KR101753457B1 - 암 줄기 유사세포 검출용 바이오마커 ｇｐｒ５０ 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 줄기-유사세포(CSLC:cancer stem like cell) 검출을 위한 바이오 마커로서 GPR50 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 GPR50의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암 줄기-유사세포(CSLC:cancer stem like cell) 검출을 위한 바이오 마커용 조성물, GPR50 유전자 또는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물, GPR50 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 방법을 통한 암의 발병 또는 중증도를 예측 및 진단하는 방법과 암 치료제 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

Description

암 줄기 유사세포 검출용 바이오마커 ＧＰＲ５０ 및 이의 용도{GPR50 as biomarker for detecting cancer stem like cell and use thereof}

본 기술은 암 줄기 유사세포 검출을 위한 신규 바이오마커인 ＧＰＲ５０ 및 이의 용도에 관한 것이다.

암의 발생원인은 정상세포가 어떤 외부적인 원인에 의해 변이를 일으켜서 발생된다고 보고되어 왔다. 따라서, 현재까지 암 치료를 위한 방법으로 정상세포와는 다른 암세포에서 특이적으로 발현되거나 과발현되는 유전자를 찾아 그 유전자를 목표로 하는 항암제 개발 및 치료가 이루어져 왔으나, 전이가 된 암 환자나 암이 재발된 환자에게서는 기존 치료법만으로는 암세포를 완전히 제거하지 못하는 문제점이 있었다.

이런 환자들을 연구하던 중 최근에는 암세포 내에서 암을 일으킬 수 있는 세포가 따로 존재하고, 이 세포들은 정상 줄기세포의 특성을 가지고 있으며, 이와 같은 세포들이 다시 암을 발생시킬 수 있다고 하며, 이러한 세포들을 줄기세포의 특성을 가지고 있다고 하여 "암 줄기세포(cancer stem cell)"라고 불리고 있다. 암 줄기세포의 패러다임은 종양이란 다양한 잠재적 능력(pulprint potency)과 자가재생능력(self renewal)을 보이는 특정한 세포군에 의하여 기인한다는 것으로, 암 줄기세포의 존재는 급성골수성 백혈병(leukemia)에서 처음 증명되었고 최근에는 유방암을 포함한 일반 고형암에서도 암 줄기세포의 존재를 확인함으로써 고형암종에서도 줄기세포가 존재함을 확인하게 되었다[D. Bonnet, J.E. Dick, Human acute myeloid leukemia is organized as hierachy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med 3(1997)730- 737; M. Al-Hajj, M.F. Clarke, Self-renewal and tumor stem cells. Oncogene 23(2003)7274-7284]. 이러한 종양줄기세포는 지금까지 개발된 항암제에 대해 저항성을 보이고 있으며 암세포 중 80 ~ 90%는 실제로 재발능력이 없지만, 나머지 10 ~ 20 %에 해당하는 종양줄기세포는 항암제를 투여했을 때 죽지 않고 남아서 암을 다시 재발하는데 작용한다.

따라서, 암세포 재발과 전이를 피하고 암을 완전히 제거하기 위해서는 암세포만을 공격하는 현재의 암치료법은 한계가 있다고 볼 수 있으며, 줄기세포의 특성을 갖는 암 줄기세포를 표적으로 하여 암 줄기세포를 제거하는 항암제의 개발이 필요하다.

한편, 현재 수행되고 있는 항암요법은 외과수술, 화학요법 및 방사선요법이 있는데, 특히, 외과수술을 제외하고 화학요법 및 방사선요법의 경우 다양한 제제와 방사선 등이 사용되지만 그들의 적용은 인체가 감당할 수 있는 범위에 한정된다. 이들 화학요법 및 방사선요법의 제한적인 적용은 동물시험에서 아무리 우수한 효능을 보일지라도 임상에서 그 효과를 상쇄시키며 적용범위를 제한하고 효능을 제한하는 단점이 있기 때문이며, 또한 항암제 내성을 가진 암세포의 출현 또는 각각의 요법의 세포독성에 기인한 부작용이 발생한다. 또한, 방사선요법은 적당한 양의 방사선을 환부에 조사함으로써 인체에 발생하는 각종 암을 치료하는 항암요법인데, 이러한 방사선요법은 인체의 조혈기능을 저하시키고 면역계를 억제시켜 암 치료의 효율성을 낮추는 문제점이 있다. 나아가 반복적인 방사선 조사로 인해 암세포가 저항성을 획득하게 되므로, 이러한 방사선 요법 또한 항암 치료에 있어 한계가 존재한다.

따라서 보다 근본적으로 암을 치료할 수 있는 새로운 치료방법의 개발이 필요하다.

대한민국 공개특허 제2012-0082372호

이에 본 발명자들은 암 줄기 유사세포를 검출할 수 있는 신규 바이오마커로서 GPR50을 발견하였고, 암의 진단과 치료를 위한 상기 바이오마커의 용도를 규명한 점에 특징이 있다.

그러므로 본 발명의 목적은 GPR50의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암 줄기-유사세포(CSLC:cancer stem like cell) 검출을 위한 바이오 마커용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 GPR50의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출할 수 있는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 GPR50 유전자 또는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 진단 또는 예후 검출용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 암의 발병 또는 중증도를 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.

이에 본 발명은 GPR50의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암 줄기-유사세포(CSLC:cancer stem like cell) 검출을 위한 바이오 마커용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1~4로 이루어진 염기서열 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암 줄기-유사세포는 암 조직으로부터 유래되어 교반과 현탁 배양으로 유도된 높은 스피어 형성능을 갖는 SS-ihSCs(shaking and suspension-induced high sphere-forming CSLCs cells)일 수 있다.

또한, 본 발명은 GPR50의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출할 수 있는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 GPR50의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GPR50의 유전자는 서열번호 1~4의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, GPR50 단백질은 서열번호 5~8의 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 GPR50 유전자 또는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 GPR50 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 진단 또는 예후 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은, (a) 생물학적 시료로부터 GPR50 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암의 발병 또는 중증도를 예측 또는 진단하기 위한 정보 제공방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 암으로 의심되는 환자 또는 암 치료를 받은 환자의 생물학적 시료로서 조직, 세포, 혈액 또는 소변일 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) GPR50 유전자 또는 GPR50 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 GPR50 유전자의 발현양, GPR50 단백질의 양 또는 GPR50 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, GPR50 유전자의 발현양, GPR50 단백질의 양 또는 GPR50 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료를 암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은, GPR50 유전자의 발현양, GPR50 단백질의 양 또는 GPR50 단백질의 활성 억제시키는 물질은 하기의 암 줄기세포 기능을 억제 또는 감소시킴으로써 항암 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

(a) 항암제 약물 저항성 억제,

(b) 암 줄기세포 표지자의 발현 억제,

(c) 자기 복제능(self renewal) 억제 및

(d) 스피어(sphere) 형성능 억제

본 발명은 암 줄기-유사세포(CSLC:cancer stem like cell) 검출을 위한 바이오 마커로서 GPR50 및 이의 용도에 관한 것으로, GPR50의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암 줄기-유사세포(CSLC:cancer stem like cell) 검출을 위한 바이오 마커용 조성물, GPR50 유전자 또는 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물, GPR50 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 방법을 통한 암의 발병 또는 중증도를 예측 및 진단하는 방법과 암 치료제 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

특히 본 발명은 암줄기 유사세포의 존재 여부를 검출할 수 있는 바이오마커로서 GPR50의 용도를 규명함으로써 약물저항성을 갖는 암세포의 치료와 암치료 후 암의 진행과정을 예측하기 위해 GPR50을 사용할 수 있어 보다 근본적인 암의 진단과 치료를 가능하게 할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 SS-ihSCs(shaking and suspension-induced high sphere-forming CSLCs cells)의 분리 방법 및 분리된 세포 특성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 SS-ihSCs(shaking and suspension-induced high sphere-forming CSLCs cells) 세포 표면 표지자들의 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 분리한 SS-ihSCs(shaking and suspension-induced high sphere-forming CSLCs cells)의 CSLC의 특성 향상 기능을 규명한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 SS-ihSCs(shaking and suspension-induced high sphere-forming CSLCs cells)의 발암 능력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 SS-ihSCs(shaking and suspension-induced high sphere-forming CSLCs cells)에서 GPR50 유전자의 발현 증가를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 GPR50 유전자가 넉다운된 SS-ihSCs의 CSLC 특성 감소 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 GPR50 유전자가 과발현에 의한 CSLC 특성 증가 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 기술은 암 줄기-유사세포(CSLC:cancer stem like cell) 검출을 위한 신규 바이오 마커로서 GPR50의 용도를 제공함에 그 특징이 있다.

최근 암의 연구는 과학적 기술 발전에 따라 암의 발병원인과 기전이 보다 구체적으로 밝혀지고 있으며 다양함 발암 원인들이 발견되고 있다.

그 중, 최근 보고된 바에 의하면 암세포에 존재하는 암줄기세포가 다시 암을 유발 및 진행시킬 수 있다고 알려지고 있으며, 암 줄기세포는 무제한 재생능력을 가지고 있으며 항암제에 대해서 약물 저항성이 강하여 약물처리 등에 의한 항암요법에 의해서도 쉽게 사멸되지 못하고 있다.

따라서 근본적인 암의 치료를 위해서는 암 세포내에 존재하는 암줄기세포를 타겟으로 하여 이의 사멸을 유도할 수 있는 치료제의 개발이 필요하여 암줄기세포의 존재 여부를 사전에 미리 검출 및 진단할 수 있는 기술 개발이 필요하다.

이러한 점에서 본 기술은 암 줄기세포 또는 암 줄기 유사세포를 검출할 수 있는 바이오마커로서 GPR50을 사용할 수 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.

이러한 규명은 하기 본 발명의 일실시예에서 확인할 수 있었는데, 다양한 암세포 종류와 암 조직에서 분리한 암 유사 줄기세포를 대상으로 발현 변화를 보이는 유전자를 확인하였는데, GPR50이 암 유사 줄기세포에서 현저하게 과발현되어 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명자들은 상기 본 발명에 따른 마커 유전자인 GPR50의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 양을 측정함을 통해 암 줄기세포의 존재 여부를 검출할 수 있으며 나아가 암의 진단 및 예후를 예측할 수 있음을 알 수 있었다.

특히 본 발명자들은 암 세포로부터 암 줄기-유사세포를 분리하였는데, 본 발명에서 분리한 암 줄기 유사세포는 암 조직/세포로부터 유래되어 교반과 현탁 배양으로 유도된 높은 스피어 형성능을 갖는 SS-ihSCs(shaking and suspension-induced high sphere-forming CSLCs cells)일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 암 줄기-유사세포(CSLC:cancer stem like cell) 검출을 위한 바이오 마커용 조성물은 유효성분으로서 GPR50의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 암 진단 또는 예후 분석용 조성물의 유효성분으로는 GPR50의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출할 수 있는 물질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 GPR50유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 GPR50의 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 GPR50의 유전자는 GPR50의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호1~4로 이루어진 염기서열 중에서 선택될 수 있고, 이는 GPR50의 다양한 변이형도 포함할 수 있다.

상기 변이형에 대해 구체적으로 설명하면, 서열번호 1는 wild type(origin형)에 대한 GPR50의 cDNA 서열을 나타낸 것이고, 서열번호 2는 서열번호 1의 GPR50의 cDNA가 번역되어 아미노산으로 코딩되어질 때 502~505에 해당하는 아미노산 서열이 결실된 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 나타낸 것이며, 서열번호 3은 서열번호 1의 GPR50의 cDNA가 번역되어 아미노산으로 코딩되어질 때 532번째의 아미노산인 T가 A로 치환된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 나타낸 것이며, 서열번호 4는 서열번호 1의 GPR50의 cDNA가 번역되어 아미노산으로 코딩되어질 때 606번째의 아미노산인 I가 V로 치환된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 나타낸 것이다.

본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 본 발명의 GPR50 마커 유전자로부터 발현된 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.

바람직하게 상기 GPR50 단백질은 서열번호 5~8의 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있으며 이는 GPR50의 변이형 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로 서열번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열을 코딩하여 번역된 아미노산 서열이고, 서열번호 6의 아미노산 서열은 GPR50의 변이형 1에 대한 아미노산서열로서, 즉 서열번호 5의 아미노산 서열에서 502-505에 대한 4개 아미노산이 결실된 것이고, 서열번호 7의 아미노산 서열은 서열번호 5의 아미노산 서열에서 532번째의 아미노산인 T가 A로 치환된 것이며, 서열번호 8의 아미노산 서열은 서열번호 5의 아미노산 서열에서 606번째의 I가 V로 치환된 것을 말한다.

상기 “항체”는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 암 진단용 마커 또는 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 암 진단용 키트는 상기 마커 유전자인 GPR50 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 암 진단용 마커 또는 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 GPR50 마커 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 암을 예측 및 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은, (a) 생물학적 시료로부터 GPR50 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암의 발병 또는 중증도를 예측 또는 진단할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 암 환자 또는 암 의심환자에서의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 암의 발병을 예측 또는 진단하는 방법은 본 발명에 따른 암 마커 유전자인 GPR50 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가되었을 경우, 암이 유발된 것으로 판단할 수 있으며, 특히 암 줄기세포의 존재로 인해 암이 유발 또는 암의 진행이 깊어진 것으로 판단할 수 있다.

나아가 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 암 진단용 마커 유전자 또는 그 발현 단백질을 포함하는 암 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 선택된 유전자의 발현양 또는 그 발현 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, 상기 선택된 유전자의 발현양 또는 그 발현 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 암을 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 올리고뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA), shRNA 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.

한편, 본 발명자들은 GPR50을 암 줄기세포 또는 암 유사 줄기세포의 존재 여부를 검출할 수 있는 바이오마커로서의 용도 및 GPR50 발현 정도를 측정할 수 있는 물질을 포함하는 암 진단용 조성물의 규명과 함께, GPR50의 발현을 억제한 경우, 실제적으로 암의 크기 및 무게가 감소되고 발암능의 억제와 함께 약물 저항성도 감소되는 것을 실험을 통해 확인할 수 있었다.

따라서 GPR50의 억제제를 암 치료제로서 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명은 GPR50을 억제하는 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 억제제로는 이에 제한되지는 않으나, GPR50 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA일 수 있다.

상기 “shRNA”란 small hairpin RNA 혹은 short hairpin RNA으로 불리며, RNA 간섭으로 유전자를 침묵시킬 수 있는 용도로 사용되는 것이다. 보통 벡터를 이용하여 목적 세포로 도입한다. 이러한 shRNA hairpin 구조는 세포내 다른 물질에 의하여 절단되어 siRNA가 되기도 한다. 본 발명의 일실시예에서는 GPR50 유전자의 넉다운을 위해 GPR50 에 대한 shRNA을 사용하였으며, shRNA 서열은 서열번호 9에 기재된 5‘-TCGTGGGTTTCTGCTACGTGAG-3’을 사용하였다.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.

본 발명에서 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI:polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

또한, 상기 마커 단백질의 발현 및 활성을 증가시키거나 감소시키는 물질로서 상기 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 암의 예방 또는 치료용 조성물은 암을 치료할 수 있는 약학적 조성물로서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<시료준비>

시약 및 세포주 준비

하기 실험에서 사용한 시약 및 세포주들은 다음과 같다.

MCF7 및 SKBR3 유방암 세포는 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclone) 및 100 U/ml penicillin/streptomycin (Hyclone)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Hylcone)에서 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. MDA-MB-231 유방암 세포는 10% 우태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 100 U/ml penicillin/streptomycin 이 보충된 RPMI-1640 배지(Gibco-BRL)에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하여 사용하였다. MCF10A 불멸화 유방 상피세포(immortalized breast epithelial)는 5% horse serum(Gibco-BRL), 0.5 ㎍/ml hydrocortisone(Sigma-Aldrich), 10㎍/ml 인슐린 (Sigma), 20 ng/ml 표피 성장인자(EGF, Sigma-Aldrich) 및 100 U/ml penicillin/streptomycin이 보충된 DMEM/F12(Gibco-BRL)에 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 세포 생존률 분석은 trypan blue exclusion(Gibco-BRL) 시약으로 염색 후 헤마토사이토미터로 계수하여 평가하였다.

독소루비신(Doxorubicin(Calbiochem))은 DMSO(Sigma-Aldrich)에서 용액으로 제조하여 사용하였고 -20℃에서 보관하였다.

화학요법 치료(CT) 또는 비처리된(NCT) 암 환자세포, MCF7, SKBR3, MDA-MB-231 및 MCF10A 세포의 처리는 희석된 독소루비신(doxorubicin) 및 파클리탁셀(paclitaxel)이 포함된 혈청없는 배지에서 배양하여 사용하였다. MDA-MB-231 및 MCF10A 세포는 p53 저해제(Pifithrin-α, Sigma-Aldrich, 63208-82-2), HDAC 저해제(Histone Acetylase and Deacetylase Inhibitors, 382181), PD98059, BIO를 포함하는 저해제로 처리한 후 실험하였다. 화합물은 다른 언급이 없는 경우 EMD Millipore Chemical에서 구입하여 사용하였고, 세포주들은 Korean Cell Line Bank(SKBR3) 및 American Type Culture Collection(MCF7, MDA-MB-231 및 MCF10A 세포)에서 입수하여 사용하였다.

<실험방법 1>

환자 유래 1차 유방암 세포의 분리

유방 종양 조직을 PBS로 세척하고 Type IV collagenase(Sigma-Aldrich, C5138)를 처리한 후, 실온에서 20분간 배양하였다. 단일 세포 현탁액(single-cell suspension)은 100-㎛ 세포 스트레이너(BD bioscience)를 통하여 상등액을 여과시켜 얻었다. 수득한 환자유래 1차 유방암 세포(환자 #1 - #45)는 10% 우태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 100 U/ml penicillin/streptomycin(Hyclone)이 보충된 DMEM에 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하면서 유지시켰다.

<실험방법 2>

진탕 및 SS - ihS ( suspension - induced high sphere - forming cells ) 수득

실험방법 1에서 수득한 환자 유래 1차 유방암 세포(7 또는 8 계대)를 10일 동안 비 코팅된 페트리 디쉬 상에서 60rpm으로 진탕시키고(shaken) EM(10% FBS 및 100 U/ml의 페니실린/스테렙토마이신을 포함하는 혈청이 없는 DMEM 배지에서 배양하였고, 배지는 2일마다 교체하였다. 10일 후, 세포들을 수집하고 1000rpm에서 5분동안 원심분리 하였고 수득한 세포를 0.1% 젤라틴 코팅 조직 배양 디쉬(G-TCD)에서 10% 우태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 100 U/ml penicillin/streptomycin(Hyclone)이 보충된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 이렇게 수집된 세포들을 “SS-ihSCs”라고 명명하였고, 세포 생존률을 trypan blue exclusion 염색하고 헤마토사이토미터로 계수하여 평가하였다. 세포 생존률 분석을 위해 부유된 세포와 부착(adherent) 세포는 따로 수입한 다음, 부유 세포는 1000rpm에서 5분 동안 원심분리를 하여 그 상등액을 거두었고, 부착 세포는 0.25% trypsin-EDTA(Gibco-BRL) 처리하고 1000rpm에서 5분 동안 원심 분리 후 수집하였다.

<실험방법 3>

종양 이식

MDA-MB-231 세포 또는 스피어에서 분리된 SS-ihSCs는 암컷 면역 결핍(SCID) 마우스에 주사한 후, 4주 동안 종양 형성을 조사하였다. 마우스를 희생시키고 종양의 존재를 부검을 통해 확인하였다.

종양 부피는 부피(mm³) = 길이 × 넓이² × 0.5로 계산하였다.

또한 일련의 재이식을 위하여 MDA-MB-231 또는 SS-ihSC-xenografts 로부터 형성된 종양을 1차 수여개체로부터 절개하고 단일세포로 해리한 후, G-TCD 상에서 부착 세포 배양 조건으로 1주일 성장시킨 후, 2차 마우스 수여개체에 재주사 하였다.

<실험방법 4>

스피어 형성 에세이

10,000개의 세포를 코팅되어 있지 않은 페트리 디쉬 상에서 20ng/ml EGF(Sigma-Aldrich, E9644), 10μg/ml 인슐린(Sigma-Aldrich, I0516) 및 0.4% bovine serum albumin(BSA, Sigma-Aldrich, A9576)이 함유된 EM 또는 SM(B27-supplement(1:50, Invitrogen, 17504044) 배지를 이용하여 배양하였다. in vitro 에서 스피어를 증식하기 위하여, 스피어들을 원심분리를 통해 수득한 후, 단일 세포로 해리한 후 배양하여 다음 세대의 스피어를 생성하였다(Fengyan Yu et al., 2007). SS-ihSCs 유래의 스피어는 3일 배양한 후 Crystal violet(Sigma-Aldrich) 염색을 수행하였고, 사진을 촬영하였다. 이어 스피어의 갯수를 trypan blue exclusion 염색 후 헤마토사이토미터를 이용하여 측정하였다.

<실험방법 5>

siRNA ( small - interfering RNA ) 형질주입

Lipofectamine(Invitrogen, 18326-012)을 이용하여 300pM의 Nanog 특이 siRNA(siNanog, Invitrogen)과 컨트롤 scrambled siRNA로 세포내로 각각 형질주입하였다. 이때 인간 Nanog 특이 siRNA은 다음의 서열을 갖는 것을 사용하였다.

정방향 프라이머 F 5'-GCAACCAGACCUGGAACAACAAUU-3',

역방향 프라이머 R 5'-UUGUUCCAGGUCUGGUUGCUU-3'

<실험방법 6>

GPR50 넉다운 및 과발현을 위한 렌티 바이러스 감염

GPR50의 발현을 넉다운 시키기 위하여, GPR50에 대한 shRNA 올리고뉴클레오타이드를 사람의 GPR50 서열을 기초로 헤어핀 구조를 갖도록 디자하였다(표적 서열 : 5'-TCGTGGGTTTCTGCTACGTGAG-3'; 서열번호 9). GPR50 유전자는 SS-ihSCs cDNA와 아래 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다.

GPR50 Foward 프라이머 : 5'-AGAGAGGGAGGCACGCTT-3'; 서열번호 10

GPR50 Reverse 프라이머 : 5'-CACAGCCATTTCATCAGG-3'; 서열번호 11

PCR 산물은 XbaI/BamHI로 전달하여 pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP lenti-viral 벡터내로 서브클로닝하였고 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다. shRNA와 pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP lenti-viral 벡터는 System Biosciences에서 구입하여 사용하였고, lenti-viral 벡터 입자(vector particles)는 바이러스로 형질감염된 293T 세포의 상등액으로부터 수득하였다. 세포 상등액은 72시간 post-transfection후 수집하였고 polyethersulfone membranes(0.45-μm pore 사이즈)를 이용하여 여과하였으며 이후 ultracentrifugation(90분, 4℃에서 50,000 × g)을 통해 120배로 농축시켰다. 펠렛은 세포 배양 배지로 재현탁시켰고 이후 다시 세포에 처리하였다. 1주일 배양한 후, GFP 발현 정도를 형광현미경(a Zeiss Axiovert 200 microscope)으로 관찰하였다.

<실험방법 7>

유세포 분석( flow cytometry analysis )

세포에 트립신을 처리하고 0.2% BSA를 포함하는 차가운(ice-cold) PBS로 2회 세척하였다. 세포의 일부를 PBS 용액 하에서 4℃의 조건으로 anti-CD44-FITC(BD Bioscience, 555478), anti-CD24-PE(BD Bioscience, 555428), anti-CD133-FITC(MACS Miltenyi Biotec Inc., 130-080-801), anti-GPR50(Santa Cruz Biotechnology, SC345), Alexa 546-conjugated goat anti-rabbit(Jackson Immuno Research labs) 및 아이소타입-매치(isotype-matched)된 대조군 IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology, SC-2025/SC-2027)를 처리하고 30분간 배양하였다. 이후 PBS로 3회 세척 후, 세포들을 PBS로 재현탁시키고 FACScan(Becton Dickinson)을 사용하여 분석하였다.

<실험방법 8>

면역 염색( Immunostaining )

세포를 유리 커버슬립 상에서 24시간 동안 EM 또는 SM를 이용하여 배양하였다. 이후 세포를 차가운(ice-cold) PBS로 한번 세척하고, 3.7% formaldehyde(Gibco-BRL)/PBS로 상온에서 15분간 고정시킨 다음 0.1% Triton X-100(Ameresco)/PBS로 10분간 침투할 수 있게 하였다. 상기 세포들이 고정된 커버슬립을 1% 노말 염소 혈청/PBS가 포함된 블럭킹 용액에서 1시간 동안 블럭킹 한 후 10시간 동안 블럭킹 용액에서 항체(1:500, 베타-액틴, Santa cruz Biotechnology, SC)와 반응시켰다. 세포를 3회 세척한 후 1시간 동안 블럭킹 용액에서 2차 항체(1:1000, Alexa 488-conjugated FITC, Molecular Probes/Life technologies, W11261)를 처리하여 반응시켰고, PBS로 3회 세척하고 핵을 TOPRO(1:1000, Molecular Probes/Life technologies, T3605)로 염색하였다. 마지막으로 세포를 마운팅 솔루션(Vector Laboratories, H1200)에 마운트하고, 공초점 현미경(LSM-710; Carl Zeiss)을 사용하여 분석하였다.

조직학적 분석을 위하여, MDA-MB-231 또는 SS-ihSC가 주입된 마우스로부터 해부된 종양들을 4% paraformaldehyde(Sigma-Aldrich)로 4℃에서 오버나잇 고정하여 세척하고 파라핀 충진 때까지 70% 에탄올(Junsei)에서 저장하였다. 파라핀으로 충진된 조직은 Jung RM 2025 MICROTOME(Leica) 상에서 절편화(두께 5 ㎛)하였고, 절편화된 슬라이드를 표준 프로토콜에 따라 hematozylin 및 eosin (H & E, Santa cruz Biotechnology, 517-28-2/173-87-1)으로 염색하였다. 그 다음 면역 염색을 위하여, 절편을 0.5% 블럭킹 버퍼(노말 염소 혈청)에서 anti-N-cadherin (1:500, Santa cruz Biotechnology, SC7939), anti-E-cadherin (1:500, Santa cruz Biotechnology, SC7870), anti-twist (1:500, Santa cruz Biotechnology, SC15393) 항체로 반응시켰다. 절편을 세척하고 0.5% 블럭킹 버퍼에서 1시간 동안 상온에서 1:1000 희석된 항-마우스 또는 토끼 2차 항체(EMD Millipore Chemical, 12-506/AP510)로 반응시킨 다음, Vectastain Elite ABC 및 diaminobenzidine(DAB) 기질 키트를 제조업자(Vector Laboratories)의 지시에 따라 면역-퍼옥시데이즈(immuno-peroxidase) 염색을 통해 분석하였다.

<실험방법 9>

정량적( Quantitative ) PCR 수행

전체 세포의 RNA를 제조업자의 프로토콜에 따라서 Trizol reagent(Gibco-BRL)을 사용하여 배양된 세포로부터 정제하였고, 그 추출된 RNA 샘플을 MMLV reverse transcriptase(Promega, M5313)로 처리하였다. PCR 산물은 1% 또는 1.2% 아가로스 젤(Invitrogen) 상에서 분석하였다. 정량적(Quantitative) 실시간 PCR은 SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad, #172-5200)을 사용하여 수행하였다. 유전자 발현의 정량 분석은 각 프라이머 쌍의 선형 범위 안에서 수행하였다. 유전자 증폭에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표에 기재된 것을 사용하였다.

<실험방법 10>

웨스턴 블럿팅

전체 세포 추출물의 수득을 위해, 세포들을 디쉬로부터 스크랩하여 추출 버퍼[100 mM Tris-Cl(Sigma-Aldrich) pH 7.8, 10 mM NaCl(Sigma-Aldrich), 10% Glycerol(Sigma-Aldrich), 1 mM sodium orthovanadate(Sigma-Aldrich), 50 mM sodium fluoride(Sigma-Aldrich) 및 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride(Sigma-Aldrich)]로 현탁시켰다. 이후 단백질이 추출된 추출액의 동량을 10% SDS-PAGE 상에서 전기영동 시키고 나이트로셀루로스 막(EMD Millipore Chemical)으로 전기이동 시킨 후, 막을 Tris-버퍼 식염수 내 5% 탈지분유(Amresco) 및 0.1% Tween-20(Amresco) 에서 블럭킹하고 1차 항체로 반응시켰다. 이때 사용한 1차 항체는 anti-N-cadherin, anti-E-cadherin, anti-Twist, anti-ACTIN, anti-NANOG(SC33759), anti-OCT4(SC5279), anti-SOX2(SC365823), anti-AKT(SC1619), anti-ERK(SC153), anti-GPR50(SC345) (Santa Cruz Biotechnology), anti-phospho-AKT(#9271), anti-phospho-ERK(#9201) (Cell Signaling Technology)을 사용하였다. 항체-항원 복합체들을 2차 항체인 anti-rabbit 또는 anti-mouse-IgG-peroxidase로 반응시킨 다음, enhanced chemiluminescence(ECL) 키트(GE Healthcare Life Science)를 사용하여 검출하였다.

참고로 본 발명의 실험에서 수득한 모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준편차(SEM)로 나타내었다. 통계적 분석을 엑셀 프로그램(Microsoft, Redmond, WA, USA)에서 two-tailed Student's t-test 또는 one-way ANOVA(분산 분석)을 사용하여 수행하였다. 유의적 차이는 P < 0.05 에서 간주 되었다.

< 실시예 1>

SS - ihSCs 의 분리 및 세포 형태 분석

상기 기술된 실험방법 1 및 2에 따라 SS-ihSCs를 분리하였고, 분리한 과정을 도 1a에 나타내었으며, 안정한 SS-ihSC 라인은 CT-PC 유래의 현탁세포(suspension cell)들로부터 수득할 수 있었고, 반면, NCT-PC들은 SS-ihS 방법에 따른 현탁 배양 조건 하에서는 세포들이 살지 못하는 것으로 나타났다.

나아가 본 발명자들은 분리한 SS-ihSCs의 발현 프로파일을 분석하였는데, 그 결과, 도 1b 및 1c에 나타낸 바와 같이 SS-ihSCs은 CT-PCs와는 확연히 다른 형태를 나타내었다. CT-PCs는 섬유 유사 형태를 보였고, 젤라틴으로 코딩된 TCDs(G-TCDs) 또는 NPDs 상에서 단층으로 세포들이 형성되는 반면, SS-ihSCs는 매끈한 가장자리를 갖는 구형 유사 형태를 보였고 핵 대 세포질의 비율이 현저하게 증가한 것으로 나타났고(도 1b), EM-NPD 현탁 배지 상에서 높은 구형 형태를 나타내는 것으로 보였다(도 1c 참조). 나아가 MDA-MB-231 세포들을 함유하는 다른 유방안 세포주들의 경우, EM 하에서 구형의 형태를 갖지 못하는 것으로 나타났는데, 단지 일부가 NPD(SM-NPD)에서 특별히 구형 형태를 나타내었다. SS-ihSCs는 EM-NPD 및 SM-NPD 모두에서 높은 구형 형태를 보였으나, CT-PCs의 경우 SM-NPD 하에서도 구형을 형성하지 못하는 것으로 나타났다.

나아가 본 발명자들은 세포에서 발현되는 줄기세포성 마커인 Oct4, Sox2 및 Nanog 유전자들의 발현정도를 분석하였는데, 도 1d에 나타낸 바와 같이, SS-ihSCs은 CT-PCs 및 다른 유방암 세포주에 비해 Oct4, Sox2 및 Nanog 유전자들이 높게 발현되는 것으로 나타났고, EM-NPD 및 SM-NPD의 배양 하에서 이들 유전자들의 발현 정도는 유사한 것으로 나타났다.

< 실시예 2>

세포수용체 및 표면 표지자 발현분석

본 발명자들은 본 발명에서 수득한 SS-ihSCs 세포의 표면에 암과 관련성이 있는 마커인 EGFRs 및 NRGs의 발현정도를 분석하였다. 그 결과, 도 2a-a에 나타낸 바와 같이, CT-PCs의 경우 세포 배양 조건 하에서 EGFR2 및 EGFR3의 발현이 증가하는 것으로 나타났고 SS-ihSCs가 형성되는 것으로 나타났으며, 특히 EGFR4는 환자 유래의 일차 유방암 세포주에서는 낮은 발현정도를 보였으나, CT-PCs을 배양하는 동안 및 SS-ihSCs에서는 높게 발현되는 것으로 나타남에 따라, EGFR4가 SS-ihSCs을 구형으로 형성하는 능력을 갖출 수 있는데 작용함을 알 수 있었다.

또한, NRGs의 발현 정도를 분석한 결과, NRG3를 제외한 NRG1, NRG2 및 NRG4는 배양된 CT-PCs 및 SS-ihSCs에서 높게 발현되는 것으로 나타났고, 이 결과를 통해 NRGs 역시 SS-ihSCs을 구형으로 형성하는 능력을 갖출 수 있는데 작용함을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 p53, p21, Nanog 및 Oct4 유전자의 발현정도를 분석하였는데, 도 2a-b에 나타낸 바와 같이 3기 암에서는 p53과 p21의 발현은 0일부터 발현되는 것으로 나타났고, CT-PCs에서는 현탁 배양 3일부터 유의적으로 이들 유전자의 발현이 감소되는 것으로 나타났다. 반면, Nanog 및 Oct4 유전자의 발현은 CT-PCs에서는 현탁 배양 3일부터 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 또한 SS-ihSCs에서는 Nanog 및 Oct4 유전자의 발현은 유의적으로 높게 나타났고, 반면 p53과 p21의 발현은 억제되어 있는 것을 알 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 EGFRs 및 NRGs의 증가된 발현이 줄기세포성 마커들인 Nanog 및 Oct4의 발현은 증진시키고 종양 억제자인 p53과 p21의 발현은 감소시켜 궁극적으로 SS-ihSCs의 스피어(sphere) 형성능에 기여한다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

SS - ihSCs 의 표면 표지자 발현패턴 분석

세포들의 표면 표지자 발현 패턴을 분석한 결과, SM-NPD로 배양한 SKBR3 및 MDA-MB-231세포들은 배양 10일째 CD44+/CD24- 발현양상을 보였다(도 2b-a). 환자 번호18 및 33 유래의 주요 세포들은 현탁배양 이전에 CD44+/CD24- 발현양상을 보였으나, 현탁 배양 10일 후에는 CD44-/CD24- 형태의 양상을 보였다(도 2b-b 상단). 한편, SS-ihSCs의 경우, SM-NPD 상에서 배양함에도 불구하고 CD44가 SS-ihSCs의 특이표지자가 아닌 것으로 나타났다. 환자 번호 18 및 33 유래의 세포들은 CD133의 발현이 EM-NPD로의 배양 전후에 관계없이 일괄적으로 지속되고 있었고, 형성된 SS-ihSCs은 CD44-/CD24-/CD133+의 표현형을 보이는 것으로 나타났다(도 2b-b 하단). SKBR3 및 MDA-MB-231 세포들에서는 SM-NPD 상에서는 CD133의 발현이 증가되는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 CT-PCs의 주요한 마커는 CD133+임을 알 수 있었으나, SS-ihSCs의 스피어 형성능과는 관련성이 없음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 교반 또는 현탁배양과 같은 물리적 스트레스 하에서SS-ihS를 지속적으로 배양할 경우, CD44+/CD24-/CD133+ CT-PCs가 CD44-/CD24-/CD133+의 높은 스피어 형성능을 갖는 줄기세포 유사 CSLC 세포로 전화될 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이렇게 전환된 SS-ihSCs은 안정적이며, CD44-/CD24-/CD133+의 면역표현형을 가지고, 높은 증식율과 높은 스피어 형성능을 가질 수 있으며, 줄기세포성 표지자의 발현이 증가되고, EMT(epithelial to mesenchymal transition) 및 약물 저항성을 높게 가질 수 있는 특징이 있다는 것을 알 수 있었다.

이러한 특징은 70번의 계대배양과 EM-NPD 현탁 배양액의 freeze-thawing을 수행하였어도 동일한 특징이 유지되는 것을 알 수 있었다(도 2c 및 2d 참조).

< 실시예 4>

SS - ihSCs 이 CLSL 특성에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 SS-ihSCs이 암줄기 유사세포(CSLC)의 특성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 약물저항성, 발암성 및 자기복제능에 대해 분석하였다.

<4-1> 약물저항성 분석

먼저, 약물저항성 분석을 위해 약물 저항 세포주로 잘 확립된 유방암 세포주와 CT-PCs 및 SS-ihSCs을 대상으로 분석하였는데 분석 결과, 3가지 세포주 모두 약물(독소루비신 및 파클리탁셀)에 대해 모두 저항성을 가지고 있는 것으로 나타났다(도 3a 참조). 또한, 다약제 저항 유전자로 알려진 ALDH1, ABCG2,ABCC1 및 ABCB5 유전자의 세포 내에서의 발현정도를 분석한 결과, 3개의 세포주 모두에서 이들 유전자가 발현되어 있는 것으로 나타났으나, SS-ihSCs에서 가장 많은 발현이 진행된 것으로 나타났다(도 3b 참조). 따라서 이러한 결과를 통해 SS-ihSCs이 가장 높은 약물 저항성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

한편, 암줄기 유사세포(CSLC)의 주요 특징으로 할 수 있는 자기 복제능(self renewal) 정도를 분석하기 위해, 다양한 암 세포들(CT-PCs, SS-ihSCs, MCF10A, MCF7, SKBR3, MDA-MB-231, N-TERA 세포주)을 대상으로 자기 복제능 여부를 판단할 수 있는 마커인 Nanog, Oct4 및 Sox2 유전자들의 발현정도를 분석하였다.

그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 다른 암세포주들에 비해 SS-ihSCs에서 Nanog, Oct4 및 Sox2의 발현이 가장 높게 나타났고, SS-ihSCs에서는 동시에 p53 및E-cadherin의 발현은 감소되고 반면, N-cadherin 및 Twist는 높게 발현되는 것으로 나타났다(도 3d 참조).

나아가 EM-NPD 및 SM-NPD 조건 하에서 스피어를 계대배양하고 SS-ihSCs 의 형성능을 분석하였는데, 그 결과 도 3e에 나타낸 바와 같이, EM-NPD 및 SM-NPD 조건 하에서 모두 유사한 정도로 SS-ihSCs이 형성된 것으로 나타났고, 이러한 스피어 형성능을 지속적인 연속 배양을 함에도 불구하고 형성되며, in vitro 상에서도 자기 복제능을 가질 수 있음을 알 수 있었다.

<4-2> 발암성 분석

앞서 약물저항성 분석에 이어 SS-ihSCs 의 발암성 분석을 수행하였는데, 이 것은 즉 자기 복제능 여부를 반영하는 것으로 볼 수 있다.

분석 결과, SS-ihSCs 의 발암성 정도는 CT-PC and MDA-MB-231 에 비해 더 높은 것으로 나타났고, NOD/SCID 마우스를 대상으로 각각의 암세포줄주를 주입한 후, 종양 형성 정도를 분석한 결과, SS-ihSCs를 주입한 군이 다른 암세포를 주입한 군에 비해 마우스에서 형성된 종양의 크기 및 무게가 더 큰 것으로 나타났다(도 4a 및 4b 참조).

또한 헤마토크실렌 및 에오신 염색시약을 통한 면역학적 분석 결과, MDA-MB-231 에 비해 SS-ihSCs을 주입하여 형성된 암 조직에서 암 전이 관련 마커인 N-cadherin과 Twist이 강하게 발현되는 것으로 나타났고, E-cadherin 의 발현은 낮게 발현되는 것으로 나타났다.

특히 이러한 종양 형성능은 SS-ihSCs을 수차례(2회 및 3회) 연속 배양후 이를 이식한 경우에도 유지된다는 것을, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 일차 암세포주 이식에 비해 3차 계대배양하여 수득한 SS-ihSCs을 주입한 군이 종양의 크기와 무게가 더 큰 것으로 나타났고 EMT 관련 유전자의 발현도 강하게 나타남을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 SS-ihSCs은 매우 강력한 약물 저항성, 스피어 형성능, 암발생능, 자기 복제능 및 줄기세포성 표지자의 강력한 발현 특징을 갖는 암 줄기 유사세포의 새로운 유형이라는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

높은 스피어 형성능을 갖는 CSLC 집단과 GRP50 발현과 상관성 분석

본 발명자들은 상기 기술된 바와 같이 장력한 암 줄기세포 성향을 가는 세포들의 존재가 암의 발생, 재발에 매우 크게 관여할 수 있다는 점을 고려하여 이러한 암 유사 줄기세포를 검출할 수 있는 바이오마커를 찾기 위해, CT-PCs, SS-ihSCs-Adh(부착형), SS-ihSCs-Sus(현탁형)를 대상으로 글로벌 유전자 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, CT-PCs 및 SS-ihSCs-Sus 간에 세포 접촉, 전이, 이동, 주화성과 관련된 다수의 유전자들에서 발현 변화가 있음을 알 수 있었고, 특히, EMT, 증식, 줄기세포성 마커에 해당하는 유전자들이 SS-ihSCs에서 월등히 증가된 발현 패턴을 보였다(도 5b 참조). 또한 보다 구체적으로 발현 변화를 보이는 후보 유전자들의 발현 변화를 분석한 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, GPR50(orphan GPCR (G-protein-coupled receptor))이 CT-PCs과 SS-ihSCs-Adh에 비해 SS-ihSCs-Sus에서 현저하게 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 5c 참조). 또한, GPR50의 발현 증가는 3기 암세포의 교반 및 현탁 배양을 통해서도 증가되는 것으로 나타났고(도 5d 참조), 다른 암세포주의 종류에 비해 SS-ihSCs에서 유독 현저하게 증가되는 것으로 나타났다(도 5e 참조). 또한 SS-ihSCs에서 과발현되는 GPR50의 발현 패턴은 SS-ihSCs을 70회 계대 배양을 진행한 후에도 지속적으로 유지되는 것으로 나타났고, 연속 배양이 될수록 발현 정도는 더 증가하는 것으로 나타났다(도 5f 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 GPR50 유전자를 암줄기 유사세포 여부를 확인할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

GRP50 의 넉다운에 의한 CSLC 특성에 미치는 영향분석

GPR50 유전자가 SS-ihSCs에서 높게 발현되어 있다는 점을 착안하여 이 유전자의 기능 분석을 위해 SS-ihSCs에서 GPR50 유전자를 넉다운 시킨 후, SS-ihSCs 세포의 특성을 분석하였다. 이때 GPR50 넉다운을 위해 shGPR50을 발현하는 lenti-viral을 이용하여 SS-ihSCs에 도입함으로써 GPR50 유전자의 발현을 억제시켰다.

분석 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, GPR50을 넉다운 시켰을 경우, SS-ihSCs의 세포 생존율을 감소하는 것으로 나타났고 20회의 계대배양을 한 경우에는 세포 생존율이 40% 미만으로 감소된 것으로 나타났다. 또한, 스피어 형성능, 암세포 전이 관련 인자, 암세포의 자기 복제능과 약물 저항성 관련 인자들의 발현도 모두 GPR50 발현 억제시 감소되는 것으로 나타났다(도 6b~6e).

또한, GPR50 발현 억제시 Nanog의 발현, STAT3와 Src의 인산화도 감소되는 것으로 나타났고, 반면 ERK의 인산화는 증가되는 것으로 나타났다(도 6f 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 GPR50이 STAT3, Src 및 ERK의 신호전달 과정에 관여함을 알 수 있었다.

나아가 GPR50 발현 억제된 SS-ihSCs의 표면 표지자의 양상을 분석하였는데, 도 6g에 나타낸 바와 같이, CD44는 GPR50의 발현 정도에 영향을 받지 않는 것으로 나타났고, CD24와 CD133은 GPR50의 발현이 억제됨에 따라 증가된 발현 양상을 나타내었다. 이로써 GPR50 은 세포 표지자들 중에서 CD24와 CD133에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 7>

GRP50 의 과발현에 의한 CSLC 특성에 미치는 영향분석

상기 실시예 6에서는 GPR50의 발현 억제에 따른 암 줄기 유사세포에 미치는 영향을 분석하였다면 본 실시예에서는 GPR50을 과발현시킬 수 있는 벡터(lenti-viaral)를 제조하고 이를 MDA-MB-231 세포도 도입시켜 상기 실시예 6과 같은 분석을 수행하였다.

분석결과, GPR50이 과발현된 MDA-MB-231 세포는 EM-NPD 및 SM-NPD 모두에서 스피어 형성이 증가된 것으로 나타났고(도 7a 참조), 자기 복제능과 약물 저항 마커 유전자들의 발현이 증가된 것으로 나타났으며(도 7b 및 7c 참조), STAT3와 Src의 인산화는 증가시키고, 반면 ERK의 인산화는 감소되는 것으로 나타났다(도 7 d 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 GPR50을 암줄기 유사세포의 존재 여부를 검출할 수 있는 마커로 사용할 수 있으며, 나아가 이를 암줄기세포 억제를 통한 근본적 암치료제의 타겟이 될 수 있음을 알 수 있었다. 특히 GPR50의 발현 또는 활성 억제제는 암 줄기세포가 갖는 특성, 즉 약물저항성, 발암성 및 자기복제능을 현저하게 억제할 수 있어 보다 효과적인 암 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Konkuk University <120> GPR50 as biomarker for detecting cancer stem like cell and use thereof <130> pn1410-315 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1854 <212> DNA <213> GPR50 wild type cDNA sequence <400> 1 atggggccca ccctagcggt tcccaccccc tatggctgta ttggctgtaa gctaccccag 60 ccagaatacc caccggctct aatcatcttt atgttctgcg cgatggttat caccatcgtt 120 gtagacctaa tcggcaactc catggtcatt ttggctgtga cgaagaacaa gaagctccgg 180 aattctggca acatcttcgt ggtcagtctc tctgtggccg atatgctggt ggccatctac 240 ccataccctt tgatgctgca tgccatgtcc attgggggct gggatctgag ccagttacag 300 tgccagatgg tcgggttcat cacagggctg agtgtggtcg gctccatctt caacatcgtg 360 gcaatcgcta tcaaccgtta ctgctacatc tgccacagcc tccagtacga acggatcttc 420 agtgtgcgca atacctgcat ctacctggtc atcacctgga tcatgaccgt cctggctgtc 480 ctgcccaaca tgtacattgg caccatcgag tacgatcctc gcacctacac ctgcatcttc 540 aactatctga acaaccctgt cttcactgtt accatcgtct gcatccactt cgtcctccct 600 ctcctcatcg tgggtttctg ctacgtgagg 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Cys Ile Tyr Leu Val Ile Thr Trp Ile Met Thr Val Leu Ala Val 145 150 155 160 Leu Pro Asn Met Tyr Ile Gly Thr Ile Glu Tyr Asp Pro Arg Thr Tyr 165 170 175 Thr Cys Ile Phe Asn Tyr Leu Asn Asn Pro Val Phe Thr Val Thr Ile 180 185 190 Val Cys Ile His Phe Val Leu Pro Leu Leu Ile Val Gly Phe Cys Tyr 195 200 205 Val Arg Ile Trp Thr Lys Val Leu Ala Ala Arg Asp Pro Ala Gly Gln 210 215 220 Asn Pro Asp Asn Gln Leu Ala Glu Val Arg Asn Phe Leu Thr Met Phe 225 230 235 240 Val Ile Phe Leu Leu Phe Ala Val Cys Trp Cys Pro Ile Asn Val Leu 245 250 255 Thr Val Leu Val Ala Val Ser Pro Lys Glu Met Ala Gly Lys Ile Pro 260 265 270 Asn Trp Leu Tyr Leu Ala Ala Tyr Phe Ile Ala Tyr Phe Asn Ser Cys 275 280 285 Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Leu Leu Asn Glu Asn Phe Arg Arg Glu 290 295 300 Tyr Trp Thr Ile Phe His Ala Met Arg His Pro Ile Ile Phe Phe Ser 305 310 315 320 Gly Leu Ile Ser Asp Ile Arg Glu Met Gln Glu Ala Arg Thr Leu Ala 325 330 335 Arg Ala Arg Ala His Ala Arg Asp Gln Ala Arg Glu Gln Asp Arg Ala 340 345 350 His 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Glu Ser Ala Ser Ser Pro Ala Ala Gly Pro Thr Lys Pro Ala Ala 565 570 575 Ser Gln Leu Glu Ser Asp Thr Ile Ala Asp Leu Pro Asp Pro Thr Val 580 585 590 Val Thr Thr Ser Thr Asn Asp Tyr His Asp Val Val Val Val Asp Val 595 600 605 Glu Asp Asp Pro Asp Glu Met Ala Val 610 615 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> GPR50 shRNA <400> 9 tcgtgggttt ctgctacgtg ag 22 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPR50 forward <400> 10 agagagggag gcacgctt 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPR50 reverse <400> 11 cacagccatt tcatcagg 18

Claims (15)

1. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 GPR50의 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 유방암의 암줄기-유사세포(CSLC:cancer stem like cell) 검출을 위한 바이오 마커용 조성물.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 암줄기-유사세포는 암 조직으로부터 유래되어 교반과 현탁 배양으로 유도된 스피어 형성능을 갖는 SS-ihSCs(shaking and suspension-induced high sphere-forming CSLCs cells)인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 GPR50의 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 유방암의 진단 또는 예후 분석용 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 GPR50의 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 shRNA를 포함하는 유방암의 치료용 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. (a) 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 세트를 이용하여 생물학적 시료로부터 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 GPR50 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 유전자 발현 수준에 비해 증가된 것을 확인하는 단계;를 포함하는 유방암의 발병 또는 중증도를 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction) 및 노던 블럿으로 이루어진 군 중에서 선택되는 공정에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10 항에 있어서,
    상기 시료는 유방암으로 의심되는 환자 또는 유방암 치료를 받은 환자의 생물학적 시료로서 조직, 세포, 혈액 또는 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
    
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