舉例而言,核酸與蛋白質之間的結合物可為直接的,例如藉由共價鍵,或為間接的,例如藉由非共價鍵(例如靜電相互作用(例如離子鍵、氫鍵、鹵素鍵)、凡得瓦爾相互作用(例如偶極-偶極、偶極-感應偶極、倫敦分散)、環堆疊(π效應)、疏水性相互作用及其類似作用)。在諸多實施例中,使用結合化學形成結合物,該結合化學包括,但不限於,親核取代(例如胺及醇與醯基鹵化物、活性酯之反應)、親電子取代(例如烯胺反應)以及碳-碳及碳-雜原子多重鍵加成(例如邁克爾反應、狄爾斯-阿德耳加成)。此等及其他適用反應論述於例如以下文獻中:March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY,第3版,John Wiley & Sons,New York,1985;Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES,Academic Press,San Diego,1996;及Feeney等人,MODIFICATION OF PROTEINS;Advances in Chemistry Series,第198卷,American Chemical Society,Washington,D.C.,1982。在諸多
實施例中,硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯骨架聚合物或非細胞穿透蛋白質藉由硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯骨架聚合物(例如單硫代磷酸酯)或非細胞穿透蛋白質之組分與生物素結合結構域或生物素結構域之組分(例如胺基酸)之間的非共價化學反應而非共價連接於生物素結合結構域或生物素結構域。在其他實施例中,硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯骨架聚合物或非細胞穿透蛋白質包括一或多個反應部分,例如,如本文中所描述之共價反應部分(例如,胺基酸反應部分,諸如乙烯碸部分(-S(O)2CH=CH2))。
包括用於本文中之結合化學反應之共價反應部分或官能基之適用反應部分包括例如:(a)羧基及其各種衍生物,包括,但不限於,N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基苯并三唑酯、醯鹵、醯基咪唑、硫酯、對硝基苯酯、烷基、烯基、炔基及芳族酯;(b)可轉化成酯、醚、醛等之羥基;(c)鹵烷基,其中稍後可用諸如例如胺、羧酸根陰離子、硫醇陰離子、碳陰離子或醇鹽離子之親核基團置換鹵化物,從而將新基團共價連接在鹵素原子之位點上;(d)能夠參與狄爾斯-阿爾德反應之親二烯基團,舉例而言,諸如馬來醯亞胺基;(e)醛或酮基,使得有可能經由形成諸如例如亞胺、腙、半卡腙或肟之羰基衍生物或經由諸如格林納加成或烷基鋰加成之機制來進行後續衍生化;(f)磺醯鹵化物基團,其用於與胺進行後續反應以例
如形成磺醯胺;(g)硫醇基,其可轉化成二硫化物、與醯基鹵化物反應或與諸如金之金屬鍵結;(h)胺或硫氫基,其可例如經醯化、烷基化或氧化;(i)烯烴,其可進行例如環加成、醯化、邁克爾加成等;(j)環氧化物,其可與例如胺及羥基化合物反應;(k)適用於核酸合成之亞磷醯胺及其他標準官能基;(l)金屬氧化矽鍵結;(m)與反應性含磷基團(例如膦)鍵結以形成例如磷酸二酯鍵之金屬;及(n)碸,例如乙烯碸。
可選擇反應性官能基以使得其不參與或干擾本文中所描述之蛋白質的化學穩定性。舉例而言,核酸可包括乙烯碸或其他反應性部分。舉例而言,具有乙烯碸反應性部分之核酸可由具有S-S-R部分之核酸形成,其中R為-(CH2)6-OH。具有乙烯碸之核酸可進一步由具有末端磷酸酯(PS)之核酸形成。
「對照」或「標準對照」係指充當參考(通常為已知參考)的樣品、量測值或值,以便比較測試樣品、量測值或值。舉例而言,測試樣品可取自疑似患有指定疾病(例如自體免疫性疾病、炎性自體免疫性疾病、癌症、感染性疾病、免疫疾病或其他疾病)之患者,且與已知正常(未患病)個體(例如標準對照個體)相比較。標準對照亦可表示自未患有指定疾病之類似個體(例如標準對照個體)群體(亦
即,標準對照群體),例如具有類似醫學背景、相同年齡、體重等之健康個體收集的平均量測值或值。標準對照值亦可獲自同一個體,例如在疾病發作之前獲自該患者之早期獲得之樣品。熟習此技術領域者應認識到,可設計標準對照以評估任何數目之參數(例如RNA含量、蛋白質含量、特定細胞類型、特定體液、特定組織、滑膜細胞、滑膜液、滑膜組織、纖維母細胞樣滑膜細胞、巨噬細胞樣滑膜細胞等)。
熟習此技術領域者應理解何種標準對照最適合指定情形且能夠基於與標準對照值之比較來分析資料。標準對照對於確定資料之顯著性(例如統計顯著性)亦為有價值的。舉例而言,若指定參數之值在標準對照中廣泛變化,則在測試樣品中之變化將不被視為顯著。
術語「診斷」係指疾病(例如自體免疫性疾病、炎性自體免疫性疾病、癌症、感染性疾病、免疫性疾病或其他疾病)存在於個體中之相對概率。類似地,術語「預後」係指就疾病狀態而言,該個體中可能發生某一未來結果之相對概率。舉例而言,在本發明之上下文中,預後可能係指個體將發展疾病(例如自體免疫性疾病、炎性自體免疫性疾病、癌症、感染性疾病、免疫性疾病或其他疾病)之可能性或該疾病之可能嚴重程度(例如疾病持續時間)。如熟習醫學診斷領域者應瞭解,該等術語不意欲為絕對的。
「生物樣品」或「樣品」係指獲自或來源於個體或患者之物質。生物樣品包括組織切片,諸如活檢及屍
檢樣品,以及出於組織學目的而獲取之冷凍切片。該等樣品包括體液,諸如血液及血液級分或產物(例如血清、血漿、血小板、紅血球等)、痰液、組織、經培養之細胞(例如原代培養物、外植體及轉型細胞)、糞便、尿液、滑膜液、關節組織、滑膜組織、滑膜細胞、纖維母細胞樣滑膜細胞、巨噬細胞樣滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、纖維母細胞、巨噬細胞、T細胞等。生物樣品典型地獲自真核生物體,諸如哺乳動物,諸如靈長類動物,例如黑猩猩或人類;奶牛;狗;貓;嚙齒動物,例如豚鼠、大鼠、小鼠;兔;或鳥;爬行動物;或魚。
如本文中所使用之「細胞」係指進行足以保留或複製其基因組DNA之代謝或其他功能之細胞。可藉由此技術領域中所熟知的方法來鑑別細胞,包括例如完整膜之存在、藉由特定染料進行染色、產生子代之能力,或在配子之情況下與第二配子組合以產生成活後代之能力。細胞可包括原核細胞及真核細胞。原核細胞包括,但不限於,細菌。真核細胞包括,但不限於,酵母細胞以及衍生於植物及動物之細胞,例如哺乳動物、昆蟲(例如斜紋夜蛾屬)及人類細胞。當細胞係天然不黏連或已經處理而不黏附於表面(例如藉由胰蛋白酶處理)時為可適用的。
細胞穿透結合物
本文中尤其提供包括與硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架連接之非細胞穿透蛋白質(例如抗體)的細胞穿透結合物。非細胞穿透蛋白質經由非共價連接
子連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架,該連接子包括生物素結合對之第一成員及生物素結合對之第二成員。生物素結合對之第一成員可為生物素結合結構域(例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白)或生物素結構域(例如生物素)。生物素結合對之第二成員可為生物素結合結構域(例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白)或生物素結構域(例如生物素)。非共價連接子係由生物素結合對之第一成員與生物素結合對之第二成員之間的非共價結合形成。在諸多實施例中,生物素結合對之第一成員為生物素結合結構域(例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白),且生物素結合對之第二成員為生物素結構域(例如生物素)。在諸多實施例中,生物素結合對之第一成員為生物素結構域(例如生物素),且生物素結合對之第二成員為生物素結合結構域(例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白)。
生物素結合對之第一成員及生物素結合對之第二成員可共價或非共價連接於非細胞穿透蛋白質、硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架。在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質共價連接於生物素結合對之第一成員(例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白),且硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架共價連接於生物素結合對之第二成員(例如生物素)。硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架經由非共價連接子連接形成本文中所提供之能夠藉由穿透進入細胞之非細胞穿透蛋白質。出於治療及診斷目的,本文中所提供之結合物尤其適用於細胞內遞送抗
體及靶向細胞內標靶(例如信號傳導蛋白質)。
在一個態樣中,提供一種細胞穿透結合物。該細胞穿透結合物包括(i)非細胞穿透蛋白質;(ii)硫代磷酸酯核酸;及(iii)連接該硫代磷酸酯核酸與該非細胞穿透蛋白質之非共價連接子。該非共價連接子包括非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域,且該硫代磷酸酯核酸增強該非細胞穿透蛋白質之細胞內遞送。
該非細胞穿透蛋白質可經由非共價連接子連接於硫代磷酸酯聚合物骨架。因而,在另一態樣中,提供細胞穿透結合物。該細胞穿透結合物包括(i)非細胞穿透蛋白質、(ii)硫代磷酸酯聚合物骨架及(iii)連接該硫代磷酸酯聚合物骨架與該非細胞穿透蛋白質之非共價連接子。該非共價連接子包括非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域,且該硫代磷酸酯聚合物骨架增強該非細胞穿透蛋白質之細胞內遞送。如以上所論述,聚合物骨架含有與核酸序列相同之結構(亦即,含有連接在一起之兩個或更多個糖殘基之鏈),例外之處在於該聚合物骨架缺乏正常情況下存在於核酸序列中之鹼基。亦提供包含該細胞穿透結合物之細胞。
在諸多實施例中,該生物素結合結構域為抗生物素蛋白結構域。在諸多實施例中,該生物素結合結構域為鏈黴抗生物素蛋白結構域。在諸多實施例中,鏈黴抗生物素蛋白結構域結合複數個生物素結構域。在諸多實施例中,鏈黴抗生物素蛋白結構域結合約四個生物素結構
域。在諸多實施例中,生物素結合結構域連接於非細胞穿透蛋白質。在諸多實施例中,生物素結合結構域共價連接於非細胞穿透蛋白質。在諸多實施例中,生物素結合結構域非共價連接於非細胞穿透蛋白質。在諸多實施例中,複數個生物素結合結構域連接於非細胞穿透蛋白質。在諸多實施例中,生物素結合結構域連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架。在諸多實施例中,生物素結合結構域共價連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架。在諸多實施例中,生物素結合結構域非共價連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架。在諸多實施例中,複數個生物素結合結構域連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架。在諸多實施例中,生物素結合結構域非共價連接於生物素結構域,從而形成非共價連接子。
在諸多實施例中,生物素結構域連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架。在諸多實施例中,生物素結構域共價連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架。在諸多實施例中,生物素結構域非共價連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架。在諸多實施例中,複數個硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架連接於生物素結構域。在諸多實施例中,生物素結構域連接於非細胞穿透蛋白質。在諸多實施例中,生物素結構域共價連接於非細胞穿透蛋白質。在諸多實施例中,生物素結構域非共價連接於非細胞穿透蛋白質。在諸多實施例中,複數個生物素結構域連接於非細胞穿透蛋白質。在諸
多實施例中,生物素結構域非共價連接於生物素結合結構域,從而形成非共價連接子。
如以上所論述,核酸,例如硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架,經由包括生物素結合結構域(例如抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白)及生物素結構域之非共價連接子連接於非細胞穿透蛋白質。核酸,例如硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架,可經由多種機制連接於生物素結合結構域或生物素結構域。類似地,非細胞穿透蛋白質可經由多種機制連接於生物素結合結構域或生物素結構域。硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯聚合物骨架或非細胞穿透蛋白質可共價或非共價連接於生物素結合結構域或生物素結構域。非細胞穿透蛋白質可共價結合於生物素結合結構域或生物素結構域。在非細胞穿透蛋白質共價結合於生物素結合結構域或生物素結構域之情況下,生物素結合結構域或生物素結構域共價結合該蛋白質之胺基酸。在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質包括共價反應部分(如以上所論述),且反應部分與生物素結合結構域或生物素結構域反應。在諸多實施例中,生物素結合結構域或生物素結構域包括共價反應部分,且該反應部分與非細胞穿透蛋白質反應。
在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架包括共價反應部分,且該反應部分與生物素結合結構域或生物素結構域反應。如以上所描述,共價反應部分可與該蛋白質之離胺酸、精胺酸、半胱胺酸或
組胺酸(例如,與胺基酸側鏈)反應。在諸多實施例中,共價反應部分與半胱胺酸反應。該共價反應部分可為乙烯碸。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架包括具有式S-S-R之反應部分,其中R為保護基。在諸多實施例中,R為己醇(單價取代基)。如本文中所使用,術語己醇包括具有式C6H13OH之化合物,且包括1-己醇、2-己醇、3-己醇、2-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、3-甲基-2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-3-戊醇、2,2-二甲基-1-丁醇、2,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇及2-乙基-1-丁醇。在諸多實施例中,R為1-己醇。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸共價結合於生物素結合結構域或生物素結構域。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸包括反應部分。在諸多實施例中,該反應部分為乙烯碸或如以上所描述之具有式S-S-R之反應部分。在諸多實施例中,R為己醇,例如1-己醇。
在諸多實施例中,當複數個硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架連接於生物素結合結構域或生物素結構域時,該複數之各者可共價或非共價連接。在諸多實施例中,當複數個生物素結合結構域或生物素結構域連接於非細胞穿透蛋白質時,該複數個各自可共價或非共價連接。硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯聚合物骨架或非細胞穿透蛋白質可含有促進硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯聚合物骨架或非細胞穿透蛋白質與生物素結合結構域或生物
素結構域之連接的反應部分,例如胺基酸反應部分或共價反應部分。因而,硫代磷酸酯核酸、硫代磷酸酯聚合物骨架或非細胞穿透蛋白質可經由如本文中所描述之反應部分連接於生物素結合結構域或生物素結構域。
提供複數種細胞穿透結合物,其包括經由非共價連接子連接於硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架的非細胞穿透蛋白質,該非共價連接子包括與生物素結構域非共價結合之生物素結合結構域(例如抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白)。硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架共價或非共價連接於非共價連接子之生物素結合結構域或生物素結構域。在諸多實施例中,該複數種包括共價連接於生物素結合結構域或生物素結構域之硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架,且不包括具有非共價連接之硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架的生物素結合結構域或生物素結構域。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架非共價連接於生物素結合結構域或生物素結構域,且該複數種不包括具有共價連接之硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架的生物素結合結構域或生物素結構域。在一些實施例中,該複數種包括一或多個包括非共價連接之硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架之生物素結合結構域或生物素結構域,及一或多個包括共價連接之硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架之生物素結合結構域或生物素結構域。因而,該複數種可包括有包含非共價及共價連接之硫代磷酸酯核酸或硫代
磷酸酯聚合物骨架的生物素結合結構域或生物素結構域。
在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架之長度為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個核酸殘基。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架之長度為約10至約30個核酸殘基。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架之長度為約20個核酸殘基。在諸多實施例中,各核酸或聚合物骨架之長度可為至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個核酸殘基或糖殘基。在諸多實施例中,各硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架之長度獨立地為5至50、10至50、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、45至50、5至75、10至75、15至75、20至75、25至75、30至75、35至75、40至75、45至75、50至75、55至75、60至75、65至75、70至75、5至100、10至100、15至100、20至100、25至100、30至100、35至100、40至100、45至100、50至100、55至100、60至100、65至100、70至100、75至100、80
至100、85至100、90至100、95至100或更多個殘基。在諸多實施例中,各硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架之長度獨立地為10至15、10至20、10至30、10至40或10至50個殘基。
在諸多實施例中,一個硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架之長度不同於另一硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架。舉例而言,若兩個硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架經由非共價連接子連接於非細胞穿透蛋白質,則第一硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架可具有一種長度(例如22個殘基),且第二硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架可具有不同的長度(例如25個殘基)。因而,若複數個硫代磷酸酯核酸及硫代磷酸酯聚合物骨架經由非共價連接子連接於非細胞穿透蛋白質,則硫代磷酸酯核酸及硫代磷酸酯聚合物骨架可具有許多不同的長度,例如長度介於10至30個殘基之範圍內。
在諸多實施例中,複數個硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架經由複數個包括與生物素結構域非共價結合之生物素結合結構域的非共價連接子連接於非細胞穿透蛋白質。在諸多實施例中,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架連接於該蛋白質。在諸多實施例中,複數個硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架連接於非共價連接子之生物素結合結構域或生物素結構域。在諸多實施例中,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更
多個硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架連接於非共價連接子之生物素結合結構域或生物素結構域。在諸多實施例中,複數個生物素結合結構域或生物素結構域連接於該蛋白質。在諸多實施例中,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個生物素結合結構域或生物素結構域連接於該蛋白質。
在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質具有超過25kD之分子量。在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質具有約25kD至約750kD之分子量。因而,非細胞穿透蛋白質可具有至少約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750或更多千道爾頓(kD)之分子量。在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質具有至少約25至100
kD、至少約25至150kD、至少約25至200kD、至少約25至250kD、至少約25至300kD、至少約25至350kD、至少約25至400kD、至少約25至450kD、至少約25至500kD、至少約25至550kD、至少約25至600kD、至少約25至650kD、至少約25至700kD或至少約25至750kD之分子量。
在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質為抗體。如以上更詳細論述,抗體可為全長抗體,諸如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗體或其片段。在諸多實施例中,抗體為IgG抗體或其片段。在諸多實施例中,抗體為IgG抗體或其片段。在諸多實施例中,抗體為Fv片段或人類化抗體。在諸多實施例中,抗體為IgA、IgM/、IgD或IgE抗體。在諸多實施例中,抗體為Fv片段。在諸多實施例中,抗體為人類化抗體。因而,提供經由包括生物素結合結構域及生物素結構域之非共價連接子連接於硫代磷酸酯核酸或聚合物骨架之抗體,其中該硫代磷酸酯核酸或聚合物骨架增強抗體向細胞中之遞送。在諸多實施例中,抗體為治療性抗體,亦即,用於治療疾病之抗體。因而,亦提供連接於一或多個硫代磷酸酯核酸或聚合物骨架之治療性抗體,其中該抗體結合細胞內標靶。
在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶。細胞內標靶可為位於細胞內之治療標靶或診斷標靶或其他相關標靶,例如標靶或結構,例如組蛋白,以便例如藉由共焦顯微術成像。因而,提供與細胞內標靶
結合之細胞穿透結合物。在諸多實施例中,該細胞內標靶為選自由自體免疫性疾病、炎性疾病、代謝病症、發育病症、心血管疾病、肝病、腸病、感染性疾病、內分泌疾病、神經系統病症及癌症組成之群之疾病的標靶。細胞內標靶之實例包括,但不限於,致癌轉錄因子,包括,但不限於,STAT3、Myc、NFkB、AP1、HIF、突變p53;致癌蛋白,包括,但不限於,Ras、Raf、MAPK、PI3激酶、AKT、BTK、JAK、SRC家族成員;免疫調節分子,包括FOXp3、T-BET、GATA3、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6。疾病之標靶可為與該疾病相關之診斷標靶或治療標靶或其他相關標靶。癌症之例示性細胞內標靶包括,但不限於,STAT(例如STAT3)、NFκ B、PKB/Akt、Myc家族成員、類固醇激素受體(例如雌激素受體)、類固醇激素受體之配體(例如週期素D1)、受體酪胺酸激酶(RTK)、EGFR、VEGFR、PDGFR、Src家族成員、Ras、Abl、BCR-Abl、NPM-Alk、Janus激酶(JAK)、Brutun氏酪胺酸激酶(BTK)及病毒致癌蛋白(例如EBV蛋白或HPV蛋白,例如E6及E7)。在諸多實施例中,感染性疾病之細胞內標靶為病毒蛋白質或病毒轉錄產物。因而,細胞內標靶可為人類免疫缺乏病毒(HIV)、流感病毒、單純性皰疹病毒、埃-巴二氏病毒、巨細胞病毒、人類乳頭狀瘤病毒或肝炎病毒之病毒蛋白質或病毒轉錄產物。在諸多實施例中,細胞內標靶為DNA結合蛋白,包括,但不限於,轉錄因子、轉錄增強子、轉錄阻遏子、組蛋白或經轉譯後修飾之組蛋白。在諸多實施例中,細胞內標靶
為經表觀基因修飾之DNA,例如甲基化或羥甲基化胞嘧啶(5mC或5hmC)、5-甲醯基胞嘧啶(5fC)及5-羧基胞嘧啶(5caC)。在諸多實施例中,細胞內標靶為核酸,例如RNA轉錄產物或核酸。舉例而言,細胞內標靶可為感染性病原體,例如寄生蟲、病毒或細菌之核酸。在諸多實施例中,細胞內標靶為信號傳導分子或轉錄因子。在諸多實施例中,信號傳導分子為磷酸酶或激酶。在諸多實施例中,細胞內標靶為癌症標靶或位於癌細胞內。在諸多實施例中,細胞內標靶為STAT,例如STAT3或輸出蛋白7。在諸多實施例中,細胞內標靶係選自由STAT3、輸出蛋白7及Src組成之群。在諸多實施例中,細胞內標靶為磷酸化Src。在諸多實施例中,細胞內標靶為FOXp3。在諸多實施例中,細胞內標靶為T-BET。在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質進一步包含連接於該蛋白質之標記、小分子或功能核酸。在諸多實施例中,細胞穿透結合物與細胞內標靶結合。
細胞組成物
在另一態樣中,提供一種包括本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)的細胞。提供包括一或多種所提供之細胞穿透結合物的細胞,例如,該等細胞可包括複數種細胞穿透結合物。在諸多實施例中,該細胞為癌細胞。在諸多實施例中,該細胞為非癌細胞。在諸多實施例中,該細胞為T細胞。在諸多實施例中,該細胞為調節性T細胞。在諸多實施例中,該結合物在該細胞內與細胞內標靶結合。舉例而言,該等細胞可包括經由包括與
生物素結構域非共價結合之生物素結合結構域的非共價連接子連接於一或多個硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物骨架的第一非細胞穿透蛋白質及第二非細胞穿透蛋白質。該第一非細胞穿透蛋白質及該第二非細胞穿透蛋白質可在該細胞內與細胞內標靶結合。在諸多實施例中,相對於該第一非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶上之不同的抗原決定基。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。在諸多實施例中,該第一及/或第二非細胞穿透蛋白質為抗體。因而,該第一非細胞穿透蛋白質及該第二非細胞穿透蛋白質可為相同的蛋白質或不同的蛋白質。
醫藥組成物
本文中提供包含細胞穿透結合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。所提供之組成物尤其適合於活體外或活體內調配及投與。適合之載劑及賦形劑及其調配物描述於Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,David B.Troy編,Lippicott Williams & Wilkins(2005)中。醫藥學上可接受之載劑意謂在生物學或其他方面不是非所欲之物質,亦即,將所述物質投與個體而不會造成非所欲之生物學效應或以有害方式與含有其之醫藥組成物中的其他組分相互作用。若投與個體,則視情況選擇載劑以減少活性成分之降解並減少在個體中之不利副作用。
本發明所提供之醫藥組成物包括其中活性
成分(例如本文中所描述之組成物,包括實施例或實例)以治療有效量,亦即,以可有效達成其預定目的之量包含在內的組成物。可有效用於特定應用之實際量將尤其視所治療之病狀而定。當在諸多方法中投與本文中所描述之重組蛋白質以治療疾病時,該重組蛋白質將含有可有效達成所欲結果(例如調節標靶分子之活性及/或減輕、消除或減緩疾病症狀之進展)之活性成分用量。本發明化合物之治療有效量之確定完全在熟習此技術領域者之能力範圍內,尤其是根據本文中之詳細揭示內容。
在另一態樣中,提供一種醫藥組成物,其包括本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)及醫藥學上可接受之載劑。在諸多實施例中,該醫藥組成物進一步包括第二非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質包括連接一或多個硫代磷酸酯核酸與該第二非細胞穿透蛋白質之第二非共價連接子。在諸多實施例中,該非共價連接子包括非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶。在諸多實施例中,相對於本文中所提供之非細胞穿透蛋白質,包括其實施例,該第二非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶上之不同的抗原決定基。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質為抗體。
所提供之組成物可包括單一藥劑或多於一種藥劑。在一些實施例中,該等組成物進一步包括經由包
括與生物素結構域非共價結合之生物素結合結構域的非共價連接子連接於一或多個硫代磷酸酯核酸或聚合物骨架的第二非細胞穿透蛋白質。因而,本文中提供諸多組成物,其包括包含經由第一非共價連接子連接於一或多個硫代磷酸酯核酸或聚合物骨架的第一非細胞穿透蛋白質的第一細胞穿透結合物,及包含經由第二非共價連接子連接於一或多個硫代磷酸酯核酸或聚合物骨架的第二非細胞穿透蛋白質的第二細胞穿透結合物,該第一非共價連接子包括與第一生物素結構域非共價結合之第一生物素結合結構域,而該第二非共價連接子包括與第二生物素結構域非共價結合之第二生物素結合結構域。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶。在諸多實施例中,相對於該第一非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶上之不同的抗原決定基。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。在諸多實施例中,該第一及/或第二非細胞穿透蛋白質為抗體。該第一非細胞穿透蛋白質及該第二非細胞穿透蛋白質可為相同的蛋白質或不同的蛋白質。
用於投與之組成物通常將包括溶解於醫藥學上可接受之載劑(較佳為水性載劑)中的如本文中所描述之藥劑。可使用多種水性載劑,例如緩衝生理鹽水及其類似物。此等溶液為無菌的且一般不含非所欲之物質。此等組成物可藉由習知、熟知滅菌技術進行滅菌。該等組成物可視需要含有醫藥學上可接受之輔助物質以接近生理條
件,諸如pH值調節及緩衝劑、毒性調節劑等,例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。活性劑在此等調配物中之濃度可廣泛變化,且將主要基於流體體積、黏度、體重等因素根據所選擇之特定投與模式及患者之需要加以選擇。
可在與諸如羥丙基纖維素之界面活性劑適當地混合的水中製備呈游離鹼或藥理學上可接受之鹽形式的活性化合物之溶液。亦可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及油類中製備分散液。在普通儲存及使用條件下,此等製劑可含有防腐劑以防止微生物生長。
醫藥組成物可經由鼻內或可吸入溶液或噴霧、氣霧劑或吸入劑遞送。鼻用溶液可為經設計以便以滴劑或噴霧形式投與鼻道之水溶液。可製備鼻用溶液,使得其在許多方面類似於鼻分泌物。因而,水性鼻用溶液通常為等滲溶液且稍加緩衝以維持pH 5.5至6.5。另外,可視需要在該調配物中包括與眼用製劑中所使用者類似之抗微生物防腐劑及適當藥物安定劑。各種市售鼻用製劑為已知的,且可包括例如抗生素及抗組胺劑。
經口調配物可包括賦形劑,例如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。此等組成物呈溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉劑形式。在一些實施例中,經口醫藥組成物將包含惰性稀釋劑或可同化之可食用載劑,或其可封裝於硬殼或軟殼明膠膠囊中,或其可壓製成錠劑,或其可
直接併入日常飲食之食物中。對於經口治療投與而言,該等活性化合物可與賦形劑合併且以可攝入錠劑、經頰錠劑、喉錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙及其類似形式使用。該等組成物及製劑應含有至少0.1%活性化合物。固然,該等組成物及製劑之百分比可變化,且可能適宜佔單位劑量重量之約2%至約75%或較佳為25%至60%。該等組成物中之活性化合物的量得以為可獲得之適合劑量。
對於呈水溶液形式之非經腸投與,舉例而言,該溶液應經適當緩衝且首先用足量生理鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑為等滲。處於特定無菌水性介質中之水溶液尤其適合於靜脈內、肌肉內、皮下及腹膜內投與。舉例而言,可將一個劑量溶解於1ml等滲NaCl溶液中且溶液添加至1000ml皮下灌注液或在所提議之輸注位點注射。
可藉由將活性化合物或構建物以所需量併入適當溶劑中,隨後進行過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般而言,藉由將多種滅菌活性成分併入含有基本分散介質之無菌媒劑中來製備分散液。可使用能產生活性成分加任何額外所要成分之粉末的真空乾燥及凍乾技術來製備無菌粉末以便復原無菌可注射溶液。亦涵蓋製備更濃或高度濃縮之溶液以用於直接注射。DMSO可用作溶劑以達成極快穿透,從而將較高濃度之活性劑遞送至較小區域。
化合物之調配物可以單位劑量或多劑量密封容器形式存在,諸如安瓿及小瓶。因而,組成物可呈單
位劑型。在此種形式下,將製劑再分成含有適量活性組分之單位劑量。因而,該等組成物可視投與方法而定呈多種單位劑型投與。舉例而言,適合於經口投與之單位劑型包括,但不限於,粉劑、錠劑、丸劑、膠囊及口含錠。
投與哺乳動物之劑量及頻率(單劑量或多劑量)可視多種因素而變化,舉例而言,哺乳動物是否罹患另一疾病及其投與途徑;接受者之體型、年齡、性別、健康狀況、體重、身體質量指數及日常飲食;所治療之疾病症狀之性質及程度(例如癌症之症狀及該等症狀之嚴重程度)、並行治療之種類、所治療之疾病的併發症或其他健康相關問題。其他治療方案或藥劑可與本發明之方法及化合物聯合使用。確定劑量之調節及控制(例如頻率及持續時間)完全在熟習此技術領域者之能力範圍內。
對於本文中所描述之任何組成物(例如所提供之細胞穿透結合物),可根據細胞培養分析法初步確定治療有效量。目標濃度應為能夠達成本文中所描述之方法的活性化合物濃度,如使用本文中所描述或此技術領域中已知的方法所量測。如此技術領域中所熟知,用於人類之有效量亦可由動物模式確定。舉例而言,用於人類之劑量可經調配以達成發現在動物中有效之濃度。如以上所描述,可藉由監測有效性並向上或向下調節劑量來調節在人類中之劑量。基於以上所描述之方法及其他方法調節劑量以便在人類中達成最大效力完全在熟習此技術領域者之能力範圍內。
劑量可視患者之要求及所採用之化合物而變化。在本發明之上下文中,投與患者之劑量應足以在一段時間內在患者中實現有益治療反應。劑量大小亦將由任何不利副作用之存在、性質及程度決定。適用於特定情形之劑量之確定在執行者之能力範圍內。一般而言,以小於化合物之最佳劑量的較小劑量開始治療。此後,以較小增量增加劑量,直至在諸多情形下達成最佳效應。
可個別地調節劑量及間隔以提供對所治療之特定臨床適應症有效之化合物投與水準。由此將提供與個體疾病狀態之嚴重程度相稱的治療方案。
利用本文中所提供之教示,可規劃不造成實質性毒性卻又可有效治療特定患者所顯示之臨床症狀的有效預防性或治療性治療方案。此規劃應包括藉由考慮諸如化合物效力、相對生物利用率、患者體重、不利副作用之存在及嚴重程度、較佳之因素來謹慎選擇活性化合物。
「醫藥學上可接受之賦形劑」及「醫藥學上可接受之載劑」係指有助於活性劑投與個體且被其吸收並且可包括在本發明組成物中而不會對患者造成顯著不利毒理學效應的物質。醫藥學上可接受之賦形劑的非限制性實例包括水、NaCl、標準生理鹽水溶液、乳酸鹽林格氏液、標準蔗糖溶液、標準葡萄糖溶液、黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑、包衣劑、甜味劑、調味劑、鹽溶液(諸如林格氏溶液)、醇、油、明膠、碳水化合物(諸如乳糖、直鏈澱粉或澱粉)、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶及顏
料及其類似物。可對該等製劑進行滅菌且在需要時與諸如潤滑劑、防腐劑、安定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響穿透壓之鹽、緩衝劑、著色劑及/或芳族物質及其不會與本發明化合物發生不利反應之類似物之助劑混合。熟習此技術領域者應認識到,其他醫藥賦形劑適用於本發明。
術語「醫藥學上可接受之鹽」係指來源於此技術領域中所熟知的多種有機及無機相對離子的鹽,且包括(僅舉例而言)鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨及其類似物;且當該分子含有鹼性官能度時,有機酸或無機酸之鹽,諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、草酸鹽及其類似鹽。
術語「製劑」意欲包括活性化合物與作為載劑之囊封物質之調配物,所提供者為膠囊,其中載劑圍繞活性組分(有或無其他載劑),由此與其締合。類似地,包括扁囊劑及口含錠。錠劑、粉劑、膠囊、丸劑、扁囊劑及口含錠可用作適於經口投與之固體劑型。
形成結合物之方法
在另一態樣中,提供一種形成細胞穿透結合物之方法。該方法包括使非細胞穿透蛋白質與硫代磷酸酯核酸接觸,其中該非細胞穿透蛋白質連接於生物素結合對之第一成員且該硫代磷酸酯核酸連接於該生物素結合對之第二成員,從而形成細胞穿透結合物,該細胞穿透結合物包括位於生物素結構域與生物素結合結構域之間的非共價鍵。如以上所描述,生物素結合對之第一成員可為生物
素結合結構域或生物素結構域,且生物素結合對之第二成員可為生物素結合結構域或生物素結構域。在諸多實施例中,生物素結合對之第一成員為生物素結合結構域。在諸多實施例中,生物素結合對之第二成員為生物素結構域。在諸多實施例中,生物素結合對之第一成員為生物素結構域。在諸多實施例中,生物素結合對之第二成員為生物素結合結構域。在諸多實施例中,硫代磷酸酯核酸包括共價反應部分。在諸多實施例中,生物素結合結構域與生物素結構域非共價結合形成非共價連接子。
遞送方法
在另一態樣中,提供一種向細胞中遞送非細胞穿透蛋白質之方法。該方法包括使該細胞與如本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)接觸。在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質結合細胞質中之核蛋白,從而形成非細胞穿透蛋白質-核蛋白複合物。在諸多實施例中,非細胞穿透蛋白質-核蛋白複合物不能夠進入細胞核。
在諸多實施例中,細胞穿透結合物用於診斷個體之疾病。因而,提供一種診斷個體之疾病之方法,其包括向該個體投與有效量之如本文中所描述之細胞穿透結合物或包含細胞穿透結合物之組成物。投與結合物可診斷個體之疾病或該疾病之一或多種症狀。所揭示之方法包括比較來自於測試樣品與對照樣品之生物標記物(例如,疾病之細胞內標靶)的含量或活性。如以上所論述,對照樣品或值係指充當參考之樣品(通常為已知參考),以用於比較
測試樣品。對照亦可表示自類似個體,例如具有類似醫學背景、相同年齡、體重等之癌症患者或健康個體之群體收集的平均值。對照值亦可獲自同一個體,例如在患病之前或在治療之前的早期獲得之樣品。亦如以上所論述,診斷係指疾病(例如自體免疫性疾病、炎性自體免疫性疾病、癌症、感染性疾病、免疫性疾病或其他疾病)存在於個體中之相對概率。
術語比較、相關聯及相關在關於確定疾病風險因素時,係指比較個體中之風險因素之存在或量(例如疾病之細胞內標靶之量)與其在已知罹患疾病或已知處在疾病風險下之個體或已知未患疾病之個體中的存在或量,且基於分析結果向個體分配增加或降低之罹患/發展該疾病之概率。
偵測方法
本文中提供一種在細胞中偵測細胞內標靶之方法,其包括使該細胞與如本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)接觸及偵測該細胞穿透結合物與該細胞內標靶之結合。細胞可為經固定之細胞或活細胞。在諸多實施例中,細胞位於活體外或活體內。可直接或間接偵測結合。應理解且本文中預期許多方法可用於偵測細胞穿透結合物與其細胞內標靶之結合。舉例而言,可藉由分析細胞穿透結合物與其細胞內標靶之偶合來直接偵測結合。舉例而言,可藉由自由如以下所描述之共免疫沈澱分析法、共定位分析法或螢光偏振分析法組成之群組中選擇分
析法來測定結合。該等分析法在此技術領域中為已知的,例如,參見Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2001);Dickson,Methods Mol.Biol.461:735-44(2008);Nickels,Methods 47(1):53-62(2009);及Zinchuk等人,Acta Histochem.Cytochem.40(4):101-11(2007)。
在諸多實施例中,藉由成像方法或系統來測定結合。因而,本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)亦可用於成像應用或其他應用以分析細胞內標靶含量及/或活性。舉例而言,所提供之細胞穿透結合物可用於相關細胞內標靶之活體外或活體內成像。在諸多實施例中,細胞穿透結合物用於活細胞成像。舉例而言,活細胞成像可用於監測活細胞內之細胞內標靶分佈及/或動力學性質,且亦適用於監測標靶相互作用。舉例而言,該等細胞穿透結合物可用於免疫沈澱及共免疫沈澱分析法中以研究細胞(在諸多實施例中,活細胞)中之蛋白質-蛋白質相互作用。在諸多實施例中,該等細胞穿透結合物用於藉由流式細胞測量術分析細胞內標靶。在成像應用中,細胞穿透結合物在諸多實施例中在對所使用之應用適當時係經標記。如以上所描述,標記或可偵測部分為可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理手段偵測之組成物。適用之標記包括,但不限於,32P、螢光染料、電子緻密試劑、酶(例如,如通常用於ELISA中)、生物素、毛地黃素或可使得可偵測之半抗原及蛋白質或其他實體,
例如藉由向與靶肽具有特異性反應性之肽或抗體中併入放射性標記。此技術領域中已知的用於結合抗體與標記之任何方法均可採用,例如,使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego中所描述之方法。
治療方法
本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)及包括如本文中所描述之細胞穿透結合物之組成物(包括其實施例)適用於預防性及治療性治療。對於預防性用途,在早期發作之前或期間(例如,在自體免疫性疾病之初步病徵及症狀時)將治療有效量之本文中所描述之藥劑投與個體。治療性治療包括在診斷或發展疾病之後向個體投與治療有效量之本文中所描述之藥劑。因而,在另一態樣中,提供一種治療有需要之個體之疾病的方法。該方法包括向個體投與有效量之如本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例),從而威脅該個體之該疾病。
在諸多實施例中,該方法包括向個體投與第二非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質包括連接一或多個硫代磷酸酯核酸與該第二非細胞穿透蛋白質之第二非共價連接子。在諸多實施例中,該非共價連接子包括非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域。在諸多實施例中,相對於本文中所提供之結合物,包括其實施例,該第二非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶上之不同的抗原決定基。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質
結合第二細胞內標靶。在諸多實施例中,同時投與本文中所提供之結合物(包括其實施例)及第二非細胞穿透蛋白質。在諸多實施例中,相繼投與本文中所提供之結合物(包括其實施例)及第二非細胞穿透蛋白質。
在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質為抗體。在諸多實施例中,該方法包括向該個體投與第二治療劑。在諸多實施例中,該疾病係選自由自體免疫性疾病、發育病症、炎性疾病、代謝病症、心血管疾病、肝病、腸病、感染性疾病、內分泌疾病、神經系統病症及癌症組成之群。在諸多實施例中,該疾病為自體免疫性疾病。在諸多實施例中,該疾病為發育病症。在諸多實施例中,該疾病為炎性疾病。在諸多實施例中,該疾病為代謝病症。在諸多實施例中,該疾病為心血管疾病。在諸多實施例中,該疾病為肝病。在諸多實施例中,該疾病為腸病。在諸多實施例中,該疾病為感染性疾病。在諸多實施例中,該疾病為內分泌疾病。在諸多實施例中,該疾病為神經系統病症。在諸多實施例中,該疾病為癌症。在諸多實施例中,該結合物之該非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶且該細胞內標靶為STAT3、輸出蛋白7或Src。在諸多實施例中,該結合物之該非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶且該細胞內標靶為磷酸化Src。在諸多實施例中,該結合物之該非細胞穿透蛋白質為特異性結合STAT3之抗體且該第二非細胞穿透蛋白質為特異性結合輸出蛋白7之抗體。在諸多實施例中,該結合物之該非細胞穿透蛋白質為特異性結合
STAT3之抗體且該第二非細胞穿透蛋白質為特異性結合STAT3之另一抗原決定基的抗體。
在所提供之治療方法中,可使用適合於所治療之疾病的附加治療劑。因而,在一些實施例中,所提供之治療方法進一步包括向該個體投與第二治療劑。適合之額外治療劑包括,但不限於,選自由止痛劑、麻醉劑、興奮劑、皮質類固醇、抗膽鹼激導性藥劑、抗膽鹼酯酶、抗驚厥劑、抗腫瘤劑、異位抑制劑、同化類固醇、抗風濕劑、精神療法、神經阻斷劑、消炎劑、驅蟲藥、抗生素、抗凝劑、抗真菌劑、抗組胺劑、抗毒蕈鹼劑、抗分支桿菌劑、抗原蟲劑、抗病毒劑、多巴胺激導劑、血液學藥劑、免疫學藥劑、毒蕈鹼、蛋白酶抑制劑、維生素、生長因子及激素組成之群的治療劑。藥劑及劑量之選擇可由熟習此技術領域者基於所治療之指定疾病而容易地確定。
藥劑或組成物之組合可伴隨(例如作為混合物)、單獨但同時(例如經由單獨靜脈管)或相繼(例如首先投與一種藥劑,繼而投與第二藥劑)投與。因而,術語組合用於指伴隨、同時或相繼投與兩種或更多種藥劑或組成物。最佳視個體之特定特徵及所選治療類型而逐一確定治療過程。治療(諸如本文中所揭示者)可每日一次、每日兩次、每週一次、每月一次或治療上有效之任何適用原則投與個體。治療可單獨或與本文中所揭示或此技術領域中已知的任何其他治療組合投與。可與第一治療同時、在不同的時間或按完全不同的治療時程投與額外治療(例如,第一治療
可為每日一次,而附加治療為每週一次)。
根據本文中所提供之方法,向個體投與有效量之本文中所提供之一或多種藥劑。術語有效量與有效劑量可互換使用。術語有效量定義為產生所要生理反應(即,減輕發炎)所必需的任何量。投與藥劑之有效量及時程可由熟習此技術領域者憑經驗確定。投藥之劑量範圍大到足以產生影響(例如減輕或延遲)疾病或病症之一或多種症狀的所要效應。劑量不應大到造成實質性不利副作用,諸如不需要之交叉反應、過敏反應及其類似作用。一般來說,劑量將隨年齡、病狀、性別、疾病類型、疾病或病症程度、投與途徑或方案中是否包括其他藥物而變化,且可由熟習此技術領域者確定。可由個別醫師調節劑量,以防存在任何禁忌。劑量可變化且可用每日投與一或多個劑量之方式投與一天或若干天。關於指定類別之藥物產品的適當劑量,指導可見於文獻中。舉例而言,對於指定參數,有效量將顯示增減至少5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、75%、80%、90%或至少100%。效力亦可表示為「倍」增減。舉例而言,治療有效量與對照相比可具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍效應。精確劑量及調配物將視治療目的而定,並且將可由熟習此技術領域者使用已知技術獲得(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1至3卷,1992);Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999);Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,
Gennaro編(2003);及Pickar,Dosage Calculations(1999))。
揭示可用於所揭示之方法及組成物、可與所揭示之方法及組成物聯合使用、可用於製備所揭示之方法及組成物或作為所揭示之方法及組成物的產物的物質、組成物及組分。本文中揭示此等及其他物質,且應理解,當揭示此等物質之組合、子集、相互作用、群組等時,儘管可能未明確揭示此等對此等化合物之各不同的個別及全體組合及排列的特定參考,但本文中明確涵蓋並描述每一者。舉例而言,若揭示並論述一種方法並且論述可對該方法中包括的多種分子進行的多種修飾,則除非明確相反指示,否則將明確涵蓋該方法之各個及每個組合及排列以及可能之修改。同樣,亦明確涵蓋並揭示此等之任何子集或組合。此原理適用於本發明之所有態樣,包括,但不限於,使用所揭示之組成物的方法中的步驟。因此,若可進行多個附加步驟,則應理解,此等附加步驟各自可與所揭示之方法的任何特定方法步驟或方法步驟之組合一起進行,且明確涵蓋並且應被視為揭示各此種組合或組合之子集。
術語「個體」、「患者」、「個人」等不意欲具有限制性且一般可互換。亦即,描述為「患者」之個體未必患有指定疾病,而可能僅僅尋求醫學建議。
如本文中所使用,「治療(treating或treatment)」病狀、疾病或病症或與病狀、疾病或病症相關之症狀係指用於獲得有益或所要結果,包括臨床結果之方法。有益或所要臨床結果可包括,但不限於,減輕或改善
一或多種症狀或病狀;減輕病狀、病症或疾病之程度;穩定病狀、病症或疾病之狀態;預防病狀、病症或疾病發展;預防病狀、病症或疾病擴散;延遲或減緩病狀、病症或疾病進展;延遲或減緩病狀、病症或疾病發作;改善或緩和病狀、病症或疾病狀態;及緩解,無論是部分緩解或是總體緩解。「治療」亦可意謂延長個體之存活時間超過不存在治療時預期之存活時間。「治療」亦可意謂抑制病狀、病症或疾病進展、暫時減緩病狀、病症或疾病進展,但在一些情況下,其包括永久停止病狀、病症或疾病之進展。如本文中所使用,術語治療係指減輕以蛋白酶之表現為特徵之疾病或病狀之一或多種症狀或該以蛋白酶之表現為特徵之疾病或病狀之症狀之影響的方法。因而,在所揭示之方法中,治療可能係指確定之疾病、病狀、或該疾病或病狀之症狀的嚴重程度降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。舉例來說,若個體中之一或多種疾病症狀與對照相比存在10%減輕,則用於治療該疾病之方法被視為治療。因而,該減輕可為同天然或對照水準相比10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或介於10%與100%之間的任何減輕百分比。應理解,治療未必指治癒或完全消除疾病、病狀或該疾病或病狀之症狀。此外,如本文中所使用,參考降低、減輕或抑制包括與對照水準相比變化10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大程度,且該等術語可包括但未必包括完全消除。
在預期組合治療之情況下,不意欲本文中所描述之藥劑(亦即,核糖核酸化合物)受該組合之特定性質限制。舉例而言,本文中所描述之藥劑可呈簡單混合物以及化學雜合物形式組合投與。後者之實例為藥劑共價連接於靶向載劑或活性藥物。共價結合可用多種方式實現,諸如,但不限於,使用市售交聯劑。
如本文中所使用,術語「醫藥學上可接受」與「生理學上可接受」及「藥理學上可接受」同義使用。醫藥組成物一般將包含用於緩衝及在儲存時防腐之試劑,且可包括緩衝劑及載劑以便適當遞送,視投與途徑而定。
「有效量」為足以實現所闡述之目的(例如達成投與所欲達成之效應、治療疾病、降低酶活性、減輕疾病或病狀之一或多種症狀)的量。「有效量」之實例為足以促成對疾病症狀之治療、預防或減輕的量,由此亦可稱為「治療有效量」。「減輕」症狀(及此片語之語法等效物)意謂降低該(等)症狀之嚴重程度或頻率或消除該(等)症狀。藥物之「預防有效量」為當投與個體時將具有預定預防效應,例如預防或延遲損傷、疾病、病變或或病狀發作(或復發),或降低損傷、疾病、病變或或病狀或其症狀發作(或復發)之可能性的量。完全預防效應未必在投與一個劑量後發生,而是可能僅在投與一系列劑量之後發生。因而,可在一或、多次投藥時投與預防有效量。如本文中所使用之「活性降低量」係指相對於不存在拮抗劑時降低酶或蛋白質之活性所需的拮抗劑的量。如本文中所使用之「功能破壞量」係指相
對於不存在拮抗劑時破壞酶或蛋白質之功能所需的拮抗劑的量。關於指定類別之藥物產品的適當劑量,指導可見於文獻中。舉例而言,對於指定參數,有效量將顯示增減至少5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、75%、80%、90%或至少100%。效力亦可表示為「倍」增減。舉例而言,治療有效量與對照相比可具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍效應。精確量將視治療目的而定,並且將可由熟習此技術領域者使用已知技術獲得(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992);Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999);Pickar,Dosage Calculations(1999);及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro編,Lippincott,Williams & Wilkins)。
如本文中所使用,術語「投與」意謂向個體經口投與、作為栓劑投與、局部接觸、靜脈內、腹膜內、肌肉內、病變內、鞘內、鼻內或皮下投與、或植入緩慢釋放裝置,例如,微型滲透泵。投與係藉由任何途徑,包括非經腸及經黏膜(例如經口腔、舌下、上顎、齒齦、鼻、陰道、直腸或經皮)。非經腸投與包括例如靜脈內、肌肉內、微動脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內及顱內。其他遞送模式包括,但不限於,使用脂質體調配物、靜脈內輸注、經皮貼片等。「共同投與」意謂本文中所描述之組成物在投與一或多額外療法(例如癌症療法,諸如化學療法、激素療法、放射療法或免疫療法)的同時、之前或之後投與。本發
明化合物可單獨投與,或可共同投與患者。共同投與意欲包括同時或相繼投與呈個別或組合(多於一種化合物)形式之化合物。因而,該等製劑當需要時亦可與其他活性物質組合(例如減輕代謝降解)。本發明之組成物可藉由經皮遞送,藉由局部途徑遞送,調配為投藥棒、溶液、懸浮液、乳液、凝膠、乳膏、軟膏、糊劑、膠狀物、油漆、粉末及氣霧劑。
本發明之組成物可另外包括諸多組分以提供持續釋放及/或安慰。該等組分包括高分子量陰離子類黏膜聚合物、膠化多糖及細粉狀藥物載劑基質。美國專利第4,911,920號、第5,403,841號、第5,212,162號及第4,861,760號中更詳細論述此等組分。此等專利之整個內容係出於所有目的而以全文引用之方式併入本文中。本發明之組成物亦可作為微球體遞送以便在體內緩慢釋放。舉例而言,微球體可經由皮內注射可在皮下緩慢釋放之含藥物微球體(參見Rao,J.Biomater Sci.Polym.Ed.7:623-645,1995、作為生物可降解且可注射之凝膠調配物(參見例如Gao Pharm.Res.12:857-863,1995)或作為經口投與微球體(參見例如Evles,J.Pharm.Pharmacol.49:669-674,1997)來投與。在諸多實施例中,本發明組成物之調配物可藉由使用與細胞膜融合或被吞噬之脂質體,亦即,藉由採用可結合細胞之表面膜蛋白受體從而引起吞噬之連接於脂質體之受體配體來遞送。藉由使用脂質體,尤其是在脂質體表面攜帶標靶細胞特異性受體配體或優先針對特定器官之情況下,吾等可
聚焦於本發明組成物向標靶細胞中之活體內遞送。(參見例如Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-306,1996;Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995;Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989)。本發明之組成物亦可作為奈米粒子遞送。
利用本文中所提供之教示,可規劃不造成實質性毒性卻又可有效治療特定患者所顯示之臨床症狀的有效預防性或治療性治療方案。此規劃應包括藉由考慮諸如化合物效力、相對生物利用率、患者體重、有害副作用之存在及嚴重程度、較佳投藥模式及所選藥劑之毒性概況之因素來謹慎選擇活性化合物。
「抗癌藥劑」係根據其普通含義使用並且係指具有抗腫瘤性質或抑制細胞生長或增殖之能力的組成物(例如化合物、藥物、拮抗劑、抑制劑、調節劑)。在諸多實施例中,抗癌劑為化學治療劑。在諸多實施例中,抗癌劑為本文中所鑑別之在治療癌症之方法中具有效用的藥劑。在諸多實施例中,抗癌劑為由FDA或除美國以外之國家的類似管理機構批准用於治療癌症的藥劑。
套組
在另一態樣中,提供一種包括本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)或如本文中所提供之醫藥組成物(包括其實施例)及使用說明的套組。在諸多實施例中,該套組包括第二非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質包括連接一或多個硫代磷酸酯核酸與該第二
非細胞穿透蛋白質之第二非共價連接子。在諸多實施例中,該第二非共價連接子包括非共價結合於第二生物素結構域之第二生物素結合結構域。在諸多實施例中,本文中所提供之結合物(包括其實施例)及第二非細胞穿透蛋白質處於單獨的容器中。在諸多實施例中,相對於本文中所提供之非細胞穿透蛋白質,包括其實施例,該第二非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶上之不同的抗原決定基。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質調配為包括第二非細胞穿透蛋白質及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。在諸多實施例中,該第二非細胞穿透蛋白質為抗體。在諸多實施例中,該套組包括用於治療或預防疾病之一或多種症狀的一或多種附加藥劑。在諸多實施例中,該套組包括投與該組成物之構件,舉例而言,諸如注射器、針、管、導管、貼片及其類似物。該套組亦可包括需要在使用前滅菌及/或稀釋之調配物及/或物質。
實例
實例1
本申請人證明具有20聚體長度之硫代磷酸酯化(PS)DNA寡聚物使得抗體能夠穿透入活細胞中且識別預定抗原。硫代磷酸酯化發生在DNA寡聚物之磷酸糖骨架中。本申請人證明連接PS DNA寡聚物有效促進抗體細胞內遞送以及標靶識別,其中20聚體PS DNA寡聚物非常有效。利用DNA寡聚物之PEG化、2'氟、2'甲基A-或2'
甲基G修飾結合不促進抗體細胞內吸收,且連接PS RNA寡聚物不促進細胞內遞送。合成連接有生物素之以上所提及之具有各種修飾之DNA寡聚物及具有PS修飾之RNA(20聚體);用抗生物素蛋白/鏈黴抗生物素蛋白標記抗體以能夠實現寡聚物與抗體之非共價鍵聯。
所提供之方法及組成物適用於純化本文中所提供之細胞穿透結合物(包括其實施例)。所連接之包括與生物素結構域非共價結合之生物素結合結構域的非共價連接子導致結合物之分子量相對於不存在該非共價連接子時有所增加。因此,本文中所提供之結合物適宜使用此技術領域中通常已知的標準尺寸排除法加以純化。
結構
5'-生物素寡聚物:紅色=生物素,黑色=C3,且綠色=螢光素dT單元
經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-DNA寡聚物結合之經修飾之抗STAT3抗體能夠進行細胞穿透。第4A圖顯示使用二次抗體偵測所遞送之抗體、抗體-抗原
複合物的流式細胞測量術分析。用經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PO-DNA寡聚物(20聚體)(紅色線)、PS-DNA寡聚物(20聚體)(紅色區域)、1kPEG(藍色線)及30kPEG(短劃線)結合之經修飾之抗STAT3抗體處理U251細胞(人類神經膠質瘤幹細胞)。用10μg/ml特定經修飾之抗STAT3抗體處理該等U251細胞且在37℃培育一小時。在洗滌步驟(PBS/1% BSA)之後,收集細胞且用500μl 2%聚甲醛固定(15min),隨後進行洗滌步驟(PBS/1% BSA)且藉由500冰冷甲醇繼續洗滌(10min)。洗滌(PBS/1% BSA)之後,在4℃用PBS/1% BSA/1%小鼠血清將該等細胞阻斷一小時。之後洗滌(PBS/1% BSA)細胞且用二級抗體(抗兔AF647,1:4.000處於PBS中)在暗處染色30min。在三個最終洗滌步驟(PBS/1% BSA)且將細胞收集在300μl洗滌緩衝液中之後進行流式分析。使用未染色之U251作為空白對照(灰色區域)。
第4B圖顯示用於偵測所遞送之抗體-抗原複合物的替代西方點漬分析法。用經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PO-DNA寡聚物(20聚體)(第一泳道)、PS-DNA寡聚物(20聚體)(第二泳道)、PEG-1k-DNA寡聚物(第三泳道)及PEG-30k-DNA寡聚物(第四泳道)結合之經修飾之抗STAT3抗體處理U251細胞。用10μg/ml所指示之經修飾之抗STAT3抗體處理該等U251細胞且在37℃培育一小時。在培育及用PBS(2ml)進行之兩個洗滌步驟之後,經由在冰上在500μl RIPA緩衝液中培育(30min)來溶解細
胞,隨後強力震盪。藉由在離心步驟(10min,13.000rpm,4℃)之後收集上清液來收集全細胞溶解產物。向各全細胞溶解產物中添加30μl重組蛋白G瓊脂糖珠粒且在4℃在振盪平臺上培育過夜。對該等珠粒進行球粒化(2min,2.400rpm,4℃)且用500μl冰冷PBS洗滌兩次。在用30μl Laemmli緩衝液沒過經乾燥之瓊脂糖珠粒且在95℃培育5min之後,將20ul裝載於10% SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)上且在125V跑膠。在凝膠於硝化纖維點漬膜(0.45μm)上點漬之後,在室溫在振盪平臺上用10% BSA/TBS-T(0.1% Tween20)將該膜阻斷一小時。之後在4℃在振盪平臺上將該膜與一級抗體(抗STAT3,1:1.000處於TBS-T中)一起培育隔夜。在三個利用TBS-T之洗滌步驟(15min,10min,10min,用TBS-T)之後,在4℃在振盪平臺上將該膜與ECLTM抗兔IgG、辣根過氧化酶(1:10.000處於TBS-T中)一起培育2至4小時。在四個最終洗滌步驟(5min,各自用TBS-T)之後,使用SuperSignal® West Dura Extended偵測套組進行偵測。
經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-DNA寡聚物結合之經修飾之抗STAT3抗體能夠進行細胞穿透及標靶識別。第6圖顯示用於偵測所遞送之抗體-抗原複合物的替代西方點漬分析。用經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PO-2'氟-寡聚物(第一泳道)、PO-2'甲基A-寡聚物(第二泳道)、PO-2'甲基G-寡聚物(第三泳道)、PO-寡聚物DNA(20聚體)(第四泳道)、PS-寡聚物DNA(20聚體)(第五泳道)結合
之經修飾之抗STAT3抗體及未經修飾之抗體(第六泳道)處理U251細胞。用10μg/ml所指示之經修飾之抗STAT3抗體處理該等U251細胞且在37℃培育一小時。在培育及用PBS(2ml)進行之兩個洗滌步驟之後,經由在冰上在500μl RIPA緩衝液中培育(30min)來溶解細胞,隨後強力震盪。藉由在離心步驟(10min,13.000rpm,4℃)之後收集上清液來收集全細胞溶解產物。向各全細胞溶解產物中添加30μl重組蛋白G瓊脂糖珠粒且在4℃在振盪平臺上培育過夜。對該等珠粒進行球粒化(2min,2.400rpm,4℃)且用500μl冰冷PBS洗滌兩次。在用30μl Laemmli緩衝液沒過經乾燥之瓊脂糖珠粒且在95℃下培育5min之後,將20ul裝載於10% SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)上且在125V跑膠。在凝膠於硝化纖維點漬膜(0.45μm)上點漬之後,在室溫在振盪平臺上用10% BSA/TBS-T(0.1% Tween20)將該膜阻斷一小時。之後在4℃在振盪平臺上將該膜與一級抗體(抗STAT3,1:1.000處於TBS-T中)一起培育隔夜。在三個利用TBS-T之洗滌步驟(15min,10min,10min,用TBS-T)之後,在4℃在振盪平臺上將該膜與ECLTM抗兔IgG、辣根過氧化酶(1:10.000處於TBS-T中)一起培育2至4小時。在四個最終洗滌步驟(5min,各自用TBS-T)之後,使用SuperSignal® West Dura Extended偵測套組進行偵測。
經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-DNA寡聚物(20聚體)結合之經修飾之抗STAT3抗體在細胞穿透
方面最有效。第7A圖上圖顯示用於使用抗兔抗體偵測所遞送之抗體的流式細胞測量術分析。用經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與所指示之PS DNA-寡聚物(80聚體)(點線)、PS-寡聚物DNA(40聚體)(短劃線)及PS-寡聚物DNA(20聚體)(紅色區域)結合之經修飾之抗STAT3抗體(兔)處理U251細胞(人類神經膠質瘤幹細胞)。第7A圖下圖顯示與第7A圖相同,但用經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-寡聚物DNA(20聚體)(紅色區域)、PS-寡聚物DNA(10聚體)(藍線)、PS-寡聚物DNA(5聚體)(紅線)、PS-寡聚物DNA(3聚體)(橙色線)、PS-寡聚物DNA(2聚體)(淡綠色線)及PS-寡聚物DNA(單體)(暗綠色線)結合之經修飾之抗STAT3抗體處理U251細胞。用10μg/ml所指示之經修飾抗STAT3抗體(兔)處理該等U251細胞且在37℃培育一小時。在洗滌步驟(PBS/1% BSA)之後,收集細胞且用500μl 2%聚甲醛固定(15min),隨後進行洗滌步驟(PBS/1% BSA)且藉由500冰冷甲醇繼續洗滌(10min)。洗滌(PBS/1% BSA)之後,在4℃用PBS/1% BSA/1%小鼠血清將該等細胞阻斷一小時。之後洗滌(PBS/1% BSA)細胞且用二級抗體(灰色線,上圖及下圖)(α Rb AF647,1:4.000處於PBS中)在暗處染色30min。在三個最終洗滌步驟(PBS/1% BSA)且將細胞收集在300μl洗滌緩衝液中之後進行流式分析。使用未染色之U251作為空白對照(灰色區域,上圖及下圖)。
第7B圖顯示用於偵測所遞送之抗體-抗原複合物的替代西方點漬分析法。用經由鏈黴抗生物素蛋白/
生物素與PS-DNA寡聚物DNA(80聚體)(第一泳道)、PS-寡聚物DNA(40聚體)(第二泳道)、PS-寡聚物DNA(20聚體)(第三泳道)、PS-寡聚物DNA(10聚體)(第四泳道)、PS-寡聚物DNA(5聚體)(第五泳道)、PS-寡聚物DNA(3聚體)(第六泳道)、PS-寡聚物DNA(2聚體)(第七泳道)及PS-寡聚物DNA(單體)(第八泳道)結合之經修飾之抗STAT3抗體處理U251細胞。用10μg/ml所指示之經修飾抗STAT3抗體處理該等U251細胞且在37℃培育一小時。在培育及用PBS(2ml)進行之兩個洗滌步驟之後,經由在冰上在500μl RIPA緩衝液中培育(30min)來溶解細胞,隨後強力震盪。藉由在離心步驟(10min,13.000rpm,4℃)之後收集上清液來收集全細胞溶解產物。向各全細胞溶解產物中添加30μl重組蛋白G瓊脂糖珠粒且在4℃在振盪平臺上培育過夜。對該等珠粒進行球粒化(2min,2.400rpm,4℃)且用500μl冰冷PBS洗滌兩次。在用30μl Laemmli緩衝液沒過經乾燥之瓊脂糖珠粒且在95℃培育5min之後,將20ul裝載於10% SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)上且在125V跑膠。在凝膠於硝化纖維點漬膜(0.45μm)上點漬之後,在室溫在振盪平臺上用10% BSA/TBS-T(0.1% Tween20)將該膜阻斷一小時。之後在4℃在振盪平臺上將該膜與一級抗體(抗STAT3,1:1.000處於TBS-T中)一起培育隔夜。在三個利用TBS-T之洗滌步驟(15min,10min,10min,用TBS-T)之後,在4℃在振盪平臺上將該膜與ECLTM抗兔IgG、辣根過氧化酶(1:10.000處於TBS-T中)
一起培育2至4小時。在四個最終洗滌步驟(5min,各自用TBS-T)之後,使用SuperSignal® West Dura Extended偵測套組進行偵測。
經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-DNA寡聚物(20聚體)結合之經修飾之抗STAT3抗體能夠進行細胞穿透。第8A圖:對用經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-寡聚物DNA(20聚體)(第一泳道)及PS-寡聚物RNA(20聚體)(第二泳道)結合之經修飾之抗STAT3抗體處理之U251細胞的替代西方點漬分析。用10μg/ml所指示之經修飾之抗STAT3抗體處理該等U251細胞且在37℃培育一小時。在培育及用PBS(2ml)進行之兩個洗滌步驟之後,經由在冰上在500μl RIPA緩衝液中培育(30min)來溶解細胞,隨後強力震盪。藉由在離心步驟(10min,13.000rpm,4℃)之後收集上清液來收集全細胞溶解產物。向各全細胞溶解產物中添加30μl重組蛋白G瓊脂糖珠粒且在4℃在振盪平臺上培育過夜。對該等珠粒進行球粒化(2min,2.400rpm,4℃)且用500μl冰冷PBS洗滌兩次。在用30μl Laemmli緩衝液沒過經乾燥之瓊脂糖珠粒且在95℃培育5min之後,將20ul裝載於10% SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)上且在125V跑膠。在凝膠於硝化纖維點漬膜(0.45μm)上點漬之後,在室溫下在振盪平臺上用10% BSA/TBS-T(0.1% Tween20)將該膜阻斷一小時。之後在4℃在振盪平臺上將該膜與一級抗體(抗STAT3,1:1.000處於TBS-T中)一起培育隔夜。在三個利用TBS-T之洗滌步驟(15
min,10min,10min,用TBS-T)之後,在4℃在振盪平臺上將該膜與ECLTM抗兔IgG、辣根過氧化酶(1:10.000處於TBS-T中)一起培育2至4小時。在四個最終洗滌步驟(5min,各自用TBS-T)之後,使用SuperSignal® West Dura Extended偵測套組進行偵測。
第8B圖:對用經由鏈黴抗生物素蛋白/生物素與PS-RNA寡聚物(20聚體)(黑色線)及PS-DNA寡聚物(20聚體)(紅色區域)結合之經修飾之抗STAT3抗體處理之U251細胞(人類神經膠質瘤幹細胞)的流式細胞測量術分析。用10μg/ml所指示之經修飾之抗STAT3抗體處理該等U251細胞且在37℃培育一小時。在洗滌步驟(PBS/1% BSA)之後,收集細胞且用500μl 2%聚甲醛固定(15min),隨後進行洗滌步驟(PBS/1% BSA)且藉由500冰冷甲醇繼續洗滌(10min)。洗滌(PBS/1% BSA)之後,在4℃下用PBS/1% BSA/1%小鼠血清將該等細胞阻斷一小時。之後洗滌(PBS/1% BSA)細胞且用二級抗體(灰色線)(α Rb AF647,1:4.000處於PBS中)在暗處染色30min。在三個最終洗滌步驟(PBS/1% BSA)且將細胞收集在300μl洗滌緩衝液之後進行流式分析中。使用未染色之U251作為空白對照(灰色區域)。
5'-生物素無鹼基寡核苷酸之結構
位於dR之間的PS鍵聯:
位於dR之間的PO鍵聯:
第9A圖描繪對用經由鏈酶抗生物素蛋白/生物素與PO-聚合物(20聚體)(短劃線)、PS-聚合物(20聚體)(黑色線)、PS-寡聚物DNA(20聚體)(紅色區域)結合之經修飾之抗STAT3抗體處理之U251細胞(人類神經膠質瘤幹細胞)的流式細胞測量術分析。用10μg/ml特定經修飾之抗STAT3抗體處理該等U251細胞且在37℃培育一小時。在洗滌步驟(PBS/1% BSA)之後,收集細胞且用500μl 2%聚
甲醛固定(15min),隨後進行洗滌步驟(PBS/1% BSA)且藉由500冰冷甲醇繼續洗滌(10min)。洗滌(PBS/1% BSA)之後,在4℃用PBS/1% BSA/1%小鼠血清將該等細胞阻斷一小時。之後洗滌(PBS/1% BSA)細胞且用二級抗體(灰色線)(α Rb AF647,1:4.000處於PBS中)在暗處染色30min。在三個最終洗滌步驟(PBS/1% BSA)且將細胞收集在300μl洗滌緩衝液中之後進行流式分析。使用未染色之U251作為空白對照(灰色區域)。
第9A圖描繪對用經由鏈酶抗生物素蛋白/生物素與PS-寡聚物DNA(20聚體)(第一泳道)、PS-寡聚物RNA(20聚體)(第二泳道)、PO-聚合物(20聚體)(第三泳道)及PS-聚合物(20聚體)(第四泳道)結合之經修飾之抗STAT3抗體處理之U251細胞的替代西方點漬分析。用10μg/ml特定經修飾之抗STAT3抗體處理該等U251細胞且在37℃培育一小時。在培育之後,經由在冰上在500μl RIPA緩衝液中孵育(30min)來溶解該等細胞,隨後強力震盪。藉由在離心步驟(10min,13.000rpm,4℃)之後收集上清液來收集全細胞溶解產物。向各全細胞溶解產物中添加30μl重組蛋白G瓊脂糖珠粒且在4℃在振盪平臺上培育過夜。對該等珠粒進行球粒化(2min,2.400rpm,4℃)且用500μl冰冷PBS洗滌兩次。在用30μl Laemmli緩衝液沒過經乾燥之瓊脂糖珠粒且在95℃培育5min之後,將20ul裝載於10% SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)上且在125V跑膠。在凝膠於硝化纖維點漬膜(0.45μm)上點
漬之後,在室溫在振盪平臺上用10% BSA/TBS-T(0.1% Tween20)將該膜阻斷一小時。之後在4℃在振盪平臺上將該膜與一級抗體(抗STAT3,1:1.000處於TBS-T中)一起培育隔夜。在三個利用TBS-T之洗滌步驟(15min,10min,10min,用TBS-T)之後,在4℃在振盪平臺上將該膜與ECLTM抗兔IgG、辣根過氧化酶(1:10.000處於TBS-T中)一起培育2至4小時。在四個最終洗滌步驟(5min,各自用TBS-T)之後,使用SuperSignal® West Dura Extended偵測套組進行偵測。
實例2
藉由抗T-Bet細胞穿透抗體調節Th1免疫性
T-bet(T-box轉錄因子TBX21(TBX21))為對Th1分化非常重要之轉錄因子。T-Bet抑制劑可治療2型糖尿病、肥胖及其他炎性疾病。相反,刺激T-bet可活化抗腫瘤及抗病毒免疫性。然而,不存在T-bet調節劑。在此,本申請人顯示,特定T-bet抗體當經修飾(經由抗生物素蛋白/鏈黴抗生物素蛋白非共價連接於硫代磷酸酯化(PS)DNA寡聚物(20聚體))時充當有效T-bet促效劑,刺激Th1免疫反應,藉由刺激樹突狀細胞將CD8+ T細胞募集至腫瘤,且抑制腫瘤生長。
細胞穿透T-Bet抗體治療限制小鼠黑素瘤發展
為了測試經修飾之細胞穿透T-Bet抗體的治療效力,每隔一天用10μg/劑量局部處理B16小鼠黑素瘤腫瘤且監測腫瘤生長。與PBS處理(媒劑對照)或經修飾
之非靶向IgG處理之群組相比,投與經修飾之抗T-Bet抗體產生顯著腫瘤生長限制(第10圖)。
經修飾之T-Bet抗體活化抗腫瘤適應性免疫反應
已知T-Bet表現於不同類型之免疫細胞中,尤其是T細胞、B細胞及樹突狀細胞(DC)。自B16小鼠黑素瘤中分離腫瘤浸潤淋巴細胞,如第10圖之圖說中所提及進行處理,且進行流式細胞測量術分析。T-Bet抗體之處理顯著增強Th1免疫反應以及功能性細胞毒性T淋巴細胞(表現IFNγ之CD4+及CD8+ T細胞增加)。另外,T-Bet抗體之活體內處理促進CD4+ T細胞中之T-Bet表現,表明其充當T-bet促效劑從而刺激Th1免疫反應(第11圖)。
細胞穿透T-Bet抗體亦靶向DC且增強其抗原呈現功能
對不同的免疫細胞中之T-Bet抗體吸收的詳細分析顯示該抗體亦由CD3-細胞吸收,該等細胞被本申請人進一步鑑別為CD11c+ DC(資料未顯示)。經修飾之T-Bet抗體之處理能夠藉由表現CD86及MHC II來促進DC之抗原呈現功能(第12A圖及第12B圖)。
實例3
用細胞穿透抗體阻斷FoxP3抑制腫瘤Treg及腫瘤進展
Treg(調節性T細胞)抑制抗腫瘤/病毒免疫反應,從而阻礙各種免疫療法。其對開發用於減少Treg之新穎免疫治療劑非常重要。FoxP3對於Treg維持及功能為必需的。然而,FoxP3由於其細胞內分佈而被認為不具成藥性。在此,本申請人顯示,經PS修飾之FoxP3抗體能夠
優先靶向FoxP3陽性細胞,抑制FoxP3及下游效應因子CTLA4之水準。更重要的是,全身投與經修飾之FoxP3抗體可減少腫瘤浸潤Treg及腫瘤生長。
細胞穿透FoxP3抗體優先被Treg保留
為了評估經修飾之細胞穿透FoxP3抗體之特異性,將自FoxP3-GFP-Tg小鼠新分離之脾細胞與10μg/ml經修飾之FoxP3抗體或與10μg/ml經修飾之IgG(充當對照)一起培養。2小時後,收集細胞,洗滌並進行流式細胞測量術分析以偵測用於標記與抗體結合之PS寡聚物的Cy5。值得注意的是,FoxP3+ Treg可保留之經修飾之FoxP3抗體比非Treg多得多。且FoxP3抗體在Treg中之可偵測性遠遠超過對照經修飾之IgG群組(圖13)。
用經修飾之FoxP3抗體進行全身處理減少FoxP3陽性及CTLA4陽性CD4+ T細胞(Treg)且終止黑素瘤生長
為了檢查經修飾之FoxP3對T細胞之效應,在B16腫瘤細胞接種後每隔一天向C57BL/6小鼠全身投與經修飾之IgG或FoxP3抗體(10μg/小鼠)直至第11天。每一或兩天監測腫瘤體積且在19天之後對所有動物施以安樂死。隨後收集腫瘤且分離腫瘤浸潤淋巴細胞用於進一步流式細胞測量術分析,以偵測FoxP3及CTLA4陽性T細胞。與經修飾之非靶向IgG相比,全身投與經修飾之抗FoxP3抗體顯著減緩黑素瘤進展。對腫瘤浸潤淋巴細胞之進一步分析顯示FoxP陽性及CTLA4陽性CD4+ T細胞之百分比降低,表明經修飾之FoxP3抗體阻斷腫瘤Treg(第14
圖)。
實施例
實施例1. 一種細胞穿透結合物,其包含:(i)非細胞穿透蛋白質;(ii)硫代磷酸酯核酸;及(iii)連接該硫代磷酸酯核酸與該非細胞穿透蛋白質之非共價連接子,該非共價連接子包含非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域;且其中該硫代磷酸酯核酸增強該非細胞穿透蛋白質之細胞內遞送。
實施例2. 如實施例1之細胞穿透結合物,其中該生物素結合結構域為抗生物素蛋白結構域。
實施例3. 如實施例1之細胞穿透結合物,其中該生物素結合結構域為鏈黴抗生物素蛋白結構域。
實施例4. 如實施例3之細胞穿透結合物,其中該鏈黴抗生物素蛋白結構域結合複數個生物素結構域。
實施例5. 如實施例4之細胞穿透結合物,其中該鏈黴抗生物素蛋白結構域結合約四個生物素結構域。
實施例6. 如實施例1至5中任一者之細胞穿透結合物,其中該生物素結合結構域共價連接於該非細胞穿透蛋白質。
實施例7. 如實施例1至6中任一者之細胞穿透結合物,其中複數個生物素結合結構域連接於該非細胞穿透蛋白質。
實施例8. 如實施例1至7中任一者之細胞穿透結合
物,其中該生物素結構域連接於該硫代磷酸酯核酸。
實施例9. 如實施例8之細胞穿透結合物,其中該生物素結構域共價連接於該硫代磷酸酯核酸。
實施例10. 如實施例8或9之細胞穿透結合物,其中複數個硫代磷酸酯核酸連接於該生物素結構域。
實施例11. 如實施例1至10中任一者之細胞穿透結合物,其中該硫代磷酸酯核酸之長度為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個核酸殘基。
實施例12. 如實施例11之細胞穿透結合物,其中該硫代磷酸酯核酸之長度為約10至約30個核酸殘基。
實施例13. 如實施例11之細胞穿透結合物,其中該硫代磷酸酯核酸之長度為約20個核酸殘基。
實施例14. 如實施例1至12中任一者之細胞穿透結合物,其中該非細胞穿透蛋白質具有超過25kD之分子量。
實施例15. 如實施例1至14中任一者之細胞穿透結合物,其中該非細胞穿透蛋白質具有約25kD至約750kD之分子量。
實施例16. 如實施例1至15中任一者之細胞穿透結合物,其中該非細胞穿透蛋白質為抗體。
實施例17. 如實施例16之細胞穿透結合物,其中該抗體為IgG抗體。
實施例18. 如實施例16之細胞穿透結合物,其中該抗體為IgA、IgM、IgD或IgE抗體。
實施例19. 如實施例16之細胞穿透結合物,其中該抗
體為Fv片段。
實施例20. 如實施例16至19中任一者之細胞穿透結合物,其中該抗體為人類化抗體。
實施例21. 如實施例1至20中任一者之細胞穿透結合物,其中該非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶。
實施例22. 如實施例21之細胞穿透結合物,其中該細胞內標靶為選自由自體免疫性疾病、炎性疾病、代謝病症、發育病症、心血管疾病、肝病、腸病、感染性疾病、內分泌疾病、神經系統病症及癌症組成之群之疾病的標靶。
實施例23. 如實施例21或22之細胞穿透結合物,其中該細胞內標靶為信號傳遞分子或轉錄因子。
實施例24. 如實施例23之細胞穿透結合物,其中該信號傳遞分子為磷酸酶或激酶。
實施例25. 如實施例21之細胞穿透結合物,其中該細胞內標靶為癌症標靶。
實施例26. 如實施例21之細胞穿透結合物,其中該細胞內標靶係選自由STAT3及Src組成之群。
實施例27. 如實施例21之細胞穿透結合物,其中該細胞內標靶為磷酸化Src。
實施例28. 如實施例1至27中任一者之細胞穿透結合物,其中該非細胞穿透蛋白質進一步包含與該蛋白質連接之標記、小分子或功能核酸。
實施例29. 如實施例1至28中任一者之細胞穿透結合物,其中該細胞穿透結合物與細胞內標靶結合。
實施例30. 一種形成細胞穿透結合物之方法,該方法包括使非細胞穿透蛋白質與硫代磷酸酯核酸接觸,其中該非細胞穿透蛋白質連接於生物素結合對之第一成員且該硫代磷酸酯核酸連接於該生物素結合對之第二成員,從而形成包含位於生物素結構域與生物素結合結構域之間的非共價鍵的細胞穿透結合物。
實施例31. 如實施例30之方法,其中該生物素結合對之該第一成員為生物素結合結構域。
實施例32. 如實施例30之方法,其中該生物素結合對之該第二成員為生物素結構域。
實施例33. 如實施例30之方法,其中該生物素結合對之該第一成員為生物素結構域。
實施例34. 如實施例30之方法,其中該生物素結合對之該第二成員為生物素結合結構域。
實施例35. 如實施例30之方法,其中該硫代磷酸酯核酸包含共價反應部分。
實施例36. 一種細胞,其包含如實施例1至29中任一者之細胞穿透結合物。
實施例37. 一種醫藥組成物,其包含如實施例1至29中任一者之細胞穿透結合物及醫藥學上可接受之載劑。
實施例38. 如實施例37之醫藥組成物,其進一步包含第二非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質包含連接一或多個硫代磷酸酯核酸與該第二非細胞穿透蛋白質之第二非共價連接子。
實施例39. 如實施例38之醫藥組成物,其中該非共價連接子包含非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域。
實施例40. 如實施例38之醫藥組成物,其中該第二非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶。
實施例41. 如實施例40之醫藥組成物,其中相對於如實施例21至27中任一者之非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質結合該細胞內標靶上之不同的抗原決定基。
實施例42. 如實施例41之醫藥組成物,其中該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。
實施例43. 如實施例38至42中任一者之醫藥組成物,其中該第二非細胞穿透蛋白質為抗體。
實施例44. 一種套組,其包含如實施例1至29中任一者之細胞穿透結合物或如實施例37之醫藥組成物以及使用說明。
實施例45. 如實施例44之套組,其進一步包含第二非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質包含連接一或多個硫代磷酸酯核酸與該第二非細胞穿透蛋白質之第二非共價連接子。
實施例46. 如實施例45之套組,其中如實施例1至29中任一者之結合物及該第二非細胞穿透蛋白質處於單獨的容器中。
實施例47. 如實施例45或46之套組,其中相對於如
實施例1至29中任一者之非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質結合該細胞內標靶上之不同的抗原決定基。
實施例48. 如實施例45至47中任一者之套組,其中該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。
實施例49. 如實施例45至48中任一者之套組,其中該第二非細胞穿透蛋白質係調配為包含該第二非細胞穿透蛋白質及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。
實施例50. 如實施例45至49中任一者之套組,其中該第二非細胞穿透蛋白質為抗體。
實施例51. 一種向細胞中遞送非細胞穿透蛋白質之方法,其包括使該細胞與如實施例1至29中任一者之細胞穿透結合物接觸。
實施例52. 如實施例51之方法,其中該非細胞穿透蛋白質結合細胞質中之核蛋白,從而形成非細胞穿透蛋白質-核蛋白複合物。
實施例53. 如實施例52之方法,其中該非細胞穿透蛋白質-核蛋白複合物不能夠進入細胞核。
實施例54. 一種治療有需要之個體之疾病的方法,該方法包括向個體投與有效量之如實施例1至29中任一者之細胞穿透結合物,從而威脅該個體之該疾病。
實施例55. 如實施例54之方法,其進一步包括向該個體投與第二非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質包含連接一或多個硫代磷酸酯核酸與該第二非細胞穿透蛋白質之第二非共價連接子。
實施例56. 如實施例55之方法,其中該非共價連接子包含非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域。
實施例57. 如實施例56之方法,其中相對於如實施例1至29中任一者之結合物,該第二非細胞穿透蛋白質結合該細胞內標靶上之不同的抗原決定基。
實施例58. 如實施例57之方法,其中該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。
實施例59. 如實施例55至58中任一者之方法,其中如實施例1至29中任一者之結合物及該第二非細胞穿透蛋白質係同時投與。
實施例60. 如實施例55至58中任一者之方法,其中如實施例1至29中任一者之結合物及該第二非細胞穿透蛋白質係相繼投與。
實施例61. 如實施例55至60中任一者之方法,其中該第二非細胞穿透蛋白質為抗體。
實施例62. 如實施例55至61中任一者之方法,其進一步包括向該個體投與第二治療劑。
實施例63. 如實施例55至62中任一者之方法,其中該疾病係選自由自體免疫性疾病、發育病症、炎性疾病、代謝病症、心血管疾病、肝病、腸病、感染性疾病、內分泌疾病、神經系統病症及癌症組成之群。
實施例64. 如實施例63之方法,其中該疾病為癌症。
實施例65. 如實施例55之方法,其中該結合物之該非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶且該細胞內標靶為STAT3
或Src。
實施例66. 如實施例55之方法,其中該結合物之該非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶且該細胞內標靶為磷酸化Src。
實施例67. 如實施例55之方法,其中該結合物之該非細胞穿透蛋白質為特異性結合STAT3之抗體且該第二非細胞穿透蛋白質為特異性結合STAT3之另一抗原決定基的抗體。
Claims (67)
- 一種細胞穿透結合物,其包含:(i)非細胞穿透蛋白質;(ii)硫代磷酸酯核酸;及(iii)連接該硫代磷酸酯核酸與該非細胞穿透蛋白質之非共價連接子,該非共價連接子包含非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域;及其中,該硫代磷酸酯核酸增強該非細胞穿透蛋白質之細胞內遞送。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞穿透結合物,其中,該生物素結合結構域為抗生物素蛋白結構域。
- 如申請專利範圍第1項所述之細胞穿透結合物,其中,該生物素結合結構域為鏈黴抗生物素蛋白結構域。
- 如申請專利範圍第3項所述之細胞穿透結合物,其中,該鏈黴抗生物素蛋白結構域結合複數個生物素結構域。
- 如申請專利範圍第4項所述之細胞穿透結合物,其中,該鏈黴抗生物素蛋白結構域結合約四個生物素結構域。
- 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該生物素結合結構域共價連接於該非細胞穿透蛋白質。
- 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,複數個生物素結合結構域連接於 該非細胞穿透蛋白質。
- 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該生物素結構域連接於該硫代磷酸酯核酸。
- 如申請專利範圍第8項所述之細胞穿透結合物,其中,該生物素結構域共價連接於該硫代磷酸酯核酸。
- 如申請專利範圍第8項或第9項所述之細胞穿透結合物,其中,複數個硫代磷酸酯核酸連接於該生物素結構域。
- 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該硫代磷酸酯核酸之長度為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個核酸殘基。
- 如申請專利範圍第11項所述之細胞穿透結合物,其中,該硫代磷酸酯核酸之長度為約10至約30個核酸殘基。
- 如申請專利範圍第11項所述之細胞穿透結合物,其中,該硫代磷酸酯核酸之長度為約20個核酸殘基。
- 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該非細胞穿透蛋白質具有超過25kD之分子量。
- 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該非細胞穿透蛋白質具有約25kD至約750kD之分子量。
- 如申請專利範圍第1項至第15項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該非細胞穿透蛋白質為抗體。
- 如申請專利範圍第16項所述之細胞穿透結合物,其中,該抗體為IgG抗體。
- 如申請專利範圍第16項所述之細胞穿透結合物,其中,該抗體為IgA、IgM、IgD或IgE抗體。
- 如申請專利範圍第16項所述之細胞穿透結合物,其中,該抗體為Fv片段。
- 如申請專利範圍第16項至第19項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該抗體為人類化抗體。
- 如申請專利範圍第1項至第20項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶。
- 如申請專利範圍第21項所述之細胞穿透結合物,其中,該細胞內標靶為選自由自體免疫性疾病、炎性疾病、代謝病症、發育病症、心血管疾病、肝病、腸病、感染性疾病、內分泌疾病、神經系統病症及癌症組成之群之疾病的標靶。
- 如申請專利範圍第21項或第22項所述之細胞穿透結合物,其中,該細胞內標靶為信號傳遞分子或轉錄因子。
- 如申請專利範圍第23項所述之細胞穿透結合物,其中,該信號傳遞分子為磷酸酶或激酶。
- 如申請專利範圍第21項所述之細胞穿透結合物,其中,該細胞內標靶為癌症標靶。
- 如申請專利範圍第21項所述之細胞穿透結合物,其中,該細胞內標靶係選自由STAT3及Src組成之群。
- 如申請專利範圍第21項所述之細胞穿透結合物,其中,該細胞內標靶為磷酸化Src。
- 如申請專利範圍第1項至第27項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該非細胞穿透蛋白質進一步包含與該蛋白質連接之標記、小分子或功能核酸。
- 如申請專利範圍第1項至第28項中任一項所述之細胞穿透結合物,其中,該細胞穿透結合物與細胞內標靶結合。
- 一種形成細胞穿透結合物之方法,該方法包括使非細胞穿透蛋白質與硫代磷酸酯核酸接觸,其中,該非細胞穿透蛋白質連接於生物素結合對之第一成員且該硫代磷酸酯核酸連接於該生物素結合對之第二成員,從而形成包含位於生物素結構域與生物素結合結構域之間的非共價鍵的細胞穿透結合物。
- 如申請專利範圍第30項所述之方法,其中,該生物素結合對之該第一成員為生物素結合結構域。
- 如申請專利範圍第30項所述之方法,其中,該生物素結合對之該第二成員為生物素結構域。
- 如申請專利範圍第30項所述之方法,其中,該生物素結合對之該第一成員為生物素結構域。
- 如申請專利範圍第30項所述之方法,其中,該生物素結合對之該第二成員為生物素結合結構域。
- 如申請專利範圍第30項所述之方法,其中,該硫代磷酸酯核酸包含共價反應部分。
- 一種細胞,其包含如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之細胞穿透結合物。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之細胞穿透結合物及醫藥學上可接受之載劑。
- 如申請專利範圍第37項所述之醫藥組成物,其進一步包含第二非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質包含連接一或多個硫代磷酸酯核酸與該第二非細胞穿透蛋白質之第二非共價連接子。
- 如申請專利範圍第38項所述之醫藥組成物,其中,該非共價連接子包含非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域。
- 如申請專利範圍第38項所述之醫藥組成物,其中,該第二非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶。
- 如申請專利範圍第40項所述之醫藥組成物,其中,相對於如申請專利範圍第21項至第27項中任一項所述之非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質結合該細胞內標靶上之不同的抗原決定基。
- 如申請專利範圍第41項所述之醫藥組成物,其中,該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。
- 如申請專利範圍第38項至第42項中任一項所述之醫藥組成物,其中,該第二非細胞穿透蛋白質為抗體。
- 一種套組,其包含如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之細胞穿透結合物或如申請專利範圍第37項所述之醫藥組成物以及使用說明。
- 如申請專利範圍第44項所述之套組,其進一步包含第二非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質包含連接一或多個硫代磷酸酯核酸與該第二非細胞穿透蛋白質之第二非共價連接子。
- 如申請專利範圍第45項所述之套組,其中,如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之結合物及該第二非細胞穿透蛋白質係處於單獨的容器中。
- 如申請專利範圍第45項或第46項所述之套組,其中,相對於如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質結合該細胞內標靶上之不同的抗原決定基。
- 如申請專利範圍第45項至第47項中任一項所述之套組,其中,該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。
- 如申請專利範圍第45項至第48項中任一項所述之套組,其中,該第二非細胞穿透蛋白質係調配為包含該第二非細胞穿透蛋白質及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。
- 如申請專利範圍第45項至第49項中任一項所述之套組,其中,該第二非細胞穿透蛋白質為抗體。
- 一種向細胞中遞送非細胞穿透蛋白質之方法,其包括 使該細胞與如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之細胞穿透結合物接觸。
- 如申請專利範圍第51項所述之方法,其中,該非細胞穿透蛋白質結合細胞質中之核蛋白,從而形成非細胞穿透蛋白質-核蛋白複合物。
- 如申請專利範圍第52項所述之方法,其中,該非細胞穿透蛋白質-核蛋白複合物不能夠進入細胞核。
- 一種治療有需要之個體之疾病的方法,該方法包括向個體投與有效量之如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之細胞穿透結合物,從而威脅該個體之該疾病。
- 如申請專利範圍第54項所述之方法,其進一步包括向該個體投與第二非細胞穿透蛋白質,該第二非細胞穿透蛋白質包含連接一或多個硫代磷酸酯核酸與該第二非細胞穿透蛋白質之第二非共價連接子。
- 如申請專利範圍第55項所述之方法,其中,該非共價連接子包含非共價連接於生物素結構域之生物素結合結構域。
- 如申請專利範圍第56項所述之方法,其中,相對於如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之結合物,該第二非細胞穿透蛋白質結合該細胞內標靶上之不同的抗原決定基。
- 如申請專利範圍第57項所述之方法,其中,該第二非細胞穿透蛋白質結合第二細胞內標靶。
- 如申請專利範圍第55項至第58項中任一項所述之方法,其中,如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之結合物及該第二非細胞穿透蛋白質係同時投與。
- 如申請專利範圍第55項至第58項中任一項所述之方法,其中,如申請專利範圍第1項至第29項中任一項所述之結合物及該第二非細胞穿透蛋白質係相繼投與。
- 如申請專利範圍第55項至第60項中任一項所述之方法,其中,該第二非細胞穿透蛋白質為抗體。
- 如申請專利範圍第55項至第61項中任一項所述之方法,其進一步包括向該個體投與第二治療劑。
- 如申請專利範圍第55項至第62項中任一項所述之方法,其中,該疾病係選自由自體免疫性疾病、發育病症、炎性疾病、代謝病症、心血管疾病、肝病、腸病、感染性疾病、內分泌疾病、神經系統病症及癌症組成之群。
- 如申請專利範圍第63項所述之方法,其中,該疾病為癌症。
- 如申請專利範圍第55項所述之方法,其中,該結合物之該非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶且該細胞內標靶為STAT3或Src。
- 如申請專利範圍第55項所述之方法,其中,該結合物之該非細胞穿透蛋白質結合細胞內標靶且該細胞內標 靶為磷酸化Src。
- 如申請專利範圍第55項所述之方法,其中,該結合物之該非細胞穿透蛋白質為特異性結合STAT3之抗體且該第二非細胞穿透蛋白質為特異性結合STAT3之另一抗原決定基的抗體。
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