WO2005037321A1 - 癌遺伝子治療薬 - Google Patents

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WO2005037321A1
WO2005037321A1 PCT/JP2004/015220 JP2004015220W WO2005037321A1 WO 2005037321 A1 WO2005037321 A1 WO 2005037321A1 JP 2004015220 W JP2004015220 W JP 2004015220W WO 2005037321 A1 WO2005037321 A1 WO 2005037321A1
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virus
cell
carrier
adenovirus
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PCT/JP2004/015220
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Akinobu Goto
Katsuyuki Hamada
Toshiro Shirakawa
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The New Industry Research Organization
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Definitions

  • the present invention relates to a cancer gene therapy drug and a cancer gene therapy method using the same.
  • Cancer cell therapy with oncolytic virus HSV-1 as a carrier cell Even when PA-1 is used, no significant antitumor effect is obtained compared to the oncolytic virus HSV-1 monotherapy.
  • the problem with cancer gene therapy with viruses is that they cannot be administered frequently due to neutralizing antibodies in the blood.
  • PA-1 When PA-1 is used, the cells are fragile and the amount of virus produced is small, so that cell-to-cell interaction can cause the cells to break down before infecting the target tumor cell, and directly It is conceivable that the virus is inactivated by the neutralizing antibody and the antitumor effect cannot be obtained!
  • Non-Patent Document 1 Human Gene Therapy, 6, 927-939, 1995
  • Non-Patent Document 2 Human Gene Therapy, 9, 2641-2649, 1998
  • Non-Patent Document 3 Science, 256, 1550-1552, 1992
  • Non-Patent Document 4 Clinical Cancer Research, 5, 1523-1537, 1999
  • Patent Document 1 Pamphlet of International Publication No. 99Z45783
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 01Z23004
  • the present invention has been made to solve such a conventional problem, and its object is to provide a new antitumor effect in cancer gene therapy using an oncolytic virus. Find carrier cells, establish new cancer gene therapies that can provide dramatic antitumor effects using the obtained carrier cells, etc., and develop new cancer gene therapies for the treatment To provide.
  • the present inventor has (1) the use of a specific cell line as a carrier cell, resulting in a strong antitumor effect compared to conventional carrier cells.
  • CTL reaction in the body is induced by administering carrier cells infected with oncolytic virus.
  • the cancer gene therapy drug of the present invention (in other words, a drug kit for cancer therapy)
  • the immunizing virus and oncolytic virus of the present invention are preferably a lentivirus such as adenowinoles, herpes virus, HIV virus, retrovirus, reovirus, vesicular stomatitis virus (VSV), or other Selected from oncolytic viruses.
  • adenovirus such as adenowinoles, herpes virus, HIV virus, retrovirus, reovirus, vesicular stomatitis virus (VSV), or other Selected from oncolytic viruses.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • the oncolytic virus of the present invention has a 1A1.3B promoter (IAL 3B promoter), a midkine promoter, a 13-HCG promoter, a SCCA1 promoter, depending on the type of cancer to be treated. cox-2 promoter, PSA promoter, or other tumor-specific promoter.
  • the oncolytic virus is not particularly limited as long as it can infect and proliferate target tumor cells.
  • the category includes wild-type adenovirus.
  • oncolytic viruses do not have tumor-specific promoters, such as ONYX's E1B gene-deleted oncolytic adenovirus or UAB University's partially deleted E1A gene Ad5-A24 adenovirus. , Even things.
  • the virus for immunization of the present invention preferably uses a non-proliferative type and a virus inactivated with Z or ultraviolet rays. By inactivating with ultraviolet rays, etc., the ability to administer the virus for immunization can shorten the period until the carrier cell administration.
  • the carrier cells of the present invention are preferably selected from A549 cells, 293 cells, SW626 cells, HT-3 cells (HT-III cells), or other human-derived cancer cells or normal cell forces. Commercial cell lines such as Crucell's PER. C6 cells may be used. .
  • the above-mentioned A549 cells, 293 cells, SW626 cells, and HT-3 cells have obtained favorable results as described below, and are more preferable as carrier cells. Is particularly preferred.
  • the oncogene therapy drug (cancer therapeutic drug kit) of the present invention is a combination of a virus for immunization and a carrier cell, or a combination of three with an oncolytic virus. Further, the following (1) one (4) substance may be provided with one or more substances.
  • GM—CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • Porphyrin compounds for example, 5-aminolevulinic acid (ALA)
  • ALA 5-aminolevulinic acid
  • a virus for immunization is administered to a human in order to induce a CTL response of a living body to carrier cell administration, and after a predetermined period of time, an oncolytic virus is infected, It is characterized by administering at least one carrier cell to act on tumor cells to humans.
  • the period from administration of the virus for immunization to administration of the carrier cell is about 2 weeks or more and 13 weeks or less (more preferably 3 weeks or more and 4 weeks or less). ).
  • the dose of the virus for immunization is about 10 5 virus particles or more and 10 11 virus particles or less for patients who are antibody-negative to the virus, while patients who are antibody-positive for the virus. Is approximately 10 2 virus particles or more and 10 7 virus particles or less.
  • the dose of oncolytic virus by a carrier cell is approximately 10 9 virus particles or more and 10 14 virus particles or less.
  • the amount of oncolytic virus infecting one rear cell is approximately 0.1 viral particle / cell (hereinafter referred to as “vp / cell”) or more and 2000 vp / cell or less (more preferably, 5 vp / cell or more). 500 vp / cell or less).
  • Carrier cells are administered by intratumoral administration.
  • iron agent and Z or vorfilin compound for example, 5-aminolevulinic acid (ALA) are administered.
  • ALA 5-aminolevulinic acid
  • Tumor cells are administered for tumor immunity with or before or after administration of the virus for immunization.
  • the cancer gene therapy drug of the present invention is a combination of two kinds of drugs, ie, a virus for immunization that is administered in advance and a carrier cell that is administered thereafter, and is administered in advance with a virus such as adenovirus.
  • a virus for immunization that is administered in advance
  • a carrier cell that is administered thereafter
  • a virus such as adenovirus.
  • the virus After immunization by administering carrier cells infected with an oncolytic virus, the virus infects the target tumor cells and has a direct anti-tumor effect.
  • a CTL response is induced and a dramatic antitumor effect can be obtained in vivo.
  • the carrier cells have a stronger antitumor effect than conventional carrier cells. Can be obtained.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of examining the growth inhibitory effect on ovarian cancer cell HEY by the number of cells at IC50 when various cell lines are used as carrier cells.
  • FIG. 2 Anti-adenovirus activity against IC50 in the growth inhibition of ovarian cancer cell HEY in the presence of virus antibody in the presence of oncolytic virus alone and in the case of using carrier cells It is a graph which shows the result investigated by the antibody titer of a virus antibody.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of examining the antiproliferative effect on ovarian cancer cell HEY in the presence of viral antibodies, using the antibody titer of anti-adenovirus antibody in IC50, for 293 cells infected with oncolytic adenovirus.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of examining the growth inhibitory effect of 293 cell, A549 cell, SW626 cell, and HT-3 cell on the proliferation of ovarian cancer cells HEY in the presence of viral antibodies.
  • FIG. 7 shows the results of studying the in vivo antitumor effect of the cancer gene therapy drug of the present invention using a subcutaneous tumor model mouse ((C57BL / 6 X C3 / He) Fl mouse) with normal immune function. Show in graph.
  • FIG. 8 A microscopic observation of cell fusion of A549 cells by adenovirus administration.
  • FIG. 9 A diagram showing a microscope of A549 cells, which was a control and did not receive adenovirus.
  • FIG. 10 shows the results of RT PCR on the expression of mitodocaine (MK) mRNA in 11 21 human surgical specimens.
  • MK mitodocaine
  • B shows four cells of malignant dariomas by the same method.
  • c shows the result of examining the expression of mitdocaine in each of the above cell lines by Western plot analysis.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of comparison of promoter activity in the above cell lines using two midkine promoters having different lengths.
  • FIG. 12 shows the oncolytic adeno with the Middokine promoter designed this time.
  • B shows the results of examining the expression of E1A protein in each cell line by Western plot analysis after infecting each of the above cell lines with three adenoviruses. is there.
  • FIG. 13 shows the results of a comparative study of the effects of three types of adenoviruses on the suppression of cancer cell growth, and (b) shows the results of an examination of the effects of adenoviruses on the growth inhibition effects of the E3 region. (C) shows the results of examining the antitumor effect of adenovirus in a nude mouse subcutaneous transplantation model with a diameter of 5 mm.
  • FIG. 14 shows the results of comparing the anti-tumor effect of a carrier cell infected with an oncolytic virus having a mitdocaine promoter to a giant tumor with a diameter of 10-15 mm compared to the virus alone administration. It is a graph.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of examining the effect of Fe on the growth inhibitory effect of adenovirus AdE3-lA1.3B on ovarian cancer cell PA 1;
  • FIG. 16 is a graph showing the results of examining the influence of ALA on the growth inhibitory effect of adenovirus AdE3-lA1.3B on ovarian cancer cell PA 1;
  • FIG. 17 is a graph showing the results of examining the effects of adenovirus AdE3-lA1.3B in the presence of both Fe and ALA on the growth inhibitory effect on ovarian cancer cell PA 1;
  • FIG. 18 (a) shows that the cancer gene therapeutic drug of the present invention (the virus for immunization treatment is treated with UV) using a subcutaneous tumor model mouse ((C57BL / 6 X C3 / He) Fl mouse) with normal immune function. (B) is a graph showing the results of long-term observation of the survival rate of each mouse subjected to this experiment.
  • FIG. 19 Immunization virus administration ability Results of examination of the administration interval until carrier cell administration.
  • A is the result of observing the tumor volume of each mouse, and
  • B is the result of each group. It is the result of observing the survival rate of us.
  • FIG. 20 A graph showing the results of a study on the ability to shorten the above-mentioned administration interval by using adenovirus UV-Ad- ⁇ gal treated with UV inactivated virus as a virus for immunization (Sano Ival 'curve).
  • FIG. 21 is a graph (tumor growth curve) showing the results of studies on the dose of the virus when UV-Ad- ⁇ gal is used as a virus for immunization.
  • FIG. 22 shows the results of examining the effects of tumor immunity.
  • A is the result of observing the tumor volume of each mouse
  • (b) is the result of observing the survival rate of each group of mice.
  • SCC7 and OVHM of the control were transplanted subcutaneously with 1 ⁇ 10 6 OVHM of flat epithelial cancer cells SCC7 or ovarian cancer cells without tumor immunization, and AdE3-lA1.3B infected carrier cells A549 It is the result of the mouse
  • FIG. 23 is a graph (survival curve) showing the results of examining the effect of tumor immunity using non-small cell lung cancer cells A549 cells.
  • the control “OVHM” is a result of a mouse in which 1 ⁇ 10 6 ovarian cancer cells OVHM were subcutaneously transplanted and AdE3-lA1.3B-infected carrier cell A549 was administered without tumor immunization.
  • AdE3-IAI.3B-infected A549 ⁇ 0VHMJ is immunized subcutaneously with 10 6 A549 cells infected with AdE3-1A1.3B and irradiated, and 1 X 10 6 ovarian cancer cells subcutaneously It is the result of the mouse
  • FIG. 24 is a graph showing the results of examining whether mortality due to side effects is improved when atelocollagen is administered together with carrier cells.
  • N in the force bar indicates the number of mice.
  • FIG. 25 Results of inactivation treatment with UV! /, NA! /, Adenovirus Ad— ⁇ gal administered 1 to 3 times, and antitumor effect in the presence of anti-adenovirus antibody, a) is the result of observing the tumor volume of each mouse, and (b) is the result of observing the survival rate of each group of mice.
  • adenovirus AdE3-lAl. 3B Not only adenovirus AdE3-lAl. 3B but also GM-CSF expression vector Is the result of examining the in vivo anti-tumor effect when administered the carrier cells (A549 cells) and the administration of atelocollagen with the carrier cells, (a) observed the tumor volume of each mouse Results (b) are the results of observing the survival rate of each group of mice.
  • “X 1”, “X 2” and “X 3” before “Ad- ⁇ -galj” indicate that adenovirus A d—j8—gal was administered once, twice and three times, respectively. .
  • FIG. 28 The results of examining the in vivo antitumor effect when iron was administered intraperitoneally at the time of carrier cell administration.
  • (A) is the result of observing the tumor volume of each mouse
  • (b) is It is the result of observing the survival rate of each group of mice.
  • 8- ⁇ & 1” indicate that adenovirus Ad-18-gal was administered once, twice or three times, respectively.
  • FIG. 29 is a graph showing the results of studies using nude mice on the dose irradiated in the radiation treatment performed on carrier cells A549.
  • FIG. 30 is a graph showing the results of examining the antitumor effect when carrier cells A549 were treated with radiation at different doses in an experiment in which OVHM was subcutaneously implanted in (C57BL / 6 X C3 / He) Fl mice.
  • FIG. 31 is a graph showing the results of examining the amount of oncolytic virus infecting carrier cells A549.
  • FIG. 32 Results of examination of tumor immunity by ovarian cancer cells OVHM, (a) is the result of observing the tumor volume of each mouse, (b) is the result of observing the survival rate of each group of mice It is.
  • ⁇ A549 '' is a mouse given AdE3-lA1.3B-infected carrier cell A549 three times without tumor immunity
  • ⁇ OVHM-RT ⁇ A549 '' is a tumor immunized with OVHM after irradiation with AdE3-1A1.3B
  • the number of mice that received 3 doses of infected carrier cells A549, n 5 in each group.
  • the carrier cell used for the cancer gene therapeutic agent of this invention is demonstrated.
  • One carrier cell can be selected, for example, from the following (1) and (4) cell forces.
  • FIG. 1 shows the results of the inventor's selection of carrier cells in order to find effective carrier cells for use in cancer gene therapy drugs. More specifically, FIG. 1 shows oncolytic in various candidate cell lines. 6 is a graph showing the results of preparing cancer gene therapy drugs infected with viruses and investigating their cancer cell growth inhibitory effects.
  • Adenovirus AdE3-1—1A1.3 ( ⁇ . 3 ⁇ ) was used as the oncolytic virus.
  • This adenovirus AdE3-lAl.3B has an E1A gene and an E3 gene, and an adenovirus having an ovarian cancer-specific lAi.3B promoter (IAL 3B promoter) upstream of the E1A gene as a tumor-specific promoter. It is a virus.
  • adenovirus Ad E3-LAL. 3B were infected 2 days at 500 Vp / C ell for various candidate cell lines, each cell was added to the culture day 2 of ovarian cancer cells HEY, the day 5 culture The growth inhibitory effect of cancer cells HEY was examined.
  • the vertical axis of the graph in FIG. 1 indicates the number of cells that can obtain 50% growth inhibitory effect (IC50) for various candidate cell lines. The smaller the number of cells, the higher the growth inhibitory effect of the cell line. .
  • the cancer cell lines investigated in this study showed a high growth inhibitory effect in the order of 293 cells, A549 cells, SW626 cells, and HT-3 cells (HT-III cells). 293 cells, A549 cells and SW626 cells showed a growth inhibition effect about 100 times higher than that of PA-1 cells, which were conventionally used as carrier cells. HT-3 cells also showed the same high growth inhibitory effect as SW626 cells.
  • cancer gene therapeutic agents were prepared by infecting the above-mentioned 293 cells, A549 cells, SW626 cells and HT-3 cells with oncolytic adenovirus, and each therapeutic agent was contained in a sufficient amount of anti-adenovirus.
  • Ab (+) Japanese antibody
  • the cancer gene therapy drug using the above four types of cells as a carrier cell showed a strong difference and showed a cancer cell proliferation inhibitory effect.
  • cancer gene therapy with viruses had the difficulty of being unable to administer frequently due to antibody production.
  • carrier cells are either A549 cells, 293 cells, SW626 cells, or HT-3 cells! By doing so, an antitumor effect can be obtained.
  • A549 cells are non-small cell lung cancer cell lines.
  • Giard, D.J., Aaronson.S.A., Todaro.G.J. the paper Giard, D.J., Aaronson.S.A., Todaro.G.J.
  • 293 cells are human embryonic kidney-derived cells, and are a cell line that is frequently used in test studies as adenovirus-producing cells. 293 cells are described in, for example, the paper Xie QW, et al. Complementation analysis of mutants of nitric oxide synthase reveals that the active site requires two hemes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4891-4896, 1996. is there.
  • SW62 6 cells are a colon cancer ovarian metastasis strain.
  • HT-3 cells are squamous cell carcinoma cells of the eclampsia and the details thereof are described in, for example, the paper Fogh J, et al.
  • A549 cells (1) produce high-titer oncolytic adenovirus and can be handled with very tough cells. (2) Cancer cells proliferate in the presence of anti-adenovirus antibodies. (3) When infected with a virus such as adenovirus, A549 cells are type II alveolar epithelial cells that release secretory granules, and this property is beneficial for cancer treatment. (4) Even after infection with adenovirus, A549 cells have many advantages when used as carrier cells, such as being less susceptible to CTL killing. Therefore, among the above four types of cells, the use of A549 cells is particularly preferable.
  • a plurality of types of cells may be used in combination as carrier cells.
  • a powerful cancer therapeutic effect was confirmed by using A549 cells and 293 cells in combination with carrier cells.
  • the characteristics of each cell are confirmed by using A549 cells and 293 cells in combination with carrier cells.
  • SW626 cells require a relatively long time to adhere, so when administered intraperitoneally, they diffuse not only locally but also to the entire periphery, and are considered suitable for intraperitoneal treatments such as ovarian cancer.
  • SW626 cells have the characteristic that the peak of virus production is relatively longer than that of A549 cells and 293 cells, and the action time is relatively long.
  • the above four types of cells that is, A549 cells, 293 cells, SW626 cells, and HT-3 cells
  • the cells that can be used as carrier cells are not limited to the above four types of cells, such as PA-1 cells (especially when herpes virus is used as an oncolytic virus), Fibroblasts, other human-derived cancer cells or normal cells, patient-derived cancer cells, and the like may be used as carrier cells.
  • a viral vector conventionally used for gene transfer can be used as the oncolytic virus that infects the carrier cells, and adenovirus, adeno-associated virus, simple herpes.
  • Virus type 1 HSV-1
  • HSV-2 herpes simplex virus type 2
  • lentivirus such as HIV virus (AIDS virus)
  • retrovirus such as murine leukemia virus, reovirus, vesicular stomatitis (Vsv) is exemplified, and other oncolytic viruses may be used.
  • An oncolytic virus is a proliferative virus vector that has a cell lysis effect that modifies the viral gene to specifically propagate in the target tumor cell or tumor tissue and melts and kills the target cell.
  • a proliferative virus vector that has a cell lysis effect that modifies the viral gene to specifically propagate in the target tumor cell or tumor tissue and melts and kills the target cell.
  • any one having an E 1 A or E 1 B region necessary for its growth may be used.
  • the cancer gene therapy drug of the present invention can be applied to almost all malignant tumors, and the types of cancer to be treated are ovarian cancer, squamous cell carcinoma (cervical cancer, skin cancer, head and neck cancer). Part cancer, esophageal cancer, lung cancer, etc.), digestive organ cancer (colon cancer, knee cancer, liver cancer, stomach cancer, etc.), neuroblastoma, brain tumor, breast cancer, testicular cancer, prostate cancer and the like. Further, by using a virus capable of infecting blood cells such as adenovirus type 34 and 35, the cancer gene therapy drug of the present invention can be applied to hematological malignancies.
  • a virus capable of infecting blood cells such as adenovirus type 34 and 35
  • the type of tumor-specific promoter introduced into the oncolytic virus may be selected.
  • the 1A1.3B promoter for ovarian cancer the middocaine promoter for brain tumors, malignant dariomas, the j8-HCG promoter for testicular cancer, and SCCA1 for squamous cell carcinoma Promoter and SCCA2 promoter, CEA promoter for colon cancer, PSA promoter for prostate cancer, and AFP promoter for liver cancer can be used.
  • other known tumor-specific promoters such as the cox-2 promoter, which exhibits promoter activity against various malignant tumors and has a broad spectrum of action, and other cancer-specific promoters such as the osteocalcin promoter, etc. You can use sex promoters.
  • the mitdocaine promoter can be used for various tumors such as brain tumors and malignant dariomas. In this respect, it has a broad spectrum of action like the cox-2 promoter.
  • each promoter sequence used is not particularly limited as long as tumor-specific promoter activity is obtained.
  • the 1A1.3B promoter can be designed and prepared as described in WO 03/025190 and the literature Cancer Research 63, 2506-2512, 2003 and inserted into the viral genome.
  • the above Midokine promoter, jS-HCG promoter, SCCA1 promoter Each of the data can be designed and prepared as described in International Publication No. 02Z10368, International Publication No. 01 Z90344, International Publication No. 00Z60068, and inserted into the viral genome.
  • SCCA1 promoter is described in the paper Biochimica et Biophysica Acta 91522 (2001) 1-8, Molecular cloning of human squamous cell carcinoma antigen 1 gene and characterization of its promoter, Katsuyuki Hamada, Hiroto Shinomiya, Yoshihiro Asano, Toshimasa Kihana, Detailed explanations are also given in Mari Iwamoto, Yasushi Hanakawa, Koji Hashimoto, Susumu Hirose, Satoru Kyo, Masaharu Ito.
  • a tumor-specific promoter is inserted upstream of the early gene E1A or E1B, which is an essential gene for adenovirus growth, or the early gene E1A or E1B promoter is inserted.
  • E1A or E1B an essential gene for adenovirus growth
  • E1A or E1B promoter is inserted.
  • viruses other than adenovirus such as HSV-1, HSV-2, retrovirus, reovirus, vesicular stomatitis virus (VSV)
  • the tumor is also upstream of the genes required for virus growth. It can be constructed by inserting a specific promoter or replacing the promoter of the gene.
  • the oncolytic virus does not necessarily have to have a tumor-specific promoter as long as it has a property of specifically growing in a target tumor cell or tumor tissue.
  • ONYX's E1B gene-deleted oncolytic adenovirus, or UAB University's E1A gene partially-deleted Ad5-A24 adenovirus can also be used.
  • a wild-type adenovirus or a gene lacking a part of the gene may be used as an oncolytic virus.
  • the method of infecting the carrier cells with the oncortic virus is not particularly limited as long as it can be performed according to a conventional method.
  • the carrier cells are seeded on a dish, and all cells of the oncortic virus are spread on the dish. 95% 0, 5%
  • a method of culturing and infecting is simple.
  • A549 cells, SW6 26 cells, and HT-3 cells were cultured by this method and infected with oncolytic virus.
  • 293 cells were cultured under conditions of FCS (+) 10%, DMEM medium, and infected with oncolytic virus.
  • Fetal calf serum FCS is in the condition of FCS (—) for 3-6 hours of infection, and for 3-6 hours of FCS (—) for further infections, followed by FCS 10% It is good to squeeze.
  • the amount and time of infection of the oncolytic virus to the carrier cells are as follows: the size of the tumor to be treated 'type, the type of carrier cell', the amount of oncolytic virus used, the method of administration of the gene therapy drug
  • the optimal amount and time can be selected according to the situation.
  • the intraperitoneal administration is about 5 to 250 vp / cell for about 6 to 24 hours
  • the intratumoral administration is about 12 to 24 for about 5 to 500 vp / cell.
  • intratumoral administration for 293 cells Can be set at about 5-50 vp / cell for about 12-24 hours, and intraperitoneally about 0.1-lOvp / cell for about 6-24 hours.
  • the amount of infection varies depending on the type of carrier cell and the administration method, but in the above example, about 0.1 to 2000 vp / cell for about 6 to 24 hours when administered intraperitoneally.
  • the amount of infection and the time of infection can be set in the range of about 5 to 500 vp / cell and about 12 to 24 hours, respectively.
  • the carrier cell When a carrier cell is infected with an oncolytic virus to prepare a virus-infected carrier cell, the carrier cell may be stored in a state without being infected with the oncolytic virus until use.
  • the carrier cells can be stored, for example, in liquid nitrogen or at a temperature of about -150 ° C.
  • oncolytic viruses can be stored at a temperature of about 80 ° C, for example.
  • carrier cells are infected with oncolytic virus by the above-mentioned method, and the obtained virus-infected carrier cells are used as they are or together with conventional pharmaceutical preparation carriers in human (or mouse, rat, etc.) experiments. Animals). Later As described above, at the time of administration of carrier cells, it is preferable to administer one or more of atelocollagen, iron agent and porphyrin compound at the same time as the carrier cells. In addition, in order to increase the CTL response, it is preferable to infect carrier cells not only with oncolytic virus but also with GM-CSF expression vector, and in other words, to administer carrier cells that have been double-infected with viral vectors. .
  • the carrier cells are administered after the lapse of a predetermined period after administration of the virus for immunization described later.
  • irradiation is preferably performed before or after virus infection.
  • A549 cells, SW626 cells, and HT-3 cells are used as carrier cells, these cells are irradiated with 120-400 Gy, 20-40 Gy, and 20-40 Gy, respectively, before administration to nude mice. Irradiation was performed.
  • A5 As a result of examining the radiation dose to 49 cells, cell growth was not observed if it was 120 Gy or more (Fig. 29), so the dose was 120 Gy or more and 600 Gy or less (more preferably 150 Gy or more and 400 Gy or less). Prefer to set to a degree.
  • the carrier cell is preferably administered as a parenteral agent, but may be used as an oral agent.
  • Administration as a parenteral agent may be either an in vivo method or an ex vivo method.
  • the dose in other words, the dose of virus-infected carrier cells
  • the carrier cells are preferably administered by the intratumoral injection method.
  • Such an injection is produced according to a conventional method, and generally a physiological saline, a cell culture solution, or the like can be used as a diluent. Furthermore, if necessary, bactericides, preservatives, stabilizers, isotonic agents, soothing agents and the like may be added.
  • the compounding amount of virus-infected carrier cells in these preparations is not particularly limited and can be arbitrarily set.
  • virus-infected carrier cells may be administered to the patient several times, or may be divided into multiple courses, and the number of administrations per course, the administration interval, etc. may be arbitrarily set. .
  • the dose of virus-infected carrier cells may be determined according to the size of the tumor, the type of symptoms, the age of the patient, the body weight, etc. Kiya Set the dose of one rear cell to approximately io 7 cells or more and io 1C) to the number of cells or less, and the single dose of oncolytic virus from the carrier cells to approximately 10 9 virus particles or more and 10 14 virus particles or less. be able to.
  • the type of carrier cell may be appropriately selected according to the type of cancer to be treated.
  • the carrier cells may be modified by gene recombination technology, and for example, specific proteins may be artificially expressed on the surface of the carrier cells so that they can easily bind to the target tumor cells. Treatment such as infection with a virus may also be performed.
  • Oncolytic virus is a cell-to-cell interatcion that infects carriers with a single cell force, target tumor cells, specifically grows in tumor cells, and melts and kills tumor cells. The effect can be exerted. Cancer gene therapy with viruses has been considered difficult because it cannot be administered frequently due to antibody production. However, when carrier cells are used, frequent infection occurs because the target tumor cells are directly infected by cell-cell interactions. Administration is possible, and a strong antitumor effect can be expected.
  • the cancer gene therapy drug of the present invention infects an oncolytic virus and an immunotherapy virus administered to induce a CTL response of a living body to carrier cell administration, and causes the virus to act on living body tumor cells.
  • a combination of two types of drugs that is, a virus for immunization that is administered in advance and a carrier cell that is administered thereafter, and is administered in advance with a virus such as adenovirus.
  • immunization pre-immunization
  • administration of carrier cells infected with oncolytic virus induces a CTL response in the body, which is a dramatic phenomenon in vivo. Antitumor effect can be obtained.
  • Non-proliferative viruses for immunization and non-proliferative viruses for which it is preferable to use Z or inactivated viruses are those that have been inactivated by further destroying DNA by UV irradiation, etc. Is more preferable.
  • adenovirus when used as a virus for immunization, it is preferable to use a virus in which the E1 region has been deleted or a DNA that has been inactivated by destroying DNA by irradiation with Z or ultraviolet rays.
  • the virus for immunization may be a virus obtained by inactivating a proliferative virus by ultraviolet irradiation or the like.
  • viruses for immunization the E1 region is deleted and a LacZ gene encoding 13-galactosidase ( ⁇ -gal) is incorporated under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • Adenovirus (Ad—18—gal) was used.
  • the virus for immunization is not limited to this, but it can be an inactivated viral adenovirus that has been inactivated by ultraviolet rays (UV). It is preferable to use non-proliferating adenoviruses with only polyA sequences (Ad-polyA) inactivated by UV irradiation.
  • the dose of the virus for immunization depends on the antibody titer against the patient's virus, the size of the tumor, the type of symptom, the patient's age, weight, etc.
  • the dose may be appropriately selected, but it is preferable to change the dose depending on whether the antibody against the virus is positive or negative. For example, if a type 5 adenovirus is used for an immunization virus or oncolytic virus, the antibody is negative for that adenovirus.
  • the dose of virus for immunization should be about 10 5 virus particles or more and 10 11 virus particles or less.
  • the dose should be approximately 10 2 virus particles or more and 10 7 virus particles or less.
  • the method for administering the virus for immunization is not particularly limited, but it is preferable to administer the virus by intradermal injection or subcutaneous injection.
  • each dose is approximately 1/1000 of the amount administered to humans taking into account the difference in body weight.
  • the dose of the drug should be set.
  • the ability to administer the virus for immunization can be set to approximately 2 weeks or more and 3 months or less, but is preferably as short as possible. In the examples described later, the above period can be shortened to about 3 weeks or more and 4 weeks or less by inactivating the immunizing virus (adenovirus) by ultraviolet irradiation.
  • the dose of oncolytic virus by carrier cells is about 10 9 virus particles to 10 14 virus particles, and oncolytic virus is administered to carrier cells.
  • Infectious dose can be set to approximately 0.1 Ivp / cell to 2000 vp / cell (more preferably 5 vp / cell to 500 vp / cell, more preferably 150 vp / cell to 400 vp / cell). .
  • tumor cells cancer cells
  • tumor immunity it is preferable to administer tumor cells (cancer cells) for tumor immunity with or before or after administration of the virus for immunization. That is, during or after the immunization with the virus for immunization, vaccination with tumor cells is performed (by administering tumor cells previously treated with radiation, ethanol, formalin, etc., immunity of the living body against tumor cells to be treated). Like to enhance the response).
  • tumor cells used for the above-described vaccine generally available tumor cells that are expected to present antigens similar to those desired from patient-derived tumor cells may be used.
  • tumor cells different from the tumor cells to be treated squamous cell carcinoma cell SCC7 and lung cancer cell A549 cells
  • the dose of tumor cells is not particularly limited. For example, it can be set to about 10 5 cells or more and 10 1 (> cells or less). Tumor cells are administered at a dose of 120 Gy or more and 600 Gy or less (more preferably 2 OOGy or more and 500 Gy or less). Administration is preferred.
  • an iron agent and administration of Z or Borfilin compound may be performed.
  • the vorphiline compound include 5-aminolevulinic acid (ALA), hematoponorphyrin, photofrin, and the like.
  • iron agents include ferrous sulfate (FeSO) and ferrous taenoate as oral agents, chondroitin iron sulfate and sugar-containing iron oxide as intravenous iron agents
  • the administration method is not particularly limited, but it is preferably administered as an injection or an oral preparation together with the cancer gene therapeutic agent of the present invention.
  • iron agent Fe
  • Z or 5-aminolevulinic acid ALA
  • telocollagen which is made water-soluble by reducing the molecular weight by cleaving only the telopeptide bond of collagen by pepsin treatment, etc.
  • the mortality due to side effects was drastically reduced (FIG. 24). This is thought to be due to the fact that oncolytic adenovirus spread was inhibited by atelocollagen and that a block against anti-adenovirus antibody was generated.
  • atelocollagen a commercially available product (for example, a product of Koken Co., Ltd.) may be used, or a product produced by pepsin treatment of collagen may be used.
  • Atelocollagen is considered to be sufficiently effective at a concentration of about 0.01-3. 0% (wZv) in the drug solution, which is preferably administered together with carrier cells in an injection solution.
  • carrier cells are infected not only with oncolytic viruses but also with GM-CSF expression vectors, so to speak, carrier cells that have been double-infected with viral vectors.
  • Administration is preferred. (Alternatively, it may be a method of simultaneously administering carrier cells each infected with both vectors.)
  • the GM-CSF expression vector is preferably a virus vector of the same type as the oncolytic virus.
  • GM- CSF the expression vector, E1 region are deleted, GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor: granulocyte-macrophage ⁇ Nkoroni 1 ⁇ stimulation
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor: granulocyte-macrophage ⁇ Nkoroni 1 ⁇ stimulation
  • Adenoviruses incorporating the GM-CSF gene encoding factor can be used.
  • the total infection amount of both oncolytic virus and GM-CSF expression vector should be about 5 virus particles Z cells or more and 2000 virus particles Z cells or less.
  • GM-CSF expression vector instead of using a GM-CSF expression vector, a method of mixing GM-CSF protein with an injection solution together with carrier cells or systemically administering intravenously is also conceivable.
  • the method of using the cancer gene therapeutic agent of the present invention is not limited to the method described above, and various examples of use can be considered.
  • the cancer gene therapy drug of the present invention may be used in combination with other stake cancer drugs or radiation.
  • cancer gene therapy drug of the present invention are divided into (1) a patient who is negative for an antibody against the virus for immunization and (2) a patient who is positive for the antibody.
  • a patient who is negative for an antibody against the virus for immunization is divided into (1) a patient who is negative for an antibody against the virus for immunization and (2) a patient who is positive for the antibody.
  • the above-mentioned non-proliferative adenovirus is inactivated by irradiation with ultraviolet rays as the immunizing virus.
  • the dose should be about 10 5 vp to ⁇ ⁇ ⁇ .
  • approximately 10 5 to 10 1 (> cells) of tumor cells (cancer cells) derived from a patient treated with about 200 Gy for tumor immunity are administered.
  • the virus and tumor cells are administered intradermally or subcutaneously.
  • the carrier cells are administered by intratumoral injection.
  • the dose of carrier cells is, for example, 1 X 10 7-1 X 10 1 (> approximately.
  • A549 cells are used as carrier cells, and after 150 Gy force is irradiated with 4 OOGy, Adenovirus is used as an oncolytic virus and GM-CSF expression vector, and carrier cells are infected with about 250 vp / cell and about 5-20 vp / cell, respectively.
  • the cancer gene therapeutic of the present invention is administered in the same manner as (1) except that the dose of the virus for immunization is about 10 5 vp or less. do it
  • cancer gene therapy drug of the present invention include (1) a combination of an immunization virus and a carrier cell, (2) a combination of an oncolytic virus that infects a carrier cell, (3) The combination of (1) or (2) above, further combined with atelocollagen, (4) The combination of (1) one (3) above, further combined with a GM-CSF expression vector (5) A combination of (1) and (4) above, and a combination of an iron agent and Z or Borfilin compound for increasing virus production, (6) (1) above (5) The combination is further combined with tumor cells to be administered for tumor immunity, (7) Compound required for storage, infection'culture, preparation of pharmaceutical preparations, etc. in the combination of (1) above (6) above (Reagents, buffers, enzymes, etc.), Others a combination container (for reaction, infection 'for culture, storage, etc.), etc., can be exemplified.
  • Example 1 Compound required for storage, infection'culture, preparation of pharmaceutical preparations, etc. in the combination of (1) above (6) above (Reagents, buffers, enzyme
  • Example 1 Selection of carrier cells and antitumor effect in the presence of antibody
  • Adenovirus AdE3-l Al. 3 ⁇ ( ⁇ . 3 ⁇ ) was used as an oncolytic virus that infects carrier cells.
  • This adenovirus AdE3-lAl. 3B has an E1A gene and an E3 gene, and an adenovirus having an ovarian cancer-specific 1A1.3B promoter (IAL 3B promoter) upstream of the E1A gene as a tumor-specific promoter. Illus.
  • the carrier cells were added to the ovarian cancer cell line HE Y on the second day of culture, and on the fifth day of culture. The in vitro growth inhibitory effect of the cell line HEY was investigated.
  • the experimental results are shown in FIG.
  • the vertical axis of the graph shows the number of cells with 50% growth inhibitory effect (IC50) for each cell line, and the cell line with fewer cells has a higher growth inhibitory effect.
  • the cancer cell lines investigated this time showed high antitumor effects in the order of 293 cells, A549 cells, SW626 cells, and HT-3 (HT-III cells).
  • 293 cells, A549 cells, and SW626 cells exhibited a growth-suppressing effect about 100 times higher than that of PA-1 cells that were conventionally used as carrier cells.
  • HT-3 cells also showed the same high growth inhibitory effect as SW626 cells.
  • Ad E3-1A1.3B was administered to 12 wel plates in the presence of anti-adenovirus antibody at 1 uel lOOOOvp / cell.
  • the growth inhibitory effect of cancer cells was examined on the fifth day of culture.
  • the experimental results are shown in FIG.
  • the vertical axis of the graph shows 50% growth inhibitory effect (IC50)
  • IC50 growth inhibitory effect
  • the dilution of anti-adenovirus antibody when is obtained is shown.
  • IC50 growth inhibitory effect
  • a 50% growth-inhibiting effect can be obtained even with a dilution of about 5 times (120 times antibody titer), and with an adenovirus alone, a dilution of about 600 times (1 time of antibody). 50% of growth inhibition effect was obtained.
  • carrier cells were used, the growth inhibitory effect was exhibited even under conditions with a high antibody titer.
  • the growth inhibitory effect on HEY cells was determined by (1) supernatant and cell components of adenovirus-infected 293 cells (AdE3-lA13B 293 cell + SUPT), (2) adenovirus Supernatant (AdE3-lA13B, SUPT) containing (3) Adenovirus-treated cell supernatant treated with 0.2 m filter (AdE3-1A13B, SUPT, filter), (4) Adenovirus alone (AdE3-lA13B) was examined for each case.
  • Figure 3 shows the results.
  • the vertical axis of the graph shows the dilution of anti-adenovirus antibody when a 50% growth inhibitory effect (IC50) is obtained. As shown in the figure, when carrier cells (293 cells) were used, a stronger antitumor effect was obtained compared to other cases.
  • the results are shown in Fig. 4.
  • the vertical axis of the graph represents the number of cancer cells on day 5 of culture.
  • A549 cells showed the strongest growth inhibitory effect when used as carrier cells.
  • Cancer gene therapy using viruses has been considered difficult due to the production of neutralizing antibodies against the virus.
  • the use of carrier cells directly infects target cancer cells through cell-cell interactions. As a result of this, frequent administration is possible. Furthermore, a strong antitumor effect can be obtained by using the above four types of cells as carrier cells.
  • Example 2 In vivo antitumor effect in nude mouse subcutaneous tumor model
  • the in vivo antitumor effect of each carrier cell infected with the adenovirus AdE3-lAl. 3 B was examined using a nude mouse subcutaneous tumor model.
  • human ovarian cancer cell RMG-1 was transplanted subcutaneously into a 5-week-old nude mouse, and 4 weeks later, each carrier cell was injected 6 times into a tumor to a giant tumor having a diameter of about 10-15 mm. Changes in tumor volume were observed. The result is shown in the graph of FIG. In the graph, the black square “control” is the result of 6 injections of PBS buffer in the tumor.
  • the black circle “AdE3-lA1.3B” is the adenovirus AdE3-1A1.3B.
  • black triangles indicate adenovirus AdE3-1A1.
  • 3B SW626 cells infected with 250 vp / cell were administered to one mouse with IX 10 7 cells, and black diamonds indicate adenovirus AdE3-1A1.
  • the white squares indicate one mouse with A549 cells infected with adenovirus AdE3-1A1.3B at 50 vp / cell.
  • 1 X 10 7 doses As shown in the figure, when 293 cells and A549 cells were used as one carrier cell, a large tumor with a diameter of about 10-15 mm disappeared completely 50 days after administration. SW626 cells showed 98% growth inhibitory effect.
  • ovarian cancer cells OVHM were transplanted subcutaneously, and after 10 days, A549 cells after radiation treatment infected with 250 vp / cell of the adenovirus AdE3-lAl. 3B were used.
  • PBS relaxation as a control The antitumor effect was examined in each case when the impulse was administered 6 times in the tumor.
  • Oncolytic adenovirus is thought to exert a cell lysis action that infects carrier cell force target tumor cells through cell-cell interaction, specifically proliferates in tumor cells, and melts and kills tumor cells.
  • a strong CTL reaction in the body that eliminates target tumor cells infected with oncolytic adenovirus is induced by administering an adenovirus for immunization in advance. It is thought that complete spontaneous elimination of adenovirus-infected tumor cells is induced.
  • FIG. 8 shows the results of observing with a microscopic microscope after 10000 virus particles were administered per cell to adenovirus inactivated by UV irradiation to a well in which A549 cells were encapsulated. . As indicated by the arrows in the figure, cell fusion occurred by adenovirus administration, and multinucleated cells were scattered. Such changes were not observed in A549 cells that were not treated with adenovirus (see Figure 9).
  • carrier cells may be targeted to target cells.
  • Adenovirus infection to target tumor cells is thought to be established by cell adhesion, and a local adenovirus burst or carrier cell fragment containing adenovirus. Either way, in adenovirus-infected target tumor cells, adenoviruses with tumor-specific promoters increase and become strong immunogens (some are cancers of target tumor cells infected with adenoviruses). It is thought that tumor cells are eliminated by CTL reaction by secondary recognition of specific peptides.
  • Figure 10 (a) shows the results of RT-PCR studies on the expression of mitodocaine (MK) mRNA in 111 human surgical specimens. As shown, glioblastoma, anaplastic astrocytoma, malignant glioma, and diffuse astrocytoma mitodocaine mRNA. Overexpression was observed. Thus, mitodocaine is overexpressed in many cancers such as brain tumors.
  • FIG. 10 (b) shows the results of RT-PCR studies on the expression of midkine mRNA in four cell lines of malignant dariomas by the same method as described above. As shown in the figure, among the four cell lines, overexpression of midkine mRNA was observed in U251MG, LN319, and U373MG, which are not expressed in U87MG.
  • Fig. 10 (c) shows the results of examination of the mitodocaine protein in each of the above cell lines by Western blot analysis. Like mRNA, the expression of mitodocaine protein is not observed in U87MG, but in U251MG, LN319, and U373MG Overexpression was observed.
  • FIG. 12 (a) is a diagram schematically showing the structure of the oncolytic (cell-thawing type) adenovirus having the mitodocaine promoter designed this time.
  • a midkine promoter with a length of 600 or 2300 bases was introduced at position 552 bp.
  • FIG. 12 (b) shows the results of examining the expression of E1A protein in each cell line by Western plot analysis after infecting each of the above-mentioned cell lines with three types of adenoviruses.
  • adenovirus AdMK600
  • AdMK600 an adenovirus
  • U373MG U373MG that express mitdocaine.
  • AdWild wild-type adenovirus
  • FIG. 13 (a) shows the results of a comparative examination of the cancer cell proliferation inhibitory effects of the three types of adenoviruses.
  • Wild-type adenovirus (AdWild) is strong in all cells! Strongly suppresses growth.
  • Adenoviruses with the mitocaine promoter (AdMK600 and AdMK2300) express mitodocaine U251MG, Only LN319 and U373MG showed growth-inhibitory effects, and these values correlated well with the expression level of mitdocaine mRNA and the activity of the probe motor.
  • AdMK600 showed stronger growth-inhibitory effect than AdMK2300, an adenovirus with a 2300-base mitocaine promoter.
  • Figure 13 (b) shows the results of examining the effect of adenovirus on the growth-inhibiting effect of the E3 region.
  • AdMK600 with the E3 region has no adenovirus ( It was about 10 times stronger than AdMK600- ⁇ E3) and showed a growth inhibitory effect.
  • Figure 13 (c) shows the results of examining the antitumor effect of adenovirus in a nude mouse subcutaneous transplantation model with a tumor diameter of about 5-10 mm.
  • the black diamonds indicate the result of administration of the wild-type adenovirus AdWild
  • the black squares indicate the result of administration of the adenovirus AdMK600 with the midkine promoter
  • the black triangles indicate the adenovirus Ad- with the LacZ gene inserted.
  • black circles indicate the results of administration of PBS buffer only.
  • wild-type adenovirus is not expressed in U87MG that does not express mitodocaine.
  • the adenovirus (Ad-MK600) having the above-mentioned midokine promoter was infected to a carrier cell, and the antitumor effect of the virus-infected carrier cell was compared with the case of administration of Ad-MK600 alone.
  • Ad-MK600 adenovirus having the above-mentioned midokine promoter
  • 293 cells and A549 cells were used as carrier cells.
  • Nude mice were transplanted with the above U373MG cells at 5 weeks of age, and after 10 weeks, a large tumor of 10-15 mm was obtained. Then, only virus-infected carrier cells or Ad-MK600 were administered, and 4 weeks later, the tumor volume increased. Compared. The results are shown in Fig. 14.
  • Ad-MK600 is the result of administering Ad-MK600 alone
  • 293 and A549 are the results of administering virus-infected carrier cells using 293 cells and A549 cells as carrier cells, respectively.
  • Ad-MK600 was administered alone there was almost no difference from the control.
  • the Mitodocaine promoter can be used for various types of malignant tumors in addition to malignant dariomas, and is considered to be effective for treating cancers other than malignant dariomas.
  • Example 5 Fe and ALA ovarian cancer cells on the growth inhibitory effect of adenovirus AdE3-1A1.3B HEY was seeded in a 12-well dish at 10000 / well, and the next day FeSO was 50 ⁇ g / ml.
  • cytotoxic adenovirus AdE3-1A1.3B was added. It was evaluated with. The results are shown in Fig. 15.
  • the vertical axis in the figure shows the relative viral dose (vp / cell) of IC50 in each case.
  • ALA 5-aminolevulinic acid
  • 5 ⁇ g / ml 5 ⁇ g / ml
  • 0.5 ⁇ g / ml 0 ⁇ g / ml ⁇ degrees
  • the growth inhibitory effect of adenovirus was evaluated by IC50.
  • the results are shown in Fig. 16.
  • the vertical axis shows the relative viral dose (vp / cell) of IC50 in each case.
  • the growth inhibitory effect was about 100 times that of adenovirus alone.
  • the growth suppression effect is approximately 1000 times that of adenovirus alone, FeSO 5 ⁇ g / ml, ALA 50 ⁇ g / ml And
  • the effect of inhibiting growth was approximately 700 times that of adenovirus alone, and FeSO 0.5 ⁇ g / ml, ALA 50 ⁇ g / ml, and adenovirus were used in combination.
  • the growth inhibition effect was about 200 times that of adenovirus alone.
  • ALA and Fe remarkably enhance the growth inhibitory effect of oncolytic adenovirus AdE3-1A1.3B.
  • the reason for this is that the adenovirus infectivity is enhanced by the j8-gal assay, and the increase in adenovirus production by the PFU assay has been clarified.
  • ALA and Fe increase the infectivity of adenovirus, It has been clarified that increasing the production amount, that is, increasing the infectivity of adenovirus in cancer cells and increasing the production amount in cells significantly enhances the antitumor effect.
  • ALA is a porphyrin metabolite that has been known to be taken up by cancer cells, and its metabolite protoporphyrin IX is likely to accumulate, which has a photosensitizing effect. In combination with excimer dye laser, it has been used for PDT treatment (photodynamic therapy) of superficial cancer.
  • the above protoporphyrin IX becomes heme by binding to Fe and forms heme protein such as cytcrome in the cell.
  • This heme protein is involved in the respiratory system in intracellular mitochondria and plays a role in ATP production and in protein synthesis.
  • heme protein is involved in protein synthesis for adenovirus production during adenovirus infection, it is considered that the increased metabolism of volphilin is likely to lead to increased adenovirus production. .
  • the therapeutic effect will be further enhanced by using these Fe and Z, or a Borfilin compound such as ALA together.
  • a Borfilin compound such as ALA together.
  • the combined use of Fe, Z, or ALA and other Borfilin compounds increases the direct anti-tumor effect and further increases the adenovirus production of target cells in the presence of antibody-suppressed infection. Due to the enhanced CTL response due to, the antitumor effect is enhanced in the syngenic mouse model, and the same good antitumor effect is also expected in humans.
  • a non-propagating adenovirus that does not have the E1 gene.
  • it is an adenovirus in which the LacZ gene is inserted downstream of the CMV promoter, which has been subjected to inactivation treatment with ultraviolet light or the like, and adenovirus Ad- ⁇ gal is used.
  • Gal was administered intradermally at 1 X 10 1G vp per mouse.
  • A549 cells which are one carrier cell, were irradiated with 200 Gy and then administered intratumorally 5 times 10 6 times per mouse for a total of 6 times.
  • FIGS. 18 (a) and 18 (b) The experimental results are shown in FIGS. 18 (a) and 18 (b).
  • “Ad- ⁇ -gal ⁇ Ad-A549j” is the result of the above experiment
  • “Ad-A549” is the result of administration of carrier cells only
  • 8-gal” is administration of the virus for immune treatment.
  • control is a result of administration of PBS buffer.
  • the graph of (a) is the result of observing the tumor volume of each mouse for a relatively short period of time
  • the graph of (b) is the result of observing the survival rate of each group of mice for a long period of time.
  • 8-gal ⁇ Ad-A549j showed a strong in vivo antitumor effect.
  • adenovirus administration power for immunization was examined for the administration interval up to the carrier cell administration.
  • This experiment is shown in Fig. 18, except that this administration interval was changed to various ones and that one adenovirus AdE3-lAl. 3B was infected with 50 vp / cell of A549 cells, one carrier cell. The same as the experiment was performed.
  • Figs. 19 (a) and 19 (b) The experimental results are shown in Figs. 19 (a) and 19 (b).
  • “2-4w”, “5-9w”, “10-15w” and “16-22w” indicate the above administration intervals for 2-4 weeks, 5-9 weeks, 10-15 weeks, 16-22, respectively.
  • the best antitumor effect was obtained when the administration interval was set to 10-15 weeks.
  • T cells were used approximately 10-15 weeks after the virus administration. The CTL reaction is considered to be superior to the suppression of infection by neutralizing antibodies.
  • the administration interval is preferably short. Therefore, it was investigated whether the administration interval could be shortened by using inactivated adenovirus Ad- ⁇ gal as a virus for immunization.
  • the administration interval was 4 weeks or Good antitumor when set to 3 weeks. It was proved that the tumor administration effect can be obtained, that is, by inactivating the immunization virus, the administration interval can be shortened to about 3 to 4 weeks.
  • Fig. 21 shows the results of examination of the dose of the virus when UV-Ad-18-gal is used as a virus for immunization.
  • the dose of UV-Ad-18-gal was changed from 1 X 10 6 vp to 1 X ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the above administration interval was set to 6 weeks, and the others were the same as the experiment shown in FIG.
  • the best antitumor effect was obtained when the dose of UV-Ad-iS-gal was IX 10 7 vp. (From this result, in the experiment shown in FIG. 20, the dose of UV-Ad-18-gal was set to 1 ⁇ 10 7 vp.)
  • Figures 22 (a) and 22 (b) show the results of examining the effect of tumor immunity.
  • the above-mentioned UV-Ad-18-gal was intradermally administered to each mouse at 1 ⁇ 10 7 vp, and 10 days later, 1 ⁇ 10 6 OVHM irradiated ovarian cancer cells irradiated for tumor immunization were subcutaneously transplanted.
  • mice that formed 5-10 mm tumors were infected with AdE3-lA1.3B infected A549 cells 5 x 10 6 tumors 6
  • the control in the figure, SCC7 tumor without tumor immunity.
  • SCC7 treated with carrier cells and OVHM treated with carrier cells against OVHM tumors without tumor immunity.
  • FIG. 23 shows the results of examining the effect of tumor immunity by non-small cell lung cancer cells A549 cells.
  • 1 X 10 6 A549 cells treated with radiation adenovirus AdE3-lAl. 3B infected with lOOvp / cell were subcutaneously transplanted per mouse, 40 days later, 1 X ovarian cancer cell OVHM 10 6 were transplanted subcutaneously.
  • This mouse (“ AdE3-lA1.3B- infected A549 ⁇ OVHM ”), the growth (proliferation) of the tumor was markedly higher than that of the control (“ OVHM ”in which the OVHM tumor was formed without tumor immunity and treated with carrier cells). Suppressed and survival improved significantly.
  • 1 ⁇ 10 6 ovarian cancer cells OVHM were subcutaneously transplanted per mouse, and after 5-10 mm tumor formation, the carrier cells after radiation treatment were injected into the tumor.
  • the carrier cells used were A549 cells alone or a mixture of A549 cells and 293 cells.
  • the mixture of A549 cells and 293 cells is adenovirus AdE3 per mouse. -.. 1A1 3B 3. 75 X 10 6 cells of A549 cells that have been 50vp / cell infected, and, Adenowi Luz Ad E3-LAL 3B 293 cells were lOvp / cell infected 3. 75 X 10 6 cells in tumors This was administered once, for a total of 6 intratumoral administrations. The results are shown in Figures 25 (a) and 25 (b). In addition, in the case of A549 cells alone, 7.5 ⁇ 10 6 A549 cells infected with 5 Ovp / cell of adenovirus AdE3-lAl. Six intratumoral doses were given.
  • X 1”, “X 2” and “X 3” are the results of administration of adenovirus Ad- ⁇ gal once, twice and three times, respectively.
  • adenovirus Ad-18-gal was administered several times, anti-adenovirus antibody plus mice were found to have antitumor effects due to carrier cells.
  • the result of using a mixture of A549 cells and 293 cells as carrier cells was better than that of A549 cells alone.
  • Fig. 27 (a) and (b) show not only adenovirus AdE3-lAl. 3B but also carrier cells (A549 cells) infected with GM-CSF expression vector were administered, and these carrier cells These results are the results of an examination of the in vivo antitumor effect when atelocollagen was administered together.
  • adenovirus Ad-j8-gal was administered once, twice or three times to each (C57BL / 6 X C3 / He) Fl mouse at 5 weeks of age (each time).
  • A549 cells were infected with adenovirus AdE3-lAl. 3 B at 50 vp / cell, and GM-CSF expression vector (adenovirus E1 gene was deleted at the site downstream of the CMV promoter).
  • a GM—CSF containing the CSF gene was infected with 1 Ovp / cell.
  • the thus-prepared A549 cells after radiation treatment were administered intratumorally together with 7.5 ⁇ 10 6 cells of atherocollagen (concentration 0.1%) at a time, for a total of 3 times (X3).
  • FIGS. 28 (a) and 28 (b) are the results of examining the effect of intraperitoneal administration of an iron preparation at the time of carrier cell administration.
  • adenovirus Ad—j8—gal was administered once, twice or three times to (C57BL / 6 X C3 / He) Fl mice at 5 weeks of age ( Every 3 weeks, 1 x 10 1 ( Vp administration), and then 1 x 10 6 subcutaneously transplanted OVHM cells per mouse, 5-10 mm tumor formation, after radiation treatment
  • One carrier cell was administered intratumorally, but at the time of carrier cell administration, iron dextran (Fe—Dextran) 0.
  • adenovirus AdE3-1A1.3B was administered to the carrier cell.
  • A549 cells infected with 50 vp / cell were used, and each dose was 7.5 ⁇ 10 6 cells, 3 times in total (X 3) (in each case, iron was also administered).
  • FIG. 28 (a) (b) "Ad- ⁇ - g al ⁇ AdE3- lA1.3B + FeJ is above experimental results," Ad- ⁇ -gal ⁇ AdE3-lA1.3Bj adenovirus This is the result of intraperitoneal administration of 7.5 x 10 6 carrier cells (A549 cells) infected with 50 vp / cell of AdE3-lAl. 3B at a time, 6 times in total (X 6).
  • the treatment with carrier cells is 3 in all cases when adenovirus Ad—j8—gal is administered once, twice or three times.
  • AdE3-lA1.3B-infected carrier cells In spite of this, in vivo anti-tumor effects were observed compared to 6 treatments with AdE3-lA1.3B-infected carrier cells.
  • FIG. 30 shows the results of examining the antitumor effect when the carrier cells (A549 cells) were treated with radiation at different doses in an experiment using (C57BL / 6 X C3 / He) Fl mice.
  • 5 weeks old (C57BL / 6 X C3 / He) Fl mice were administered 1 X 10 1G vp of adenovirus UV—Ad j8—gal, and 5 weeks later, ovarian cancer cells OVHM 1 1 ⁇ 10 6 mice were implanted subcutaneously, and after 5-10 mm tumor formation, carrier cells treated with radiation at doses of 50 Gy, 100 Gy, 200 Gy or 400 Gy were administered intratumorally.
  • A549 cells infected with 50 vp / cell of adenovirus AdE3-1A1.3B were used as carrier cells, and 7.5 ⁇ 10 6 cells were administered intratumorally 6 times in total. As a result, 400 Gy was better than 200 Gy in the radiation treatment.
  • Fig. 31 shows the results of examining the amount of oncolytic virus infecting carrier cells.
  • 5 weeks old (C57BL / 6 X C3 / He) Fl mice were administered adenovirus Ad—j8—gal with 1 X 10 1 (> vp), and 4 weeks later, ovarian cancer cells OVHM were administered to mice.
  • lAl.3B The infectious dose of lAl.3B was either 100 vp / cell, 250 vp / cel or 500 vp / cell, and 7.5 ⁇ 10 6 carrier cells were administered once in each tumor.
  • atelocollagen Concentration 0.1%) was administered intratumorally, and as a result, the best results were obtained when the above infection amount was 250 vp / cell, about 150-400 vp / cell. It was found to be good if set to.
  • FIGS. 32 (a) and 32 (b) show the results of examining the effect of tumor immunity in an experiment similar to the experiment shown in FIG.
  • 5 weeks old (C57BL / 6 X C3 / He) Fl mice were administered adenovirus Ad— ⁇ gal with 1 X 10 1G vp, and 4 weeks later, they were irradiated with a dose of 80 Gy for tumor immunity.
  • Ovarian cancer cells OVHM—RT were implanted subcutaneously at 1 ⁇ 10 6 mice per mouse. Thereafter, 1 ⁇ 10 6 ovarian cancer cells OVHM were subcutaneously transplanted, and after 5-10 mm tumor formation, carrier cells treated with radiation at a dose of 250 Gy were administered intratumorally.
  • A549 cells infected with adenovirus AdE3-lAl.3B at 50 vp / cell were used, and 7.5 ⁇ 10 6 cells were administered intratumorally three times in total.
  • atelocollagen concentration 0.1%) was administered intratumorally.
  • tumor growth was significantly suppressed in the mice that received tumor immunity (“OVHM-RT ⁇ A549” in the figure) compared to the mice that did not receive tumor immunity (“A549” in the figure). Survival rate improved greatly
  • the cancer gene therapy drug of the present invention can be applied to almost all malignant tumors, such as ovarian cancer, squamous cell carcinoma (cervical cancer, skin cancer, head and neck cancer, esophageal cancer). , Lung cancer, etc.), gastrointestinal cancer (colorectal cancer, knee cancer, liver cancer, gastric cancer, etc.), neuroblastoma, brain tumor, breast cancer, testicular cancer, prostate cancer, etc.

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Abstract

　本発明の癌遺伝子治療薬は、生体のＣＴＬ反応を誘導するために投与される免疫処置用ウイルスと、投与前にオンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを生体の腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞とを組み合わせたものである。キャリアー細胞には例えばＡ５４９細胞を使用することができる。また、免疫処置用ウイルスには例えば紫外線照射により不活化した非増殖型アデノウイルスを、オンコリティックウイルスには例えば腫瘍特異的プロモーターを有する増殖型アデノウイルスを、それぞれ使用することができる。

Description

明 細 書
癌遺伝子治療薬
技術分野
[0001] 本発明は、癌遺伝子治療薬、および同治療薬を用いた癌遺伝子治療方法に関す るものである。
背景技術
[0002] 近年、癌治療に関し、遺伝子治療が注目されており、これまでにも様々な遺伝子治 療法が提案され、臨床試験が行われている。このうち、キャリアー細胞を使用した遺 伝子治療については、 Freemanらによって臨床試験が行われている。この遺伝子治 療は、レトロウイルスによって HSV— tk遺伝子を導入した卵巣癌細胞 PA— 1をキヤリ ァー細胞に使用するものであり、卵巣癌治療、さらに悪性中皮腫治療のための臨床 試験が行われている（後述の非特許文献 1 · 2参照)。一方、 Culverらは、キャリアー細 胞にマウス NIH— 3T3細胞を使用して脳腫瘍に対する臨床試験を行っている（後述 の非特許文献 3参照)。しかし、ヒトへの癌治療の適用を考慮すると、キャリアー細胞 にはヒト由来細胞を使用することが要請される。
[0003] 卵巣癌細胞 PA-1をキャリアー細胞に使用した遺伝子治療は、 Coukosらによっても 行われている（後述の非特許文献 4参照)。この遺伝子治療は、腫瘍細胞において特 異的に増殖するオンコリティックウィルス（oncolytic virus)を構築し、同ウィルスをキヤ リア一細胞 (プロデューサー細胞）に感染させた後、このキャリアー細胞を腫瘍部位に 投与するというものである。オンコリティックウィルスには単純へルぺスウィルス 1型（H SV-1)が用いられ、ヌードマウスの卵巣癌腹腔内播種性転移モデルに対して腹腔 内投与する動物実験が行われて!/、る (後述の特許文献 1 · 2参照)。
[0004] しかし、上記の卵巣癌細胞 PA— 1は、増殖能力が高く操作しやすい細胞ではあるも のの、細胞質が小さく壊れやすい。そのため、レトロウイルスによって HSV— tk遺伝子 を導入しても腫瘍部位での HSV— tk遺伝子発現は少なく、 Freemanらの臨床試験で は、卵巣癌および悪性中皮腫に対する充分な抗腫瘍効果は得られて 、な 、。
[0005] オンコリティックウィルス HSV— 1による癌遺伝子治療にぉ 、てキャリアー細胞として PA— 1を使用した場合も、オンコリティックウィルス HSV— 1の単独療法に比べて著明 な抗腫瘍効果は得られていない。ウィルスによる癌遺伝子治療の問題点は、血中の 中和抗体により頻回投与ができない点である。 PA— 1を使用した場合、細胞が脆弱 でウィルス産生量も少ないため、細胞間相互作用（cell to cell interaction)により標的 腫瘍細胞に感染する前に細胞が壊れてしまうこと、さらに、直接的に中和抗体により ウィルスが不活化され、抗腫瘍効果が得られな!/ヽことなどが考えられる。
[0006] また、細胞性免疫遺伝子治療の臨床試験にお!/、て、患者自身の癌細胞ある!/、は 線維芽細胞 (fibroblast)をキャリアー細胞に使用することがある力 この場合安定した 細胞系が得られるまで時間がかかり、手技が困難であること、さらに遺伝子導入が個 体により差があり一定でないことから安定した効果を得ることが困難であった。
[0007] 非特許文献 1： Human Gene Therapy, 6, 927-939, 1995
非特許文献 2 : Human Gene Therapy, 9, 2641-2649, 1998
非特許文献 3 : Science, 256, 1550-1552, 1992
非特許文献 4 : Clinical Cancer Research, 5, 1523-1537, 1999
特許文献 1：国際公開第 99Z45783号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 01Z23004号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、このような従来の問題点を解決するためになされたものであり、その目的 は、オンコリティックウィルスを用いた癌遺伝子治療において、強力な抗腫瘍効果が 得られる新たなキャリアー細胞を見出すこと、さらに得られたキャリアー細胞等を用い て劇的な抗腫瘍効果が得られる新たな癌遺伝子治療法を確立すること、および、同 治療法に用いる新たな癌遺伝子治療薬を提供すること、にある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、（1)キャリアー細胞に特 定の細胞株を使用することで、従来のキャリアー細胞に比べて強力な抗腫瘍効果が 得られること、さらに、（2)予めウィルスを投与して免疫処置を施した後、オンコリティ ックウィルスを感染させたキャリアー細胞を投与することで、生体の CTL反応が誘導 · 惹起され、 in vivoにおいて劇的な抗腫瘍効果が得られること、等を見出し、本発明を 完成させるに至った。
[0010] 即ち、本発明の癌遺伝子治療薬 (換言すれば、癌治療用薬剤キット）は、
キャリアー細胞投与に対する生体の CTL反応を誘導するために投与される免疫処 置用ウィルスと、
投与前にオンコリティックウィルスを感染させ、同ウィルスを生体の腫瘍細胞に作用 させるためのキャリアー細胞とを組み合わせたものである。
[0011] 本発明の免疫処置用ウィルスおよびオンコリティックウィルスは、好ましくは、アデノ ウイノレス、ヘルぺスウィルス、 HIVウィルス等のレンチウィルス、レトロウイルス、レオゥ ィルス、水疱性口内炎ウィルス（VSV)、又はその他のオンコリティックウィルスから選 ばれる。このうち、アデノウイルスの使用は、後述のように良好な結果が得られたため 、特に好ましい。
[0012] また好ましくは、本発明のオンコリティックウィルスは、治療対象の癌の種類等に応 じて、 1A1. 3Bプロモーター（IAL 3Bプロモーター）、ミツドカインプロモーター、 13— HCGプロモーター、 SCCA1プロモーター、 cox— 2プロモーター、 PSAプロモータ 一、又はその他の腫瘍特異的プロモーターを有する。なお、本発明においてオンコリ ティックウィルスは、標的腫瘍細胞に感染し、増殖しうるものであればよぐ例えばァ デノウィルスの場合、その範疇には、野生型アデノウイルスが含まれる。その他オンコ リティックウィルスは、 ONYX社の E1B遺伝子欠失型のオンコリティックアデノウィル ス、あるいは、 UAB大学の E1A遺伝子の一部欠損型の Ad5-A24アデノウイルスな ど、腫瘍特異的プロモーターを有しな 、ものであってもよ 、。
[0013] 本発明の免疫処置用ウィルスには、非増殖型のものおよび Z又は紫外線等で不活 化したものを使用することが好ましい。紫外線等で不活ィ匕することによって、免疫処 置用ウィルスの投与力 キャリアー細胞投与までの期間を短期間にすることができる
[0014] 本発明のキャリアー細胞は、好ましくは、 A549細胞、 293細胞、 SW626細胞、 HT —3細胞（HT— III細胞）、又はその他のヒト由来の癌細胞もしくは正常細胞力 選ば れるが、その他、 Crucell社の PER. C6細胞など市販の細胞ラインを使用してもよい 。上記 A549細胞、 293細胞、 SW626細胞および HT— 3細胞は、後述のように良好 な結果が得られたため、キャリアー細胞としてより好ましぐさらに後述するように、これ ら細胞の中でも A549細胞の使用は特に好ま 、。
[0015] 本発明の癌遺伝子治療薬 (癌治療用薬剤キット）は、免疫処置用ウィルスおよびキ ャリア一細胞を組み合わせたもの、あるいは、これにオンコリティックウィルスをカ卩えて 3者を組み合わせたキットの構成が考えられる力 さらに下記（1)一（4)の物質のうち 、 1又は 2以上の物質を備えたものであってもよい。
(1)ァテロコラーゲン
(2)投与前にキャリアー細胞に感染させる GM— CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor:顆粒球'マクロファージコロニー刺激因子）発現ベクター
(3)鉄剤
(4)ポルフィリン化合物（例えば、 5—アミノレブリン酸（5-aminolevulinic acid : ALA) ) [0016] また、免疫処置用ウィルスの投与と共に、あるいはその前後に、腫瘍免疫のため患 者由来の腫瘍細胞またはそれと類似した抗原を提示すると考えられる一般に入手可 能な放射線照射した腫瘍細胞を投与することが好ま ヽが、本発明の癌遺伝子治療 薬は、腫瘍免疫のためこのような放射線照射した腫瘍細胞を備えたものであってもよ い。
[0017] 本発明の癌遺伝子治療方法は、キャリアー細胞投与に対する生体の CTL反応を 誘導するために免疫処置用ウィルスをヒトに投与し、所定期間経過後、オンコリテイツ クウィルスを感染させ、同ウィルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を少 なくとも 1回ヒトに投与することを特徴とする。
[0018] 本発明の癌遺伝子治療方法において、好ましくは、免疫処置用ウィルス投与からキ ャリア一細胞投与までの期間を、およそ 2週間以上 13週間以下 (より好ましくは、 3週 間以上 4週間以下)とする。また好ましくは、（1)免疫処置用ウィルスの投与量を、当 該ウィルスに対する抗体陰性の患者にはおよそ 105ウィルス粒子以上 1011ウィルス粒 子以下とする一方、当該ウィルスに対する抗体陽性の患者にはおよそ 102ウィルス粒 子以上 107ウィルス粒子以下とし、 (2)キャリアー細胞によるオンコリティックウィルス の 1回の投与量を、およそ 109ウィルス粒子以上 1014ウィルス粒子以下とし、（3)キヤ リア一細胞に対するオンコリティックウィルスの感染量を、およそ 0. 1ウィルス粒子 Z 細胞（viral particle/cell :以下、「vp/cell」という。）以上 2000vp/cell以下（より好ましく は、 5vp/cell以上 500vp/cell以下）とする。
[0019] また本発明の癌遺伝子治療方法において、下記（1)一（5)の方法を採用すること は好ましい。
(1)腫瘍内投与によりキャリアー細胞を投与する。
(2)キャリアー細胞と共に、ァテロコラーゲンを投与する。
(3)オンコリティックウィルスのみならず、 GM—CSF発現ベクターを感染させたキヤリ ァー細胞を投与する。
(4)キャリアー細胞と共に、鉄剤および Z又はボルフイリンィ匕合物（例えば、 5—ァミノ レブリン酸（5- aminolevulinic acid： ALA) )を投与する。
(5)免疫処置用ウィルスの投与と共に、またはその前後に、腫瘍免疫のため腫瘍細 胞を投与する。
発明の効果
[0020] 本発明の癌遺伝子治療薬は、予め投与される免疫処置用ウィルスと、その後に投 与されるキャリアー細胞との 2種類の薬剤を組み合わせたものであり、予めアデノウィ ルス等のウィルス投与により免疫処置を施した後、オンコリティックウィルスを感染させ たキャリアー細胞を投与することで、同ウィルスが標的腫瘍細胞に感染して直接的な 抗腫瘍効果をもたらし、さらに感染標的細胞に対し生体の CTL反応が誘導され、 in vivoにおいて劇的な抗腫瘍効果を得ることができる。
[0021] また、キャリアー細胞に、 in vitroおよび in vivoの双方において高い抗腫瘍効果が 認められた A549細胞などの細胞株を使用することによって、従来のキャリアー細胞 に比べて強力な抗腫瘍効果を得ることができる。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]各種細胞株をキャリアー細胞に用いた場合の卵巣癌細胞 HEYに対する増殖 抑制効果を IC50における細胞数で調べた結果を示すグラフである。
[図 2]オンコリティックウィルス単独の場合とキャリアー細胞を用いた場合とで、ウィル ス抗体存在下、卵巣癌細胞 HEYに対する増殖抑制効果を IC50における抗ァデノウ ィルス抗体の抗体価で調べた結果を示すグラフである。
[図 3]オンコリティックアデノウイルス感染 293細胞などにっ 、て、ウィルス抗体存在下 の卵巣癌細胞 HEYに対する増殖抑制効果を IC50における抗アデノウイルス抗体の 抗体価で調べた結果を示すグラフである。
[図 4]293細胞、 A549細胞、 SW626細胞、 HT— 3細胞の各キャリアー細胞につい て、ウィルス抗体存在下の卵巣癌細胞 HEYに対する増殖抑制効果を細胞数で調べ た結果を示すグラフである。
[図 5]ヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞 RMG—1を移植し形成された 10— 15mm の巨大腫瘍モデルを用いて、オンコリティックアデノウイルス感染キャリアー細胞の in vivo抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフである。
[図 6]ヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞 PA— 1を移植し形成された 10— 15mmの 巨大腫瘍モデルを用いて、オンコリティックアデノウイルス感染キャリアー細胞の in vivo抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフである。
[図 7]免疫機能が正常な皮下腫瘍モデルマウス ((C57BL/6 X C3/He)Flマウス）を用 V、て本発明の癌遺伝子治療薬の in vivo抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフで める。
[図 8]アデノウイルス投与による A549細胞の細胞融合を顕微鏡により観察した図で める。
[図 9]コントロールであり、アデノウイルスを投与しな力つた A549細胞を顕微鏡により 観察した図である。
[図 10] (a)は、 1一 21のヒト手術標本におけるミツドカイン（MK) mRNAの発現を RT PCRで検討した結果、（b)は、同様の方法により、悪性ダリオ一マの 4つの細胞株 におけるミツドカイン mRNAの発現を RT— PCRで検討した結果、（c)は、上記各細 胞株におけるミツドカインの発現をウェスタンプロット解析によって検討した結果、であ る。
[図 11]長さが異なる 2つのミツドカインプロモーターを用いて上記各細胞株における プロモーター活性を比較した結果を示すグラフである。
[図 12] (a)は、今回設計した、ミツドカインプロモーターを有するオンコリティックアデノ ウィルスの構造を模式的に示す図であり、（b)は、 3種類のアデノウイルスを上記各細 胞株に感染させ、それぞれの細胞株における E1A蛋白の発現をウェスタンプロット 解析によって検討した結果である。
[図 13] (a)は、 3種類のアデノウイルスによる癌細胞増殖抑制効果を比較検討した結 果であり、（b)は、アデノウイルスの E3領域の増殖抑制効果に与える影響を検討した 結果であり、（c)は、直径 5mmのヌードマウス皮下移植モデルにおけるアデノウィル スの抗腫瘍効果を検討した結果である。
[図 14]ミツドカインプロモーターを有するオンコリティックウィルスをキャリアー細胞に感 染させ、当該ウィルス感染キャリアー細胞の直径 10— 15mmの巨大腫瘍に対する抗 腫瘍効果をウィルス単独投与の場合と比較した結果を示すグラフである。
[図 15]アデノウイルス AdE3-lA1.3Bの卵巣癌細胞 PA 1に対する増殖抑制効果に対 する Feの影響を検討した結果を示すグラフである。
[図 16]アデノウイルス AdE3-lA1.3Bの卵巣癌細胞 PA 1に対する増殖抑制効果に対 する ALAの影響を検討した結果を示すグラフである。
[図 17]アデノウイルス AdE3-lA1.3Bの卵巣癌細胞 PA 1に対する増殖抑制効果に対 する Feおよび ALA両存在下の影響を検討した結果を示すグラフである。
[図 18] (a)は、免疫機能が正常な皮下腫瘍モデルマウス ((C57BL/6 X C3/He)Flマウ ス）を用いて、本発明の癌遺伝子治療薬 (免疫処置用ウィルスを UV処理して 、な ヽ 場合)の in vivo抗腫瘍効果を検討した結果であり、 (b)は、この実験に供された各マ ウスの生存率を長期間観察した結果を示すグラフである。
[図 19]免疫処置用ウィルス投与力 キャリアー細胞投与までの投与間隔について検 討を行った結果であり、（a)は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マ ウスの生存率を観察した結果である。
[図 20]UVで不活ィ匕処理したアデノウイルス UV— Ad— β galを免疫処置用ウィルス に使用することにより、上記投与間隔を短くすることができる力検討した結果を示すグ ラフ（サノ ィバル 'カーブ)である。
[図 21]上記 UV— Ad— β galを免疫処置用ウィルスに使用した場合の当該ウィルス の投与量にっ 、て検討した結果を示すグラフ (腫瘍成長カーブ)である。 [図 22]腫瘍免疫の効果を検討した結果であり、（a)は、各マウスの腫瘍体積を観察し た結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である。各群のマウスの数は n = 5である。図中、コントロールの「SCC7」「OVHM」は、腫瘍免疫を行わずに、扁平上 皮癌細胞 SCC7または卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 106個皮下移植し、 AdE3-lA1.3B 感染キャリアー細胞 A549を投与したマウスの結果である。 roVHM-RT+Ad- β -gal →SCC7, OVHM」は、放射線照射した OVHMによる腫瘍免疫および Ad- - galによ るアデノウイルスに対する CTLを誘導した後に、 SCC7あるいは OVHMの皮下腫瘍 を作成し、 AdE3-l Al .3B感染キャリアー細胞 A549を投与したマウスの結果である。
[図 23]非小細胞性肺癌細胞 A549細胞による腫瘍免疫の効果を検討した結果を示 すグラフ（サバイバル 'カーブ）である。各群のマウスの数は n= 10である。図中、コン トロールの「OVHM」は、腫瘍免疫を行わずに、卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 106個皮下 移植し、 AdE3-lA1.3B感染キャリアー細胞 A549を投与したマウスの結果である。図 中「AdE3-IAI.3B- infected A549→0VHMJは、 AdE3- 1A1.3Bを感染し放射線照射し た A549細胞を 106個、皮下に免疫し、卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 106個皮下移植し、 AdE3- 1A1.3B感染キャリアー細胞 A549を投与したマウスの結果である。
[図 24]キャリアー細胞と共にァテロコラーゲンを投与した場合に、副作用による死亡 率が改善されるかどうか調べた結果を示すグラフである。図中、力つこ内の Nはマウス の数を示す。
[図 25]UVで不活化処理して!/、な!/、アデノウイルス Ad— β galを 1 3回投与し、抗ァ デノウィルス抗体存在下での抗腫瘍効果について検討した結果であり、（a)は、各マ ウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である 。キャリアー細胞には、 A549細胞と 293細胞とを混合したものを使用した。各群のマ ウスの数は n= 5である。
[図 26]UVで不活化処理して!/、な!/、アデノウイルス Ad— β galを 1 3回投与し、抗ァ デノウィルス抗体存在下での抗腫瘍効果について検討した結果であり、（a)は、各マ ウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である 。キャリアー細胞には A549細胞のみ使用した。各群のマウスの数は n= 5である。
[図 27]アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bのみならず、 GM— CSF発現ベクターを感染 させたキャリアー細胞 (A549細胞）を投与し、かつ、このキャリアー細胞と共にァテロ コラーゲンを投与した場合の in vivo抗腫瘍効果について検討した結果であり、 (a)は 、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果 である。図中、「Ad- β -galjの前の「 X 1」「 X 2」「 X 3」は、それぞれ、アデノウイルス A d— j8— galを 1回、 2回、 3回投与したことを示す。各群のマウスの数は n= 5である。
[図 28]キャリアー細胞投与時に、鉄剤を腹腔内投与した場合の in vivo抗腫瘍効果に ついて検討した結果であり、（a)は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各 群マウスの生存率を観察した結果である。図中、「 (1- |8 -§&1」の前の「 1」「 2」「 3」は、それぞれ、アデノウイルス Ad— 18— galを 1回、 2回、 3回投与したことを示す。各 群のマウスの数は n= 5である。
[図 29]キャリアー細胞 A549に対して行う放射線処理において照射する線量につい て、ヌードマウスを用いて検討した結果を示すグラフである。
[図 30](C57BL/6 X C3/He)Flマウスに OVHMを皮下移植した実験で、キャリアー細 胞 A549を異なる線量で放射線処理した場合の抗腫瘍効果について検討した結果 を示すグラフである。
[図 31]キャリアー細胞 A549に対するオンコリティックウィルスの感染量について検討 した結果を示すグラフである。
[図 32]卵巣癌細胞 OVHMによる腫瘍免疫の効果を検討した結果であり、（a)は、各 マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果であ る。図中、「A549」は腫瘍免疫なしに AdE3-lA1.3B感染キャリアー細胞 A549を 3回投 与したマウス、「OVHM- RT→A549」は放射線照射した OVHMによる腫瘍免疫後、 AdE3- 1A1.3B感染キャリアー細胞 A549を 3回投与したマウス、各群のマウスの数は n= 5である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の一形態について説明する。
〔1〕本発明の癌遺伝子治療薬に使用するキャリアー細胞等
まず、本発明の癌遺伝子治療薬に使用するキャリアー細胞について説明する。キヤ リア一細胞は、例えば以下の（1)一（4)の細胞力 選択することができる。 (1) A549細胞
(2) 293細胞
(3) SW626細胞
(4) HT - 3細胞（HT - ΠΙ細胞）
[0024] 図 1は、癌遺伝子治療薬に用いる効果的なキャリアー細胞を見出すために本発明 者がキャリアー細胞の選別を行った結果であり、より具体的には、各種候補細胞株に オンコリティックウィルスを感染させた癌遺伝子治療薬を調製し、各々の癌細胞増殖 抑制効果を調査した結果を示すグラフである。オンコリティックウィルスには、アデノウ ィルス AdE3— 1A1. 3Β (ΙΑΙ. 3Β)を使用した。このアデノウイルス AdE3—lAl. 3B は、 E1A遺伝子および E3遺伝子を有し、かつ、 E1A遺伝子の上流に腫瘍特異的プ 口モーターとして卵巣癌特異的 lAi . 3Bプロモーター（IAL 3Bプロモーター）を有 するアデノウイルスである。このアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを各種候補細胞株に 対して 500vp/Cellで 2日間感染させた後、各細胞を培養 2日目の卵巣癌細胞 HEY に添加し、培養 5日目に同癌細胞 HEYの増殖抑制効果を調べた。
[0025] 図 1のグラフ縦軸は、各種候補細胞株について 50%の増殖抑制効果 (IC50)が得 られる細胞数を示し、細胞数が少な 、細胞株ほど増殖抑制効果が高 、ことになる。 同図に示すように、今回調査した癌細胞株では、 293細胞、 A549細胞、 SW626細 胞、 HT - 3細胞 (HT - III細胞）の順に高い増殖抑制効果を示した。 293細胞、 A54 9細胞および SW626細胞は、従来キャリアー細胞として使用されていた PA— 1細胞 に比べて、およそ 100倍程度の高い増殖抑制効果を示した。 HT— 3細胞についても 、 SW626細胞と同程度の高い増殖抑制効果を示した。
[0026] また、上記の 293細胞、 A549細胞、 SW626細胞および HT— 3細胞にオンコリティ ックアデノウイルスを感染させた癌遺伝子治療薬を調製し、各治療薬について、充分 量の抗アデノウイルス中和抗体存在下 (Ab (+) )における、癌細胞増殖抑制効果を 検討した。その結果、図 4に示すように、抗体存在下であっても、上記 4種の細胞をキ ャリア一細胞に用いた癌遺伝子治療薬は 、ずれも強 、癌細胞増殖抑制効果を示し た。従来、ウィルスによる癌遺伝子治療は、抗体産生により頻回投与ができないこと が難点とされていた力 上記 4種の細胞をキャリアー細胞に用いた場合は、抗体存在 下にもかかわらず in vitroにおいて強力な増殖抑制効果が得られた。なお、図 4に示 すように、上記 4種類の細胞のうち、 A549細胞をキャリアー細胞に用いた場合に最も 強力な増殖抑制効果を示した。即ち、充分量の抗ァデノウィルス中和抗体存在下に アデノウイルス感染 A549細胞を投与すると、標的癌細胞の増殖は抗体存在下にも かかわらずほぼ完全に抑制された。
[0027] さらに、直径 10— 15mmの巨大なヌードマウス皮下腫瘍モデルを用いた in vivoの実 験においても、上記の A549細胞、 293細胞および SW626細胞をキャリアー細胞に 用いた場合は、強力な抗腫瘍効果を示した (図 5および図 6参照)。なお、これら実験 の詳細は後述の実施例において説明する。
[0028] このように、オンコリティックウィルスをキャリアー細胞に感染させて得られる癌遺伝 子治療薬において、キャリアー細胞に A549細胞、 293細胞、 SW626細胞、 HT— 3 細胞の!/ヽずれかを使用することで高 、抗腫瘍効果を得ることができる。
[0029] 上記 4種の細胞にっ 、て説明すると、 A549細胞は、非小細胞性肺癌細胞株であり 、その詳細については例えば論文 Giard,D.J.， Aaronson.S.A., Todaro.G.J.,
Arnstein'P., KerseyJ.H., Dosik'H., and Parks, W. P. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors, J. Natl. Cancer Inst., 51: 1417-1423, 1973.などに記載されている。 293細胞は、ヒト胎児腎 由来細胞であり、アデノウイルス産生細胞として試験研究に多く用いられている細胞 株である。 293細胞については例えば論文 Xie QW , et al. Complementation analysis of mutants of nitric oxide synthase reveals that the active site requires two hemes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4891-4896, 1996.などに説明がある。 SW62 6細胞は、大腸癌卵巣転移株であり、その詳細については例えば論文 Fogh J , et al. Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors. J. Natl. Cancer Inst. 58: 209-214, 1977.などに記載されている。 HT— 3細胞は、子宫 頸部扁平上皮癌細胞であり、その詳細については例えば論文 Fogh J , et al.
Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors. J. Natl. Cancer Inst. 58: 209-214, 1977.などに記載されている。これら 4種の細胞株は いずれも ATCC (American Type Culture Collection)等の細胞保存機関から入手可 能であり、その他、市販されているものを使用してもよい。
[0030] A549細胞は、（1)高力価のオンコリティックアデノウイルスを産生し、非常にタフな 細胞で扱 、やす 、、 (2)抗アデノウイルス抗体存在下にお 、て癌細胞の増殖を最も 強力に抑制する、（3)アデノウイルス等のウィルスが感染すると A549細胞は由来が type IIの肺胞上皮細胞であるため分泌顆粒を放出し、この性質が癌治療において有 利に作用すると考えられる、（4)アデノウイルスに感染した後も A549細胞は CTLに よる殺細胞効果を受けにくい、などキャリアー細胞として使用する場合に多くの利点 を有している。したがって、上記 4種の細胞のうち、 A549細胞の使用は特に好ましい
[0031] また、キャリアー細胞として、複数の種類の細胞を併用してもよい。後述の実施例で は、キャリアー細胞に A549細胞と 293細胞とを併用することによって、強力な癌治療 効効果が認められた。このように、複数の種類の細胞を併用した場合は、各細胞の特徴
、利点を癌治療に利用することができ、好ましい。例えば、 SW626細胞は、接着（ adhere)するのに比較的時間を要するため、腹腔内投与すると局所のみにとどまらず 周囲全体に拡散し、卵巣癌などの腹腔内治療に好適と考えられる。また、 SW626細 胞は、ウィルス産生量のピークが A549細胞や 293細胞などよりも遅ぐ作用時間が 比較的長 ヽと 、う特徴を有して 、る。
[0032] 上述したように、キャリアー細胞は、上記 4種の細胞（即ち、 A549細胞、 293細胞、 SW626細胞、 HT— 3細胞）を使用することが好ましい。しかし、キャリアー細胞として 利用可能な細胞は上記 4種の細胞に限定されるものではなぐ他の細胞、例えば、 P A— 1細胞 (特にへルぺスウィルスをオンコリティックウィルスに使用する場合等）、繊 維芽細胞 (fibroblast)、その他のヒト由来の癌細胞あるいは正常細胞、患者由来の癌 細胞などをキャリアー細胞に使用してもよい。
[0033] 本発明の癌遺伝子治療薬において、上記キャリアー細胞に感染させるオンコリティ ックウィルスとしては、従来遺伝子導入に用いられるウィルスベクターを使用すること ができ、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、単純へルぺスウィルス 1型（HSV— 1)、 単純へルぺスウィルス 2型（HSV— 2)、 HIVウィルス（エイズウイルス）等のレンチウイ ルスやマウス白血病ウィルス等のレトロウイルス、レオウィルス、水疱性口内炎ウィル ス (vsv)などが例示され、さらにその他のオンコリティックウィルスであってもよい。ォ ンコリティックウィルスは、増殖型ウィルスベクターであって標的の腫瘍細胞または腫 瘍組織において特異的に増殖するようウィルス遺伝子を改変し、標的細胞を融解- 殺傷する cell lysis作用を有するものであればよぐ例えばアデノウイルスの場合、その 増殖に必要な E 1 Aまたは E 1 B領域を有するものであればよい。
[0034] 本発明の癌遺伝子治療薬は、ほぼ全ての悪性腫瘍に適用することができ、治療対 象となる癌の種類は、卵巣癌、扁平上皮癌 (子宮頸部癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道 癌、肺癌等)、消化器癌 (大腸癌、膝癌、肝癌、胃癌等)、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳 癌、精巣癌、前立腺癌などが例示される。また、アデノウイルス 34,35型など血液細胞 にも感染可能なウィルスを使用することで、本発明の癌遺伝子治療薬は血液性悪性 腫瘍にも適用可能である。
[0035] 治療対象となる癌の種類に応じて、オンコリティックウィルスに導入する腫瘍特異的 プロモーターの種類を選択するとよい。例えば、卵巣癌に対しては 1A1. 3Bプロモ 一ター、脳腫瘍、悪性ダリオ一マなどに対してはミツドカインプロモーター、精巣癌に 対しては j8—HCGプロモーター、扁平上皮癌に対しては SCCA1プロモーターおよ び SCCA2プロモーター、大腸癌に対しては CEAプロモーター、前立腺癌に対して は PSAプロモーター、肝癌に対しては AFPプロモーター、を使用することができる。 勿論、他の公知の腫瘍特異的プロモーター、例えば、種々の悪性腫瘍に対してプロ モーター活性を発揮し、広い作用スペクトラムを有する cox— 2プロモーターや、その 他ォステオカルシンプロモーター等の各種癌特異性プロモーターを使用してもよ 、。 上記ミツドカインプロモーターについては、脳腫瘍、悪性ダリオ一マのほか種々の悪 性腫瘍に対して使用可能であり、この点において cox— 2プロモーターと同様に広い 作用スペクトラムを有する。
[0036] 使用する各プロモーター配列の長さ等については、腫瘍特異的プロモーター活性 が得られる限りにおいて特に限定されるものではない。上記 1A1. 3Bプロモーター は、国際公開第 03/025190号パンフレットおよび文献 Cancer Research 63, 2506-2512, 2003の記載にしたがって設計'調製し、ウィルスゲノムに挿入することが できる。上記のミツドカインプロモーター、 jS—HCGプロモーター、 SCCA1プロモー ターについては、それぞれ、国際公開第 02Z10368号パンフレット、国際公開第 01 Z90344号パンフレット、国際公開第 00Z60068号パンフレットの記載にしたがつ て設計'調製し、ウィルスゲノムに挿入することができる。
[0037] 上記 SCCA1プロモーターについては、論文 Biochimica et Biophysica Acta 91522 (2001) 1-8, Molecular cloning of human squamous cell carcinoma antigen 1 gene and characterization of its promoter, Katsuyuki Hamada, Hiroto Shinomiya, Yoshihiro Asano, Toshimasa Kihana, Mari Iwamoto, Yasushi Hanakawa, Koji Hashimoto, Susumu Hirose, Satoru Kyo, Masaharu Itoにも詳細な説明がなされている。
[0038] 例えば、オンコリティックアデノウイルスを作製する場合、アデノウイルスの増殖に必 須の遺伝子である初期遺伝子 E1Aまたは E1Bの上流に腫瘍特異的プロモーターを 挿入するか、あるいは、初期遺伝子 E1Aまたは E1Bプロモーターと置換することによ り構築することができる。 HSV— 1、 HSV— 2、レトロウイルス、レオウィルス、水疱性口 内炎ウィルス (VSV)など、アデノウイルス以外のウィルスを使用する場合も、同様に 、ウィルスの増殖に必要な遺伝子の上流に腫瘍特異的プロモーターを挿入するか、 あるいは、当該遺伝子のプロモーターと置換することにより構築することができる。
[0039] もっとも、オンコリティックウィルスは、標的の腫瘍細胞または腫瘍組織にぉ ヽて特 異的に増殖する性質を有する限り、必ずしも腫瘍特異的プロモーターを有するもの でなくてもよい。例えば、 ONYX社の E1B遺伝子欠失型のオンコリティックアデノウィ ルス、あるいは、 UAB大学の E1A遺伝子の一部欠損型の Ad5-A24アデノウイルス など、腫瘍特異的プロモーターを有しな 、オンコリティックウィルスを使用することも可 能である。また、オンコリティックウィルスとして野生型アデノウイルス、あるいは、その 一部遺伝子を欠失させたものを使用することとしてもよい。
[0040] オンコリティックウィルスをキャリアー細胞に感染させる方法は、常法に従って行え ばよく特に限定されるものではないが、例えばキャリアー細胞をディッシュに播き、こ れにオンコリティックウィルスをすベての細胞に感染可能な量添カ卩し、 95%0、 5%
2
CO、 37°C、牛胎児血清 FCS (—)、 RPMI培地の条件下で 6時間から 36時間程度
2
培養し感染させる方法が簡便である。後述の実施例においては、 A549細胞、 SW6 26細胞、 HT— 3細胞はこの方法で培養し、オンコリティックウィルスを感染させたが、 293細胞に関しては FCS ( + ) 10%、 DMEM培地の条件下で培養し、オンコリテイツ クウィルスを感染させた。なお、牛胎児血清 FCSは、 3— 6時間感染の場合は FCS (— )の条件で、それ以上の時間感染させる場合は 3— 6時間 FCS (—)の状態におき、後 に FCS 10%をカロえるとよい。
[0041] キャリアー細胞に対するオンコリティックウィルスの感染量および感染時間は、治療 対象の腫瘍の大きさ'種類、キャリアー細胞の種類'投与量、使用するオンコリティック ウィルスの種類、本遺伝子治療薬の投与方法などに応じて最適な量と時間を選択す ればよい。特に限定されないが、一例として、キャリアー細胞に A549細胞を使用した 場合、腹腔内投与では約 5— 250vp/cellでおよそ 6— 24時間、腫瘍内投与では約 5— 500vp/cellでおよそ 12— 24時間、 SW626細胞の場合、腹腔内投与では約 250— 2 OOOvp/cellでおよそ 6— 24時間、腫瘍内投与では約 100— 500vp/cellでおよそ 12— 24時間、 293細胞の場合、腫瘍内投与では約 5— 50vp/cellでおよそ 12— 24時間、 腹腔内投与では約 0. 1-lOvp/cellでおよそ 6— 24時間、に設定することができる。こ のようにキャリアー細胞の種類、投与方法に応じて感染量'感染時間も異なるが、上 記の例では腹腔内投与のときは約 0. 1— 2000vp/cellでおよそ 6— 24時間、腫瘍内 投与のときは約 5— 500vp/cellでおよそ 12— 24時間、の範囲でそれぞれ感染量 ·感 染時間を設定することができる。
[0042] キャリアー細胞にオンコリティックウィルスを感染させ、ウィルス感染キャリアー細胞 を調製する場合、使用時まではオンコリティックウィルスを感染させな 、状態でキヤリ ァー細胞を保存しておいてもよい。他方、オンコリティックウィルスを感染させ放射線 照射したキャリアー細胞を凍結し、これを医療現場で解凍して使用するという製品形 態にする場合は、ウィルス感染させたキャリアー細胞を保存しておくことが好ま 、。 キャリアー細胞の保存は、例えば液体窒素中あるいは- 150°C程度の温度にて保存 することができる。一方、オンコリティックウィルスは、例えば 80°C程度の温度にて保 存することができる。
[0043] 使用時には、前記の方法によりオンコリティックウィルスをキャリアー細胞に感染させ 、得られたウィルス感染キャリアー細胞を、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤 担体とともに、ヒト (またはマウス、ラット等の実験動物）に投与することができる。後述 のように、キャリアー細胞投与時に、ァテロコラーゲン、鉄剤、ポルフィリン化合物のう ち、 1又は 2以上を組み合わせてキャリアー細胞と同時に投与することは好ましい。ま た、 CTL反応を高めるため、キャリアー細胞に、オンコリティックウィルスのみならず、 GM—CSF発現ベクターをも感染させ、 、わばウィルスベクターをダブルで感染させ たキャリアー細胞を投与することは好ま 、。
[0044] キャリアー細胞は、後述の免疫処置用ウィルスを投与して力 所定期間経過後に 投与する。キャリアー細胞に癌細胞を用いる際には、ウィルス感染前または感染後に 放射線照射することが好ましい。後述の実施例では、キャリアー細胞に A549細胞、 SW626細胞、 HT— 3細胞を使用した場合、これらの細胞をヌードマウスに投与する 前にそれぞれ 120— 400Gy、 20— 40Gy、 20— 40Gyにて放射線照射を行った。 A5 49細胞に対する放射線の照射量について検討した結果、 120Gy以上であれば細 胞の増殖は観察されな力つたので（図 29)、照射量は 120Gy以上 600Gy以下 (より 好ましくは 150Gy以上 400Gy以下)程度に設定することが好ま 、。
[0045] キャリアー細胞は、非経口剤として投与することが好ましいが、経口剤として使用で きる可能性もある。非経口剤としての投与は、 in vivo法、 ex vivo法のいずれであって もよい。 in vivo法の場合、腫瘍の大きさ'種類、症状の程度、患者の年齢、体重など に応じて用量 (換言すれば、ウィルス感染キャリアー細胞の投与量)を調節し、例え ば、静注、点滴静注、腫瘍内注射、腹腔注射のような腔内注射などによって投与する ことができるが、キャリアー細胞は、腫瘍内注射の方法により投与することが好ましい 。このような注射剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に生理食塩水、細胞 培養液等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張 ィ匕剤、無痛化剤などを加えてもよい。これら製剤中のウィルス感染キャリアー細胞の 配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。
[0046] 勿論、上記のウィルス感染キャリアー細胞は、数回にわたり患者に投与してもよいし 、複数回のクールに分け、一クール当たりの投与回数、投与間隔などを任意に設定 してちよい。
[0047] 上記のように、ウィルス感染キャリアー細胞の投与量は、腫瘍の大きさ'種類、症状 の程度、患者の年齢、体重などに応じて決定すればよいが、通常の場合、 1回のキヤ リア一細胞の投与量をおよそ io7細胞数以上 io1C)細胞数以下に、キャリアー細胞に よるオンコリティックウィルスの 1回の投与量をおよそ 109ウィルス粒子以上 1014ウィル ス粒子以下に設定することができる。
[0048] キャリアー細胞の種類は治療対象の癌の種類などに応じて適宜選択してもよい。ま た、遺伝子組換え技術によってキャリアー細胞を改変し、例えば標的腫瘍細胞と結 合しやすくなるようキャリアー細胞の細胞表面に人為的に特定タンパク質等を発現さ せてもよいし、キャリアー細胞にセンダイウィルスを感染させる等の処置を行ってもよ い。
[0049] オンコリティックウィルスは、細胞間相互作用（cell to cell interatcion)によりキャリア 一細胞力 標的腫瘍細胞へと感染し、腫瘍細胞内で特異的に増殖し、腫瘍細胞を 融解'殺傷する cell lysis作用を発揮することができる。ウィルスによる癌遺伝子治療は 、抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていたが、キャリアー細胞を用 いると細胞間相互作用により標的腫瘍細胞に直接的に感染が成立することによって 頻回投与が可能となり、強力な抗腫瘍効果が期待できる。
[0050] 〔2〕本発明の癌遺伝子治療薬とその好適な使用例
本発明の癌遺伝子治療薬は、キャリアー細胞投与に対する生体の CTL反応を誘 導するために投与される免疫処置用ウィルスと、オンコリティックウィルスを感染させ、 同ウィルスを生体の腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞とを組み合わせたも の、つまり、予め投与される免疫処置用ウィルスと、その後に投与されるキャリアー細 胞との 2種類の薬剤を組み合わせたものであり、予めアデノウイルス等のウィルス投 与により免疫処置 (事前免疫 (ィムナイゼーシヨン) )を施した後、オンコリティックウイ ルスを感染させたキャリアー細胞を投与することで、生体の CTL反応が誘導'惹起さ れ、 in vivoにおいて劇的な抗腫瘍効果を得ることができる。
[0051] 実際に免疫機能が正常な syngenicモデルマウスを使った実験において、本発明の 癌遺伝子治療薬は劇的な抗腫瘍効果を示した。詳細は後述するが、 (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに卵巣癌細胞 OVHMを皮下移植し、その後、卵巣癌特異的プロモ 一ターを導入したオンコリティックアデノウイルスを感染させたキャリアー細胞 (A549 細胞）を局所注射したところ、 3ヶ月前に予めアデノウイルス (Ad- β -gal)により免疫 処置を施こしたマウスでは、投与開始後 3-4日で明らかな抗腫瘍効果を示し、 9日後 に腫瘍は完全に消失し、リンパ節転移も消失した（図 7および図 18以下参照)。
[0052] このように、抗体産生があるにもかかわらずむしろ免疫力のあるマウスでより強力か つ劇的な抗腫瘍効果が得られたのは、免疫処置用アデノウイルスの投与によって生 体の CTL反応 (細胞障害性 T細胞を介した細胞障害活性)が誘導 ·惹起されたため と考えられる。つまり、従来のウィルスによる癌遺伝子治療は、抗体産生により頻回投 与ができないことが難点とされていたが、本発明の癌遺伝子治療薬は、生体の免疫 機構を利用してウィルスが感染した標的腫瘍細胞を攻撃させることにより、むしろこれ を武器に変えるものといえる。
[0053] 免疫処置用ウィルスとオンコリティックウィルスとは同種類のものを使用することが好 ましい。免疫処置用ウィルスには非増殖型のものおよび Z又は不活ィ匕したものを使 用することが好ましぐ非増殖型のものを更に紫外線照射等により DNAを破壊し不 活ィ匕したものがより好ましい。例えば、免疫処置用ウィルスにアデノウイルスを使用す る場合は、 E1領域が欠失したものおよび Z又は紫外線照射により DNAを破壊し不 活ィ匕したものを使用するとよい。このように、免疫処置用ウィルスには、増殖型ウィル スを紫外線照射等により不活ィ匕したものを使用してもよい。
[0054] 後述の実施例では、免疫処置用ウィルスとして、 E1領域が欠失し、サイトメガロウイ ルス (CMV)プロモーターの制御下に 13 -galactosidase ( β -gal)をコードする LacZ 遺伝子が組み込まれたアデノウイルス (Ad— 18— gal)を使用した。勿論、免疫処置用 ウィルスとしてはこれに限定されるものではなぐ増殖型アデノウイルスを紫外線 (UV )で不活ィ匕したものでもよぐさらに、 LacZ遺伝子ほか何らの遺伝子も組み込まれて おらず、 polyA配列のみの非増殖型アデノウイルス (Ad-polyA)を紫外線照射によ り不活ィ匕して使用することは好まし 、。
[0055] 本発明の癌遺伝子治療薬において、免疫処置用ウィルスの投与量は、患者のウイ ルスに対する抗体価、腫瘍の大きさ'種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応 じて適宜選択すればよいが、ウィルスに対する抗体が陽性か陰性かに応じて投与量 を変更することは好ましい。例えば、免疫処置用ウィルスおよびオンコリティックウィル スにタイプ 5のアデノウイルスを使用する場合、当該アデノウイルスに対する抗体陰性 (一)の患者には免疫処置用ウィルスの投与量をおよそ 105ウィルス粒子以上 1011ウイ ルス粒子以下とする一方、当該アデノウイルスに対する抗体陽性（+)の患者には免 疫処置用ウィルスの投与量をおよそ 102ウィルス粒子以上 107ウィルス粒子以下とす る。免疫処置用ウィルスの投与方法は特に限定されるものではないが、皮内注射ま たは皮下注射の方法により投与することが好ましい。
[0056] なお、実験などでマウス、ラット等の動物に対して本発明の癌遺伝子治療薬を投与 する場合は、体重差を考慮してヒトに投与する場合のおよそ 1000分の 1量に各薬剤 の投与量を設定すればよい。
[0057] 免疫処置用ウィルス投与力 キャリアー細胞投与までの期間はおよそ 2週間以上 3 ヶ月以下に設定することができるが、できるだけ短期間であることが望ましい。後述の 実施例では、免疫処置用ウィルス (アデノウイルス）を紫外線照射により不活化するこ とで、上記期間を 3週間以上 4週間以下程度に短縮することができるようになった。
[0058] ウィルス感染キャリアー細胞の投与量などについては前述した力 キャリアー細胞 によるオンコリティックウィルスの 1回の投与量をおよそ 109ウィルス粒子以上 1014ウイ ルス粒子以下に、キャリアー細胞に対するオンコリティックウィルスの感染量を、およ そ 0. Ivp/cell以上 2000vp/cell以下（より好ましくは 5vp/cell以上 500vp/cell以下、さ らに好ましくは 150vp/cell以上 400vp/cell以下）に設定することができる。
[0059] 免疫処置用ウィルスの投与と共に、またはその前後に、腫瘍免疫のため腫瘍細胞（ 癌細胞）を投与することは好ましい。即ち、免疫処置用ウィルスによるィムナイゼーシ ヨン時、またはその前後に、腫瘍細胞によるワクチネーシヨンを行う（予め放射線、エタ ノール、ホルマリン等処理した腫瘍細胞を投与することにより、治療対象の腫瘍細胞 に対する生体の免疫応答を高めるようにする）ことは好ま 、。
[0060] 上記ワクチネーシヨン (腫瘍免疫）に使用する腫瘍細胞としては、患者由来の腫瘍 細胞が望ま ヽが、それと類似した抗原を提示すると考えられる一般に入手可能な 腫瘍細胞を使用してもよい。後述の実施例では、卵巣癌 (OVHM)に対する治療効 果を調べる実験で、治療対象の腫瘍細胞とは種類の異なる腫瘍細胞 (扁平上皮癌 細胞 SCC7や肺癌細胞 A549細胞）を腫瘍免疫に使用した場合にも、良好な癌治療 効果が認められた。 [0061] 上記ワクチネーシヨン (腫瘍免疫）にお 、て、腫瘍細胞の投与量は特に限定される ものではないが、例えば、およそ 105細胞数以上 101(>細胞数以下に設定することが できる。腫瘍細胞への放射線の照射量は、 120Gy以上 600Gy以下 (より好ましくは 2 OOGy以上 500Gy以下)程度に設定することが好ましぐ腫瘍細胞の投与方法は、 皮内注射または皮下注射の方法により投与することが好ましい。
[0062] さらに、治療対象の癌におけるウィルス産生量を高めるために、鉄剤の投与および Z又はボルフイリンィ匕合物の投与を行ってもよい。ボルフイリンィ匕合物としては、 5—ァ ミノレブリン酸 (5— aminolevulinic acid : ALA)、へマトポノレフイリン (hematoporphyrin)、 フォトフィリン (photofrin)等が例示される。鉄剤としては、経口剤として硫酸第一鉄（ FeSO )、タエン酸第一鉄、静注用鉄剤としてコンドロイチン硫酸鉄、含糖酸化鉄が例
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示される。投与方法は特に限定されるものではないが、本発明の癌遺伝子治療薬と ともに、注射剤あるいは経口剤として投与することが好ましい。
[0063] 実際に、鉄剤 (Fe)および Z又は 5—アミノレブリン酸 (ALA)を投与することにより、 オンコリティックアデノウイルス AdE3-lA1.3Bの癌細胞増殖抑制効果を著しく亢進す ることができた（図 15—17および図 28参照）。
[0064] キャリアー細胞と共に、ァテロコラーゲン（コラーゲンのテロペプチド結合のみをぺプ シン処理などで切断し、分子量を小さくすることで水溶性としたもの）を投与することも 好ましい。後述の実施例に示すように、ァテロコラーゲンをキャリアー細胞と同時投与 した場合は、副作用による死亡率が激減した（図 24)。これは、ァテロコラーゲンによ りオンコリティックアデノウイルスの拡散が抑制されると共に抗アデノウイルス抗体に対 するブロックが生じたためと考えられる。
[0065] したがって、ァテロコラーゲンをキャリアー細胞と同時投与することにより副作用を抑 え、オンコリティックウィルスの高投与が可能になる。ァテロコラーゲンは、市販品（例 えば、株式会社高研の製品）を使用してもよいし、あるいは、コラーゲンをペプシン処 理するなどして製造したものを使用してもよい。ァテロコラーゲンは、キャリアー細胞と 共に注射液に混ぜて投与することが好ましぐ薬液中濃度 0. 01-3. 0% (wZv)程 度で十分効果を発揮すると考えられる。（後述の実施例では、薬液中 0. 1-0. 2%と いう低濃度でも十分効果が認められた。 ) [0066] また前述したように、免疫反応を高めるため、キャリアー細胞に、オンコリティックウイ ルスのみならず、 GM— CSF発現ベクターをも感染させ、いわばウィルスベクターをダ ブルで感染させたキャリアー細胞を投与することは好ましい。（あるいは、両ベクター をそれぞれ個別に感染させたキャリアー細胞を同時に投与する方法としてもよい。）
[0067] GM— CSF発現ベクターには、オンコリティックウィルスと同種類のウィルスベクター を使用することが好ましい。例えば、オンコリティックウィルスにアデノウイルスを使用 する場合、 GM— CSF発現ベクターには、 E1領域が欠失し、 GM-CSF ( granulocyte-macrophage colony stimulating factor:顆粒球 ·マクロファ ~~ンコロニ1 ~~ 刺激因子）をコードする GM— CSF遺伝子が組み込まれたアデノウイルスを使用する ことができる。
[0068] また、このようにウィルスベクターをキャリアー細胞に感染させる場合は、オンコリティ ックウィルスおよび GM— CSF発現ベクターの両者を合わせた感染量を、およそ 5ウイ ルス粒子 Z細胞以上 2000ウィルス粒子 Z細胞以下とする。
[0069] 実際に GM— CSF発現ベクターを使用することで、非常に優れた癌治療効果が認 められた（図 27)。
[0070] その他、 GM— CSF発現ベクターを使用する代わりに、 GM— CSF蛋白をキャリアー 細胞と共に注射液に混ぜる、あるいは経静脈的に全身投与する方法も考えられる。
[0071] 本発明の癌遺伝子治療薬の使用方法は、勿論、上述した方法に限定されるもので はなぐ様々な使用例が考えられる。例えば、オンコリティックウィルスの感染力を高 めるために、本発明の癌遺伝子治療薬を他の杭がん剤あるいは放射線照射などと併 用してちょい。
[0072] 本発明の癌遺伝子治療薬の好適な使用例について、（1)免疫処置用ウィルスに対 する抗体が陰性の患者の場合と、 (2)同抗体が陽性の患者の場合とに分けて説明す る。
[0073] 上記（1)の場合、免疫処置用ウィルスには、例えば、前述の非増殖型アデノウィル スを紫外線照射により不活化して使用する。投与量はおよそ 105vpから ΙΟ^νρ程度 とする。免疫処置用ウィルスの投与と共に、腫瘍免疫のため 200Gy程度で放射線処 理した患者由来の腫瘍細胞 (癌細胞)をおよそ 105個から 101(>個投与する。免疫処置 用ウィルスおよび腫瘍細胞の投与方法は、皮内注射または皮下注射とする。
[0074] 免疫処置用ウィルスおよび腫瘍細胞の投与からおよそ 3— 4週後に、キャリアー細胞 を腫瘍内注射にて投与する。キャリアー細胞の投与量は、例えば 1回につき、 1 X 10 7個- 1 X 101(>個程度とする。キャリアー細胞には A549細胞を使用し、 150Gy力も 4 OOGy程度で放射線処理した後、投与する。オンコリティックウィルスおよび GM-CS F発現ベクターにはアデノウイルスを使用し、キャリアー細胞にはそれぞれ、 250 vp/cell程度、 5— 20vp/cell程度感染させる。注射液には液中濃度およそ 0. 1-0. 2 %となるようァテロコラーゲンを混ぜて投与する。また同時に、鉄 (Fe)を 40-100mg 程度静注する。あるいは、同時に、 ALAを 2-2000mg腫瘍内に投与する。
以上を 1回として、キャリアー細胞等を 1 6回投与する。複数回投与する場合は、 連日あるいは 2, 3日おきに投与する。
[0075] 患者が抗体陽性の上記（2)の場合、免疫処置用ウィルスの投与量をおよそ 105vp 以下とする以外は、上記（1)と同様に、本発明の癌遺伝子治療薬を投与すればよい
[0076] 本発明の癌遺伝子治療薬の具体例としては、（1)免疫処置用ウィルスとキャリアー 細胞とを組み合わせたもの、（2)さらに、キャリアー細胞に感染させるオンコリティック ウィルスを組み合わせたもの、（3)上記（1)又は（2)の組み合わせに、さらに、ァテロ コラーゲンを組み合わせたもの、（4)上記（1)一（3)の組み合わせに、さらに、 GM— CSF発現ベクターを組み合わせたもの、（5)上記（1)一（4)の組み合わせに、さらに 、ウィルス産生量を高めるための鉄剤および Z又はボルフイリンィ匕合物を組み合わせ たもの、（6)上記（1)一（5)の組み合わせに、さらに、腫瘍免疫のため投与される腫 瘍細胞を組み合わせたもの、（7)上記（1)一 (6)の組み合わせに、保存、感染'培養 、医薬製剤の調製などに必要な化合物 (試薬、緩衝液、酵素等)、または容器 (反応 用、感染'培養用、保存用等)などを組み合わせたもの、を挙げることができる。 実施例
[0077] 以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら 実施例によって何ら限定されるものではない。
[0078] 〔実施例 1：キャリアー細胞の選別と、抗体存在下における抗腫瘍効果〕 既存の癌細胞株のうち、キャリアー細胞として強力な癌細胞増殖抑制効果を発揮 する細胞株を選別するため、以下の実験を行った。
[0079] キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウィルスには、アデノウイルス AdE3—l Al. 3Β (ΙΑΙ. 3Β)を使用した。このアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bは、 E1A遺伝 子および E3遺伝子を有し、かつ、 E1A遺伝子の上流に腫瘍特異的プロモーターと して卵巣癌特異的 1A1. 3Bプロモーター（IAL 3Bプロモーター）を有するアデノウ ィルスである。このアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを種々のキャリアー細胞に対し 50 Ovp/cellで 2日間感染させた後、同キャリアー細胞を培養 2日目の卵巣癌細胞株 HE Yに加え、培養 5日目に同細胞株 HEYの in vitro増殖抑制効果を調査した。
[0080] 上記実験結果を図 1に示す。同図グラフの縦軸は、各細胞株について 50%の増殖 抑制効果 (IC50)が得られる細胞数を示し、細胞数が少ない細胞株ほど増殖抑制効 果が高いことになる。同図に示すように、今回調査した癌細胞株では、 293細胞、 A5 49細胞、 SW626細胞、 HT— 3 (HT— III細胞）細胞の順に高い抗腫瘍効果を示した 。 293細胞、 A549細胞および SW626細胞は、従来キャリアー細胞として使用され ていた PA— 1細胞に比べて、およそ 100倍程度の高い増殖抑制効果を示した。 HT -3細胞についても、 SW626細胞と同程度の高い増殖抑制効果を示した。
[0081] 次に、オンコリティックウィルス単独の場合とキャリアー細胞を用いた場合とで、ウイ ルス抗体存在下、増殖抑制効果がどのように変化するかを調べた。キャリアー細胞に は 293細胞を用い、この 293細胞に上記アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 2日間感 染させ、得られたアデノウイルス AdE3— 1A1. 3B感染 293細胞およびその細胞上 清（AdE3- 1A13B 293 cell+SUPT)を、抗アデノウイルス抗体存在下、 12ゥエルプレー トに投与した。各ゥエルには前日に 5万個程度の卵巣癌細胞株 HEYがまき込まれて いる。抗アデノウイルス抗体には、 600倍の抗体価を有するものを様々な抗体価に希 釈して用いた。同様に、オンコリティックウィルス単独の場合として、アデノウイノレス Ad E3-1A1. 3Bを、抗アデノウイルス抗体存在下、 1ゥエル lOOOvp/cellで 12ゥエルプ レートに投与した。そして、それぞれの場合において培養 5日目に癌細胞 (HEY細 胞)の増殖抑制効果を調べた。
[0082] 上記実験結果を図 2に示す。同図グラフの縦軸は、 50%の増殖抑制効果 (IC50) が得られるときの抗アデノウイルス抗体の希釈度を示す。つまり、 293細胞を用いた 場合は、 5倍程度の希釈（120倍の抗体価)でも 50%の増殖抑制効果が得られ、ァ デノウィルス単独の場合は、 600倍程度の希釈（1倍の抗体価）によって 50%の増殖 抑制効果が得られた。このように、キャリアー細胞を用いた場合は、抗体価の高い条 件下においても増殖抑制効果を発揮することが示された。
[0083] 同様に、抗アデノウイルス抗体存在下、 HEY細胞に対する増殖抑制効果を、（1)ァ デノウィルス感染 293細胞の上清と細胞成分 (AdE3-lA13B 293 cell+SUPT)、（2)ァ デノウィルスを含む細胞上清（AdE3-lA13B, SUPT)、（3)アデノウイルスを含む細胞 上清を 0. 2 mのフィルターで処理したもの（AdE3- 1A13B, SUPT, filter) , (4)アデノ ウィルス単独（AdE3-lA13B)、のそれぞれの場合について調べた。その結果を図 3 に示す。同図グラフの縦軸は、 50%の増殖抑制効果 (IC50)が得られるときの抗ァ デノウィルス抗体の希釈度を示す。同図に示すように、キャリアー細胞（293細胞）を 用いた場合に、他の場合と比べてより強力な抗腫瘍効果が得られた。
[0084] さらに上記と同様の実験で、 293細胞、 A549細胞、 SW626細胞、 HT— 3細胞の 各キャリアー細胞にっ 、て、 600倍の抗体価を有する抗アデノウイルス抗体存在下（ Ab (+) )、または非存在下 (Ab (—) )における、癌細胞株 HEY細胞に対する増殖抑 制効果を検討した。その結果を図 4に示す。同図グラフの縦軸は、培養 5日目の癌細 胞数を示す。同図に示すように、上記 4種類の細胞のうち、 A549細胞をキャリアー細 胞に用いた場合に最も強力な増殖抑制効果を示した。即ち、充分量の抗ァデノウィ ルス中和抗体存在下にアデノウイルス感染 A549細胞を投与すると、標的癌細胞の 増殖は抗体存在下にもかかわらずほぼ完全に抑制された。他の 3種類の細胞につい ても、抗体存在下、充分な増殖抑制効果が得られた。
[0085] ウィルスによる癌遺伝子治療は、ウィルスに対する中和抗体産生により頻回投与が できないことが難点とされていた力 キャリアー細胞を用いることで、細胞間相互作用 により標的癌細胞に直接的に感染が成立することによって、頻回投与が可能となる。 さらに、キャリアー細胞として上記 4種類の細胞を用いることで、強力な抗腫瘍効果を 得ることができる。
[0086] 〔実施例 2：ヌードマウス皮下腫瘍モデルにおける in vivo抗腫瘍効果〕 次に、ヌードマウス皮下腫瘍モデルを用いて、上記アデノウイルス AdE3—lAl. 3 Bを感染させた各キャリアー細胞の in vivo抗腫瘍効果を検討した。実験では、生後 5 週のヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞 RMG— 1を移植し、 4週間後、直径約 10— 15mmになった巨大腫瘍に対し、各キャリアー細胞を 6回腫瘍内注射し、腫瘍体積 の変化を観察した。その結果を図 5のグラフに示す。グラフ中、黒四角印の「control」 は PBS緩衝液を 6回腫瘍内注射した結果、黒丸印の「AdE3-lA1.3B」は上記アデノ ウィルス AdE3— 1A1. 3Bをマウス 1匹に 1 Χ 10ωウィルス粒子投与した結果、黒三角 印はアデノウイルス AdE3— 1A1. 3Bを 250vp/cell感染させた SW626細胞をマウス 1匹に I X 107個投与した結果、黒菱形印はアデノウイルス AdE3— 1A1. 3Bを 25 vp/cell感染させた 293細胞をマウス 1匹に 1 X 107個投与した結果、白四角印はアデ ノウィルス AdE3— 1A1. 3Bを 50vp/cell感染させた A549細胞をマウス 1匹に 1 X 10 7個投与した結果、である。同図に示すように、 293細胞および A549細胞をキャリア 一細胞に用いた場合は、投与後 50日経過すると、直径約 10— 15mmの巨大腫瘍が 完全に消退した。 SW626細胞は、 98%の増殖抑制効果を示した。
[0087] 上記と同様の実験を、生後 5週のヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞 PA— 1を移 植して行った。その結果を図 6に示す。同図に示すように、 293細胞および A549細 胞をキャリアー細胞に用いると、直径約 10— 15mmの巨大腫瘍が完全に消退した。 S W626細胞は、 5匹中 4匹のマウスにおいて腫瘍が完全に消失した。
[0088] 〔実施例 3：免疫力のある皮下腫瘍モデルマウスにおける in vivo抗腫瘍効果〕
次に、免疫機能が正常な (C57BL/6 X C3/He)Flマウスを用いて本発明の癌遺伝子 治療薬の in vivo抗腫瘍効果を検討した。本実験では、 (1) syngenicモデルマウスに対 し同種の卵巣癌細胞 OVHMを皮下移植し、その 10日後以降形成された 5— 10mm の皮下腫瘍に対し、上記アデノウイルス AdE3—lAl . 3Bを 250vp/cell感染させた 放射線処理 (放射線治療)後の A549細胞を 6回腫瘍内投与した場合、 (2)生後 7週 の syngenicモデルマウスを免疫処置用ウィルスであるアデノウイルス投与により予め 免疫し、その 3ヶ月後、上記 (1)の場合と同様に、卵巣癌細胞 OVHMを皮下移植し、 その 10日後以降、上記アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 250vp/cell感染させた放 射線処理後の A549細胞を 6回腫瘍内投与した場合、 (3)コントロールとして PBS緩 衝液を 6回腫瘍内投与した場合、のそれぞれの場合にっ ヽて抗腫瘍効果を検討した
[0089] 上記実験結果を図 7のグラフに示す。グラフ中、黒四角印の「control」は上記 (3)の コントロールの場合の結果であり、黒丸印の「Ad (-)→A549」は上記 (1)の免疫処置用 アデノウイルスを投与しな力つた場合の結果であり、黒三角印の「Ad(+)→A549」は上 記 (2)の免疫処置用アデノウイルスを投与した場合の結果である。なお、免疫処置用 アデノウイルスには、 E1遺伝子を有しない非増殖型のアデノウイルスを使用し、より 具体的には、 CMVプロモーターの下流に LacZ遺伝子が挿入されたアデノウイルス を使用した。同図に示すように、予めアデノウイルスによる免疫をしていない上記 (1) の場合では、コントロールに比べて 20%の抗腫瘍効果を示したのに対し、予めアデ ノウィルスによる免疫処置を施した上記 (2)の場合では、投与開始後 3— 4日で明らか な抗腫瘍効果を示し、 9日後に腫瘍は完全に消失し、リンパ節転移も消失した。この ように、抗体産生があるにも関わらずむしろ免疫力のあるマウスでより強力かつ劇的 な抗腫瘍効果が得られたのは、免疫処置用アデノウイルスの投与によって生体の CT L反応が誘導 ·惹起されたためと考えられる。
[0090] オンコリティックアデノウイルスは、細胞間相互作用によりキャリアー細胞力 標的腫 瘍細胞へと感染し、腫瘍細胞内で特異的に増殖し、腫瘍細胞を融解 ·殺傷する cell lysis作用を発揮すると考えられるが、本発明の癌遺伝子治療薬においては、予め免 疫処置用アデノウイルスを投与することによって、オンコリティックアデノウイルスに感 染した標的腫瘍細胞を排除する生体の強!ヽ CTL反応が誘導され、アデノウイルス感 染腫瘍細胞の完全な自然排除が誘導されると考えられる。
[0091] 標的腫瘍細胞へのアデノウイルスの感染方法の 1つとして、アデノウイルスによる細 胞融合が考えられる。図 8は、 A549細胞をまき込んだゥエルに、紫外線照射により不 活ィ匕したアデノウイルスを 1細胞当たり 10000ウィルス粒子投与し、一晩培養後、顕 微鏡により観察した結果を示すものである。同図矢印に示すように、アデノウイルスの 投与によって細胞融合が起こり、多核細胞が散見された。アデノウイルスを投与しな 力つた A549細胞では、このような変化は観察されな力つた（図 9参照)。
[0092] 細胞融合以外に考えられる感染方法としては、キャリアー細胞の標的細胞への細 胞接着さらに局所的なアデノウイルスのバーストあるいはアデノウイルスを含むキヤリ ァー細胞 fragmentによる標的腫瘍細胞へのアデノウイルスの感染が成立すると考えら れる。何れの方法にせよ、アデノウイルスに感染した標的腫瘍細胞においては、腫瘍 特異的プロモーターを有するアデノウイルスが増加し強力な免疫原となって (ある ヽ はアデノウイルスに感染した標的腫瘍細胞が有する癌特異的ペプチドを二次的に抗 原認識することによって）、 CTL反応により腫瘍細胞が排除されると考えられる。
[0093] 〔実施例 4：ミツドカインプロモーターを使用した場合の抗腫瘍効果〕
次に、ミツドカインプロモーターを使用した場合の抗腫瘍効果を検討した。図 10 (a) は、 1一 21のヒト手術標本におけるミツドカイン（MK) mRNAの発現を RT— PCRで 検討した結果である。同図に示すように、神経膠芽腫 (glioblastoma) , 未分化星細 胞腫 (anaplastic astrocytoma)と 、つた悪'性グリオ一マ (malignant glioma)および瀰漫 性星細胞腫（diffiise astrocytoma)においてミツドカイン mRNAの過剰発現が認めら れた。このように、ミツドカインは脳腫瘍など多くの癌において過剰発現が認められる
[0094] 図 10 (b)は、上記と同様の方法により、悪性ダリオ一マの 4つの細胞株におけるミツ ドカイン mRNAの発現を RT— PCRで検討した結果である。同図に示すように、 4つ の細胞株のうち、 U87MGでは発現はなぐ U251MG、 LN319、 U373MGではミ ッドカイン mRNAの過剰発現が認められた。
[0095] 図 10 (c)は、上記各細胞株におけるミツドカイン蛋白の発現をウェスタンブロット解 祈によって検討した結果であり、 mRNAと同様に U87MGでは発現はなぐ U251M G、 LN319、 U373MGではミツドカイン蛋白の過剰発現が認められた。
[0096] 次に、ミツドカインのプロモーターアツセィを行った。実験では、長さが異なる 2つの ミツドカインプロモーター（600塩基と 2300塩基）の活性を比較した。それぞれのプロ モーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたプラスミド（PGL3-MK600およ び PGL3-MK2300)を上記各細胞株に導入し、それぞれのルシフェラーゼ活性を調べ ることによりプロモーター活性を評価した。その結果、図 11に示すように、悪性ダリオ 一マの細胞株では、長さ 600塩基のほうが長さ 2300塩基より高いプロモーター活性 を示した。 [0097] 図 12 (a)は、今回設計した、ミツドカインプロモーターを有するオンコリティック (細胞 融解型)アデノウイルスの構造を模式的に示す図である。長さ 600塩基または 2300 塩基のミツドカインプロモーターは、 552bpの位置に導入された。
[0098] 図 12 (b)は、 3種類のアデノウイルスを上記各細胞株に感染させ、それぞれの細胞 株における E1A蛋白の発現をウェスタンプロット解析によって検討した結果である。 同図に示すように、長さ 600塩基のミツドカインプロモーターを有するアデノウイルス ( AdMK600)を感染させた場合、ミツドカインを発現する U251MG、 LN319、 U373 MGでのみアデノウイルスの El A蛋白の発現が観察された。これに対して、野生型の アデノウイルス (AdWild)では正常脳細胞を含めすベての細胞に E1A蛋白の発現 が観察され、コントロールウィルスである AdLacZでは!/、ずれの細胞にぉ 、ても E1A 蛋白の発現が観察されな力つた。
[0099] 図 13 (a)は、 3種類のアデノウイルスによる癌細胞増殖抑制効果を比較検討した結 果である。野生型のアデノウイルス (AdWild)ではすベての細胞にお!、て強!、増殖 抑制効果を示した力 ミツドカインプロモーターを有するアデノウイルス (AdMK600 および AdMK2300)では、ミツドカインを発現する U251MG、 LN319、 U373MG においてのみ増殖抑制効果を示し、これらの値は、ミツドカイン mRNAの発現量、プ 口モーター活性とよく相関した。また、長さ 2300塩基のミツドカインプロモーターを有 するアデノウイルス AdMK2300より AdMK600のほうが強い増殖抑制効果を示した
[0100] 図 13 (b)は、アデノウイルスの E3領域の増殖抑制効果に与える影響を検討した結 果であり、同図に示すように、 E3領域のある AdMK600では E3領域のないアデノウ ィルス (AdMK600- Δ E3)より 10倍程度の強 、増殖抑制効果を示した。
[0101] 図 13 (c)は、腫瘍の直径 5— 10mm程度の大きさのヌードマウス皮下移植モデルに おけるアデノウイルスの抗腫瘍効果を検討した結果である。図中、黒菱形印は野生 型のアデノウイルス AdWildを投与した結果、黒四角印はミツドカインプロモーターを 有するアデノウイルス AdMK600を投与した結果、黒三角印は LacZ遺伝子が挿入 されたアデノウイルス Ad- β -galを投与した結果、黒丸印は PBS緩衝液のみ投与した 結果である。同図に示すように、ミツドカインを発現しない U87MGでは野生型のアデ ノウィルスのみ抗腫瘍効果を示し、ミツドカインを発現する U373MGでは AdMK60 0と AdWildは完全に腫瘍の消失をもたらし、 PBS緩衝液のみ注射したコントロールと AdLacZを注射したものとの間には大きな差異は認められなかった。
[0102] さらに、上記ミツドカインプロモーターを有するアデノウイルス（Ad- MK600)をキヤ リア一細胞に感染させ、当該ウィルス感染キャリアー細胞の抗腫瘍効果を Ad-MK6 00単独投与の場合と比較した。実験では、 293細胞および A549細胞をキャリアー 細胞に使用した。ヌードマウス 5週令に上記 U373MG細胞を移植し、 3週間後に 10 —15mmの巨大腫瘍が得られた後、ウィルス感染キャリアー細胞または Ad-MK600 のみを投与し、その 4週間後に腫瘍体積の大きさを比較した。その結果を図 14に示 す。図中、「Ad-MK600」は Ad-MK600を単独投与した結果、「293」「A549」はそれ ぞれ 293細胞、 A549細胞をキャリアー細胞に用いたウィルス感染キャリアー細胞を 投与した結果である。同図に示すように、ウィルス感染キャリアー細胞を投与したとき は完全に腫瘍が消失した。一方、 Ad-MK600を単独投与したときはコントロール（ control)と殆ど差は認められなかった。
[0103] これまでの実験結果から、キャリアー細胞に A549細胞、 293細胞などを使用し、ォ ンコリティックウィルスに 1A1. 3Bプロモーター又はミツドカインプロモーターを有する アデノウイルスを使用することによって、実際に卵巣癌、悪性ダリオ一マに対する良好 な治療効果が認められた。ミツドカインプロモーターは、悪性ダリオ一マのほか種々の 悪性腫瘍に対して使用可能であり、悪性ダリオ一マ以外の癌治療にも有効と考えら れる。
[0104] 〔実施例 5：アデノウイルス AdE3- 1A1.3Bの増殖抑制効果に対する Feおよび ALAの 卵巣癌細胞 HEYを 12well dishに 10000/well播いた後、翌日に FeSOを 50 μ g/ml
4 、
5 g/ml、 0.5 /z g/ml、 0 /z g/mlの各濃度において入れ、全ての wellに細胞障害型ァ デノウィルス AdE3- 1A1.3Bを入れ、 5日後にアデノウイルスの増殖抑制効果を IC50 で評価した。その結果を図 15に示す。図中縦軸は、各場合における IC50のウィルス 投与量 (vp/cell)を相対的に示すものである。同図に示すように、 FeSO 50 /z g/mlお
4
よびアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ約 20倍、 FeSO 5 g/mlおよびアデノウイルス併用では、アデノウイルス単独に比べ約 8倍の増殖抑 制効果を示した。
[0105] 次に、卵巣癌細胞株 HEYを 12well dishに 10000/well播いた後、翌日に
5— aminolevulinic acid ( ALA)を 50 μ g/ml、 5 μ g/ml、 0.5 μ g/ml、 0 μ g/mlの ^度に おいて入れ、全ての wellに細胞障害型アデノウイルス AdE3-lA1.3Bを入れ、 5日後に アデノウイルスの増殖抑制効果を IC50で評価した。その結果を図 16に示す。図中 縦軸は、各場合における IC50のウィルス投与量 (vp/cell)を相対的に示すものであ る。同図に示すように、 ALA 50 g/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、ァ デノウィルス単独に比べ約 100倍の増殖抑制効果を示した。
[0106] さらに、卵巣癌細胞株 HEYを 12well dishに 10000/well播いた後、翌日に FeSOを
4
50 μ g/ml、 5 μ g/ml、 0.5 μ g/ml、 0 μ g/mlの各濃度にお!ヽて入れ、各 wellに細胞障害 型アデノウイルス AdE3-lA1.3Bおよび 5- aminolevulinic acid (ALA) 50 g/ml、又は コントロールとしてアデノウイルス単独を入れ、 5日後にアデノウイルスの増殖抑制効 果を IC50で評価した。その結果を図 17に示す。図中縦軸は、各場合における IC50 のウィルス投与量 (vp/cell)を相対的に示すものである。同図に示すように、 FeSO 50
4 μ g/ml、 ALA 50 g/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単 独に比べ、約 1000倍の増殖抑制効果を示し、 FeSO 5 μ g/ml、 ALA 50 μ g/mlおよ
4
びアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ、約 700倍の増殖 抑制効果を示し、 FeSO 0.5 μ g/ml、 ALA 50 μ g/mlおよびアデノウイルスを併用した
4
場合では、アデノウイルス単独に比べ、約 200倍の増殖抑制効果を示した。
[0107] 以上のように、 ALAおよび Feは、オンコリティックアデノウイルス AdE3- 1A1.3Bの増 殖抑制効果を著しく亢進することが明ら力となった。この理由は、 j8 -gal assayにより アデノウイルスの感染能力を高めること、 PFU assayによりアデノウイルスの産生量の 増加によることが明らかとなっており、 ALAおよび Feは、アデノウイルスの感染力を 高め、産生量を増加させること、つまりアデノウイルスの癌細胞内への感染力増加と 細胞内における産生量増加とともに抗腫瘍効果を著しく高めることが明らかとなった。
[0108] ALAは、ポルフィリン代謝物で従来より癌細胞に取り込まれ、その代謝物である protoporphyrin IXが蓄積されやすいことが知られており、これが光増感作用を有する ことよりエキシマダイレーザーと併用され、表在性癌の PDT治療（photodynamic therapy)に用いられてきた。
[0109] 上記 protoporphyrin IXは、 Feと結合することにより hemeとなり、細胞内で cytcrome 等の heme蛋白を形成する。この heme蛋白は、細胞内ミトコンドリアで呼吸器系に関与 しており、 ATP産生に働き蛋白合成に関与する。このように、 heme蛋白は、アデノウ ィルス感染時のアデノウイルス産生のための蛋白合成に関与するため、これらボルフ ィリン代謝が亢進することは、アデノウイルス産生増加につながる可能性が高いと考 えられる。
[0110] したがって、本発明の癌遺伝子治療薬、癌遺伝子治療方法において、これら Feお よび Z又は ALA等のボルフイリンィ匕合物を併用することにより、さらに治療効果を高 めることが期待できる。即ち、 Feおよび Z又は ALA等のボルフイリンィ匕合物を併用す ることにより、直接的な抗腫瘍効果の増カロ、さらには抗体存在下の感染抑制状態に おいて、標的細胞のアデノウイルス産生増加による CTL responseの亢進により、 syngenic mouse modelにおいて抗腫瘍効果が高まり、ヒトにおいても同様な良好な抗 腫瘍効果を呈するものと考えられる。
[0111] また、オンコリティックウィルスを用いた癌遺伝子治療において、キャリアー細胞を使 用しな 、場合であっても、 Feおよび Z又は ALA等のポルフィリン化合物を併用する ことにより、治療効果を高めることが期待できる。
[0112] 〔実施例 6 :本発明の癌遺伝子治療薬による癌治療法の最適化の検討〕
本発明の癌遺伝子治療薬による癌治療法の最適化を図るため、以下一連の実験 を行った。
[0113] まず、図 7に示す実験と同様に、免疫機能が正常な皮下腫瘍モデルマウス（
(C57BL/6 X C3/He)Flマウス）を用いて、本発明の癌遺伝子治療薬の in vivo抗腫瘍 効果を検討した。本実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスを免疫処置 用ウィルスの投与により事前免疫し、その 12週後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1匹 あたり I X 106個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成後、上記アデノウイルス AdE3—l Al . 3Bを 250vp/cell感染させた A549細胞 (Ad— A549)を腫瘍内投与した。免疫 処置用ウィルスには、 E1遺伝子を有しない非増殖型のアデノウイルスを使用し、より 具体的には、 CMVプロモーターの下流に LacZ遺伝子が挿入されたアデノウイルス であって、紫外線等による不活ィ匕処理を行って 、な 、アデノウイルス Ad— β galを 使用し、この Ad— 18— galをマウス 1匹あたり 1 X 101Gvp皮内投与した。また、キャリア 一細胞である A549細胞は、 200Gyにて放射線処理後、マウス 1匹につき 1回あたり 5 X 106個、合計 6回腫瘍内投与した。
[0114] 上記実験結果を図 18 (a) (b)に示す。各グラフ中、「Ad- β -gal→Ad-A549jは上記 実験結果であり、「Ad-A549」はキャリアー細胞のみ投与した結果、「Ad- |8 - gal」は免 疫処置用ウィルスは投与せず、治療として Ad- 18 -galのみ投与した結果、「control」は PBS緩衝液を投与した結果である。各群のマウスの数は n= 5である。（a)のグラフは 、各マウスの腫瘍体積を比較的短期間観察した結果であり、（b)のグラフは、各群マ ウスの生存率を長期間観察した結果である。これらの図に示すように、「Ad- |8 -gal→ Ad-A549jでは強力な in vivo抗腫瘍効果が認められた。
[0115] 次に、免疫処置用アデノウイルス投与力 キャリアー細胞投与までの投与間隔につ いて検討を行った。本実験は、この投与間隔を様々なものに変更した点、および、キ ャリア一細胞である A549細胞にアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/cell感染さ せた点以外は、図 18に示す実験と同様に行った。
上記実験結果を図 19 (a) (b)に示す。各グラフ中、「2— 4w」「5— 9w」「10— 15w」「 16— 22w」は、それぞれ、上記投与間隔を 2— 4週、 5— 9週、 10— 15週、 16— 22週の 間に設定した実験結果であり、各群のマウスの数は n= 5である。これらの図に示すよ うに、上記投与間隔を 10-15週に設定したとき最も良好な抗腫瘍効果が得られた。 本実験のように、不活化処理して 、な 、アデノウイルス Ad— β galを免疫処置用ウイ ルスに使用した場合には、当該ウィルス投与後およそ 10— 15週にぉ ヽて T細胞によ る CTL反応が中和抗体による感染抑制に比べ優位になると考えられる。
[0116] 臨床応用を考慮すると、上記投与間隔は短期間であることが望ましい。そこで、不 活ィ匕処理したアデノウイルス Ad— β galを免疫処置用ウィルスに使用することで上 記投与間隔を短くすることができないか検討した。その結果図 20に示すように、紫外 線 (UV)照射し、不活ィ匕処理したアデノウイルス UV— Ad— β galを免疫処置用ウイ ルスに使用した場合は、上記投与間隔を 4週または 3週に設定したときに良好な抗腫 瘍効果が得られること、すなわち、免疫処置用ウィルスを不活化処理することで、上 記投与間隔を 3— 4週程度に短縮できることがわ力つた。
[0117] 上記実験は、不活ィ匕処理したアデノウイルス UV— Ad— β galを免疫処置用ウィル スに使用した点、上記 UV— Ad— 18— galをマウス 1匹あたり 1 X 107vp皮内投与した点 、上記投与間隔を 3週、 4週、 5週または 6週に設定した点、および、キャリアー細胞で ある A549細胞にアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/cell感染させた点以外は 、図 18に示す実験と同様に行った。各群のマウスの数は n= 10である。
[0118] 図 21は、上記 UV— Ad— 18— galを免疫処置用ウィルスに使用した場合の当該ウイ ルスの投与量について検討した結果である。この実験では、上記 UV— Ad— 18— gal の投与量を 1 X 106vpから 1 X ΙΟ^νρの範囲で変更した。また、上記投与間隔は 6週 に設定し、それ以外は図 20に示す実験と同様に行った。その結果、 UV-Ad- iS -g alの投与量 I X 107vpのときに最も良好な抗腫瘍効果が得られた。（この結果から、図 20に示す実験では、 UV— Ad— 18— galの投与量を 1 X 107vpに設定した。）
[0119] 図 22 (a) (b)は、腫瘍免疫 (tumor vaccination)の効果を検討した結果である。上記 UV-Ad- 18 -galをマウス 1匹につき 1 X 107vp皮内投与し、その 10日後に腫瘍免疫 のため放射線照射した卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 106個皮下移植した。同時に、扁平 上皮癌細胞 SCC7または卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 106個皮下移植し、 5— 10mmの 腫瘍を形成したマウスに AdE3-lA1.3B感染 A549細胞を 5 X 106個腫瘍内に 6回投与 したマウス（図中、「OVHM— RT+Ad— j8— gal→SCC7」「OVHM— RT+Ad— j8— gal→ OVHM」）では、コントロール（図中、腫瘍免疫無しに SCC7腫瘍に対してキャリアー 細胞治療した「SCC7」、腫瘍免疫無しに OVHM腫瘍に対してキャリアー細胞治療し た「OVHM」）に比べて腫瘍の成長 ·増殖は著しく抑制され、特に放射線照射した OV HMによって腫瘍免疫し OVHM腫瘍形成したマウスにキャリアー細胞による治療を 行うと、全てのマウスにおいて腫瘍は消失し、再発は認められな力つた。
[0120] 図 23は、非小細胞性肺癌細胞 A549細胞による腫瘍免疫の効果を検討した結果 である。この実験では、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを lOOvp/cell感染させた放 射線処理後の A549細胞をマウス 1匹につき 1 X 106個皮下移植し、その 40日後に 卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 106個皮下移植した。このマウス（図中、「 AdE3-lA1.3B- infected A549→OVHM」）においても、コントロール（図中、腫瘍免疫 無しに OVHM腫瘍形成しキャリアー細胞による治療を行った「OVHM」 )に比べて腫 瘍の成長'増殖は著しく抑制され、生存率は大きく改善した。
[0121] 以上の結果から、種類の異なる癌細胞で腫瘍免疫を行っても抗腫瘍効果があるこ とがわかった。
[0122] 次に、キャリアー細胞と共にァテロコラーゲンを投与した場合の効果について検討 した。この実験では、生後 5— 10週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウイルス AdE3— 1A1. 3Bを所定量感染させた A549細胞を 5 X 106個投与した力 このとき ァテロコラーゲンを混注して最終濃度を 0. 1%とし、アデノウイルス投与に伴う副作用 による死亡率が改善されるかどうかを調べた。その結果を図 24に示す。図中、右側 のバーは、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/celほたは 250vp/cell感染させ た A549細胞と共にァテロコラーゲンを投与した結果、左側および中央のバーは、ァ デノウィルス AdE3— 1A1. 3Bをそれぞれ 5vp/cell、 50vp/cell感染させた A549細胞 を投与した結果 (ァテロコラーゲンは混注せず)である。同図に示すように、ァテロコラ 一ゲンを同時投与した場合は、副作用による死亡率が激減し、投与量も増加すること が可能となった。これは、ァテロコラーゲンによりアデノウイルスの拡散が抑制されると 共に抗アデノウイルス中和抗体に対するブロックが生じたためと考えられる。
[0123] 以上の結果から、ァテロコラーゲンをキャリアー細胞と同時投与することによって副 作用を抑え、アデノウイルスの高容量の投与が可能になることがわかった。
[0124] 次に、不活ィ匕処理していない前記アデノウイルス Ad— 18— galを 1、 2、 3回投与し、 ブースター効果によりそれぞれ血中抗アデノウイルス抗体が増加したマウスにおける 抗腫瘍効果について検討した。この実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマ ウスに、アデノウイルス Ad— j8— galを 1回、 2回または 3回投与し (各回 3週おきに、 1 回あたり 1 X 101Gvp投与）、その後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1匹あたり 1 X 106個 皮下移植し、 5-10mmの腫瘍形成後、放射線処理後のキャリアー細胞を腫瘍内投 与した。キャリアー細胞には、 A549細胞単独、または、 A549細胞と 293細胞とを混 合したものを使用した。
[0125] A549細胞と 293細胞とを混合したものは、マウス 1匹につき、アデノウイルス AdE3 — 1A1. 3Bを 50vp/cell感染させた A549細胞を 3. 75 X 106個、および、アデノウィ ルス AdE3—lAl. 3Bを lOvp/cell感染させた 293細胞を 3. 75 X 106個腫瘍内投与 し、これを 1回として合計 6回腫瘍内投与した。その結果を図 25 (a) (b)に示す。また 、 A549細胞単独の場合は、マウス 1匹につき、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 5 Ovp/cell感染させた A549細胞を 7. 5 X 106個腫瘍内投与し、これを 1回として合計 6 回腫瘍内投与した。その結果を図 26 (a) (b)に示す。図 25および図 26において、「 X 1」「 X 2」「 X 3」は、それぞれ、アデノウイルス Ad— β galを 1回、 2回、 3回投与し た結果である。これらの図に示すように、アデノウイルス Ad— 18— gal数回投与により 抗アデノウイルス抗体プラスのマウスにぉ 、ても、キャリアー細胞による抗腫瘍効果が 認められた。また今回の実験では、 A549細胞単独に比べて、 A549細胞と 293細胞 とを混合したものをキャリアー細胞に使用したほうが成績は良好であった。
[0126] 図 27 (a) (b)は、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bのみならず、 GM— CSF発現べク ターを感染させたキャリアー細胞 (A549細胞）を投与し、かつ、このキャリアー細胞と 共にァテロコラーゲンを投与した場合の in vivo抗腫瘍効果にっ 、て検討した結果で ある。この実験では、図 26に示す実験と同様に、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Fl マウスに、アデノウイルス Ad— j8— galを 1回、 2回または 3回投与し（各回 3週おきに、 1回あたり 1 X 101Gvp投与）、その後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1匹あたり 1 X 106 個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成後、放射線処理後のキャリアー細胞を腫瘍内 投与した。ただし、キャリアー細胞 (A549細胞）には、アデノウイルス AdE3—lAl. 3 Bを 50vp/cell感染させると共に、 GM— CSF発現ベクター（アデノウイルスの E1遺伝 子を欠失した部位に CMVプロモーターの下流に GM— CSF遺伝子を挿入したベタ ター）を 1 Ovp/cell感染させた。こうして調製した放射線処理後の A549細胞を 1回に つき 7. 5 X 106個、ァテロコラーゲン (濃度 0. 1%)と共に腫瘍内投与し、合計 3回（ X 3)腫瘍内投与した。
[0127] 図 27 (a) (b)において、「Ad- j8 - gal→AdE3- 1A1.3B + GMCSF」は上記実験結果で あり、「Ad- j8 -gal→AdE3-l A1.3BJはアデノウイルス AdE3—lAl . 3Bのみ 50vp/cell 感染させたキャリアー細胞 (A549細胞）を 1回につき 7. 5 X 106個、合計 6回（X 6) 腫瘍内投与した結果である。同図に示すように、「Ad- |8 - gal→AdE3-lA1.3B + GMCSF」では、 3回投与にもかかわらず「AdE3-lA1.3B」6回投与に比べ、アデノウィ ルス Ad— j8— galを 1回、 2回、 3回投与した場合のいずれも非常に強い in vivo抗腫瘍 効果が認められ
[0128] 以上の結果から、キャリアー細胞にオンコリティックアデノウイルスのみならず、 GM
CSF発現ベクターをも感染させることは、癌治療に非常に有効であることがわかつ た。
[0129] 図 28 (a) (b)は、キャリアー細胞投与時に、鉄剤を腹腔内投与した場合の効果につ いて検討した結果である。この実験では、図 27に示す実験と同様に、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウイルス Ad— j8— galを 1回、 2回または 3回投 与し (各回 3週おきに、 1回あたり l X 101(Vp投与）、その後、卵巣癌細胞 OVHMをマ ウス 1匹あたり 1 X 106個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成後、放射線処理後のキヤ リア一細胞を腫瘍内投与した。ただし、キャリアー細胞投与時に、鉄剤として鉄デキス トラン (Fe— Dextran) 0. Olmgを腹腔内投与した。キャリアー細胞には、アデノウィ ルス AdE3— 1A1. 3Bを 50vp/cell感染させた A549細胞を使用し、 1回につき 7. 5 X 106個、合計 3回（X 3)腫瘍内投与した (各回、鉄剤も投与した)。
[0130] 図 28 (a) (b)において、「Ad- β -gal→AdE3-lA1.3B + FeJは上記実験結果であり、 「Ad- β -gal→AdE3-lA1.3Bjはアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/cell感染さ せたキャリアー細胞 (A549細胞）を 1回につき 7. 5 X 106個、合計 6回（X 6)腫瘍内 投与した結果である。同図に示すように、「Ad- J8 -gal→AdE3-lA1.3B + Fe」では、ァ デノウィルス Ad— j8— galを 1回、 2回、 3回投与した場合のいずれもキャリアー細胞に よる治療は 3回にもかかわらず、 AdE3-lA1.3B感染キャリアー細胞による 6回の治療 に比べ非常に強 、in vivo抗腫瘍効果が認められた。
[0131] 以上の結果から、キャリアー細胞投与時に、あわせて鉄剤を投与することは、癌治 療に非常に有効であることがわ力つた。
[0132] 次に、キャリアー細胞投与前にキャリアー細胞に対して行う放射線処理において照 射する線量について検討した。実験には、生後 5週のヌードマウスを使用し、 A549 細胞を異なる線量で放射線処理後、マウス 1匹あたり 1 X 107個皮下移植し、腫瘍の 形成'成長を観察した。その結果を図 29に示す。同図に示すように、照射する線量を 120Gy以上とすることで、腫瘍の形成 ·成長は抑制された。
[0133] (C57BL/6 X C3/He)Flマウスを使用した実験で、キャリアー細胞 (A549細胞）を異 なる線量で放射線処理した場合の抗腫瘍効果について検討した結果を図 30に示す 。この実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウイルス UV— Ad j8— galを 1 X 101Gvp投与し、その 5週後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1匹あたり 1 X 106個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成後、線量 50Gy、 100Gy、 200Gyまたは 400Gyで放射線処理したキャリアー細胞を腫瘍内投与した。キャリアー細胞には、ァ デノウィルス AdE3— 1A1. 3Bを 50vp/cell感染させた A549細胞を使用し、 1回につ き 7. 5 X 106個、合計 6回腫瘍内投与した。その結果、放射線処理において照射す る線量は、 200Gyよりも 400Gyのほうが良好な結果が得られた。
[0134] 図 31は、キャリアー細胞に対するオンコリティックウィルスの感染量について検討し た結果を示す。この実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウ ィルス Ad— j8— galを 1 X 101(>vp投与し、その 4週後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1 匹あたり 1 X 106個皮下移植し、 5- 10mmの腫瘍形成後、線量 250Gyで放射線処 理したキャリアー細胞を腫瘍内投与した。また、キャリアー細胞 (A549細胞）に対す るアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bの感染量を、 100vp/cell、 250vp/celほたは 500 vp/cellのいずれかとし、 1回につきキャリアー細胞を 7. 5 X 106個、合計 6回腫瘍内 投与した。さらに、キャリアー細胞投与時に、あわせてァテロコラーゲン (濃度 0. 1%) を腫瘍内投与した。その結果、上記感染量は 250vp/cellのときに最も良好な結果が 得られ、 150— 400vp/cell程度に設定すれば良好であることがわかった。
[0135] 図 32 (a) (b)は、図 31に示す実験と同様の実験において、腫瘍免疫の効果を検討 した結果である。この実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウ ィルス Ad— β galを 1 X 101Gvp投与し、その 4週後に腫瘍免疫のため線量 80Gyで 放射線処理した卵巣癌細胞 OVHM— RTをマウス 1匹あたり 1 X 106個皮下移植した 。さらにこの後、卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 106個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成 後、線量 250Gyで放射線処理したキャリアー細胞を腫瘍内投与した。キャリアー細 胞には、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/cell感染させた A549細胞を使用し 、 1回につき 7. 5 X 106個、合計 3回腫瘍内投与した。また、キャリアー細胞投与時に 、あわせてァテロコラーゲン (濃度 0. 1%)を腫瘍内投与した。その結果、腫瘍免疫を 行ったマウス（図中、「OVHM- RT→A549」）では、腫瘍免疫を行わなかったマウス（図 中、「A549」）に比べて腫瘍の成長'増殖は著しく抑制され、生存率は大きく改善した
[0136] 以上の結果から、本発明の癌遺伝子治療薬の使用に際し、腫瘍免疫を併用するこ とで良好な抗腫瘍効果が得られることがわ力つた。
産業上の利用可能性
[0137] 以上のように、本発明の癌遺伝子治療薬は、ほぼ全ての悪性腫瘍に適用すること ができ、卵巣癌、扁平上皮癌 (子宮頸部癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、肺癌等)、 消化器癌 (大腸癌、膝癌、肝癌、胃癌等)、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳癌、精巣癌、 前立腺癌など各種癌に対する強力な抗腫瘍効果が期待できる。

Claims

請求の範囲
[1] キャリアー細胞投与に対する生体の CTL反応を誘導するために投与される免疫処 置用ウィルスと、
投与前にオンコリティックウィルスを感染させ、同ウィルスを生体の腫瘍細胞に作用 させるためのキャリアー細胞とを組み合わせた癌遺伝子治療薬。
[2] 免疫処置用ウィルスおよびオンコリティックウィルスは、アデノウイルス、ヘルぺスゥ ィルス、 HIVウィルス等のレンチウィルス、レトロウイルス、レオウィルス、水疱性口内 炎ウィルス (VSV)、又はその他のオンコリティックウィルス力も選ばれる、請求項 1記 載の癌遺伝子治療薬。
[3] 免疫処置用ウィルスは非増殖型のものおよび Z又は不活化したものである、請求 項 1又は 2記載の癌遺伝子治療薬。
[4] キャリアー細胞は、 A549細胞、 293細胞、 SW626細胞、 HT— 3細胞、 PA— 1細胞 、又はその他のヒト由来の癌細胞もしくは正常細胞力も選ばれる、請求項 1一 3のい ずれか 1項に記載の癌遺伝子治療薬。
[5] キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウィルスは、治療対象の癌の種類等に 応じて、 1A1. 3Bプロモーター、ミツドカインプロモーター、 jS—HCGプロモーター、 SCCA1プロモーター、 cox— 2プロモーター、 PSAプロモーター、又はその他の腫瘍 特異的プロモーターを有する、請求項 1記載の癌遺伝子治療薬。
[6] さらに、ァテロコラーゲンを備えた、請求項 1記載の癌遺伝子治療薬。
[7] さらに、投与前にキャリアー細胞に感染させる GM— CSF発現ベクターを備えた、請 求項 1記載の癌遺伝子治療薬。
[8] さらに、鉄剤および Z又はボルフイリンィ匕合物を備えた、請求項 1記載の癌遺伝子
[9] さらに、腫瘍免疫のため投与される腫瘍細胞を備えた、請求項 1記載の癌遺伝子
[10] キャリアー細胞投与に対する生体の CTL反応を誘導するために免疫処置用ウィル スをヒトに投与し、所定期間経過後、オンコリティックウィルスを感染させ、同ウィルス を腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を少なくとも 1回ヒトに投与することを 特徴とする癌遺伝子治療方法。
[11] 免疫処置用ウィルス投与力 キャリアー細胞投与までの期間を、およそ 2週間以上 13週間以下とする、請求項 10記載の癌遺伝子治療方法。
[12] 免疫処置用ウィルスの投与量を、当該ウィルスに対する抗体陰性の患者にはおよ そ 105ウィルス粒子以上 1011ウィルス粒子以下とし、当該ウィルスに対する抗体陽性 の患者にはおよそ 107ウィルス粒子以下とする、請求項 10記載の癌遺伝子治療方法
[13] キャリアー細胞によるオンコリティックウィルスの 1回の投与量を、およそ 109ウィルス 粒子以上 1014ウィルス粒子以下とする、請求項 10記載の癌遺伝子治療方法。
[14] キャリアー細胞に対するオンコリティックウィルスの感染量を、およそ 0. 1ウィルス粒 子 Z細胞以上 2000ウィルス粒子 Z細胞以下とする、請求項 10記載の癌遺伝子治 療方法。
[15] 腫瘍内投与によりキャリアー細胞を投与する、請求項 10記載の癌遺伝子治療方法
[16] キャリアー細胞と共に、ァテロコラーゲンを投与する、請求項 10記載の癌遺伝子治 療方法。
[17] オンコリティックウィルスのみならず、 GM— CSF発現ベクターを感染させたキャリア 一細胞を投与する、請求項 10記載の癌遺伝子治療方法。
[18] キャリアー細胞と共に、鉄剤および Z又はポルフィリン化合物を投与する、請求項 1
0記載の癌遺伝子治療方法。
[19] 免疫処置用ウィルスの投与と共に、またはその前後に、腫瘍免疫のため腫瘍細胞 を投与する、請求項 10記載の癌遺伝子治療方法。
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