ES2576036T3 - Métodos de vacunación - Google Patents
Métodos de vacunación Download PDFInfo
- Publication number
- ES2576036T3 ES2576036T3 ES10753031.3T ES10753031T ES2576036T3 ES 2576036 T3 ES2576036 T3 ES 2576036T3 ES 10753031 T ES10753031 T ES 10753031T ES 2576036 T3 ES2576036 T3 ES 2576036T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- vsv
- vector
- antigen
- hdct
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 131
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 131
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 131
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 130
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 102
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 53
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims abstract description 27
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 98
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 75
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 claims description 44
- 108010051081 dopachrome isomerase Proteins 0.000 claims description 44
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 27
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 17
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 claims description 9
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 claims description 9
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000711970 Vesiculovirus Species 0.000 claims description 4
- 241001372913 Maraba virus Species 0.000 claims description 3
- 241000712467 Cytorhabdovirus Species 0.000 claims description 2
- 241001455610 Ephemerovirus Species 0.000 claims description 2
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001094545 Homo sapiens Retrotransposon-like protein 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000711828 Lyssavirus Species 0.000 claims description 2
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 241000712466 Nucleorhabdovirus Species 0.000 claims description 2
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 claims 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 102
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 84
- 230000004044 response Effects 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 48
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 35
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 33
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 25
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 25
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 25
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 24
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 19
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 18
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 16
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 13
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 13
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 12
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 11
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 11
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 11
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 11
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 10
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 8
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 8
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-azaniumyl-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxylatobutanoyl]amino]-6-azaniumy Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N 0.000 description 7
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 7
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 6
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 6
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 6
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 108010075205 OVA-8 Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 5
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 4
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 4
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000712899 Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus Species 0.000 description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 2
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 208000025997 central nervous system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229940038426 oncolytic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 2
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 238000012756 BrdU staining Methods 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101150043052 Hamp gene Proteins 0.000 description 1
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000691463 Homo sapiens Placenta-specific protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102100026181 Placenta-specific protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000425571 Trepanes Species 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N gamma-cyhalothrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](\C=C(/Cl)C(F)(F)F)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008902 immunological benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- CWEFIMQKSZFZNY-UHFFFAOYSA-N pentyl 2-[4-[[4-[4-[[4-[[4-(pentoxycarbonylamino)phenyl]methyl]phenyl]carbamoyloxy]butoxycarbonylamino]phenyl]methyl]phenyl]acetate Chemical compound C1=CC(CC(=O)OCCCCC)=CC=C1CC(C=C1)=CC=C1NC(=O)OCCCCOC(=O)NC(C=C1)=CC=C1CC1=CC=C(NC(=O)OCCCCC)C=C1 CWEFIMQKSZFZNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000002672 stereotactic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108010094106 vesicular stomatitis virus nucleoprotein (52-59) Proteins 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
- A61K39/001181—Alpha-feto protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
- A61K39/001182—Carcinoembryonic antigen [CEA]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00119—Melanoma antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00119—Melanoma antigens
- A61K39/001191—Melan-A/MART
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00119—Melanoma antigens
- A61K39/001192—Glycoprotein 100 [Gp100]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4612—B-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/464838—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/20243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Un vector oncolítico rabdoviral replicante para su uso en el tratamiento de cáncer en un mamífero, en el que dicho vector expresa un antígeno de tumor al que el mamífero tiene una inmunidad preexistente y dicho vector se administra intravenosamente al mamífero.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Metodos de vacunacion Campo de la invencion
La presente invencion se refiere generalmente a metodos de vacunacion de un mamlfero, y en particular, a metodos de vacunacion utiles para reforzar la respuesta inmunitaria, ademas de metodos utiles para tratar enfermedad.
Antecedentes de la invencion
Aunque muchas pautas de vacunacion satisfactorias han tanto eliminado como controlado completamente las enfermedades infecciosas, tales como la viruela y la poliomielitis, se ha hecho evidente que ciertos patogenos no son facilmente controlados por los actuales enfoques de vacunacion. Por ejemplo, patogenos tales como el VIH, Mycobacterium tuberculosis y el parasito de la malaria resisten todos a la inmunidad humoral que se genera caracterlsticamente por las vacunas tradicionales. Se ha hecho un esfuerzo significativo por desarrollar vacunas que puedan promover la potente inmunidad celular a estos patogenos y patogenos relacionados. Similarmente, la inmunizacion con antlgenos de tumor principalmente depende de linfocitos T, especialmente CTL CD8+, para reconocer y destruir celulas cancerosas debido a que muchos antlgenos asociados a tumor son protelnas intracelulares. La induccion de inmunidad celular, sin embargo, es compleja y plantea numerosos problemas para los vacunologos. Estos incluyen dificultades en generar inmunidad celular que sea de intensidad y longevidad suficientes.
Un posible enfoque para evitar estos problemas es mediante la administracion secuencial de vacunas usando vectores heterologos. Aunque una pauta de inmunizacion-refuerzo tlpica implica vacunas basadas en ADN y variolovacuna, tambien se han explotado otras combinaciones usando bacteria-virus o dos virus diferentes en modelos animales. Los poxvirus mas usados para la vacunacion es el virus de la variolovacuna, que se uso para la vacunacion contra la viruela. La variolovacuna recombinante puede administrar antlgenos extranos al citoplasma de celulas de mamlfero, permitiendoles as! el acceso directo a las vlas de procesamiento de antlgeno que conduce a presentacion de peptidos derivados de antlgeno en asociacion con moleculas MHC clase I y clase II sobre la superficie celular. Esta propiedad hace que la variolovacuna sea util como vacuna recombinante, particularmente para estimular respuestas inmunitarias de linfocitos T CD 8+ y CD4+. Cuestiones sobre la capacidad del virus de la variolovacuna para replicarse en celulas de mamlfero han limitado su uso cllnico y conducido a la busqueda de alternativas mas seguras.
Con respecto al uso de virus para tratar enfermedad tal como el cancer, se han encontrado virus oncollticos (OV) que curan el cancer en modelos animales si infectan tumores y se replican ampliamente para mediar en la destruccion completa. Sin embargo, la amplia aplicacion cllnica requiere tratar huespedes inmunocompetentes portadores de tumores malignos que pueden tener mecanismos antivirales parcialmente intactos. Una respuesta inmunitaria del huesped activa contra el virus que elimina rapidamente la replicacion viral, conduciendo a destruccion tumoral incompleta o transitoria, representa una barrera importante al exito. Se ha mostrado en animales sin tratamiento previo que el desarrollo de una respuesta inmunitaria adquirida normalmente dura menos de una semana, dejando una pequena ventana de oportunidad para que funcionen los vectores oncollticos. Para maximizar la replicacion del virus administrado o virus re-administrado, se ha probado una variedad de enfoques que varlan de inmunosupresion completa, al uso de celulas portadoras (denominadas "caballos de Troya") y encubrimiento viral.
A pesar de los intentos anteriores por tratar los problemas asociados a los actuales metodos de vacunacion, se desea desarrollar metodos mas eficaces de generacion de una respuesta inmunitaria en un mamlfero.
Sumario de la invencion
Ahora se han desarrollado novedosos metodos de vacunacion.
Por consiguiente, en un aspecto de la invencion, se proporciona un metodo de tratamiento de cancer en un mamlfero que comprende administrar intravenosamente al mamlfero un vector oncolltico rabdoviral replicante, en el que el vector expresa un antlgeno de tumor para el que el mamlfero tiene una inmunidad preexistente.
En otro aspecto se proporciona un kit para su uso en el tratamiento de cancer que comprende un antlgeno de tumor, o un vector que expresa un antlgeno de tumor, en una cantidad adecuada para inducir una respuesta inmunitaria en un mamlfero, y un vector oncolltico rabdoviral replicante que expresa el antlgeno de tumor en una cantidad adecuada para potenciar la respuesta inmunitaria.
En otro aspecto se desvela un metodo de refuerzo de la respuesta inmunitaria en un mamlfero que tiene una inmunidad preexistente a un antlgeno. El metodo comprende administrar al mamlfero intravenosamente un vector que expresa el antlgeno, en el que dicho vector es capaz de infectar linfocitos B.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En otro aspecto se desvela un metodo de refuerzo de respuesta inmunitaria en un mamlfero que tiene una inmunidad preexistente a un antlgeno que comprende administrar intravenosamente al mamlfero linfocitos B cargados de antlgeno.
En todavla otro aspecto se desvela un kit para su uso en reforzar una respuesta inmunitaria en un mamlfero. El kit comprende un antlgeno, o un vector que expresa el antlgeno, en una forma administrable adecuada, y un vector que expresa el antlgeno que esta en una forma adecuada para administracion intravenosa.
Estos y otros aspectos de la invencion seran evidentes en la descripcion detallada que sigue y por referencia a las siguientes figuras.
Breve descripcion de las figuras
La FIGURA 1 ilustra el efecto de VSV-GFP (A), Ad-hDCT (B y C) y VSV-hDCT sobre tumores in vivo;
la FIGURA 2 muestra la llnea de tiempo (A), perfil de linfocitos T CD8+ (B) y efecto sobre la supervivencia (C) para un tratamiento de combination con Ad-hDCT y VSV-hDCT;
la FIGURA 3 muestra el perfil de linfocitos T CD8+ especlficos de DCT (A), correlation de la supervivencia con la frecuencia de linfocitos T especlficos de antlgeno de tumor (B), numero de linfocitos T de DCT (C) y frecuencia de linfocitos T de gp100 (D) tras un tratamiento de combinacion con Ad-hDCT y VSV-hDCT;
la FIGURA 4 demuestra tltulos virales (A) y pesos cerebrales (B) en ratones portadores de tumor tras la vacunacion con Ad-hDCT y posterior tratamiento con VSV-hDCT;
la FIGURA 5 muestra el transcurso de tiempo para la expansion de linfocitos T CD8+ especlficos de DCT en sangre (A), bazo (B) y ganglios linfaticos cervicales (C) tras el tratamiento con VSV-hDCT de huespedes sensibilizados con Ad-hDCT;
la FIGURA 6 resume el transcurso de tiempo para pautas de tratamiento de intervalo corto y largo (A), y tltulos de VSV en los pulmones y cerebros de ratones tras los protocolos de inmunizacion y de tratamiento del transcurso de tiempo de intervalo corto (B) e intervalo largo (B);
la FIGURA 7 muestra el porcentaje (A) y numero (B) de linfocitos T CD8+ especlficos de DCT en sangre cuando se tratan con VSV-hDCT tanto 14 como 100 dlas tras la inmunizacion con Ad-hDCT;
la FIGURA 8 ilustra los datos de inmunoanalisis (A) y de supervivencia (B) tras el tratamiento de tumores con un tratamiento de combinacion de vacunacion con Ad-hDCT y Maraba-hDCT oncolltico;
la FIGURA 9 ilustra datos de supervivencia (A) y la mediana de la supervivencia (B) de un tratamiento de combinacion usando vectores de celula dendrltica para administrar el antlgeno de DCT (DCh-DCT);
la FIGURA 10 ilustra el efecto sobre el volumen tumoral (A) y la supervivencia (B) con el uso de vector de la variolovacuna delecionado doble para administrar antlgeno de dCt (ddVV-hDCT) en un tratamiento de combinacion;
la FIGURA 11 demuestra una comparacion de vlas de administracion para la pauta de sensibilizacion-refuerzo;
la FIGURA 12 muestra las capacidades de refuerzo a diferentes intervalos;
la FIGURA 13 demuestra una comparacion entre la capacidad de VSV y el virus de la variolovacuna administrados i.v. en las respuestas inmunitarias de refuerzo;
la FIGURA 14 muestra la capacidad de la version G-menos (mutante) de VSV para reforzar respuestas inmunitarias;
la FIGURA 15 demuestra la calidad de linfocitos T provocados por la pauta de inmunizacion-refuerzo;
la FIGURA 16 muestra la calidad de los linfocitos T provocados reforzando con VSV en comparacion con reforzar con un vector de la variolovacuna;
la FIGURA 17 demuestra la respuesta de linfocitos T de la pauta de refuerzo usando diferentes antlgenos y cepas huesped;
la FIGURA 18 muestra que el efecto de refuerzo mediado por VSV i.v. es independiente de linfocitos T CD4+;
la FIGURA 19 demuestra la durabilidad de la respuesta inmunitaria secundaria y proportion de celulas efectoras que se han convertido en celulas de memoria;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
la FIGURA 20 muestra que una vacuna de VSV mutante inductora de interferon atenuada refuerza equivalentemente a VSV no mutante;
la FIGURA 21 compara la respuesta inmunitaria cuando los vectores basados en VSV y Maraba se utilizan para administrar un refuerzo de antlgeno de DCT;
la FIGURA 22 ilustra las respuestas inmunitarias en sangre (A y B) y bazo (C) cuando los vectores Ad y de Maraba se usan para administrar un antlgeno y los vectores de Maraba y VSV se usan para reforzar la inmunidad al antlgeno;
la FIGURA 23 ilustra la respuesta inmunitaria con diversas dosis de antlgeno (A) para establecer una inmunidad preexistente y el efecto de un refuerzo de VSV sobre cada uno (B);
la FIGURA 24 compara la respuesta inmunitaria primaria a un antlgeno en ratones mutantes frente a deficientes en linfocitos B (A) y la respuesta inmunitaria en sangre y bazo tras un refuerzo con antlgeno (B); y
la FIGURA 25 ilustra el efecto de la reconstitucion de linfocitos B (A) sobre un refuerzo de antlgeno (B).
Description detallada de la invention
Se proporciona un metodo de vacunacion util para tratar cancer en un mamlfero en el que un vector oncolltico rabdoviral replicante que expresa un antlgeno de tumor, al que el mamlfero tiene una inmunidad preexistente, se administra intravenosamente al mamlfero. La invencion proporciona un metodo en el que la respuesta inmunitaria del mamlfero al antlgeno de tumor sobrepasa la respuesta inmunitaria del mamlfero al virus oncolltico, produciendo as! tratamiento eficaz del cancer.
El presente metodo de vacunacion es util para tratar cancer en un mamlfero. El termino "cancer" se usa en el presente documento para englobar cualquier cancer, que incluye, pero no se limita a, melanoma, sarcoma, linfoma, carcinoma tal como cancer de cerebro, mama, hlgado, estomago y de colon, y leucemia.
El termino "mamlfero" se refiere a seres humanos, ademas de a mamlferos no humanos.
El metodo incluye la administration al mamlfero de un vector oncolltico rabdoviral replicante que expresa un antlgeno de tumor al que el mamlfero tiene una inmunidad preexistente. Como se usa en el presente documento, se indica que el termino "inmunidad preexistente" engloba una inmunidad inducida por la vacunacion con un antlgeno, ademas de una inmunidad naturalmente existente dentro del mamlfero.
Asl, en una realization, para establecer una inmunidad preexistente, el presente metodo incluye una etapa de vacunar un mamlfero con un antlgeno de tumor apropiado para inducir una reaction inmunitaria contra celulas cancerosas diana. El antlgeno de tumor puede, por ejemplo, ser un antlgeno asociado a tumor (TAA), por ejemplo, una sustancia producida en una celula tumoral que desencadena una respuesta inmunitaria en el mamlfero. Ejemplos de tales antlgenos incluyen antlgenos oncofetales tales como alfa-fetoprotelna (AFP) y antlgeno carcinoembrionario (CEA), glucoprotelnas superficiales tales como CA 125, oncogenes tales como Her2, antlgenos asociados a melanoma tales como dopacromo tautomerasa (DCT), GP100 y MART1, antlgenos de cancer de testlculos tales como las protelnas MAGE y NY-ESO1, oncogenes virales tales como HPV E6 y E7, protelnas ectopicamente expresadas en tumores que estan normalmente limitados a tejidos embrionarios o extraembrionarios tales como PLAC1. Como apreciara un experto en la materia, un antlgeno puede seleccionarse basandose en el tipo de cancer que va a tratarse usando el presente metodo, ya que uno o mas antlgenos pueden ser particularmente aptos para uso en el tratamiento de ciertos canceres. Por ejemplo, para el tratamiento de melanoma puede usarse un antlgeno asociado a melanoma tal como DCT.
El antlgeno de tumor puede administrarse por si mismo, o, preferentemente, administrarse mediante un vector, por ejemplo, vector adenoviral (Ad), poxviral o retroviral, un plasmido o celulas presentadoras de antlgeno cargadas tales como celulas dendrlticas. Metodos de introduction del antlgeno de tumor en el vector son conocidos para aquellos expertos en la materia. Generalmente, el vector se modificara para expresar el antlgeno. A este respecto, el acido nucleico que codifica el antlgeno seleccionado se incorpora en el vector seleccionado usando tecnologla recombinante bien establecida.
El antlgeno de tumor se administra al mamlfero en una cualquiera de varias vlas que incluyen, pero no se limitan a, intravenosamente, intramuscularmente o intranasalmente. Como sera apreciado por un experto en la materia, el antlgeno de tumor, o vector que incorpora el antlgeno de tumor, se administrara en un vehlculo adecuado, tal como solution salina u otro tampon adecuado. Tras la vacunacion con un antlgeno de tumor seleccionado, se genera una respuesta inmunitaria por el mamlfero dentro de un intervalo de respuesta inmunitaria, por ejemplo, dentro de aproximadamente 4 dlas, y que se extiende durante meses, anos, o posiblemente toda la vida.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Para establecer una respuesta inmunitaria al antlgeno de tumor, se realiza vacunacion usando el antlgeno usando tecnicas bien establecidas. Por consiguiente, un antlgeno de tumor seleccionado, o un vector que expresa el antlgeno de tumor, puede administrarse al mamlfero en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmunitaria. Como apreciara un experto en la materia, la cantidad requerida para generar una respuesta inmunitaria variara con varios factores que incluyen, por ejemplo, el antlgeno seleccionado, el vector usado para administrar el antlgeno y el mamlfero que va a tratarse, por ejemplo, especie, edad, tamano etc. A este respecto, por ejemplo, la administracion intramuscular de un mlnimo de al menos aproximadamente 107 UFP de vector adenoviral a un raton es suficiente para generar una respuesta inmunitaria. Una cantidad correspondiente serla suficiente para administracion a un ser humano para generar una respuesta inmunitaria.
En otra realizacion, la respuesta inmunitaria al antlgeno puede ser que exista de forma natural dentro del mamlfero y no es necesaria una primera etapa de vacunacion para inducir la respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria que existe de forma natural a un antlgeno puede resultar de cualquier exposition anterior al antlgeno.
Una vez se ha generado una respuesta inmunitaria en el mamlfero, dentro de un intervalo de respuesta inmunitaria adecuado, por ejemplo, al menos aproximadamente 24 horas, preferentemente al menos aproximadamente 2-4 dlas o mas, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 semana, entonces se administra un virus oncolltico rabdoviral replicante que expresa el antlgeno de tumor al mamlfero en una cantidad adecuada para terapia viral oncolltica, que variara con el virus oncolltico seleccionado, y el mamlfero que va a tratarse, como sera apreciado por un experto en la materia. Por ejemplo, un mlnimo de 108 UFP de VSV oncolltico administrado IV a un raton es suficiente para terapia oncolltica. Una cantidad correspondiente serla suficiente para su uso en un ser humano.
Un virus oncolltico rabdoviral replicante que expresa un antlgeno de tumor seleccionado puede prepararse incorporando un transgen que codifica el antlgeno en el virus usando tecnologla recombinante estandar. Por ejemplo, el transgen puede incorporarse en el genoma del virus, o alternativamente, puede incorporarse en el virus usando un plasmido que incorpora el transgen. El presente metodo puede incluir cualquier virus oncolltico rabdoviral replicante capaz de destruir el tumor, mientras que sea apropiado para administracion a un mamlfero. Ejemplos de virus oncollticos que pueden utilizarse en el presente metodo incluyen rabdovirus tales como vesiculovirus, por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular (VSV) y virus de Maraba, Ephemerovirus, Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus y virus Lyssavirus.
Este metodo de vacunacion de combination proporciona tratamiento eficaz de un cancer en un mamlfero administrando un antlgeno de tumor diana al mamlfero, estimulando as! una respuesta inmunitaria al antlgeno diana, seguido de potenciamiento de la respuesta inmunitaria administrando al mamlfero un virus oncolltico rabdoviral replicante que tambien expresa el antlgeno de tumor. Tambien se encontro que este metodo reducla la respuesta antiviral del mamlfero, convirtiendo el virus oncolltico rabdoviral replicante en un contribuyente util con respecto a la degradation tumoral.
Tambien se proporciona un kit en otro aspecto de la invention util en el tratamiento del cancer. El kit comprende un antlgeno de tumor, o un vector que expresa un antlgeno de tumor, en una cantidad adecuada para inducir una respuesta inmunitaria en un mamlfero, y un vector oncolltico rabdoviral replicante que expresa el antlgeno de tumor en una cantidad adecuada para potenciar la respuesta inmunitaria. Antlgenos de tumor adecuados y vectores oncollticos para inclusion en el kit se describen anteriormente.
En otro aspecto se desvela un metodo de refuerzo de una respuesta inmunitaria en un mamlfero que tiene una inmunidad preexistente a un antlgeno. El metodo comprende administracion intravenosa al mamlfero del antlgeno, preferentemente mediante un vector que es capaz de infectar los linfocitos B. El termino "inmunidad preexistente" es como se ha definido anteriormente y puede lograrse como se ha descrito anteriormente.
Este metodo puede utilizarse para reforzar la inmunidad con respecto a cualquier antlgeno, que incluye, por ejemplo, antlgenos de tumor, antlgenos virales y particularmente antlgenos derivados de organismos patogenos virales tales como VIH, HepC, FIV, LCMV, virus del Ebola, ademas de patogenos bacterianos tales como Mycobacterium tuberculosis. Como apreciara un experto en la materia, el vector puede prepararse para expresar un antlgeno seleccionado usando tecnologla recombinante bien establecida.
Vectores apropiados para su uso en la administracion de un antlgeno al mamlfero son vectores que son capaces de infectar linfocitos B, que incluyen, por ejemplo, rabdovirus como se exponen anteriormente que incluyen vesiculovirus y virus basados en Maraba. Tambien son apropiados vectores virales mutantes para su uso en el presente metodo. Son particularmente ventajosos virus atenuados mutantes, que incluyen formas incompetentes para la replication, para su uso en el presente metodo. El antlgeno tambien puede administrarse al mamlfero cargado en celulas presentadoras de antlgeno, tales como linfocitos B.
Una vez el vector se prepara para expresar el antlgeno seleccionado, se administra intravenosamente al mamlfero para el optimo refuerzo de la inmunidad. La cantidad de vector administrada variara de nuevo con el vector seleccionado, ademas del mamlfero. En relation con la inmunidad preexistente, el vector que expresa antlgeno puede administrarse al mamlfero antes de o coincidente con la respuesta inmunitaria pico de la inmunidad
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
preexistente. El vector que expresa antlgeno se administra optimamente al mamlfero para reforzar la inmunidad preexistente tras la fase efectora de la inmunidad preexistente por sensibilizacion.
Tal administracion intravenosa del vector que expresa antlgeno, por ejemplo, el vector de refuerzo, produce un refuerzo significativo en la respuesta inmunitaria al antlgeno en comparacion con otras vlas de administracion que incluyen intramuscular, intraperitoneal, subcutanea e intranasal. El metodo proporciona un aumento de al menos aproximadamente 4 veces en la respuesta inmunitaria en comparacion con otras vlas de administracion.
Tambien se desvela un kit para su uso en reforzar una respuesta inmunitaria en un mamlfero. El kit comprende un antlgeno, o un vector que expresa el antlgeno, en una cantidad adecuada para inducir una respuesta inmunitaria al antlgeno. El antlgeno o vector se proporciona en una forma administrable adecuada, por ejemplo, en una forma adecuada para administracion intravenosa, intramuscular o intranasal. El kit tambien incluye un vector que expresa el mismo antlgeno que esta en una forma adecuada para administracion intravenosa, por ejemplo, en una solucion salina o solucion tamponada. Antlgenos y vectores adecuados para inclusion en el kit se han descrito anteriormente.
En otro aspecto se desvela un metodo de refuerzo de la respuesta inmunitaria en un mamlfero que tiene una inmunidad preexistente a un antlgeno, que comprende administrar intravenosamente al mamlfero linfocitos B cargados de antlgeno. Como se indica, la administracion intravenosa de linfocitos B cargados de antlgeno produce un refuerzo significativo a la respuesta inmunitaria preexistente al antlgeno.
Realizaciones de la invencion describen a continuacion ejemplos especlficos que no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplo 1
MATERIALES Y METODOS
Ratones. Ratones hembra de la misma edad (8-10 semanas de edad al inicio del estudio), que incluyen ratones C57BL/6 (H-2b) y BalB/c (H-2d) (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), se alojaron en una instalacion libre de patogenos especlfica. Los estudios en animales cumplieron con las normas del Canadian Council on Animal Care y fueron autorizados por el comite de etica de investigation animal de la Universidad de McMaster.
Celulas. Se cultivaron celulas de melanoma murino B16-F10 y celulas de carcinoma de colon CT26 en medio esencial mlnimo F11 que contenla 10 % de FBS, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, disolucion de vitamina, aminoacidos no esenciales 0,01 mM, 2-mercaptoetanol 50 gM, 100 U/ml de penicilina y 100 gg/ml de estreptomicina (todos de Invitrogen, Grand Island, NY, EE.Uu.). Se cultivaron celulas HEK293T en D-mEm mas 10 % de FBS, mientras que las celulas Vero se cultivaron en a-MEM mas 10 % de FBS.
Vectores. Ad-hDCT es un Ad tipo 5 humano delecionado en E1/E3 que expresa el gen hDCT de longitud completa y AdBHG es un virus delecionado en E1/E3 que no contiene transgen (Lane, C., et al. Cancer Res 64, 1509-1514 (2004); Ng et al. Mol Ther 3, 809-815 (2001)). Se manipulo VSV recombinante del serotipo Indiana para expresar la hDCT subclonando un fragmento de PCR de hDCT en los sitios XhoI y NheI entre los genes G y L del plasmido pVSV-XN (proporcionado por John Rose, Universidad de Yale, New Haven, Connecticut), ademas de un genoma viral que lleva una mutation AM51 en el gen matriz como se describe en Stojdl, D.F., et al. Cancer Cell 4, 263-275 (2003). Se construyeron vectores de Maraba analogos usando la misma estrategia. Se rescataron genomas recombinantes usando tecnicas convencionales (Lawson et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1995 Sep 12;92(19):9009) para generar VSV que expresa hDCT competente en la replication (VSV-hDCT). El VSV parental que no contiene transgen se rescato como virus de control para algunos experimentos (VSV-MT). Un VSV que lleva la protelna verde fluorescente (GFP) se describio previamente en Stojdl, D.F., et al. Cancer Cell 4, 263-275 (2003) y se uso para monitorizar la infection en este estudio (VSV-GFP). Tambien se usaron virus que expresan una fusion SIINFEKL- luciferasa para inducir respuestas frente a este epitope derivado de ovoalbumina. Tambien se construyeron virus que expresan epitopes de LCMV para vacunar contra este virus. Las reservas de VSV se produjeron a partir de celulas HEK 293T y se purificaron por centrifugation por gradiente de sacarosa. El titulo viral se determino por ensayo en placa en celulas Vero.
Peptidos. El peptido inmunodominante de DCT que se une a H-2Kb (DCT180-188, SVYDFFVWL; compartido por DCT humana y murina) se sintetizo por sistemas PepScan (Lelystad, Los Paises Bajos). El epitope limitado por H- 2Kb de la proteina N de VSV (RGYVYQGL) y un peptido gp100 murino que se une a Db (mgp10025-33; EGSRNQDWL) se compraron de Biomer Technologies (Hayward, CA).
Cirugia estereotactica. Para establecer tumores cerebrales, los ratones recibieron inyecciones intracraneales de 1x10^ celulas B16-F10 en 2 gl de PBS. Los ratones se colocaron en una estereotaxia (Xymotech Biosystems Inc, Quebec, Canada) y se hizo una incision en el cuero cabelludo para exponer el craneo bajo anestesia. Se coloco una aguja montada en una jeringa de Hamilton de 10 gl (Hamilton Company, Reno, NV) sobre el hemisferio derecho del cerebro, 2,25 mm lateral al bregma. Se perforo un pequeno agujero de trepano a traves del craneo y el bisel de la aguja se inserto en la parenquima cerebral a una profundidad de 3 mm. Las celulas se inyectaron durante un periodo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de 1 minuto. La aguja se dejo en el sitio durante 2 minutos antes de extraerla para minimizar el reflujo a lo largo del tramo de inyeccion. La incision del cuero cabelludo se cerro con grapas de acero inoxidable que se quitaron 7-10 dlas despues.
Tumores metastasicos de pulmon en ratones BalB/c. Se inocularon ratones BalB/c con 2x105 celulas CT26 en 200 gl de PBS mediante inyeccion en la vena de la cola. Todos los ratones sin tratar llegaron al punto final en el plazo de 24 dlas.
Protocolo de vacunacion. Se inmunizaron ratones anestesiados por inyeccion intramuscular (i.m.) de 1x108 ufp de vector Ad en 100 gl de PBS (50 gl/tendon) o inyeccion de 2-10x108 ufp de VSV en 200 gl de PbS en la vena de la cola (i.v.).
Titulacion viral en homogeneizados de tejido. Para medir la replicacion de virus intratumoral, se recogieron los cerebros o pulmones 3 dlas despues de la inoculacion i.v. de vectores de VSV, se pesaron y se homogeneizaron antes de la titulacion. Los tltulos virales se cuantificaron por ensayo en placa en monocapas de Vero y se expresan como unidades formadoras de placa (UFP) por gramo de tejido.
Anticuerpos. Se usaron los siguientes Ab monoclonales en ensayos de citometrla de flujo: anti-CD16/CD32 (clon 2.4G2) para bloquear receptores de Fc, anti-CD3 (clon 145-2C11), anti-CD8 (clon 53-6.7) para detectar marcadores de la superficie celular y anti-IFN-g (clon XMG1.2) para la tincion intracelular (todos los reactivos de BD Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.).
Preparacion de linfocitos T y tincion intracelular. Para la recogida de CMSP (celulas mononucleares de sangre periferica), se recogio sangre del seno peri-orbital y se lisaron los globulos rojos. Para el aislamiento de TIL (linfocitos infiltrantes de tumor), se diseccionaron tumores del SNC de los cerebros, se pesaron, se trituraron y posteriormente se incubaron a 37° 1 h en solucion salina tamponada de Hank que contenla 0,1 % de colagenasa tipo I (Invitrogen Life Technologies) y DNasa (0,1 mg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Tras la digestion, las celulas liberadas se filtraron a traves de un tamiz de 70 gM y los TIL se purificaron usando el sistema EasySep CD90-PE (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC). Las celulas mononucleares de sangre y los TIL de los tumores cerebrales se estimularon con peptidos (1 gg/ml) en presencia de brefeldina A (GolgiPlug, BD Pharmingen, 1 gg/ml anadido despues de 1 h de incubacion). Despues de 5 h de tiempo de incubacion total, las celulas se trataron con anti-CD16/CD32 y se marcaron fluorescentemente marcadores superficiales mediante la adicion de Ab. Entonces, las celulas se permeabilizaron y se fijaron con Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen) y se tineron para citocinas intracelulares. Los datos se adquirieron usando un citometro de flujo FACSCanto con el software FACSDiva 5.0.2 (BD Pharmingen) y se analizaron con el software FlowJo Mac Version 6.3.4 (Treestar).
Tincion de tetrameros y ensayo de incorporation de BrdU. Los ratones inmunizados recibieron inyecciones i.p. de 1 mg de BrdU 24 h antes de la recogida. Los linfocitos de diferentes organos se tineron primero con tetramero conjugado con APC H-2Kb/SVYDFFVWL y a continuation se tineron para BrdU usando el kit de tincion de BrdU (BD Pharmingen) segun las instrucciones del fabricante.
Tincion de tejido. Para la tincion de secciones de cerebro en parafina, se fijo tejido durante la noche en 10 % de formalina, se transfirio a 70 % de etanol, se incorporo en parafina y se secciono a un espesor de 5 gm. Las secciones se tineron con hematoxilina y eosina (Sigma).
Analisis estadlsticos. Se uso GraphPad Prism version 4.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.) para todas las graficas y analisis estadlsticos. Las respuestas de linfocitos T se analizaron por la prueba de la t de Student bilateral o ANOVA uni o bilateral. Las diferencias entre medias se consideraron significativas a p<0,05. Se muestran barras de medias mas error estandar. Los datos de supervivencia se analizaron usando el metodo de Kaplan-Meier y la prueba del orden logarltmico para la tendencia.
RESULTADOS
Impacto de la oncolisis y la vacunacion tumoral en huespedes sin tratamiento previo
Ratones C57BL/6 recibieron inyecciones intracraneales de 1x103 celulas B16-F10. Una semana despues, los ratones se trataron con inyecciones intravenosas de 1x109 ufp de VSV-GFP. La microscopla fluorescente revelo que los cerebros recogidos 3 dlas despues del tratamiento con VSV tenlan evidencia de expresion intratumoral de gFp. El examen macroscopico de cerebros recogidos en el dla 4 despues de la infection revelo una gran reduction en la carga tumoral en cerebros tratados con VSV-GFP. Las secciones tratadas con hematoxilina y eosina de estos cerebros tambien indicaron esta reduccion. Los estudios de supervivencia, como se muestran en la Fig. 1A, dejaron de detectar supervivencia prolongada tras el tratamiento oncolltico con VSV-GFP (dos grupos de cinco ratones se trataron como antes y se repitio 3 veces con resultados similares). Alternativamente, en el dla 5 despues del injerto, los ratones se trataron con una unica dosis intramuscular de 1x108 UFP de Ad-hDCT o Ad-BHG. El analisis inmunologico de sangre periferica se realizo en el dla 14 despues de la vacunacion. El porcentaje de linfocitos T CD8+ positivos para IFNg intracelular tras la estimulacion con el epitope dominante para DCT se muestra en la Fig.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
1B. Se recogieron los datos de supervivencia, que indican una extension significativa de la supervivencia en ratones vacunados con Ad-hDCT como se muestra en la Fig. 1C. El experimento se repitio 3 veces y se muestran datos representativos. En otro experimento, en el dla 5 despues del injerto, los ratones portadores de tumores B16 intracraneales se trataron con una dosis intravenosa unica de 1x109 UFP de VSV-hDCT. El analisis inmunologico de la sangre periferica se realizo en el dla 14 despues de la administracion de VSV. El porcentaje de linfocitos T CD8+ positivos para IFNg intracelular tras la estimulacion con los epitopes dominantes para DCT y para la nucleocapside del VSV se muestra en la Fig. 1D. Los estudios de supervivencia dejaron de detectar supervivencia prolongada tras el tratamiento oncolltico con VSV-hDCT (dos grupos de cinco ratones, se repitio 3 veces con resultados similares) como se muestra en la Fig. 1E.
Convertir la respuesta inmunitaria contra el virus oncolltico (OV) en una beneficiosa.
La llnea de tiempo para un tratamiento de combinacion con Ad-hDCT y VSV-hDCT en la que los ratones portadores de tumor se vacunan en el dla 5 despues del injerto para generar una respuesta anti-DCT antes de la administracion del virus oncolltico en el dla 19 se muestra en la Figura 2A. Se recogio sangre periferica 6 dlas despues del tratamiento con VSV y se realizo ICS para IFNg en respuesta a los epitopes dominantes para DCT y para VSV-N. Los ratones sin tratamiento previo presentaron una respuesta frente a VSV-hDCT que estuvo dominada por la respuesta antiviral, mientras que los ratones vacunados presentaron una respuesta dominada por la respuesta anti- DCT y una respuesta anti-VSV reducida (vease la Fig. 2B). La Fig. 2C muestra los datos de supervivencia reunidos para tres experimentos independientes en los que los ratones se trataron con vector Ad vaclo (Ad-BHG), Ad-hDCT solo o Ad-hDCT, seguido de VSV-hDCT (n=19, n=18 y n=15 respectivamente), y claramente establece la elevada supervivencia con la ultima combinacion.
Caracterlsticas inmunologicas del refuerzo inmunitario con virus oncolltico.
La comparacion de los numeros de linfocitos T CD8+ IFNg+ especlficos de DCT en la sangre periferica de ratones C57BL/6 portadores de tumor (TB) y libres de tumor (TF) en el pico de la respuesta despues del tratamiento con VSV (TB n=7, TF n=5) se muestra en la Fig. 3A. Los datos reunidos que demuestran la correlation entre la magnitud de la respuesta anti-DCT en la sangre periferica y la supervivencia se muestran en la Fig. 3B. Los datos incluyen ratones que se vacunaron con vector vaclo (Ad-BHG, x), se vacunaron con Ad-hDCT (□) o se trataron con la combinacion de Ad-hDCT + VSV-hDCT (•). Las llneas horizontales indican la respuesta media lograda en ratones libres de tumor +/- EEM (llneas discontinuas). La mayorla de las respuestas asociadas a la supervivencia >45 dlas solo pueden lograrse en animales portadores de tumor que demostraron la importancia de uso de un virus oncolltico como vector de refuerzo. Los ratones C57BL/6 vacunados con Ad-hDCT portadores de tumores B16-F10 intracraneales se trataron posteriormente con PBS, VSV-MT (sin transgen) o VSV-hDCT. Siete dlas despues se recogieron los tumores y se enumeraron los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) IFNg+ sensibles al peptido DCT180- 188 como se muestra en la Fig. 3C. Los linfocitos T CD8+ sensibles a gp100 se enumeraron por ICS para IFNg, demostrando que la terapia de combinacion de animales portadores de tumor (TB) induce la diseminacion de epitope (Fig. 3D).
Impacto de la vacunacion sobre la replication de OV.
Se inmunizaron i.m. ratones C57BL/6 libres de tumor (TF) o portadores de tumor B16-F10 (TB) con vectores Ad. Catorce dlas despues del tratamiento Ad, los ratones se administraron con VSV-hDCT mediante inyeccion i.v. y los cerebros se pesaron y se homogeneizaron 3 dlas despues de la inoculation con VSV. Los tltulos virales se cuantificaron por ensayo en placa en monocapas de Vero y se expresan como UFP por gramo de tejido cerebral (Figura 4A). Los pesos cerebrales se resumen en la Figura 4B. Los datos se reunieron de dos experimentos con 5 ratones por grupo.
Cinetica de la replicacion de linfocitos T tras el tratamiento con VSV-hDCT.
Se inmunizaron ratones C57BL/6 libres de tumor con Ad-hDCT durante 14 dlas antes de la inoculacion con VSV- hDCT. Los ratones inmunizados recibieron inyecciones i.p. de 1 mg de BrdU 24 h antes de la recogida. Se recogieron los tejidos cada 24 h para monitorizar la proliferation de linfocitos T durante 7 dlas. La proliferation de linfocitos T CD8+ especlficos de antlgeno en la sangre (Figura 5A), bazo (Figura 5B) y ganglios linfaticos cervicales (Figura 5C) se determino por co-tincion con un anticuerpo para BrdU y tetramero H-2Kb/SVYDFFVWL. Cada slmbolo representa 5 ratones y el experimento se repitio dos veces con resultados similares.
Impacto de la vacunacion sobre la oncolisis en un modelo metastasico de pulmon.
Se inmunizaron i.m. ratones BalB/c con 108 UFP de Ad-hDCT 14 dlas antes (intervalo largo) o el mismo dla (intervalo corto) del injerto del tumor CT26 (2x105 celulas, inyeccion i.v.) como se muestra en la llnea de tiempo (Fig. 6A). Catorce dlas despues de la inoculacion del tumor, los ratones se trataron con 2x108 UFP de VSV-hDCT o VSV- GFP mediante inyeccion en la vena de la cola. Se recogieron los pulmones completos y se homogeneizaron 4 dlas despues del tratamiento con VSV. Los tltulos virales se cuantificaron por ensayo en placa en monocapas de Vero y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
se expresan como UFP por gramo de tejido (veanse las Figs. 6B y 6C, respectivamente). Se reunieron los datos de dos experimentos con 5 ratones por grupo.
El elevado intervalo entre la sensibilizacion y el refuerzo mejora la magnitud de la respuesta.
Se inmunizaron inicialmente ratones C57BL/6 con una dosis i.m. de 108 UFP de Ad-hDCT. Catorce o 100 dlas despues, los ratones se administraron con 109 UFP de VSV-hDCT mediante inyeccion en la vena de la cola. El porcentaje (Figura 7A) o numero (Figura 7B) de linfocitos T CD8+ que secretan IFNg especlficos de DCT en la sangre se cuantifico por analisis de FACS 7 dlas despues del tratamiento con VSV. Cada barra representa 5 ratones.
Vectores de vacuna oncolltica basados en Maraba
Se vacunaron ratones C57/B6 potadores de tumores B16F10 intracraneales con Ad-BHG (vector vaclo, control negativo) o Ad-hDCT (1x108 UFP IM). Un grupo recibio posteriormente una dosis intravenosa unica de hDCT de Maraba (2x109 UFP). Se realizo analisis inmunitario en linfocitos T de sangre periferica 5 dlas despues (tres barras por tratamiento, la barra izquierda es IFNg+, la central es TNFa+ y la barra derecha es doble positivo en cada caso) (Figura 8A) y se registraron los datos de supervivencia (Figura 8B).
Vacunacion con celulas dendrlticas cargadas de antlgeno
Se injertaron intravenosamente ratones C57/B6 con celulas B16F10. Los ratones se vacunaron con celulas dendrlticas cargadas de Ad-hDCT o hDCT (DC) solas o en combinacion con VSV-hDCT administrado posteriormente IV. Se recogieron los datos de supervivencia, como muestra la Fig. 9A. Dos ratones tratados con la combinacion de DC-hDCT+VSV-hDCT fueron supervivientes a largo plazo (se sacrificaron 100 dlas despues del injerto, los pulmones estaban claros). Los grupos vacunados con Ad y el grupo vacunado con DC presentaron todos mediana de la supervivencia significativamente mayor frente al grupo tratado con PBS, mientras que el grupo tratado con DC-hDCT+VSV-hDCT de combinacion presento la mayor mediana de la supervivencia. (Figura 9B).
Vacunacion con vector viral de la variolovacuna cargado con antlgeno
Se trataron tumores de melanoma B16F10 subcutanea de dla 10 con PBS, hDCT de la variolovacuna doblemente delecionada (ddVV-hDCT, 1x108 UFP IT) sola o ddVV-hDCT, seguido cuatro dlas despues por VSV-hDCT (2x109 UFP IV). Se proporcionan los volumenes tumorales (Fig. 10A) y los datos de supervivencia (Fig. 10B) e ilustran la elevada respuesta a la terapia de combinacion.
Discusion
Se utilizo un modelo de melanoma intracraneal (i.c.) agresivo B16 en un huesped inmunocompetente usando antlgenos asociados a melanoma. En este modelo, ratones C57BL/6 se injertaron con 1x103 celulas B16-F10 mediante inyeccion i.c. y la mediana del tiempo de supervivencia tras la administration tumoral fue 15 dlas (datos acumulados para controles no tratados, n=41). Para evaluar la eficacia del tratamiento con VSV, los ratones portadores de tumores B16 de 5 dlas de edad se trataron con una dosis intravenosa unica (i.v.) de 1x109 VSV-GFP. El tumor se infecto con VSV, produciendo una clara reduction en los volumenes tumorales como era de esperar. Sin embargo, este efecto fue transitorio y dejo de traducirse en un beneficio de supervivencia (Fig 1a).
En otro enfoque se probo el tratamiento de melanoma B16 i.c. mediante la vacunacion del tumor. Se injertaron ratones C57BL/6 con una dosis i.c. de 1x103 celulas B16 y estos se trataron intramuscularmente (i.m.) con 1x108 UFP de Ad-hDCT 5 dlas despues del injerto. La respuesta de linfocitos T CD8+ contra un epitope inmunodominante DCT180-188 (identico entre ser humano y raton) fue evidente en sangre periferica una semana despues de la vacunacion y alcanzo el punto maximo en el dia 12-14 (~3,5 % de linfocitos T CD8+ IFN-g+, Fig. 1b). En comparacion con el tratamiento con VSV, la vacunacion con Ad-hDCT prolongo significativamente la supervivencia (mediana del tiempo hasta la muerte 32 dias frente a 19 dias, P=0,0044) (Fig 1c), pero fue incapaz de curar ninguno de los ratones. No se midieron linfocitos T especificos de DCT o protection en ratones inmunizados con un vector de control Ad-BHG o PBS.
En otro enfoque, VSV se manipulo para expresar hDCT (VSV-hDCT) y se trataron ratones que tenian tumores B16- F10 i.c. con el vector VSV-hDCT. Este vector indujo una pequena respuesta de linfocitos T CD8+ anti-DCT (0,26 %, Fig 1d) que fue 12 veces mas pequena que la provocada por Ad-hDCT (3,2 %, Fig. 1b). Sin embargo, se detecto un alto nivel de linfocitos T CD8+ contra un epitope de la nucleoproteina del VSV tras el tratamiento con VSV-hDCT (14,0 %, Fig. 1d), sugiriendo que la respuesta antiviral domino el desenlace inmunologico. Similar a la observation con VSV-GFP (Fig. 1a), el tratamiento con VSV-hDCT no proporciono ningun beneficio a la supervivencia (Fig. 1e). Asi, la potente respuesta inmunitaria antiviral provocada por el virus oncolitico no solo produce el impacto oncolitico del vector por ser transitorio, sino que tambien domina los intentos por inducir directamente respuestas inmunitarias contra el transgen del antlgeno asociado a tumor (TAA).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En otro enfoque se indujo una respuesta inmunitaria contra un antlgeno de tumor definido, seguido de tratamiento con un virus oncolltico que expresa el mismo antlgeno. Los ratones C57BL/6 portadores de tumores B16 i.c. de 7 dlas de edad se trataron por inyeccion i.m. de 1x108 UFP de tanto Ad-BHG como Ad-hDCT. Catorce dlas despues, los ratones se administraron con una dosis i.v. unica de VSV-GFP o 1x109 UFP de VSV-hDCT (Fig. 2a). Como se resumen en la Figura 2b, la inmunizacion con Ad-hDCT seguida de VSV-hDCT en ratones portadores de tumor produjo que el 22 % de los linfocitos T CD8+ derivados de la sangre fueran especlficos de DCT; 7 veces (en comparacion con Fig. 1b) o 85 veces (en comparacion con Fig. 1 d) superiores a cualquier tratamiento de vector solo. Ademas, no solo esta combinacion potencio significativamente la respuesta inmunitaria a TAA, en realidad redujo la magnitud de la respuesta de linfocitos T CD8+ anti-VSV en comparacion con la observada tras la exposicion de un raton sin tratamiento previo a este OV (del 14 % al 4,7 % de los linfocitos T CD8+ derivados de la sangre; Fig. 2b), demostrando una inversion de la respuesta inmunitaria contra el virus oncolltico de la vacuna en el que la respuesta antitumoral domino ahora con respecto a la inmunidad antiviral. Y, lo que es mas importante, la terapia de combinacion condujo a otra extension en la mediana de la supervivencia, es decir, un efecto sinergico (mediana de la supervivencia de 15 dlas con Ad-BHG solo, mediana de la supervivencia de 30,5 dlas con Ad-hDCT solo, mediana de la supervivencia de 54 dlas con tratamiento de combinacion) y el 20 % de los ratones tratados de este modo presentaron cura duradera a largo plazo (Fig. 2c) tras solo una dosis de cada vector.
La magnitud de la respuesta de linfocitos T anti-DCT fue mayor en animales portadores de tumor que en animales libres de tumor, demostrando la ventaja de uso de un OV replicante para administrar el transgen en presencia de un tumor (Fig 3a). Ademas, la supervivencia se correlaciono directamente con el nivel de linfocitos T CD8+ especlficos de DCT, donde la mayor extension a la supervivencia solo se logro cuando la magnitud de esta respuesta inmunitaria supero la que podrla generarse en huespedes libres de tumor (Fig. 3b). Asl, el maximo efecto terapeutico estuvo mediado por la replicacion del vector de refuerzo oncolltico dentro del tumor. Ademas, la frecuencia de linfocitos T CD8+ infiltrantes de tumor especlficos para DCT fue significativamente mayor en animales tratados con VSV-hDCT en comparacion con aquellos tratados con el virus de control VSV-MT, que indica que el tratamiento con VSV-hDCT no solo produjo un aumento global en el numero de linfocitos T CD8+ especlficos de antlgeno en la periferia, sino que tambien potencio su reclutamiento en el tumor (Fig. 3c). De forma interesante, se detecto una respuesta de linfocitos T CD8+ contra GP100, otro TAA con el que los ratones no se vacunaron, proporcionando evidencia de diseminacion de epitope probablemente resultante de la potenciada destruccion tumoral por tanto CTL anti-DCT como la oncolisis viral debido a que no se midio una respuesta anti-GP100 con ningun tratamiento solo (Fig. 3d).
Aunque las observaciones descritas anteriormente sugieren que VSV-hDCT sigue siendo oncolltico en presencia de respuesta inmunitaria contra el transgen de vector, se evaluo el impacto de tal inmunidad preexistente sobre la replicacion de VSV. Los ratones libres de tumor y los ratones portadores de tumores B16-F10 intracraneales se trataron con Ad-hDCT o Ad-BHG. Catorce dias despues, los ratones se administraron con una dosis i.v. de 1x109 UFP de VSV-hDCT. Se recogieron los cerebros 42 h despues de la administracion de VSV y se determinaron los titulos virales. En ratones vacunados con vector vacio, tanto los cerebros libres de tumor como los portadores de tumor presentaron abundante replicacion de VSV-hDCT, presentando los cerebros portadores de tumor un titulo viral 50 veces mayor (Fig 4a). Como la vacunacion con vector vacio no impidio el crecimiento tumoral, estos ratones tuvieron una carga tumoral significativa (Fig 4b) y estuvieron muy cerca del punto final en el momento de la eutanasia. En los ratones vacunados con Ad-hDCT, los titulos de VSV fueron mucho menores, sin embargo, los cerebros portadores de tumor todavia presentaron un mayor titulo de VSV-hDCT (Fig 4a) aun cuando estos cerebros tuvieron carga tumoral minima en este momento de tiempo (Fig 4b). Asi, VSV fue todavia capaz de infectar y replicarse en este tumor residual, a pesar de la inmunidad preexistente al transgen de vector. Para determinar el desfase temporal para la expansion de linfocitos T CD8+ especlficos de DCT por VSV-hDCT, los ratones se reforzaron con VSV-hDCT y recibieron BrdU 24 h antes de las recogidas de tejido que incluyeron bazos y ganglios linfaticos. Los datos resumidos en la Figura 5 indican que la expansion de linfocitos T CD8+ no se detecto hasta el dia 3 despues del tratamiento con VSV-hDCT. Estos datos sugieren que el vector oncolltico de vacuna tuvo al menos 3 dias para replicarse en presencia de la respuesta inmunitaria primaria contra el transgen de TAA antes de la gran expansion en linfocitos T especlficos de TAA observada despues del tratamiento.
Como Ad-hDCT tuvo un gran impacto sobre la carga tumoral, fue dificil analizar cuantitativamente el impacto de una respuesta inmunitaria preexistente contra un transgen sobre la replicacion viral en el modelo de B16. Por tanto, este efecto se midio en un modelo de tumor diferente en el que la DCT no era un antlgeno de tumor. Esto permitio una comparacion en la que los ratones tenian cargas tumorales similares independientemente de la vacunacion y tambien permitio flexibilidad con respecto al intervalo entre la vacunacion y la oncolisis viral. Para este fin, se selecciono un modelo metastasico de pulmon de carcinoma de colon CT26 en el que DCT era irrelevante. Los ratones se inocularon i.v. con celulas cT26 y se vacunaron i.m. con Ad-hDCT el mismo dia. Catorce dias despues, los ratones recibieron 2x108 UFP de tanto VSV-hDCT como VSV-GFP mediante inyeccion i.v. Para medir la replicacion viral, los ratones se sacrificaron 96 h despues de la administracion de VSV y se recogieron los pulmones y los cerebros para la determinacion de los titulos de VSV por ensayo en placa (Fig 6a). Se observo una reduccion de aproximadamente 1,5 logaritmos de los titulos virales en tanto los pulmones como los cerebros de animales tratados con VSV-hDCT, en comparacion con controles de VSV-GFP (Fig. 6b). De forma interesante, sin embargo, hubo una reduccion mas pequena en los titulos pulmonares de VSV-hDCT si los ratones se inmunizaron 14 dlas antes del injerto de CT26 (27 dlas antes del tratamiento con VSV-hDCT) (Fig. 6c), sugiriendo que un elevado
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
intervalo entre estos dos tratamientos puede minimizar posiblemente la compensacion en la oncolisis. Tambien se observo una reduccion significativa en los tltulos de cerebro de VSV-DCT (Fig 6c), que demuestra que la vacunacion anterior contra un transgen no estructural codificado por un virus oncolltico (OV) reduce la replicacion de OV en tejidos normales y as! potencia el perfil de seguridad del OV.
La reduccion en la oncolisis puede minimizarse adicionalmente aumentando el intervalo entre la vacunacion y la administracion de OV, ya que la frecuencia de efectores especlficos de antlgeno disminuye con el tiempo. Otro beneficio de extender el intervalo entre la vacunacion y la oncolisis viral puede demostrarse en animales libres de tumor en los que la frecuencia media de linfocitos T CD8+ especlficos para el epitope inmunodominante de DCT alcanzo el 37 % (doble del nivel observado cuando se hace en el momento de tiempo de 14 dlas) si VSV-hDCT se administro 100 dlas despues de Ad-hDCT (Figura 7).
En vista de lo anterior, se demuestra una estrategia de tratamiento que usa eficazmente vacunacion tumoral para modificar la respuesta inmunitaria contra un vector oncolltico viral manipulado de tal manera que se permite una oncolisis viral transitoria que conduce directamente a una respuesta inmunitaria antitumoral masiva. El arreglar el sistema de forma que la respuesta inmunitaria dominante frente al virus oncolltico tambien sea una respuesta inmunitaria antitumoral funciona para extender el impacto del vector viral a traves de esta reaccion inmunitaria. Asi, la manipulacion de virus oncoliticos para expresar antigenos de tumor naturales puede inducir una debil respuesta de linfocitos T contra el antigeno de tumor, pero esta respuesta esta completamente eclipsada por la respuesta inmunitaria contra antigenos virales. Aunque la inmunizacion previa contra un transgen de vector oncolltico puede parecer ser contraintuitiva ya que puede alterar la administracion o replicacion viral, los presentes resultados demostraron que la vacuna oncolitica fue mas potente bajo estas circunstancias, ya que amplifico espectacularmente la inmunidad antitumoral preexistente, mientras que retuvo la actividad oncolitica, conduciendo a desenlaces clinicos significativamente mejorados. Sorprendentemente, la inmunidad preexistente no previno la replicacion viral intratumoral y el gran beneficio inmunologico de este enfoque hace de esto una compensacion razonable. Aunque esta respuesta especifica de antlgeno potenciada puede reducir adicionalmente la replicacion del OV, los datos de ratones marcados con BrdU indicaron que hay al menos una ventana de 3 dlas de oportunidad para la oncolisis viral. En realidad, se desea el reclutamiento de CTL en el tumor en ese punto y potencia la eliminacion de tanto el virus como el tumor.
Un beneficio adicional de este enfoque es el potenciado perfil de seguridad presentado por el vector oncolltico de vacuna. Los datos demuestran infeccion intracraneal por VSV tras la administracion intravenosa, sin embargo, los titulos virales fueron menores en los cerebros de animales inmunizados y, lo mas impresionante, no hubo paralisis de las extremidades traseras en ninguno de los ratones que habian sido vacunados contra el transgen viral aun cuando se uso VSV no mutante. Esta terapia de combinacion tambien se probo con un mutante de VSV inductor de interferon que expresa hDCT y produjo supervivencia comparable en el modelo de B16 intracraneal (no mostrado), que indica que este enfoque puede combinarse satisfactoriamente con otros medios de direccionamiento y atenuacion virales.
El presente metodo de terapia de combinacion puede utilizar diversos metodos de generacion de una respuesta inmunitaria al antigeno preexistente (viral, plasmido y celular), y tambien puede utilizar diversos vectores oncoliticos de vacuna que incluyen VSV y Maraba.
Ejemplo 2
MATERIALES Y METODOS
Virus - Se construyeron vectores de VSV usando un genoma de plasmido portador de un gen M no mutante (pVSV- XN) o un mutante de protelna M de serotipo Indiana (0M51-VSV) y se crearon subclonando fragmentos de PCR entre los sitios Xhol y Nhel de los plasmidos pVSV-XN o pAM5. VSV/SIINFEKL-Luc (VSV/SIIN) contiene una version modificada de luciferasa que lleva el epitope de clase I inmunodominante de OVA (SIINFEKL) marcado en el extremo N. VSV/hDCT lleva un antlgeno asociado a melanoma humano, dopacromo tautomerasa (DCT). VSV/GFP aloja la protelna verde fluorescente y el virus de control, VSV/MT, no contiene transgen. Los vectores de VSV se propagaron en cultivos de celulas 293T y se purificaron por centrifugacion en un gradiente de sacarosa. El virus de la variolovacuna delecionado doble-hDCT (ddVV-hDCT) es una timidina cinasa recombinante y el virus de la variolovacuna doble delecionado del factor de crecimiento de la variolovacuna se manipulo para expresar hDCT. La variolovacuna se cultivo en celulas CV1.
Peptidos - Se sintetizaron el peptido inmunodominante de DCT que se une a H-2Kb (DCT18o-188, SVYDFFVWL; compartido por DCT humana y murina) (Parkhurst et al, 1998) y un peptido de union a Kb de OVA (SIINFEKL) por PepScan Systems (Lelystad, Los Palses Bajos).
Protocolo de vacunacion - Se inmunizaron ratones anestesiados por inyeccion i.m. de 1 x 108 ufp de vector Ad en 100 pl de PBS (50 pl/tendon) y seguido de inyeccion i.v. con 1-2 x 109 ufp de VSV en 200 pl de PBS en la vena de la cola. El intervalo oscila de 8 a 233 dlas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Anticuerpos - Se usaron los siguientes Ab monoclonales en ensayos de citometrla de flujo: anti-CD16/CD32 (clon 2.4G2) para bloquear receptores de Fc, anti-CD3 (clon 145-2C11), anti-CD4 (clon RM4-5), anti-CD8 (clon 53-6.7) para detectar marcadores de la superficie celular y anti-IFN-g (clon XMG1.2) y anti-TNF-a (clon MP6-XT22) para tincion intracelular (todos los reactivos de BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). Se realizaron estudios de inmunoagotamiento con los mAb GK1.5 (anti-CD4) y/o 2.43 (anti-CD8) de ATCC. Los mAb purificados (250 gg en 500 gl de solucion salina) se inyectaron i.p. separados dos dlas y a continuacion dos veces a la semana a partir de aqul a una dosis de mantenimiento de 200 gg por tratamiento. La eficiencia del agotamiento especlfico de subconjuntos de linfocitos fue >98 % como se mide por citometrla de flujo.
Preparacion de linfocitos T y tincion intracelular - Se recogio sangre del seno peri-orbital y se lisaron los globulos rojos. Se incubaron los bazos y ganglios linfaticos en solucion salina tamponada de Hank (HBSS) con 0,05 mg/ml de colagenasa tipo I (Invitrogen Life Technologies) a 37° durante 30 min y a continuacion se presionaron entre portaobjetos de microscopio para generar suspensiones de celulas individuales. Para el aislamiento de TIL, se diseccionaron tumores del SNC de los cerebros de ratones perfundidos con PBS, luego se pesaron, se trituraron y posteriormente se incubaron a 37° durante 45 min en HBSS que contenla 0,5 mg/ml de colagenasa tipo I, 0,2 mg/ml de DNasa y 0,02 mg/ml de hialuronidasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Tras la digestion, las celulas liberadas se filtraron a traves de un tamiz de 70 gM y los TIL se purificaron usando el sistema EasySep CD90-PE (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC). Las celulas mononucleares preparadas se estimularon con peptidos (1 gg/ml) en presencia de brefeldina A (GolgiPlug, BD Pharmingen, 1 gg/ml anadido despues de 1 h de incubacion). Despues de 5 h de tiempo de incubacion total, las celulas se trataron con anti-CD16/CD32 y se marcaron fluorescentemente marcadores superficiales mediante la adicion de Ab. Entonces, las celulas se permeabilizaron y se fijaron con Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen) y se tineron para citocinas intracelulares. Los datos se adquirieron usando un citometro de flujo FACSCanto con el software FACSDiva 5.0.2 (BD Pharmingen) y se analizaron con el software FlowJo Mac Version 6.3.4 (Treestar).
Aislamiento y cultivo de linfocitos B - Se aislaron linfocitos B esplenicos por seleccion negativa usando un kit MACS (Miltenyi) para eliminar linfocitos B no0. Los linfocitos B se cultivaron en IMDM mas FCS y muIL2 durante 4 dlas antes de la infeccion con vectores Ad o de VSV a una MOI de 25 durante 2 horas antes del lavado y administracion mediante la vena de la cola en ratones receptores.
RESULTADOS
Ratones C57BL/6 (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad-hDCT en el dla 0, seguido de inyecciones de 1x109 ufp de VSV-hDCT por diversas vlas (i.m.: intramuscular, s.c.: subcutanea, i.p.: intraperitoneal, i.n.: intranasal, i.v.: intravenosa) en el dla 14. Siete dlas despues, las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre al epitope inmunodominante del antigeno asociado a melanoma, dopacromo tautomerasa (DCT180-188), se midieron por analisis de citometria de flujo de tincion intracelular de interferon-gamma tras la re-estimulacion con el peptido 9 (vease la Fig. 11).
Ratones C57BL/6 (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad-hDCT en el dia 0, seguido de inyecciones i.v. de 1x10®ufp de VSV-hDCT en el pico de la respuesta inmunitaria primaria, dia 14 (Figura 12a), o antes del pico, dia 8 (Figura 12b) (Nota: El pico inducido por Ad es el dia 12-14). Siete dias despues, las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre al epitope inmunodominante del antigeno asociado a melanoma, dopacromo tautomerasa (DCT180-188), se midieron por analisis de citometrla de flujo de tincion intracelular de interferon- gamma tras la re-estimulacion con el peptido. Esta estrategia funciono en tanto escenarios libres de tumor (Figura 12a) como portadores de tumor (Figura 12b; en este caso, melanomas B16-F10 intracraneales, conocidos por ser inmunosupresores).
Ratones C57BL/6 (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad-hDCT en el dla 0, seguido de inyecciones i.v. de 1x107 ufp de VSV-hDCT o ddVV-hDCT en el dla 232. Las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre a los epitopes inmunodominante (SVY) (Figura 13a) y segundo mas dominante (VIT) (Figura 13b) del antigeno asociado a melanoma, dopacromo tautomerasa, se midieron por analisis de citometrla de flujo de tincion intracelular de interferon-gamma tras la re-estimulacion con el peptido.
Ratones C57BL/6 (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad-hDCT en el dla 0, seguido de inyecciones i.v. de 1x10^ ufp de VSV-hDCT o VSV-deltaG-hDCT (una version del vector que conduce a una infeccion no productiva; considerada extremadamente segura) en el dia 35. Las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre a los epitopes inmunodominante (SVY), segundo mas dominante (VIT) y tercer mas dominante (STF) del antigeno asociado a melanoma, dopacromo tautomerasa, se midieron por analisis de citometrla de flujo de tincion intracelular de interferon-gamma tras la re-estimulacion con el peptido (Fig. 14).
Ratones C57BL/6 (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad-hDCT en el dla 0, seguido de inyecciones i.v. de 1x109 ufp de VSV-hDCT en el dla 8. En los dias 8, 15, 22 y 29 despues de Ad, las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre al epitope inmunodominante (SVY) del antigeno asociado a melanoma, dopacromo tautomerasa, se midieron por analisis de citometrla de flujo de tincion intracelular de interferon-gamma tras la re-estimulacion con el peptido. Mas linfocitos T produjeron factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa (Figura 15a)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(expresado como una relacion de celulas productoras de citocina doble con respecto a citocina individual) en respuesta al refuerzo por VSV-hDCT en comparacion con Ad-hDCT solo, con o sin la presencia de melanomas de cerebro B16-F10, o Ad + un vector de VSV de control (VSV-GFP). Ademas, cada linfocito T de ratones reforzados con VSV-hDCT-produjo mas interferon-gamma (Figura 15b).
Ratones C57BL/6 (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad-hDCT en el dla 0, seguido de inyecciones i.v. de 1x107 ufp de VSV-hDCT o ddVV-hDCT en el dla 232. Las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre a los epitopes inmunodominante (SVY) (Figura 16a, c) y segundo mas dominante (VIT) (Figura 16b, d) del antlgeno asociado a melanoma, dopacromo tautomerasa, se midieron por analisis de citometrla de flujo de tincion intracelular de interferon-gamma tras la re-estimulacion con el peptido. Se evaluaron la cantidad de interferon (IFN) gamma producida en una base por celula (Figura 16a, b) y la proporcion de celulas productoras de IFN-gamma que tambien secretaron factor de necrosis tumoral (TNF) alfa (Figura 16c, d).
Ratones C57BL/6 (Figura 17a, b) o BALB/c (Figura 17c) (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad- hDCT en el dla 0, seguido de inyecciones i.v. de 1x109 ufp de VSV-SIIN (Figura 14a) o VSV-hDCT (Figura 17b, c) o VSV-DCT murina (VSV-mDCT) (Figura 17b) 17 dlas (Figura 17a) o 35 dlas despues (Figura 17b, c). Cinco dlas despues de VSV, las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre a SIINFEKL (Figura 17a) o el antlgeno asociado a melanoma, dopacromo tautomerasa (Figura 17b, c), se midieron por analisis de citometrla de flujo de tincion intracelular de interferon-gamma tras la re-estimulacion con el peptido.
Ratones C57BL/6 (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad-SIIN en el dla 0, seguido de inyecciones i.v. de 1x109 ufp de VSV-SIIN en el dla 17. Diez dlas despues de Ad (1a respuesta) y cinco dlas despues de VSV (2a respuesta), las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre a SIINFEKL se midieron por tincion de tetrameros. Los resultados muestran la frecuencia (Figura 18a), numero (Figura 18b) y aumento en veces en estas respuestas.
Ratones C57BL/6 (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad-SIIN en el dla 0, seguido de
inyecciones i.v. de 1x109 ufp de VSV-SIIN en el dla 14. En los dlas 10, 19, 51 y 233, las respuestas de linfocitos T
derivados de la sangre a SIINFEKL se midieron por tincion de tetrameros. La longevidad de la respuesta se muestra en (Figura 19a). Se evaluo la proporcion de celulas especlficas de SIINFEKL de memoria efectora (definidas como CD127+CD62L-) (Figura 19b) y de memoria central (CD127+CD62L+) (Figura 19c) en el dla 51.
Ratones C57BL/6 (n=5/grupo) recibieron inyecciones i.m. de 1x108 ufp de Ad-SIIN en el dla 0, seguido de
inyecciones i.v. de 1x109 ufp de tanto wtVSV-hDCT como deltaM51 VSV-hDCT en el dla 14. Cinco dlas despues de
VSV, se midieron las respuestas de T derivados de la sangre por analisis de citometrla de flujo de tincion intracelular de interferon-gamma tras la re-estimulacion con el peptido (Fig. 20).
Ratones C57/B6 se sensibilizaron con Ad-hDCT y a continuacion se reforzaron con una dosis intravenosa de tanto VSV-hDCT como Maraba-hDCT 14 dlas despues. El analisis inmunitario de las respuestas de linfocitos T CD8+ se midio en sangre periferica. A una dosis equivalente, la respuesta inducida por la vacunacion con Maraba fue 3-8 veces tan grande como las respuestas inducidas por VSV frente al transgen (Fig. 21). En otro experimento, los ratones C57/B6 tanto se sensibilizaron con Maraba-hDCT (2x109 UFP IV) como se sensibilizaron con Ad-hDCT (1x108 UFP IM) y se reforzaron con Maraba-hDCT (2x109 UFP IV). Las respuestas inmunitarias se midieron en sangre y bazo 5 dlas despues (tres barras por tratamiento, la barra izquierda es IFNg+, la central es TNFa+ y la barra derecha es positivo doble en cada caso) como se muestra en la Fig. 22A. Maraba-hDCT administrado IV 9 o 12 dlas despues de la sensibilizacion con Ad (en el pico de la fase efectora inducida por Ad) puede todavla reforzar respuestas inmunitarias (Fig. 22B). Maraba-hDCT y VSV-hDCT administrados intravenosamente refuerzan ambos significativamente las respuestas inmunitarias en ratones BalB-C (ratones tratados como en A, las barras representan IFNg+, TNFa+ y doble+ izquierda a derecha para cada tratamiento) como se muestra en la Fig. 22C.
Ratones C57/B6 se sensibilizaron con dosis variables de VSV y variolovacuna que expresa SIINFEKL-luciferasa para sensibilizar una respuesta frente a este epitope de OVA (Fig. 23A) y posteriormente se reforzaron con VSV- hDCT intravenosamente administrado. Se midieron las respuestas de linfocitos T especlficas de SIINFEKL y se muestran en la Fig. 23, que estan significativamente potenciadas por el posterior refuerzo de VSV.
Ratones C57/B6 se administraron con una dosis intravenosa unica de 2x109 UFP de VSV-GFP y 24 horas despues los bazos se recogieron para analisis de citometrla de flujo. El 61,3 % de los esplenocitos voluminosos fueron B220+CD19+, indicativo de linfocitos B. El 50,8 % de las celulas positivas para GFP son B220+CD19+ y se detectan en la fraccion de linfocitos B.
Se vacunaron ratones C57-B6 no mutantes y -/- para linfocitos B con Ad-hDCT para sensibilizar una respuesta inmunitaria anti-DCT como se mide por linfocitos T CD8+ especlficos de DCT en la sangre (Fig. 24A). La respuesta secundaria se midio tras la administracion intravenosa de VSV-hDCT. Los numeros de linfocitos T CD8+ IFNg+ como se mide por tincion intracelular se indican +/- EEM. (Figura 24B) indico dependencia del refuerzo de linfocitos B.
Se transfirieron adoptivamente linfocitos B de ratones no mutantes y/o suero inmune a ratones deficientes en linfocitos B. Los linfocitos B se midieron como un porcentaje de linfocito de sangre periferica en 1) control no mutante
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2) B-/- mas VSV 3) B-/- mas VSV mas suero 4) B-/- mas linfocitos B VSV y 5) B-/- mas linfocitos B mas suero mas VSV como se muestra en la Fig. 25A. Se midieron las respuestas de linfocitos T anti-DCT en ratones deficientes en linfocitos B reconstituidos tras el refuerzo con VSV. Los numeros de linfocitos T CD8+ IFNg+ se indican +/- EEM. Carriles: 1) B-/- mas VSV 2) B-/- mas VSV mas suero 3) B-/- mas linfocitos B VSV y 4) B-/- mas linfocitos B mas suero mas VSV (Figura 25B) que muestran respuestas potenciadas en linfocitos B.
Se inyecto VSV-SIIN (2*109 ufp) intravenosamente en un raton C57/B6, y 24 horas despues, se recogieron los bazos y se purificaron celulas CD19 positivas de esplenocitos totales. Las celulas CD19+ se co-cultivaron con una llnea celular de DKL. Activacion de linfocitos T cocultivados con celulas CD19+ de raton inmunizado con VSV-SIIN, celulas CD19- de raton inmunizado con VSV-SIIN, celulas CD19+ de raton inmunizado con VSV-SIIN co-cultivado con DKL en presencia del peptido SIIN (control positivo) y control negativo. Los resultados muestran que los linfocitos B infectados con el virus pueden estimular al linfocito T para producir IFN-g
Se aislaron linfocitos B esplenicos de ratones C57/B6 y se cultivaron en muIL2 durante 4 dlas y a continuacion se cargaron con tanto VSV-SIINFEKL/luciferasa como Ad-SIINFEKL/luciferasa (infeccion de 2 horas, se lavaron y se recogieron). Estos linfocitos B cargados se administraron IV a receptores sin tratamiento previo o sensibilizados. Las respuestas de linfocitos T se midieron 5 dlas despues. Los linfocitos T de ratones sensibilizados con variolovacuna- SIINFEKL/luciferasa mostraron respuesta al peptido SIINFEKL. Los linfocitos T de ratones sensibilizados con linfocitos B cargados con VSV-SIINFEKL/luciferasa mostraron respuesta al peptido SIINFEKL. Los linfocitos T de ratones sensibilizados con linfocitos B cargados con vAd-SIINFEKL/luciferasa mostraron una respuesta minima al peptido SIINFEKL. Los linfocitos T de ratones sensibilizados con variolovacuna-SIIIVFEKL/luciferasa y luego reforzados con linfocitos B cargados con VSV-SIINFEKL/luciferasa mostraron respuesta al peptido SIINFEKL. Los linfocitos T de ratones sensibilizados con variolovacuna-SIINFEKL/luciferasa y luego reforzados con linfocitos B cargados con Ad-SIINFEKL/luciferasa mostraron respuesta al peptido SIINFEKL (TNFa eje Y, IFNg eje X en cada caso).
Discusion
Los ratones se inmunizaron con adenovirus mediante inyeccion intramuscular durante 14 dlas. Se administro una dosis unica de VSV recombinante a ratones como la porcion de refuerzo de una pauta de vacunacion por sensibilizacion-refuerzo por cualquier de las vias intramuscular, subcutanea, intraperitoneal, intranasal o intravenosa. Las respuestas de linfocitos T especificas de antigeno se midieron 7 dias despues y se observo que hubo una respuesta de linfocitos T significativamente mayor cuando VSV se administro intravenosamente (vease la Fig. 11).
El momento exacto del refuerzo de la respuesta inmunitaria provocado por VSV se probo en este modelo de vacunacion por sensibilizacion-refuerzo. El refuerzo se administro intravenosamente en el pico de la respuesta inmunitaria primaria (dia 14) o en el dia 8, precediendo al pico (durante la fase efectora). Las respuestas de linfocitos T medidas 7 dias despues revelaron que el refuerzo de VSV fue capaz de reforzar la respuesta inmunitaria en y antes del pico de la respuesta inmunitaria primaria. Esto se demostro en tanto ratones libres de tumor como portadores de tumor y, por tanto, entornos inmunosupresores (vease la Fig. 12). Es notable que el refuerzo fue eficaz durante la fase efectora. Generalmente, los linfocitos T efectores menguan antes de que funcione un vector de refuerzo tal.
La capacidad de refuerzo inmunitario de VSV se comparo con un virus de la variolovacuna de control. El refuerzo se realizo 232 dias tras la sensibilizacion inicial (este intervalo prolongado permite dosis 100 veces menores de VSV para lograr el mismo nivel de refuerzo de linfocitos T como se demuestra anteriormente) y se probo la respuesta de linfocitos T a 2 peptidos especificos de antigeno diferentes. Se encontro que la capacidad de refuerzo del VSV, como se mide por las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre, era sustancialmente mejor que la del virus de la variolovacuna para ambos peptidos de antigeno probados (vease la Fig. 13).
Se probo una version mutante de VSV que puede replicar su genoma y expresar genes dentro de celulas que son inicialmente infectadas, pero es incapaz de producir progenie infecciosa, para su capacidad para reforzar la respuesta inmunitaria. Las respuestas de linfocitos T derivados de la sangre a 3 epitopes dominantes del antigeno usado en el protocolo de inmunizacion-refuerzo indicaron que el VSV mutante reforzo la respuesta inmunitaria tan eficazmente como la version no mutante (vease la Fig. 14). Esto indica que puede usarse una version mas segura del virus que no puede diseminarse para reforzar una respuesta inmunitaria.
Se evaluo la calidad de linfocitos T provocados reforzando con VSV, como se mide por la produccion de multiples citocinas, ademas de la cantidad de produccion de citocinas por celula, para el refuerzo de VSV. La calidad se comparo con los linfocitos T provocados por una sensibilizacion-vacunacion sola o un refuerzo con un vector de control de VSV (sin transgen de Ag insertado). Los linfocitos T generados por el refuerzo de VSV especifico de antigeno produjeron multiples citocinas y una mayor cantidad de interferon-gamma (vease Fig. 15). La calidad de los linfocitos T provocados por el refuerzo de VSV que contiene antigeno se comparo adicionalmente con un refuerzo de virus de la variolovacuna. De nuevo, los linfocitos T de la poblacion de refuerzo de VSV produjeron una mayor cantidad de interferon gamma y tambien secretaron mayores cantidades de factor de necrosis tumoral alfa (vease la Fig. 16).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se probaron dos cepas de raton diferentes con la pauta de VSV de sensibilizacion-refuerzo, ya que fueron dos antlgenos diferentes. En todos los escenarios, se observo el masivo refuerzo inmunitario tras la administracion de VSV (vease la Fig. 17).
Se probo el requisito para linfocitos T cooperadores CD4+ en el refuerzo inmunitario mediado por VSV. Se examinaron respuestas de linfocitos T tras el refuerzo tanto con como sin agotamiento de celulas CD4. El agotamiento tuvo un impacto sobre la respuesta inmunitaria primaria, pero no sobre la respuesta secundaria como se mide por el porcentaje, numero y aumento en veces en linfocitos T CD8+ (vease la Fig. 18). El metodo de sensibilizacion-refuerzo con VSV mantiene la promesa de tratar pacientes inmunocomprometidos tales como aquellos afectados con SIDA/infeccion por el VIH.
La durabilidad de la respuesta inmunitaria reforzada se probo 10, 19, 51 y 233 dlas tras el refuerzo. La respuesta de linfocitos T medida en estos momentos de tiempo indica que la respuesta inmunitaria se mantuvo a largo plazo. Una evaluacion de la proportion de celulas de memoria efectora y de memoria central en el dla 51 indica que hubo una conversion de una mayor proporcion de celulas efectoras en fenotipo de memoria en comparacion con una respuesta sensibilizada sola (vease la Fig. 19). Ya no se necesitan celulas efectoras una vez se ha eliminado el antlgeno. Un mayor conjunto de celulas de memoria en este momento, especialmente celulas de memoria central, garantizara un mejor re-expansion cuando se encuentren con el antlgeno de nuevo.
Un vector de VSV que lleva una mutation deltaM51 en la protelna de la matriz que lo incapacita para bloquear la production de interferon, y denominado as! un mutante inductor de interferon, puede usarse para generar un efecto de refuerzo similar. Se sensibilizaron ratones con Ad-hDCT con un refuerzo posterior de tanto VSV-hDCT no mutante (wtVSV-hDCT) como deltaM51 VSV-hDCT (dM51VSV-hDCT) y se midieron linfocitos T especlficos de DCT en la sangre (vease Figura 20). El vector de deltaM51VSV se atenua por induction por interferon in vivo y as! es tanto un vector mas seguro como tiene asociadas propiedades oncollticas. Esto demuestra que pueden utilizarse diversos medios para atenuar VSV, mientras que se retiene la capacidad para reforzar respuestas inmunitarias tras la administracion intravenosa.
Las vacunas con vector de VSV son agentes de refuerzo particularmente potentes cuando se administran intravenosamente. Las caracterlsticas unicas y notables de este enfoque incluyen la magnitud de respuesta, durabilidad de la memoria, via de administracion preferida, independencia de linfocitos T CD4, capacidad para reforzar la respuesta inmunitaria temprana (durante la fase efectora), capacidad para provocar una calidad de linfocitos T superior, refuerzo de respuestas a epitopes subdominantes y la adaptabilidad a vectores atenuados mas seguros. Se desvela que esta estrategia puede aplicarse a cualquier antlgeno deseado que incluye, por ejemplo, antigenos extranos derivados de patogenos, ademas de autoantigenos, antigenos oncofetales y neoantigenos que se dirigen a tumores. El refuerzo puede usarse conjuntamente con cualquier estrategia de sensibilization para reforzar respuestas de linfocitos T y de anticuerpos para tanto vacunacion profilactica como terapeutica. Ademas, pueden usarse otros miembros de las familias de vesiculovirus o rabdovirales en lugar de VSV como vector de refuerzo. Tambien pueden usarse diversas versiones no replicantes o mutantes de estos virus de refuerzo como vectores de refuerzo.
La capacidad de refuerzo de vectores de VSV intravenosamente administrados es dependiente de linfocitos B. El VSV administrado IV infecta linfocitos B en el bazo. Cuando estas celulas se aislan tras la administracion de VSV, se muestra que presentan antlgeno de transgen a linfocitos T especificos ex vivo. Los linfocitos B cargados con una vacuna de VSV ex vivo es una plataforma de vacunacion superior para vacunar tanto animales sin tratamiento previo como sensibilizados. Tambien pueden usarse otros virus con un tropismo de linfocitos B para lograr estos efectos.
El documento del estado de la tecnica Rose, NF et al., J. of Virology, The American Society of Microbiology, US, vol. 74, no. 23, 2000-12-01, paginas 10903-10910, describe que los vectores de vacuna de VSV modificados con la glucoproteina G permiten el refuerzo eficaz y la generation de anticuerpos neutralizantes a una cepa aislada del VIH primaria. El documento Diaz RM et al., Cancer Reseach, 2007, 67:2840-2828, se refiere a inmunoterapia oncolitica para melanoma usando VSV.
Claims (6)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Un vector oncolltico rabdoviral replicante para su uso en el tratamiento de cancer en un mamlfero, en el que dicho vector expresa un antlgeno de tumor al que el mamlfero tiene una inmunidad preexistente y dicho vector se administra intravenosamente al mamlfero.
- 2. El vector oncolltico para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el antlgeno de tumor es un antlgeno asociado a tumor.
- 3. El vector oncolltico para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el antlgeno de tumor esta seleccionado del grupo que consiste en un antlgeno oncofetal, una glucoprotelna superficial, un marcador de la superficie celular, un antlgeno asociado a melanoma, antlgeno de cancer de testlculos, un oncogen, un oncogen viral, dopacromo tautomerasa (DCT), GP100, MART1, alfa-fetoprotelna (AFP) y antlgeno carcinoembrionario (CEA).
- 4. El vector oncolltico para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el vector oncolltico es un rabdovirus seleccionado del grupo que consiste en vesiculovirus tales como virus de la estomatitis vesicular y virus de Maraba, Ephemerovirus, Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus y Lyssavirus.
- 5. El vector oncolltico para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el mamlfero se ha vacunado con el antlgeno de tumor para generar la inmunidad preexistente al antlgeno antes de la administracion del vector oncolltico.
- 6. Un kit para su uso como se define en la reivindicacion 1, que comprende un antlgeno de tumor, o un vector que expresa un antlgeno de tumor, en una cantidad adecuada para inducir una respuesta inmunitaria en un mamlfero, y un vector rabdoviral oncolltico replicante que expresa el antlgeno de tumor en una cantidad adecuada para potenciar la respuesta inmunitaria, en el que el vector oncolltico esta en una forma adecuada para administracion intravenosa.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16037209P | 2009-03-16 | 2009-03-16 | |
| US16037109P | 2009-03-16 | 2009-03-16 | |
| US160371P | 2009-03-16 | ||
| US160372P | 2009-03-16 | ||
| PCT/CA2010/000379 WO2010105347A1 (en) | 2009-03-16 | 2010-03-16 | Vaccination methods |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2576036T3 true ES2576036T3 (es) | 2016-07-05 |
Family
ID=42739077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10753031.3T Active ES2576036T3 (es) | 2009-03-16 | 2010-03-16 | Métodos de vacunación |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9707285B2 (es) |
| EP (1) | EP2408473B1 (es) |
| CN (1) | CN102448487B (es) |
| CA (1) | CA2755790A1 (es) |
| ES (1) | ES2576036T3 (es) |
| WO (1) | WO2010105347A1 (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112012013664B1 (pt) | 2009-12-10 | 2020-11-10 | Turnstone Limited Partnership | rabdovírus oncolítico |
| CA2829607A1 (en) | 2011-03-11 | 2012-09-20 | Mcmaster University | A method of vaccination comprising a histone deacetylase inhibitor |
| AU2014221143B2 (en) * | 2013-02-21 | 2019-02-07 | Turnstone Limited Partnership | Vaccine composition |
| DK3113795T3 (da) * | 2014-03-01 | 2019-10-21 | Univ Texas | Rekombinante virale isfahan-vektorer |
| EP3402500A4 (en) * | 2016-01-11 | 2019-06-12 | Turnstone Limited Partnership | COMBINATION THERAPY OF ONCOLYTIC VIRUS AND CHECKPOINT INHIBITOR |
| WO2017172713A1 (en) | 2016-03-28 | 2017-10-05 | Minjie Hu | Anti-cancer oncolytic virus combination therapies and elite responder selection platforms |
| AU2017264901A1 (en) * | 2016-05-09 | 2018-12-06 | Turnstone Limited Partnership | Combination prime: boost therapy |
| KR20190033066A (ko) | 2016-06-24 | 2019-03-28 | 맥마스터 유니버시티 | 입양 세포 전달 및 종양붕괴 바이러스 병용 치료 |
| CN111315404A (zh) * | 2017-11-06 | 2020-06-19 | 美利坚合众国, 由健康及人类服务部部长代表 | 利用预先存在的微生物免疫的癌症治疗 |
| CN112399855A (zh) * | 2018-02-22 | 2021-02-23 | 特斯通有限责任合伙公司 | 作为佐剂的溶瘤病毒 |
| CA3207359A1 (en) | 2021-02-05 | 2022-08-11 | Cecile Chartier-Courtaud | Adjuvant therapy for cancer |
| CN113461805B (zh) * | 2021-09-02 | 2021-12-10 | 广州吉妮欧生物科技有限公司 | 一种嵌入抗原表位肽的荧光素酶及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6565831B1 (en) | 1999-02-24 | 2003-05-20 | Oncolytics Biotech Inc. | Methods for preventing reovirus recognition for the treatment of cellular proliferative disorders |
| AU782402B2 (en) | 1999-09-17 | 2005-07-28 | Wellstat Biologics Corporation | Oncolytic virus |
| IL152420A0 (en) * | 2001-02-23 | 2003-05-29 | Novartis Ag | Novel oncolytic adenoviral vectors |
| CA2453880A1 (en) * | 2001-07-25 | 2003-02-06 | New York University | Use of glycosylceramides as adjuvants for vaccines against infections and cancer |
| GB2421025A (en) | 2004-12-09 | 2006-06-14 | Oxxon Therapeutics Ltd | HSV vaccination vectors |
| AU2006287052B2 (en) | 2005-08-31 | 2009-03-12 | Oncolytics Biotech Inc. | Treatment with an oncolytic virus and an immunostimulant for in vivo enhancement of immune system recognition of neoplasms |
| US8926993B2 (en) | 2006-07-17 | 2015-01-06 | Aduro Biotech | Methods and compositions using Listeria for enhancing immunogenicity by prime boost |
| US20100086522A1 (en) | 2006-07-18 | 2010-04-08 | Ottawa Health Research Institute | Disparate suicide carrier cells for tumor targeting of promiscuous oncolytic viruses |
| WO2008011726A1 (en) | 2006-07-27 | 2008-01-31 | Ottawa Health Research Institute | Staged immune-response modulation in oncolytic therapy |
-
2010
- 2010-03-16 US US13/257,115 patent/US9707285B2/en active Active
- 2010-03-16 WO PCT/CA2010/000379 patent/WO2010105347A1/en active Application Filing
- 2010-03-16 EP EP10753031.3A patent/EP2408473B1/en active Active
- 2010-03-16 CA CA2755790A patent/CA2755790A1/en active Pending
- 2010-03-16 ES ES10753031.3T patent/ES2576036T3/es active Active
- 2010-03-16 CN CN201080022270.2A patent/CN102448487B/zh active Active
-
2017
- 2017-06-22 US US15/630,454 patent/US10925946B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2408473A4 (en) | 2013-02-13 |
| EP2408473A1 (en) | 2012-01-25 |
| CA2755790A1 (en) | 2010-09-23 |
| US20170348404A1 (en) | 2017-12-07 |
| CN102448487B (zh) | 2016-03-16 |
| CN102448487A (zh) | 2012-05-09 |
| EP2408473B1 (en) | 2016-03-16 |
| US10925946B2 (en) | 2021-02-23 |
| US20120014990A1 (en) | 2012-01-19 |
| WO2010105347A1 (en) | 2010-09-23 |
| US9707285B2 (en) | 2017-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2576036T3 (es) | Métodos de vacunación | |
| JP6688535B2 (ja) | ワクチン組成物 | |
| JP5642556B2 (ja) | 複製欠損アレナウイルスベクター | |
| ES2618309T3 (es) | Partículas de replicón de alfavirus multi-antigénico y métodos | |
| CA3003557A1 (en) | Vaccines against hepatitis b virus | |
| WO2014063601A1 (zh) | 诱导肿瘤特异性免疫的疫苗及其应用 | |
| ES2387141T3 (es) | Composición que comprende la proliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5B del VHC, vectores de expresión que incluyen las secuencias nucleicas correspondientes y su utilización terapéutica | |
| Erkes et al. | Intratumoral infection with murine cytomegalovirus synergizes with PD-L1 blockade to clear melanoma lesions and induce long-term immunity | |
| US11351237B2 (en) | CMV-based intra-tumoral cancer therapies | |
| Bonilla et al. | Heterologous arenavirus vector prime-boost overrules self-tolerance for efficient tumor-specific CD8 T cell attack | |
| BR112021009929B1 (pt) | Adenovírus recombinante, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e seus usos para tratamento de câncer | |
| WO2005037321A1 (ja) | 癌遺伝子治療薬 | |
| ES2463966T3 (es) | Uso médico de vectores de vacuna de adenovirus | |
| JP7454320B2 (ja) | アジュバントとしての腫瘍溶解性ウイルス | |
| Jadav et al. | Improved immune response by ID-pVAC: a secretory DNA vaccine construct delivered by PLG micro particles against foot and mouth disease in guinea pigs | |
| Wang | Prime and boost vaccination against HER2/neu in breast cancer | |
| Bonilla et al. | Heterologous arenavirus vector prime-boost overrules self-tolerance for efficient tumor-specific CD8 T cell attack | |
| Hartman et al. | Utility of Adenovirus-Based Vectors for Multiple Cancer Vaccine Approaches |