MX2008002743A - Potenciacion in vivo del reconocimiento de neoplasmas por el sistema inmunitario posterior a viroterapia oncolitica o vector para terapia genica. - Google Patents

Abstract

Esta invencion proporciona metodos novedosos para el tratamiento o alivio de neoplasmas en un mamifero y potenciar la eficacia de virus oncoliticos al utilizar una combinacion de un virus oncolitico y un inmunoestimulante, que comprende administrar un retrovirus a un hospedero y potenciar una respuesta inmunitaria mediante la adicion de un inmunoestimulante, tal como un oligodeoxinucleotido CpG o al menos un antigeno del virus que es liberado al hospedero mediante las celulas dendriticas.

Description

POTENCIACIÓN N VIVO DEL RECONOCIMIENTO DE NEOPLASMAS POR EL SISTEMA INMUNITARIO POSTERIOR A VIROTERAPIA ONCOLITICA O VECTOR PARA TERAPIA GENICA Campo de la Invención Esta invención se relaciona con métodos para el tratamiento contra trastornos proliferativos en un mamífero utilizando inmunoestimulantes y virus oncolíticos.

Antecedentes de la Invención Solo en EE.UU. se diagnostica cáncer en más de un millón de personas cada año. A pesar de los diversos avances en la investigación médica, el cáncer sigue siendo la segunda causa principal de muerte en EE.UU. En las naciones industrializadas, aproximadamente 1 de cada 5 personas morirá por cáncer. En la búsqueda de novedosas estrategias, recientemente ha emergido la viroterapia oncolítica como un método viable para eliminar específicamente células tumorales. A diferencia de la terapia génica convencional, utiliza virus de replicación competente que son capaces de diseminarse a través del tejido tumoral por virtud de su replicación viral y lisis celular concomitante, lo que proporciona un tratamiento alternativo contra el cáncer. Ahora se han manipulado genéticamente los virus para replicarse selectivamente y eliminar células cancerosas . Los virus oncolíticos pueden utilizar múltiples mecanismos Ref.188694 de acción para eliminar células cancerosas, mediante lisis celular, apoptosis celular, antiangiogénesis y necrosis celular. El virus infecta la célula tumoral y luego comienza a replicarse. El virus continúa replicándose hasta que finalmente "lisa" (hace estallar) la membrana de la célula hospedera ya que la célula tumoral ya no puede contener el virus . La célula tumoral es destruida y los virus recientemente formados se diseminan a células cancerígenas circundantes para continuar el ciclo. Es importante recordar que todos los virus oncolíticos pretenden replicarse sólo en células cancerosas y pasar a través del tejido normal sin causar daño. Por lo tanto, una vez que todas las células tumorales son erradicadas, el virus oncolítico ya no tiene la habilidad de replicarse y el sistema inmunitario lo elimina del cuerpo. Durante los últimos años, los nuevos descubrimientos sobre mecanismos moleculares de citotoxicidad viral han proporcionado el razonamiento científico para diseñar virus oncolíticos más efectivos. Los recientes avances en biología molecular permiten el diseño de diversos virus genéticamente modificados, tales como adenovirus y virus de herpes simplex que se replican específicamente y eliminan específicamente células tumorales. Por otra parte, también se están evaluando para propósitos terapéuticos, los virus con capacidad oncolítica intrínseca. Aunque la eficacia de la terapia con virus oncolíticos ha sido generalmente demostrada en estudios preclínicos, la eficacia terapéutica en ensayos clínicos no es aún óptima. Por lo tanto, se evalúan estrategias que pudieran mejorar posteriormente el potencial oncolítico de virus con replicación condicionada.

Breve Descripción de la Invención Aunque se reconoce que la administración de un virus oncolítico en un paciente puede provocar en el paciente una respuesta inmunitaria antiviral, el enfoque de la investigación se lleva a acabo en obviar esta respuesta innata. La presente invención, por otra parte, toma ventaja de esta respuesta innata para potenciar la eliminación de neoplasmas. Al administrar agentes inmunoestimulantes a pacientes luego del tratamiento con una terapia del virus oncolítico, se puede aumentar la eliminación de células tumorales. No sólo son las células tumorales susceptibles a los virus oncolíticos, pero también las células tumorales infectadas, que expresan para el antígeno viral sobre su superficie, pueden ser reconocidas y atacadas como "extrañas" por el sistema inmunitario estimulado. Más aún, las células tumorales que ha sido lisadas por los virus oncolíticos se exponen al sistema inmunitario, aumentando así la probabilidad de reconocimiento de antígenos tumorales por el sistema inmunitario, particularmente en presencia de agentes inmunoestimulantes. Un aspecto de la invención proporciona métodos para el tratamiento contra neoplasmas en un mamífero que padece del neoplasma, el método comprende administrarle un virus oncolítico y un inmunoestimulante al mamífero. Preferiblemente, el inmunoestimulante se administra después del virus oncolítico, con mayor preferencia el virus oncolítico ha infectado una célula neoplásica. Con mayor preferencia, el inmunoestimulante se administra después de que la célula neoplásica infectada expresa al menos para un antígeno del virus oncolítico. Preferiblemente, el inmunoestimulante es un oligodeoxinucleótido sintético, tal como citosina-fosfato-guanosina (CpG por sus siglas en inglés) . En una modalidad preferida, el virus oncolítico es un reovirus, con mayor preferencia un reovirus de origen natural . En otro aspecto, la invención proporciona métodos para potenciar la actividad antineoplásica de un virus oncolítico en un mamífero que padece del neoplasma, el método comprende administrar un inmunoestimulante además de administrar el virus oncolítico al mamífero. Preferiblemente, el inmunoestimulante se administra después de que se administra el virus oncolítico. Con mayor preferencia, el inmunoestimulante se administra después de que la célula neoplásica infectada expresa para al menos un antígeno del virus oncolítico. En una modalidad, el inmunoestimulante es un oligodeoxinucleótido (ODN) sintético, preferiblemente citosina-fosfato-guanosina (CpG) no metilada. Incluso otro aspecto de la invención proporciona métodos para potenciar la actividad antineoplásica de un virus oncolítico en un mamífero que padece neoplasma, el método comprende (a) poner en contacto una célula dendrítica con el virus oncolítico, (b) inducir la célula dendrítica a que presente un antígeno del virus oncolítico, y (c) provocar una respuesta inmunitaria para el antígeno presentado por la célula dendrítica, provocando con ello una respuesta inmunitaria para el virus oncolítico en el mamífero. En una modalidad preferida, el paso (a) ocurre in vivo . En otra modalidad preferida, el paso (a) ocurre ex vivo y la célula dendrítica se administra al mamífero luego de haberse puesto en contacto con el virus. Otro aspecto de la invención proporciona un método para potenciar la eficacia de una terapia con virus oncolítico que comprende administrar un virus oncolítico a un mamífero y administrar un inmunoestimulante al mamífero. Preferiblemente, el inmunoestimulante se administra después del virus oncolítico, con mayor preferencia, después de que el virus oncolítico ha infectado la célula neoplásica. Más preferiblemente, el inmunoestimulante se administra después de que la célula neoplásica infectada exprese para al menos un antígeno del virus oncolítico. Preferiblemente, el inmunoestimulante es un oligodeoxinucleótido (ODN) sintético, tal como citocina-fosfato-guanosina (CpG) . En una modalidad preferida, el virus oncolítico es un reovirus, con mayor preferencia, un reovirus de origen natural. Un aspecto de la invención proporciona métodos para aumentar el reconocimiento inmunológico de una célula neoplásica que comprende (a) infectar la célula neoplásica con un virus oncolítico y, (b) provocar una respuesta inmunitaria para una antígeno del virus oncolítico, con lo cual la respuesta inmunitaria al virus oncolítico responde a un antígeno del virus oncolítico expresado por la célula neoplásica infectada. Preferiblemente, la respuesta inmunitaria es provocada mediante un proceso que comprende (i) poner en contacto una célula dendrítica con el virus oncolítico, (ii) inducir a la célula dendrítica a que presente un antígeno del virus oncolítico y (iii) provocar una respuesta inmunitaria al virus oncolítico. En una modalidad preferida, el contacto ocurre in vivo . En otra modalidad preferida, el contacto ocurre ex vivo y la célula dendrítica se administra al mamífero luego de haberse puesto en contacto.

Descripción Detallada de la Invención A. Definiciones El término "administrar" significa cualquiera de los métodos convencionales de administración de una composición farmacéutica conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, entre otros, la administración enteral, transdérmica, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. El término "administración de un virus" en un paciente, se refiere al acto de administrar el virus a un paciente en forma tal, que haga contacto con las células neoplásicas objetivo. La ruta mediante la cual el virus se administra, así como la formulación, el portador o vehículo, dependerán de la ubicación así como del tipo de células objetivo. El término "resistencia" de células a la infección viral indica que la infección de células del virus no dio como resultado una producción viral significativa. Las células que son "susceptibles" son aquellas que demuestran inducción de efectos citopáticos, síntesis de proteína viral y/o producción viral. El término "célula neoplásica", "célula tumoral" o "célula con un trastorno proliferativo", se refiere a una célula que prolifera a una velocidad anormalmente elevada. Un nuevo crecimiento que comprende células neoplásicas es un neoplasma, también conocido como un "tumor". Un tumor es un crecimiento anormal del tejido, generalmente se forma como una masa distinta que crece por proliferación celular con mayor rapidez que el crecimiento normal del tejido. Un tumor puede mostrar una falta parcial o total de organización estructural y coordinación funcional con respecto al tejido normal. Como se utiliza aquí, un tumor pretende abarcar tumores hematopoyéticos así como tumores sólidos. Un tumor pude ser benigno (tumor benigno) o maligno (tumor maligno o cáncer) . Los tumores malignos pueden clasificarse ampliamente en tres tipos principales. Los tumores malignos que se derivan de estructuras epiteliales son llamados carcinomas, los tumores malignos que se originan de tejido conectivo tal como músculo, cartílago, grasa o hueso son llamados sarcomas y los tumores malignos que afectan estructuras hematopoyéticas (estructuras que pertenecen a la formación de células sanguíneas) incluyendo los componentes del sistema inmunitario, son llamados leucemias y linfomas . Otros tumores incluyen, pero no están limitados a neurofibromatosis. Preferiblemente, la célula neoplásica está ubicada en un mamífero, particularmente un mamífero seleccionado a partir de un grupo que comprende perros, gatos, roedores, ovejas, cabras, ganado, caballos, cerdos, humanos y primates no humanos. Con mayor preferencia, el mamífero es un humano . El término "virus oncolítico" es un virus que preferiblemente se replica y elimina en células neoplásicas. Un virus oncolítico puede ser un virus de origen natural o un virus manipulado genéticamente. Los virus oncolíticos también abarcan virus inmunoprotegidos y virus reasociados o "reasortantes" como se describe detalladamente para los reovirus . El término "infección por un virus oncolítico" se refiere a la entrada y replicación de un virus oncolítico en una célula. Similarmente, el término "infección de un tumor por un virus oncolítico" se refiere a la entrada y replicación de un virus oncolítico en las células de un tumor.

El término "cantidad efectiva" es una cantidad de un inmunoestimulante o reovirus que es suficiente para dar como resultado el efecto pretendido. Para un virus oncolitico utilizado para el tratamiento o disminución de un tumor, una cantidad efectiva es una cantidad de virus oncolítico suficiente para aliviar o eliminar los síntomas del tumor o para disminuir el progreso del tumor. El término "tratamiento o alivio de un neoplasma" significa aliviar o eliminar los síntomas de un neoplasma o disminuir el progreso del neoplasma. El alivio es preferiblemente de aproximandamente de 10% con una preferencia de aproximandamente % a 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%. Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se utilizan indistintamente para dar a entender una molécula que comprende múltiples nucleotidos. Como se utiliza aquí, el término se refiere a los oligorribonucleótidos así como a los oligodesoxirribonucleótidos . Los términos también deben incluir los polinucleósidos (es decir, un polinucleótido menos el fosfato) y cualquier otro polímero que contenga una base orgánica. Los ácidos nucleicos incluyen vectores, por ejemplo plásmidos asi como los oligonucleótidos. Las moléculas de ácido neucleico pueden obtenerse a partir de fuentes existentes de ácidos nucleicos, pero preferiblemente, a partir de fuentes sintéticas (por ejemplo, producidos por síntesis de oligonucleótidos) .

El término "inmunoestimulantes" se refiere esencialmente a cualquier sustancia que potencialice o intensifique una respuesta inmunitaria (de anticuerpo y/o celular) para un antigeno exogeno. El término "ácido nucleico inmunoestimulante" como se utiliza aquí, es cualquier ácido nucleico que contiene una estructura principal o motivo inmunoestimulante que induzca una respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria puede caracterizarse, pero no limitarse a la respuesta inmunitaria tipo Thl o una repuesta inmunitaria Th2. Estas respuestas inmunitarias se definen por perfiles de producción de citocinas y anticuerpos que son provocadas por células inmunitarias activadas .

B. Métodos de Tratamiento Contra Neoplasma La invención proporciona métodos de tratamiento contra un neoplasma en un mamífero que padece el mismo, el método comprende administrar un virus oncolítico y un inmunoestimulante en un mamífero. El virus oncolítico se administra en forma tal, que pueda ponerse en contacto con las células neoplásicas objetivo. La ruta mediante la cual se administra el virus oncolítico, así como la formulación, el portador o vehículo, dependen de la ubicación así como del tipo de células objetivo. Se pueden emplear una amplia variedad de rutas de administración. Por ejemplo, para un neoplasma sólido que es accesible, el virus oncolítico puede administrarse mediante inyección directa al neoplasma. Para un neoplasma hematopoyético, por ejemplo, el virus oncolítico puede administrarse intravenosamente o intravascularmente. Para los neoplasmas de difícil acceso dentro del cuerpo, como las metástasis, los virus oncolíticos se administran de manera tal, que puedan transportarse sistemáticamente a través del cuerpo del mamífero y con ello alcanzar el neoplasma (por ejemplo, intravenosamente o intramuscularmente) . Alternativamente, el virus oncolítico puede administrarse directamente a un solo neoplasma sólido, en donde después se transporta sistémicamente a través del cuerpo hasta la metástasis. El virus oncolítico también puede administrarse subcutáneamente, intraperitonealmente, intratecalmente (por ejemplo, a un tumor cerebral), tópicamente (por ejemplo, para el melanoma), oralmente (por ejemplo, para neoplasma oral o esofágico) , rectalmente (por ejemplo, para neoplasma colorrectal) , vaginalmente (por ejemplo, para neoplasma cervical o vaginal) , nasalmente o mediante aerosol inhalado (por ejemplo, para neoplasma pulmonar) . El virus oncolítico se puede administrar en una sola dosis o múltiples dosis (es decir, más de una dosis) . Las dosis múltiples pueden administrarse concomitantemente en diferentes sitios o mediante diferentes rutas o consecutivamente (por ejemplo, durante un período de días o semanas) . El virus oncolítico se administra preferiblemente antes del inmunosupresor. En una modalidad de esta invención, un programa de terapia de virus/inmunosupresor se administra una o más veces . Preferiblemente, el virus oncolítico se formula en forma de closis unitaria, cada dosis contiene de aproximadamente 102 pfus hasta aproximadamente 1013 pfus del reovirus. El término "formas de dosis unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitaria en pacientes humanos y otros mamíferos, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de virus oncolítico calculada para producir un efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado. La presente invención puede aplicarse a cualquier paciente animal, preferiblemente un mamífero. Preferiblemente, el mamífero se selecciona a partir del grupo que comprende caninos, felinos, roedores, ganado doméstico (tales como ovejas, cabras, ganado vacuno, caballos y cerdos), en humanos y primates no humanos. Preferiblemente, el mamífero es un humano. Está contemplado que la presente invención puede combinarse con otras terapias antitumorales tales como quimioterapia, radioterapia, cirugía, terapia hormonal y/o inmunoterapia . El experto en la técnica puede llevar a la práctica la presente invención utilizando cualquier virus oncolítico según la descripción del documento y el conocimiento disponible en la técnica. El virus oncolítico puede ser un miembro de la familia mioviridae, sifoviridae, podpviridae, teciviridae, corticoviridae, plasmaviridae, lipotrixviridae, fuseloviridae, poxviridae, iridoviridae, ficodnaviridae, baculoviridae, herpesviridae, adenoviridae, papovaviridae, polidnaviridae, inoviridae, microviridae, geminiviridae, circoviridae, parvoviridae, hepadnaviridae, retroviridae, cictoviridae, reoviridae, birnaviridae, paramixoviridae, rabdoviridae, filoviridae, ortomixoviridae, bunyaviridae, arenaviridae, leviviridae, picornaviridae, sequiviridae, comoviridae, potiviridae, caliciviridae, astroviridae, nodaviridae, tetraviridae, tombusviridae, coronaviridae, glaviviridae, togaviridae o barnaviridae. Los reovirus son los virus oncolíticos particularmente preferidos . Los reovirus son virus con un genoma ARN segmentado y bicatenario. Los viriones miden 60-80 nm de diámetro y tienen dos cápsides concéntricos, cada uno es icosaedro. El genoma comprende ARN bicatenario en 10-12 segmentos discretos con un tamaño total del genoma de 16-27 kbp. Los segmentos AR? individuales pueden variar en tamaño. El reovirus humano comprende tres serotipos: tipo 1 (cepa Lang o TIL), tipo 2 (cepa Jones, T2J) y tipo 3 (cepa Dearing o cepa Abney, T3D) . Los tres serotipos son fácilmente identificables con base en las valoraciones de inhibición de hemaglutinina y neutralización (ver, por ejemplo Fields, B. N. et al., 1996). En otra implementación de la invención, el virus oncolítico es un adenovirus atenuado o modificado. Los adenovirus atenuados o modificados pueden modificarse en células con una vía Ras activada, pero son incapaces de replicarse en células que no tienen la vía Ras activada. El adenovirus es un virus ADN bicatenario de aproximadamente 3.6 kilobases. En humanos, los adenovirus pueden replicarse y causar una enfermedad en el ojo y en los tractos respiratorios, gastrointestinales y urinarios. Aproximadamente un tercio de los 47 serotipos conocidos en humanos son responsables de la mayoría de los casos de enfermedad en humanos por adenovirus . El adenovirus codifica para varios productos génicos que contrarrestan los mecanismos de defensa antiviral del hospedero. El ARN asociado al virus (V AI AR? o VA AR?i) del adenovirus es pequeño, son ARN estructurados que se acumulan a elevadas concentraciones en el citoplasma en una etapa posterior a la infección por el adenovirus. Este VAI ARN se une a los motivos de unión del ARN bicatenario (ARNds ) de PKR y bloquean la activación dependiente de ARNds de PKR mediante autofosforilación, Por lo tanto, PKR no es capaz de funcionar y el virus puede replicarse dentro de la célula. La sobreproducción de viriones eventualmente conlleva a la muerte celuLar. El término "adenovirus atenuado" o "adenovirus modificado", como se utiliza aquí, significa que el producto o productos génicos que evitan la activación del PKR están faltantes, inhibidos o mutados de manera tal, que no se bloquea la activación PKR. Preferiblemente, los VAI ARN no se transcriben. Estos adenovirus modificados o atenuados no son capaces de replicarse en células normales que no tengan la vía Ras activada, pero son capaces de infiltrar y replicarse en células que sí tienen la vía Ras activada. El virus de la enfermedad de ?ewcastle (NDV, por sus siglas en inglés) se replica preferiblemente en células malignas y la cepa más comúnmente utilizada es 73-T (Reichard et al., 1992; Zorn et al., 1994; Bar-Eli et al., 1996). El PV701, una cepa oncolítica atenuada y no recombinante del virus de la enfermedad de ?ewcastle, lisa de manera selectiva las células tumorales con respecto a células normales basándose en defectos específicos del tumor en una respuesta antiviral mediada por interferón. El virus parapoxvirus orf es un poxvirus que induce lesiones cutáneas agudas en diferentes especies de mamíferos, incluyendo humanos. El virus parapoxvirus orf codifica para el gen OV20.0L que está involucrado en el bloqueo de la actividad PKR. El virus parapoxvirus orf es incapaz de replicarse en células que no tienen la vía Ras activada. Un virus oncolítico más preferido para utilizarse en la invención es un "virus parapoxvirus orf atenuado" o "virus parapoxvirus orf modificado" en donde el producto o productos génicos que evitan la activación de PKR están faltantes, inhibidos o mutados de manera tal que la activación PKR no se bloquea. Preferiblemente, el gen OV20.0L no se transcribe. Este virus parapoxvirus orf atenuado o modificado no sería capaz de replicarse en células normales que no tengan la vía Ras activada, pero es capaz de infectar y replicarse en células que tengan la vía Ras activada. Un mutante de virus herpes simplex (HSV-1) que es defectuoso en la expresión para ribonucleótido reductasa, hrR3 , demostró replicarse en células de carcinoma de colon pero no en células hepáticas normales (Yoon et al., 2000). El virus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) y sus vectores son particularmente útiles, debido a que pueden manipularse genéticamente para replicarse y diseminarse muy selectivamente en células tumorales y también pueden expresar para múltiples transgenes exógenos. Estos vectores pueden manifestar un efecto citopático en una amplia variedad de tipos tumorales sin dañar tejidos normales, proporcionan una administración génica amplificada dentro del tumor e inducen la inmunidad antitumoral específica. Se han probado en pacientes múltiples vectores HSV-1 recombinantes con tumores cerebrales y otros tipos de cáncer y mostraron la viabilidad de la administración segura de vectores HSV-1 competentes para la replicación en órganos humanos, incluyendo cerebro. Los expertos en la técnica conocen muchos otros virus oncolíticos. Por ejemplo, el virus de estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en inglés) elimina selectivamente células neoplásicas. El virus de encefalitis demostró tener un efecto oncolítico en el tumor de sarcoma de ratón, pero su atenuación es requerida para reducir su infectividad en células normales . El virus de la vacuna, debido a su excepcional habilidad para replicarse en células tumorales, representa otro virus oncolítico replicante útil en la presente invención. Además, las funciones virales específicas pueden aumentarse o eliminarse para potenciar la eficacia antitumoral y mejorar la selectividad de objetivo de célula tumoral. Por ejemplo, la supresión de genes virales para timidina cinasa y el factor de crecimiento de vacuna dan como resultado mutantes de vacuna con una actividad potenciada de especificidad de objetivo tumoral. En una implementación preferida, el virus oncolítico es un virus de vacuna modificado, como se describe en la Patente de EE.UU. No. de publicación 2002/0028195, en donde E3L o K3L ha sido mutado. La cepa de vacuna de virus de paperas (MV por sus siglas en inglés) lisa fácilmente células transformadas, mientras que la replicación y lisis están limitadas a células humanas normales. Por lo tanto, MV es muy adecuado para el desarrollo como agente oncolítico. La regresión tumoral también se ha descrito en pacientes con tumores infectados con herpes zoster, virus de hepatitis, influenza, varicela y virus de paperas (para un repaso, ver Nemunaitis, 1999) . Cualquier virus oncolítico puede utilizarse en la invención reivindicada. Se sabe que la habilidad de los diversos virus oncolíticos para replicarse selectivamente en células neoplásicas se basa en diferentes mecanismos. Por ejemplo, los reovirus requieren de la presencia de una vía de señalización Ras activada a fin de replicarse y destruir células. En algunos otros virus oncolíticos, la selectividad tumoral se logra al colocar el gen viral esencial bajo el control de un promotor específico para el tumor. En ciertos virus, la región ElA es responsable de unirse al supresor Rb tumoral celular e inhibir la función Rb, permitiendo así la maquinaria proliferativa celular y por lo tanto, la replicación celular, para que procedan en forma descontrolada. Delta24 tiene una supresión en la región de unión a Rb y no se une a Rb (Fueyo et al., 2000) . Por lo tanto, la replicación del virus mutante se inhibe por Rb en una célula normal. Sin embargo, si Rb es inactivado y la célula se vuelve neoplásica, Delta24 ya no se inhibe. Por lo tanto, el virus mutante se replica eficientemente y lisa las células neoplásicas deficientes en Rb. En la técnica se conocen otros mecanismos para la replicación selectiva en células neoplásicas . La presente invención no limita el mecanismo mediante el cual el virus oncolítico se replica selectivamente en células neoplásicas en comparación con células normales . Es preferible que el virus no sea un vehículo para administrar un gen para el propósito de la terapia génica. Por ejemplo, se han diseñado virus para administrar el gen ElA adenovírico, el gen supresor de tumor p53, genes que codifican para profármacos (Chmura et al., 1999; 2001) o genes bajo un promotor inducible por radiación. Ciertamente, estos virus normalmente no se replican preferencialmente en células neoplásicas y por lo tanto, no se consideran virus oncolíticos. El virus oncolítico puede ser de origen natural o modificado. El virus oncolítico es "de origen natural" cuando puede darse a partir de una fuente natural y no ha sido intencionalmente modificado por humanos en el laboratorio. Por ejemplo, el virus oncolítico puede ser de una "fuente de campo" esto es, que sea de un humano que ha sido infectado con el virus oncolítico. El virus oncolítico puede ser un virus oncolítico recombinante como resultado de la recombinación/reasociación de segmentos genómicos de virus oncolítico a partir de dos o más virus oncolíticos genéticamente distintos. La recombinación/reasociación de los segmentos genómicos de virus oncolíticos puede ocurrir en la naturaleza luego de la infección en un organismo hospedero con al menos dos virus oncolíticos genéticamente distintos. Los viriones recombinantes también pueden generarse en un cultivo celular, por ejemplo, mediante la coinfección de células hospederas permisivas con virus oncolíticos genéticamente distintos (Nibert et al., 1995) . La invención además contempla el uso de un virus oncolítico recombinante dando como resultado la reasociación de segmentos genómicos a partir de dos o más virus oncolíticos genéticamente distintos en donde al menos un virus parental está genéticamente manipulado, comprende uno o más segmentos genómicos químicamente sintetizados, ha sido sometido a tratamiento con mutágenos químicos o físicos o es en sí mismo el resultado de un evento de recombinación. La invención además comprende el uso de un virus oncolítico recombinante que ha experimentado recombinación en presencia de mutágenos químicos, incluyendo entre otros, dimetil sulfato y bromuro de etidio o mutágenos físicos, incluyendo, entre otros, luz ultravioleta y otras formas de radiación. La invención además contempla el uso de virus oncolíticos recombinantes que comprenden supresiones o duplicaciones en uno o más segmentos genómicos, que comprenden información genética adicional como resultado de la recombinación con un genoma de célula hospedera o que comprende genes sintéticos. El virus oncolítico puede ser modificado pero ser aún capaz de infectar líticamente una célula neoplásica de mamífero. El virus oncolítico puede someterse a tratamiento previo en forma química o bioquímica (por ejemplo, mediante el tratamiento con una proteasa, tal como una quimotripsina o tripsina) antes de su administración a células proliferativas. El tratamiento previo con una proteasa puede eliminar el recubrimiento externo o cápside del virus y aumentar la infectividad del virus. El virus oncolítico puede recubrirse en un liposoma o micelio. Por ejemplo, el virión puede someterse a tratamiento con quimotripsina en presencia de concentraciones formadoras de micelios de detergentes alquil sulfato para generar una nueva partícula infecciosa de subvirión. El virus oncolítico se puede modificar mediante la incorporación de proteínas de cubierta mutadas, tales como por ejemplo, el cápside externo del virión. Las proteínas pueden mutarse mediante reemplazo, inserción o supresión. El reemplazo incluye la inserción de diferentes aminoácidos en lugar de los aminoácidos naturales . Las inserciones incluyen la inserción de residuos adicionales de aminoácidos en la proteína en una o más ubicaciones . Las supresiones incluyen supresiones de uno o más residuos aminoacídicos en la proteína. Estas mutaciones pueden generarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida a la secuencia oligonucleotídica del gen que codifica para una de las proteínas de cubierta puede dar como resultado la generación de la proteína de cubierta mutante deseada. La expresión de la proteína mutada en el virus oncolítico de células de mamífero infectadas in vi tro, tal como células COS 1, puede dar como resultado la incorporación de proteína mutada en la partícula de virión del virus oncolítico (Turner y Duncan 1992; Duncan et al., 1991; Mah et al., 1990). Un tipo preferido de inmunoestimulante comprende un adyuvante. Varios adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral y un estimulante para respuestas inmunitarias, tal como lípido A, proteínas derivadas de Bordetella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Por ejemplo, hay varios adyuvantes comercialmente disponibles como Adyuvante Incompleto de Freund y Adyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); Adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKIine Beecham, Filadelfia, Pa) ; sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alum) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares aciladas; polisacáridos catiónicamente o aniónicamente derivados; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforilo lípido A, QS21, aminoalquil glucosaminida 4-fosfato y Quil A. Citocinas, tales como GM-CSF, interleucina-2 , -7, -12 y otros factores de crecimiento similares, que también pueden utilizarse como adyuvantes. El inmunoestimulante se administra al hospedero en forma convencional para la composición particular, generalmente como una sola dosis unitaria en solución salina amortiguada. Se pueden administrar adicionalmente dosis de refuerzo opcionales, normalmente de una a varias semanas después en forma enteral o parenteral, por ejemplo, subcutáneamente, cutáneamente, intramuscularmente, intradérmicamente, intravenosamente, intraarterialmente, intraperitonealmente, intranasalmente, oralmente, intracardiacamente, intrapancreáticamente, intraarticularmente, etc. La ubicación de la dosis inicial o de refuerzo del inmunoestimulante puede lograrse mediante la administración en el sitio objetivo, el uso de implantes de liberación prolongada, administración en forma de partículas no difundibles y lo similar, como se conoce en la técnica. La dosis y protocolo para la administración del inmunoestimulante puede variar con el agente específico seleccionado. Normalmente, se administran una o más dosis. En una modalidad de la invención, el inmunoestimulante es un agente activador policlonal, que puede incluir endotoxinas, por ejemplo, lipopolisacárido (LPS) ; y superantígenos (exotoxinas) (ver Hermán et al. (1991) Annu Rev Immunol 9: 745-72). La endotoxina interactúa principalmente con receptores CD14 en macrófagos, mientras que los superantígenos activan preferiblemente las células T. Ambos tipos celulares se activan para liberar citocinas proinflamatorias . Los superantígenos (Sags, por sus siglas en inglés) son presentados por las moléculas tipo II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC por sus siglas en inglés) e interactúan con una gran cantidad de células T que expresan para dominios V beta específicos de receptor de células T. Alternativamente, se pueden utilizar ácidos nucleicos inmunoestimulantes. Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes poseen motivos inmunoestimulantes tales como el motivo CpG y motivos poli-G. En algunas modalidades de la invención, cualquier ácido nucleico, sin importar si posee un motivo identificable, puede utilizarse en la terapia combinada para provocar una respuesta inmunitaria. En una modalidad, el ácido nucleico inmunoestimulante contiene la secuencia CpG, preferiblemente un motivo CpG mitogénico de consenso representado por la fórmula 5 'X?X2CGX3X43 ' , en donde C y G no están metilados, Xi, X2, X3 y X4 son nucleótidos y la secuencia trinucleótida GCG no está presente en o cerca del término 5' y 3' (ver Patente de EE.UU. No. 6,008,200, Krieg et al., presentado el 28 de diciembre de 1999) . Se sabe que los ácidos nucleicos CpG inmunoestimulantes estimulan las respuestas inmunitarias tipo Thl. Las secuencias CpG, aunque son relativamente raras en el ADN humano, se encuentran comúnmente en el ADN de organismos infecciosos tales como bacterias . Aparentemente, el sistema inmunitario humano ha evolucionado para reconocer las secuencias CpG como un signo de advertencia temprana de infección y para iniciar una respuesta inmunitaria inmediata y poderosa contra los patógenos invasores sin causar reacciones adversas que se observan frecuentemente con otros agentes inmunoestimulantes. Por lo tanto, los ácidos nucleicos que contienen CpG, que se basan en este mecanismo de defensa inmunitario innato, pueden utilizar una vía exclusiva y natural de terapia inmunitaria. Los efectos de ácidos nucleicos CpG en la regulación inmunitaria se han descrito de manera extensiva en la Patente de EE.UU. No. 6,194,388 y se han publicado en las solicitudes de patente, tales como PCT/US95/01570, PCT/US97/19791, PCT/US98/03678 , PCT/US98/10408 , PCT/US98/04703 , PCT/US99/07335 y PCT/US99/09863. En otra modalidad, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes son ácidos nucleicos inmunoestimulantes poli-G. Una variedad de referencias, incluyendo Pisetsky y Reich, 1993 Mol Biol. Reports, 18: 217-221; Krieger y Herz, 1994, Ann. Rev. Biochem., 63: 601-637; Macaya et al., 1993, PNAS, 90: 3745-3749; yatt et al., 1994 PNAS, 91: 1356-1360; Rando y Hogan, 1998, en Applied Antisense Oligonucleotide Technology, ed. Krieg y Stein, p. 335-352; y Kimura et al., 1994, J. Biochem. 116, 991-994 describen las propiedades inmunoestimulantes de ácidos nucleicos poli-G. Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden ser bicatenarios o monocatenarios . En términos generales, las moléculas bicatenarias son más estables in vivo, mientras que las moléculas monocatenarias tienen una actividad inmunogénica mayor. Por lo tanto, en algunos aspectos de la invención, se prefiere que los ácidos nucleicos sean monocatenarios y en otros aspectos, se prefiere que los ácidos nucleicos sean bicatenarios. El ácido nucleico inmunoestimulante completo, o sus porciones, pueden no estar metilados, pero al menos el C de 5'CpG3' deberá estar sin metilación.

Para facilitar la captación en células, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes preferiblemente se encuentran dentro del intervalo de 2 a 100 bases de longitud. Sin embargo, los ácidos nucleicos de cualquier tamaño mayor a 6 nucleótidos (incluso de varios Kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta inmunitaria si están presentes suficientes motivos inmunoestimulantes. Preferiblemente, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene entre 8 y 100 nucleótidos y en algunas modalidades, entre 8 y 50 u 8 y 30 nucleótidos de longitud. Una ventaja particular en el uso de ácidos nucleicos inmunoestimulantes en los métodos de la invención es que los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden ejercer una actividad inmunorreguladora incluso a dosis relativamente bajas. Aunque la dosis utilizada varía dependiendo de los objetivos clínicos a lograrse, un intervalo adecuado de dosificación es uno que proporcione de aproximadamente 1 Fg a aproximadamente 10,000 Fg, normalmente de aproximadamente 1,000 Fg de ácidos nucleicos inmunoestimulantes en una sola dosis . Alternativamente, una dosis objetivo de los ácidos nucleicos inmunoestimulantes da como resultado aproximadamente 1-10 femtomolar de ácidos nucleicos inmunoestimulantes en un volumen de sangre del hospedero extraída dentro de las primeras 24-48 horas posteriores a la administración de los ácidos nucleicos inmunoestimulantes. Basándose en los estudios actuales, se piensa que los ácidos nucleicos inmunoestimulantes tienen poca o ninguna toxicidad a estos niveles de dosis . Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes adecuados para el propósito de la invención pueden encontrarse en forma de fosfodiesteres o, a fin de ser más estables, en forma de fosforotioatos o híbridos fosfodiéster-fosforotioato . Aunque es posible utilizar oligonucleótidos que se originen a partir de fuentes existentes de ácidos nucleicos, tales como el ADN genómico o ADNc, se da preferencia al uso de oligonucleótidos sintéticos. Por lo tanto, es posible desarrollar oligonucleótidos en un soporte sólido utilizando el método ß-cianoetil fosforamidita (Beaucage, S.L. y Caruthers, M.H. Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981)) para el ensamble 3 ' —>5 ' y luego precipitación en etanol en presencia de 0.3 M acetato de sodio no ajustado en pH (0.3 M final) que se puede llevar a cabo. Después, se lleva a cabo la precipitación con 4 volúmenes de 80% etanol, seguido de secado antes de absorber el precipitado en agua pura. En los oligonucleótidos que contienen fosforotioato, uno de los átomos de oxígeno que conforma el grupo fosfato es reemplazado con un átomo de azufre. Su síntesis puede llevarse a cabo como se describe previamente, excepto que la solución de yodo/agua/piridina tetrahidrofurano que se utiliza en el paso de oxidación requerido para la síntesis de los enlaces fosfodiéster es reemplazada con una solución TETD (disulfuro de tetraetiltiuramo) , que proporciona los iones sulfato para la producción del grupo fosforotioato.

También es posible visualizar otras modificaciones de los enlaces fosfodiéster, de las bases o de azúcares, para así modificar las propiedades de los oligonucleótidos utilizados particularmente para aumentar su estabilidad. Alternativamente, la estabilización de ácidos nucleicos puede lograrse mediante modificaciones en la estructura principal. Los ácidos nucleicos estabilizados y preferidos de la invención actual tienen una estructura principal modificada. Se ha demostrado que la modificación de la estructura principal de ácidos nucleicos proporciona una actividad mejorada de los ácidos nucleicos inmunoestimulantes cuando se administran in vivo . Las estructuras principales inmunoestimulantes incluyen, entre otras, estructuras principales modificadas de fosfato, tales como estructuras principales de fosforotioato. El uso de las secuencias inmunoestimulantes se conoce en la técnica, por ejemplo, ver Bauer et al. (1999) I munology 97(4): 699-705; Klinman et al. (1999) Vaccine 17(1): 19-25; Hasan et al. (1999) J Immunol Methods 229 (1-2): 1-22; y otros. Un tipo de esta modificación es una modificación en la estructura principal fosfato. Por ejemplo, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes, incluyen al menos dos enlaces fosforotioato en el extremo 5' del oligonucleótido y múltiples enlaces fosforotioato en el extremo 3' (preferentemente 5), y pueden proporcionar una máxima actividad y proteger el ácido nucleico de la degradación mediante exo y endonucleasas intracelulares . Otros ácidos nucleicos modificados de fosfato incluyen ácidos nucleicos modificados de fosfodiéster, combinaciones de ácidos nucleicos fosfodiéster y fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato y combinaciones de éstos. Cada una de estas combinaciones de ácidos nucleicos inmunoestimulantes y sus efectos particulares en las células inmunitarias se menciona con más detalle en las Solicitudes de Patente PCT Publicadas PCT/US95/01570 y PCT/US97/19791. Los inmunoestimulantes preferidos para provocar una respuesta predominantemente tipo Thl incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforilo lípido A, preferiblemente el monofosforilo lípido A 3-de-0-acilado junto con una sal de aluminio. Los oligonucleótidos que contienen CpG (en donde el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Thl. Otro inmunoestimulante preferido comprende saponina, tal como Quil A, o sus derivados, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.); y saponinas de Escina; Digitonina; o Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones preferidas incluyen más de una saponina, por ejemplo combinaciones de al menos dos miembros seleccionados a partir del grupo que comprende QS21, QS7, Quil A, ßecsina y digitonina. Según otra modalidad de la invención, el inmunoestimulante es al menos un antígeno de un virus oncolítico administrado a un hospedero mediante células presentadoras del antígeno (APC por sus siglas en inglés) , tales como células dendríticas, macrófagos, células B, monocitos y otras células que pueden manipularse genéticamente para ser APC eficientes. Estas células pueden estar, pero no necesariamente, genéticamente modificadas para aumentar la capacidad de presentar al antígeno, mejorar la activación y/o mantenimiento de la respuesta de células T. Los APC pueden generalmente aislarse a partir de una variedad de fluidos biológicos y órganos biológicos, incluyendo tejidos tumorales y peritumorales y pueden ser autólogos, halogénicos, singénicos o genogénicos. La inmunoterapia anticancerígena utilizando células dendríticas cargadas con antígenos asociados al tumor ha demostrado producir respuestas inmunitarias específicas para el tumor y actividad antitumoral (Campton et al. 2000; Fong y Engelmann 2000) . Se obtuvieron resultados prometedores en ensayos clínicos in vivo utilizando células dendríticas pulsadas con antígeno tumoral (Tarte y Klein 1999) . Estos estudios demuestran claramente la eficacia del uso de células dendríticas para generar respuestas inmunitarias contra antígenos cancerosos . Ciertas modalidades preferidas de la presente invención utilizan células dendríticas o sus progenitores como células presentadoras del antígeno. Las células dendríticas son APCs muy potentes (Banchereau y Steinman, Nature 392: 245-251, 1998) y se ha demostrado que son efectivas como adyuvante fisiológico para provocar como respuesta una inmunidad antitumoral terapéutica o profiláctica (ver Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529, 1999). En términos generales, las células dendríticas pueden identificarse basándose en su forma típica (estelares in si tu, con procesos citoplásmicos marcados (dendritas) visibles in vi tro) , su habilidad de captar, procesar y presentar antígenos con una gran eficiencia y por su habilidad para activar respuestas en células T sin estimulación previa. Las células dendríticas pueden manipularse genéticamente para expresar para ligandos o receptores específicos de superficie celular que no se encuentran comúnmente en células dendríticas in vivo o ex vivo y estas células dendríticas modificadas están contempladas en la presente invención. Como una alternativa a células dendríticas, se pueden utilizar las vesículas secretadas por células dendríticas cargadas con antígeno (llamadas exosomas) (ver Zitvogel et al., Nature Med. 4: 594-600, 1998). Las células dendríticas y sus progenitores pueden obtenerse a partir de sangre periférica, médula ósea, células infiltradoras al tumor, células infiltradoras a tejidos peritumorales, nodulos linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical y otros fluidos o tejidos adecuados. Por ejemplo, las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo al agregar una combinación de citocinas tales como GM-SCF, IL-4, IL-13 y/o TNFa en cultivos de monocitos recolectados a partir de sangre periférica. Alternativamente, las células positivas para CD34 recolectadas de sangre periférica, cordón umbilical o médula ósea pueden diferenciarse en células dendríticas agregándose al medio de cultivo, combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNFa, el ligando CD40, LPS, ligando fit3 y/u otros compuestos que induzcan la diferenciación, maduración y proliferación de células dendríticas.

III. EJEMPLOS Ejemplo 1 Se inyectan dos grupos de ratones hembra SCID con lxlO6 de células MDA-MB468 de carcinoma de mama en humano en dos sitios subcutáneos, subyaciendo ambos en la cadera. Los tumores palpables son evidentes aproximadamente 2 a 4 semanas posteriores a la inyección. Se inyecta en el lado derecho de la masa tumoral, reovirus serotipo 3 sin diluir (cepa Dearing) en un volumen de 20 µl a una concentración de l.OxlO7 UFP/ml. Los animales en un grupo también se inyectan con 10 µg de ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT) , un oligonucleótido que contiene CpG, junto con el reovirus. Dos semanas después, estos animales se inyectan nuevamente con la misma cantidad de ODN 1826. Los animales en el grupo 2 reciben inyecciones salinas en la misma cantidad y frecuencia que CpG. Los resultados muestran que en ambos grupos, el tamaño de los tumores en el lado izquierdo de los animales es mayor que el tamaño de los tumores en el lado derecho de los animales, lo que indica que la terapia con virus oncolítico es efectiva para el tratamiento contra neoplasmas.

Además, el tamaño de los tumores en el lado izquierdo de los animales en el grupo 1 es menor que el tamaño de los tumores en el lado izquierdo de los animales en el grupo 2, lo que indica un adicional efecto antitumoral por la administración del inmunoestimulante combinado con la terapia de virus oncolítico.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Uso de un virus oncolítico y un inmunoestimulante para elaborar un medicamento, para el tratamiento o alivio de un neoplasma en un mamífero que padece neoplasma, en donde: (a) se administra el virus oncolítico al mamífero; y (b) se administra un inmunoestimulante. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el inmunoestimulante se administra poeterior al virue oncolítico.
3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde el inmunoestimulante se administra después de que el virus oncolítico ha infectado una célula tumoral.
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el inmunoestimulante se administra después de que la célula de tumor infectada expresa al menos un antígeno de virus oncolítico o un antígeno específico para el tumor.
5. 5. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde el inmunoestimulante se administra 24 horas después del virus oncolítico.
6. 6. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virue oncolítico es un reovirus.
7. 7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el reovirus es un reovirus de origen natural.
8. 8. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el inmunoestimulante es un oligodeoxinucleótido sintético (ODN) .
9. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el inmunoestimulante es citosina-fosfato-guanoeina no metilada (CpG) .
10. 10. Uso de un virus oncolítico y un inmunoestimulante para elaborar un medicamento, para potenciar la actividad antineoplásica de un virus oncolítico en un mamífero que padece de un neoplasma, el cual comprende administrar el inmunoestimulante y el virus oncolítico al mamífero.
11. 11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el inmunoestimulante se administra después de que el virus oncolítico ha infectado una célula tumoral.
12. 12. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el inmunoestimulante se administra después de que la célula infectada expresa al menos un antígeno del virus oncolítico o un antígeno específico para el tumor.
13. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde el inmunoestimulante se administra 24 horas después del virus oncolítico.
14. 14. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el virus oncolítico es un reovirus.
15. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde el reovirus es un reovirus de origen natural.
16. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el inmunoestimulante es un oligodeoxinucleótido sintético (ODN) .
17. 17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el inmunoestimulante es citosina- fosfato-guanosina sin metilar.
18. 18. Uso de una célula dendrítica modificada para elaborar un medicamento, para potenciar la actividad antineoplásica de un virus oncolítico en un mamífero que padece un neoplasma, el cual comprende usar la célula dendrítica modificada para provocar una respuesta inmunitaria hacia el virus oncolítico en el mamífero; en donde la célula dendrítica modificada es obtenida mediante: (a) poner en contacto una célula dendrítica con un virus oncolítico; e (b) inducir a que la célula dendrítica presente un antígeno al virus oncolítico.
19. 19. El uso de la célula dendrítica modificada conformidad con la reivindicación 18, en donde el contacto ocurre ex vivo y la célula dendrítica se administra al mamífero luego del contacto.
20. 20. Uso de un virus oncolítico y un inmunoestimulante para elaborar un medicamento, para potenciar la eficacia de una terapia con virus oncolítico, el cual comprende: (a) administrar el virus oncolítico a un mamífero; y (b) administrar el inmunoestimulante.
21. 21. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde el inmunoestimulante se administra posterior al virus oncolítico.
22. 22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el inmunoestimulante se administra después de que el virus oncolítico ha infectado una célula tumoral.
23. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el inmunoestimulante se administra 24 horas después de la terapia con virus oncolítico.
24. 24. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde la terapia con virus oncolítico es con un reovirus.
25. 25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde el reovirus es un reovirus de origen natural.
26. 26. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde el inmunoestimulante es un oligodeoxinucleótido sintético (ODN) .
27. 27. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el inmunoestimulante es citosina- foefato-guanosina sin metilar.
28. 28. Uso de una célula dendrítica modificada para elaborar un medicamento, para aumentar el reconocimiento inmunitario de una célula neoplásica infectada con un virus oncolítico, el cual comprende usar la célula dendrítica modificada para provocar una respuesta inmunitaria hacia un antígeno de virus oncolitico; con lo cual la respuesta inmunitaria hacia el virus oncolítico responde a un antígeno de virue oncolítico expreeado por la célula neoplásica infectada; en donde la célula dendrítica modificada es obtenida mediante : (i) poner en contacto una célula dendrítica con el virus oncolítico; y (ii) inducir a que la célula dendrítica presente un antígeno al virus oncolítico.