WO2005037322A1

WO2005037322A1 - 癌遺伝子治療薬

Info

Publication number: WO2005037322A1
Application number: PCT/JP2004/015221
Authority: WO
Inventors: Akinobu Goto; Katsuyuki Hamada; Toshiro Shirakawa
Original assignee: The New Industry Research Organization
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2004-10-15
Publication date: 2005-04-28
Also published as: JPWO2005037321A1; KR20060096023A; CN100438920C; CA2542337A1; WO2005037321A1; CA2542335A1; JPWO2005037322A1; CN1867362A; EP1676590A1; KR100798996B1; EP1676589A4; KR20060096024A; JP4423508B2; CN100488567C; US20070141028A1; EP1676590A4; JP4423507B2; EP1676589A1; US20070134202A1; KR100842658B1

Abstract

　本発明の癌遺伝子治療薬は、オンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、当該キャリアー細胞には、強力な抗腫瘍効果が認められたＡ５４９細胞、２９３細胞、ＳＷ６２６細胞、ＨＴ—３細胞のいずれかが使用される。本発明は、in vitroおよびin vivoの双方において高い抗腫瘍効果が認められたこれらの細胞をキャリアー細胞として用いているので、従来のキャリアー細胞に比べて強力な抗腫瘍効果を得ることができる。

Description

明細書

癌遺伝子治療薬

技術分野

[0001] 本発明は、癌遺伝子治療薬、および同治療薬を用いた癌遺伝子治療方法に関するものである。

背景技術

[0002] 近年、癌治療に関し、遺伝子治療が注目されており、これまでにも様々な遺伝子治療法が提案され、臨床試験が行われている。このうち、キャリアー細胞を使用した遺伝子治療については、 Freemanらによって臨床試験が行われている。この遺伝子治療は、レトロウイルスによって HSV— tk遺伝子を導入した卵巣癌細胞 PA— 1をキヤリァー細胞に使用するものであり、卵巣癌治療、さらに悪性中皮腫治療のための臨床試験が行われている（後述の非特許文献 1 · 2参照)。一方、 Culverらは、キャリアー細胞にマウス NIH— 3T3細胞を使用して脳腫瘍に対する臨床試験を行っている（後述の非特許文献 3参照)。しかし、ヒトへの癌治療の適用を考慮すると、キャリアー細胞にはヒト由来細胞を使用することが要請される。

[0003] 卵巣癌細胞 PA-1をキャリアー細胞に使用した遺伝子治療は、 Coukosらによっても行われている（後述の非特許文献 4参照)。この遺伝子治療は、腫瘍細胞において特異的に増殖するオンコリティックウィルス（oncolytic virus)を構築し、同ウィルスをキヤリア一細胞 (プロデューサー細胞）に感染させた後、このキャリアー細胞を腫瘍部位に投与するというものである。オンコリティックウィルスには単純へルぺスウィルス 1型（H SV-1)が用いられ、ヌードマウスの卵巣癌腹腔内播種性転移モデルに対して腹腔内投与する動物実験が行われて!/、る (後述の特許文献 1 · 2参照)。

[0004] しかし、上記の卵巣癌細胞 PA— 1は、増殖能力が高く操作しやす!/、細胞ではあるものの、細胞質が小さく壊れやすい。そのため、レトロウイルスによって HSV— tk遺伝子を導入しても腫瘍部位での HSV— tk遺伝子発現は少なく、 Freemanらの臨床試験では、卵巣癌および悪性中皮腫に対する充分な抗腫瘍効果は得られて、な、。

[0005] オンコリティックウィルス HSV— 1による癌遺伝子治療にぉ、てキャリアー細胞として PA— 1を使用した場合も、オンコリティックウィルス HSV— 1の単独療法に比べて著明な抗腫瘍効果は得られていない。ウィルスによる癌遺伝子治療の問題点は、血中の中和抗体により頻回投与ができない点である。 PA— 1を使用した場合、細胞が脆弱でウィルス産生量も少ないため、細胞間相互作用（cell to cell interaction)により標的腫瘍細胞に感染する前に細胞が壊れてしまうこと、さらに、直接的に中和抗体によりウィルスが不活化され、抗腫瘍効果が得られな!/ヽことなどが考えられる。

[0006] また、細胞性免疫遺伝子治療の臨床試験にお!/、て、患者自身の癌細胞ある!/、は線維芽細胞 (fibroblast)をキャリアー細胞に使用することがある力この場合安定した細胞系が得られるまで時間がかかり、手技が困難であること、さらに遺伝子導入が個体により差があり一定でないことから安定した効果を得ることが困難であった。

[0007] 非特許文献 1： Human Gene Therapy, 6, 927-939, 1995

非特許文献 2 : Human Gene Therapy, 9, 2641-2649, 1998

非特許文献 3 : Science, 256, 1550-1552, 1992

非特許文献 4 : Clinical Cancer Research, 5, 1523-1537, 1999

特許文献 1：国際公開第 99Z45783号パンフレット

特許文献 2：国際公開第 01Z23004号パンフレット

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、このような従来の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、オンコリティックウィルスを用いた癌遺伝子治療において、強力な抗腫瘍効果が得られる新たなキャリアー細胞を見出すこと、さらに得られたキャリアー細胞を用いて劇的な抗腫瘍効果が得られる新たな癌遺伝子治療法を確立すること、および、同治療法に用いる新たな癌遺伝子治療薬を提供すること、にある。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、（1)キャリアー細胞に特定の細胞株を使用することで、従来のキャリアー細胞に比べて強力な抗腫瘍効果が得られること、さらに、（2)予めウィルスを投与して免疫処置を施した後、オンコリティックウィルスを感染させたキャリアー細胞を投与することで、生体の CTL反応が誘導 · 惹起され、 in vivoにおいて劇的な抗腫瘍効果が得られること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。

[0010] 即ち、本発明の癌遺伝子治療薬は、オンコリティックウィルスを感染させ、同ウィルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、当該キャリアー細胞は以下の（1)一（4)の細胞力も選ばれるものである。

(1) A549細胞

(2) 293細胞

(3) SW626細胞

(4) HT-3 (HT— III細胞）

[0011] 後述するように、上記 4種の細胞の中でも A549細胞の使用は特に好ましい。

[0012] オンコリティックウィルスは、好ましくは、アデノウイルス、ヘルぺスウィルス、 HIVウイルス等のレンチウィルス、レトロウイルス、レオウィルス、水疱性口内炎ウィルス（VSV )、又はその他のオンコリティックウィルスから選ばれる。このうち、アデノウイルスの使用は、後述のように良好な結果が得られたため、特に好ましい。

[0013] また好ましくは、本発明のオンコリティックウィルスは、治療対象の癌の種類等に応じて、 1A1. 3Bプロモーター（IAL 3Bプロモーター）、ミツドカインプロモーター、 13— HCGプロモーター、 SCCA1プロモーター、 cox— 2プロモーター、 PSAプロモータ一、又はその他の腫瘍特異的プロモーターを有する。なお、本発明においてオンコリティックウィルスは、標的腫瘍細胞に感染し、増殖しうるものであればよぐ例えばァデノウィルスの場合、その範疇には、野生型アデノウイルスが含まれる。その他オンコリティックウィルスは、 ONYX社の E1B遺伝子欠失型のオンコリティックアデノウィルス、あるいは、 UAB大学の E1A遺伝子の一部欠損型の Ad5-A24アデノウイルスなど、腫瘍特異的プロモーターを有しな、ものであってもよ、。

[0014] 本発明の癌遺伝子治療薬を、癌治療用薬剤キットとして構成し、さらに、キャリアー細胞投与に対する生体の CTL反応を誘導するために投与される免疫処置用ウィルスを備えた構成とすることは好ましい。免疫処置用ウィルスには、オンコリティックウイルスと同種類のものを使用することが好ましい。また、免疫処置用ウィルスには、非増殖型のものおよび Z又は紫外線等で不活ィ匕したものを使用することが好ましい。紫外線等で不活ィ匕することによって、免疫処置用ウィルスの投与力もキャリアー細胞投与までの期間を短期間にすることができる。

[0015] 本発明の癌遺伝子治療薬は、癌治療用薬剤キットとして、キャリアー細胞、またはキャリア一細胞とオンコリティックウィルスとの組み合わせ (あるいはこれに免疫処置用ゥィルスをカ卩えた 3者の組み合わせ）にカ卩えて、さらに下記（1)一（4)の物質のうち、 1 又は 2以上の物質を備えたものであってもよ、。

(1)ァテロコラーゲン

(2)投与前にキャリアー細胞に感染させる GM— CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor:顆粒球'マクロファージコロニー刺激因子）発現ベクター

(3)鉄剤

(4)ポルフィリン化合物（例えば、 5—アミノレブリン酸（5-aminolevulinic acid : ALA) ) [0016] また、免疫処置用ウィルスの投与と共に、あるいはその前後に、腫瘍免疫のため患者由来の腫瘍細胞またはそれと類似した抗原を提示すると考えられる一般に入手可能な放射線照射した腫瘍細胞を投与することが好まヽが、本発明の癌遺伝子治療薬は、腫瘍免疫のためこのような放射線照射した腫瘍細胞を備えたものであってもよい。

[0017] 本発明の癌遺伝子治療薬による好適な癌治療方法は、キャリアー細胞投与に対する生体の CTL反応を誘導するために免疫処置用ウィルスをヒトに投与し、所定期間経過後、オンコリティックウィルスを感染させ、同ウィルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を少なくとも 1回ヒトに投与する、というものである。

[0018] 上記癌治療方法において、好ましくは、免疫処置用ウィルス投与からキャリアー細胞投与までの期間を、およそ 2週間以上 13週間以下 (より好ましくは、 3週間以上 4週間以下）とする。また好ましくは、（1)免疫処置用ウィルスの投与量を、当該ウィルスに対する抗体陰性の患者にはおよそ 10⁵ウィルス粒子以上 10¹¹ウィルス粒子以下とする一方、当該ウィルスに対する抗体陽性の患者にはおよそ 10²ウィルス粒子以上 1 0⁷ウィルス粒子以下 (場合によっては、 10²ウィルス粒子未満または非投与としてもよい。）とし、（2)キャリアー細胞によるオンコリティックウィルスの 1回の投与量を、およそ 10⁹ウィルス粒子以上 10¹⁴ウィルス粒子以下とし、 (3)キャリアー細胞に対するオンコリティックウィルスの感染量を、およそ 0. 1ウィルス粒子 Z細胞（viral particle/cell：以下、「vp/cell」という。）以上 2000vp/cell以下（より好ましくは、 5vp/cell以上 500 vp/cell以下）とする。

[0019] また上記癌治療方法において、下記（1)一（5)の方法を採用することは好ましい。

( 1)腫瘍内投与によりキャリアー細胞を投与する。

(2)キャリアー細胞と共に、ァテロコラーゲンを投与する。

(3)オンコリティックウィルスのみならず、 GM—CSF発現ベクターを感染させたキヤリァー細胞を投与する。

(4)キャリアー細胞と共に、鉄剤および Z又はボルフイリンィ匕合物（例えば、 5—ァミノレブリン酸（5- aminolevulinic acid： ALA) )を投与する。

(5)免疫処置用ウィルスの投与と共に、またはその前後に、腫瘍免疫のため腫瘍細胞を投与する。

発明の効果

[0020] 本発明の癌遺伝子治療薬は、選別の結果、 in vitroおよび in vivoの双方にお!、て高ヽ抗腫瘍効果が認められた A549細胞などの細胞株をキャリアー細胞として用いているので、従来のキャリアー細胞に比べて強力な抗腫瘍効果を得ることができる。

[0021] また、予め投与される免疫処置用ウィルスと、その後に投与されるキャリアー細胞との 2種類の薬剤を組み合わせた構成とした場合、予めアデノウイルス等のウィルス投与により免疫処置を施した後、オンコリティックウィルスを感染させたキャリアー細胞を投与することで、同ウィルスが標的腫瘍細胞に感染して直接的な抗腫瘍効果をもたらし、さらに感染標的細胞に対し生体の CTL反応が誘導され、 in vivoにおいて劇的な抗腫瘍効果を得ることができる。

図面の簡単な説明

[0022] [図 1]各種細胞株をキャリアー細胞に用いた場合の卵巣癌細胞 HEYに対する増殖抑制効果を IC50における細胞数で調べた結果を示すグラフである。

[図 2]オンコリティックウィルス単独の場合とキャリアー細胞を用いた場合とで、ウィルス抗体存在下、卵巣癌細胞 HEYに対する増殖抑制効果を IC50における抗ァデノウィルス抗体の抗体価で調べた結果を示すグラフである。 [図 3]オンコリティックアデノウイルス感染 293細胞などにっ、て、ウィルス抗体存在下の卵巣癌細胞 HEYに対する増殖抑制効果を IC50における抗アデノウイルス抗体の抗体価で調べた結果を示すグラフである。

[図 4]293細胞、 A549細胞、 SW626細胞、 HT— 3細胞の各キャリアー細胞について、ウィルス抗体存在下の卵巣癌細胞 HEYに対する増殖抑制効果を細胞数で調べた結果を示すグラフである。

[図 5]ヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞 RMG—1を移植し形成された 10— 15mm の巨大腫瘍モデルを用いて、本発明の癌遺伝子治療薬の in vivo抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフである。

[図 6]ヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞 PA— 1を移植し形成された 10— 15mmの巨大腫瘍モデルを用いて、本発明の癌遺伝子治療薬の in vivo抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフである。

[図 7]免疫機能が正常な皮下腫瘍モデルマウス ((C57BL/6 X C3/He)Flマウス）を用 Vヽて本発明の癌遺伝子治療薬の in vivo抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフである。

[図 8]アデノウイルス投与による A549細胞の細胞融合を顕微鏡により観察した図である。

[図 9]コントロールであり、アデノウイルスを投与しな力つた A549細胞を顕微鏡により観察した図である。

[図 10] (a)は、 1一 21のヒト手術標本におけるミツドカイン（MK) mRNAの発現を RT PCRで検討した結果、（b)は、同様の方法により、悪性ダリオ一マの 4つの細胞株におけるミツドカイン mRNAの発現を RT— PCRで検討した結果、（c)は、上記各細胞株におけるミツドカインの発現をウェスタンプロット解析によって検討した結果、である。

[図 11]長さが異なる 2つのミツドカインプロモーターを用いて上記各細胞株におけるプロモーター活性を比較した結果を示すグラフである。

[図 12] (a)は、今回設計した、ミツドカインプロモーターを有するオンコリティックアデノウィルスの構造を模式的に示す図であり、（b)は、 3種類のアデノウイルスを上記各細胞株に感染させ、それぞれの細胞株における E1A蛋白の発現をウェスタンプロット解析によって検討した結果である。

[図 13] (a)は、 3種類のアデノウイルスによる癌細胞増殖抑制効果を比較検討した結果であり、（b)は、アデノウイルスの E3領域の増殖抑制効果に与える影響を検討した結果であり、（c)は、直径 5mmのヌードマウス皮下移植モデルにおけるアデノウィルスの抗腫瘍効果を検討した結果である。

[図 14]ミツドカインプロモーターを有するオンコリティックウィルスをキャリアー細胞に感染させて本発明の癌遺伝子治療薬を調製し、直径 10— 15mmの巨大腫瘍に対するその抗腫瘍効果をウィルス単独投与の場合と比較した結果を示すグラフである。

[図 15]アデノウイルス AdE3-lA1.3Bの卵巣癌細胞 PA 1に対する増殖抑制効果に対する Feの影響を検討した結果を示すグラフである。

[図 16]アデノウイルス AdE3-lA1.3Bの卵巣癌細胞 PA 1に対する増殖抑制効果に対する ALAの影響を検討した結果を示すグラフである。

[図 17]アデノウイルス AdE3-lA1.3Bの卵巣癌細胞 PA 1に対する増殖抑制効果に対する Feおよび ALA両存在下の影響を検討した結果を示すグラフである。

[図 18] (a)は、免疫機能が正常な皮下腫瘍モデルマウス ((C57BL/6 X C3/He)Flマウス）を用いて、本発明の癌遺伝子治療薬 (免疫処置用ウィルスを UV処理して、なヽ場合)の in vivo抗腫瘍効果を検討した結果であり、 (b)は、この実験に供された各マウスの生存率を長期間観察した結果を示すグラフである。

[図 19]免疫処置用ウィルス投与力キャリアー細胞投与までの投与間隔について検討を行った結果であり、（a)は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である。

[図 20]UVで不活ィ匕処理したアデノウイルス UV— Ad— β galを免疫処置用ウィルスに使用することにより、上記投与間隔を短くすることができる力検討した結果を示すグラフ（サノィバル 'カーブ)である。

[図 21]上記 UV— Ad— β galを免疫処置用ウィルスに使用した場合の当該ウィルスの投与量にっ、て検討した結果を示すグラフ (腫瘍成長カーブ)である。

圆 22]腫瘍免疫の効果を検討した結果であり、（a)は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である。各群のマウスの数は n = 5である。図中、コントロールの「SCC7」「OVHM」は、腫瘍免疫を行わずに、扁平上皮癌細胞 SCC7または卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 10⁶個皮下移植し、 AdE3-lA1.3B 感染キャリアー細胞 A549を投与したマウスの結果である。 roVHM-RT+Ad- β -gal →SCC7, OVHM」は、放射線照射した OVHMによる腫瘍免疫および Ad- - galによるアデノウイルスに対する CTLを誘導した後に、 SCC7あるいは OVHMの皮下腫瘍を作成し、 AdE3-l Al .3B感染キャリアー細胞 A549を投与したマウスの結果である。

[図 23]非小細胞性肺癌細胞 A549細胞による腫瘍免疫の効果を検討した結果を示すグラフ（サバイバル 'カーブ）である。各群のマウスの数は n= 10である。図中、コントロールの「OVHM」は、腫瘍免疫を行わずに、卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 10⁶個皮下移植し、 AdE3-lA1.3B感染キャリアー細胞 A549を投与したマウスの結果である。図中「AdE3-IAI.3B- infected A549→0VHMJは、 AdE3- 1A1.3Bを感染し放射線照射した A549細胞を 10⁶個、皮下に免疫し、卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 10⁶個皮下移植し、 AdE3- 1A1.3B感染キャリアー細胞 A549を投与したマウスの結果である。

[図 24]キャリアー細胞と共にァテロコラーゲンを投与した場合に、副作用による死亡率が改善されるかどうか調べた結果を示すグラフである。図中、力つこ内の Nはマウスの数を示す。

[図 25]UVで不活化処理して!/、な!/、アデノウイルス Ad— β galを 1 3回投与し、抗ァデノウィルス抗体存在下での抗腫瘍効果について検討した結果であり、（a)は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である。キャリアー細胞には、 A549細胞と 293細胞とを混合したものを使用した。各群のマウスの数は n= 5である。

[図 26]UVで不活化処理して!/、な!/、アデノウイルス Ad— β galを 1 3回投与し、抗ァデノウィルス抗体存在下での抗腫瘍効果について検討した結果であり、（a)は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である。キャリアー細胞には A549細胞のみ使用した。各群のマウスの数は n= 5である。

[図 27]アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bのみならず、 GM— CSF発現ベクターを感染させたキャリアー細胞 (A549細胞）を投与し、かつ、このキャリアー細胞と共にァテロコラーゲンを投与した場合の in vivo抗腫瘍効果について検討した結果であり、 (a)は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である。図中、「Ad- β -galjの前の「 X 1」「 X 2」「 X 3」は、それぞれ、アデノウイルス A d— j8— galを 1回、 2回、 3回投与したことを示す。各群のマウスの数は n= 5である。

[図 28]キャリアー細胞投与時に、鉄剤を腹腔内投与した場合の in vivo抗腫瘍効果について検討した結果であり、（a)は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である。図中、「 (1- |8 -_§&1」の前の「 1」「 2」「 3」は、それぞれ、アデノウイルス Ad— 18— galを 1回、 2回、 3回投与したことを示す。各群のマウスの数は n= 5である。

[図 29]キャリアー細胞 A549に対して行う放射線処理において照射する線量について、ヌードマウスを用いて検討した結果を示すグラフである。

[図 30](C57BL/6 X C3/He)Flマウスに OVHMを皮下移植した実験で、キャリアー細胞 A549を異なる線量で放射線処理した場合の抗腫瘍効果について検討した結果を示すグラフである。

[図 31]キャリアー細胞 A549に対するオンコリティックウィルスの感染量について検討した結果を示すグラフである。

[図 32]卵巣癌細胞 OVHMによる腫瘍免疫の効果を検討した結果であり、（a)は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（b)は、各群マウスの生存率を観察した結果である。図中、「A549」は腫瘍免疫なしに AdE3-lA1.3B感染キャリアー細胞 A549を 3回投与したマウス、「OVHM- RT→A549」は放射線照射した OVHMによる腫瘍免疫後、 AdE3- 1A1.3B感染キャリアー細胞 A549を 3回投与したマウス、各群のマウスの数は n= 5である。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の実施の一形態について説明する。

〔1〕本発明の癌遺伝子治療薬

本発明の癌遺伝子治療薬は、オンコリティックウィルスを感染させ、同ウィルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、当該キャリアー細胞は以下の（1) 一（4)の細胞力選ばれる。 (1) A549細胞

(2) 293細胞

(3) SW626細胞

(4) HT - 3細胞（HT - ΠΙ細胞）

[0024] 図 1は、癌遺伝子治療薬に用いる効果的なキャリアー細胞を見出すために本発明者がキャリアー細胞の選別を行った結果であり、より具体的には、各種候補細胞株にオンコリティックウィルスを感染させた癌遺伝子治療薬を調製し、各々の癌細胞増殖抑制効果を調査した結果を示すグラフである。オンコリティックウィルスには、アデノウィルス AdE3— 1A1. 3Β (ΙΑΙ. 3Β)を使用した。このアデノウイルス AdE3—lAl. 3B は、 E1A遺伝子および E3遺伝子を有し、かつ、 E1A遺伝子の上流に腫瘍特異的プ口モーターとして卵巣癌特異的 lAi . 3Bプロモーター（IAL 3Bプロモーター）を有するアデノウイルスである。このアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを各種候補細胞株に対して 500vp/_Cellで 2日間感染させた後、各細胞を培養 2日目の卵巣癌細胞 HEY に添加し、培養 5日目に同癌細胞 HEYの増殖抑制効果を調べた。

[0025] 図 1のグラフ縦軸は、各種候補細胞株について 50%の増殖抑制効果 (IC50)が得られる細胞数を示し、細胞数が少な、細胞株ほど増殖抑制効果が高、ことになる。同図に示すように、今回調査した癌細胞株では、 293細胞、 A549細胞、 SW626細胞、 HT - 3細胞 (HT - III細胞）の順に高い増殖抑制効果を示した。 293細胞、 A54 9細胞および SW626細胞は、従来キャリアー細胞として使用されていた PA— 1細胞に比べて、およそ 100倍程度の高い増殖抑制効果を示した。 HT— 3細胞についても、 SW626細胞と同程度の高い増殖抑制効果を示した。

[0026] また、上記の 293細胞、 A549細胞、 SW626細胞および HT— 3細胞にオンコリティックアデノウイルスを感染させた癌遺伝子治療薬を調製し、各治療薬について、充分量の抗アデノウイルス中和抗体存在下 (Ab (+) )における、癌細胞増殖抑制効果を検討した。その結果、図 4に示すように、抗体存在下であっても、上記 4種の細胞をキャリア一細胞に用いた癌遺伝子治療薬は、ずれも強、癌細胞増殖抑制効果を示した。従来、ウィルスによる癌遺伝子治療は、抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていた力上記 4種の細胞をキャリアー細胞に用いた場合は、抗体存在下にもかかわらず in vitroにおいて強力な増殖抑制効果が得られた。なお、図 4に示すように、上記 4種類の細胞のうち、 A549細胞をキャリアー細胞に用いた場合に最も強力な増殖抑制効果を示した。即ち、充分量の抗ァデノウィルス中和抗体存在下にアデノウイルス感染 A549細胞を投与すると、標的癌細胞の増殖は抗体存在下にもかかわらずほぼ完全に抑制された。

[0027] さらに、直径 10— 15mmの巨大なヌードマウス皮下腫瘍モデルを用いた in vivoの実験においても、上記の A549細胞、 293細胞および SW626細胞をキャリアー細胞に用いた場合は、強力な抗腫瘍効果を示した (図 5および図 6参照)。なお、これら実験の詳細は後述の実施例において説明する。

[0028] このように、オンコリティックウィルスをキャリアー細胞に感染させて得られる癌遺伝子治療薬において、キャリアー細胞に A549細胞、 293細胞、 SW626細胞、 HT— 3 細胞の!/ヽずれかを使用することで高、抗腫瘍効果を得ることができる。

[0029] 上記 4種の細胞にっ、て説明すると、 A549細胞は、非小細胞性肺癌細胞株であり、その詳細については例えば論文 Giard,D.J.， Aaronson.S.A., Todaro.G.J.,

Arnstein'P., KerseyJ.H., Dosik'H., and Parks, W. P. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors, J. Natl. Cancer Inst., 51: 1417-1423, 1973.などに記載されている。 293細胞は、ヒト胎児腎由来細胞であり、アデノウイルス産生細胞として試験研究に多く用いられている細胞株である。 293細胞については例えば論文 Xie QW , et al. Complementation analysis of mutants of nitric oxide synthase reveals tnat the active site requires two hemes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4891-4896, 1996.などに説明がある。 SW62 6細胞は、大腸癌卵巣転移株であり、その詳細については例えば論文 Fogh J , et al. Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors. J. Natl. Cancer Inst. 58: 209-214, 1977.などに記載されている。 HT— 3細胞は、子宫頸部扁平上皮癌細胞であり、その詳細については例えば論文 Fogh J , et al.

Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors. J. Natl. Cancer Inst. 58: 209-214, 1977.などに記載されている。これら 4種の細胞株はいずれも ATCC (American Type Culture Collection)等の細胞保存機関から入手可能であり、その他、市販されているものを使用してもよい。

[0030] A549細胞は、（1)高力価のオンコリティックアデノウイルスを産生し、非常にタフな細胞で扱、やす、、 (2)抗アデノウイルス抗体存在下にお、て癌細胞の増殖を最も強力に抑制する、（3)アデノウイルス等のウィルスが感染すると A549細胞は由来が type IIの肺胞上皮細胞であるため分泌顆粒を放出し、この性質が癌治療において有利に作用すると考えられる、（4)アデノウイルスに感染した後も A549細胞は CTLによる殺細胞効果を受けにくい、などキャリアー細胞として使用する場合に多くの利点を有している。したがって、上記 4種の細胞のうち、 A549細胞の使用は特に好ましい

[0031] また、キャリアー細胞として、複数の種類の細胞を併用してもよい。後述の実施例では、キャリアー細胞に A549細胞と 293細胞とを併用することによって、強力な癌治療効果が認められた。このように、複数の種類の細胞を併用した場合は、各細胞の特徴、利点を癌治療に利用することができ、好ましい。例えば、 SW626細胞は、接着（ adhere)するのに比較的時間を要するため、腹腔内投与すると局所のみにとどまらず周囲全体に拡散し、卵巣癌などの腹腔内治療に好適と考えられる。また、 SW626細胞は、ウィルス産生量のピークが A549細胞や 293細胞などよりも遅ぐ作用時間が比較的長ヽと、う特徴を有して、る。

[0032] 本発明の癌遺伝子治療薬において、上記キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウィルスとしては、従来遺伝子導入に用いられるウィルスベクターを使用することができ、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、単純へルぺスウィルス 1型（HSV— 1)、単純へルぺスウィルス 2型（HSV— 2)、 HIVウィルス（エイズウイルス）等のレンチウイルスやマウス白血病ウィルス等のレトロウイルス、レオウィルス、水疱性口内炎ウィルス (VSV)などが例示され、さらにその他のオンコリティックウィルスであってもよい。ォンコリティックウィルスは、増殖型ウィルスベクターであって標的の腫瘍細胞または腫瘍組織において特異的に増殖するようウィルス遺伝子を改変し、標的細胞を融解- 殺傷する cell lysis作用を有するものであればよぐ例えばアデノウイルスの場合、その増殖に必要な E 1 Aまたは E 1 B領域を有するものであればよい。

[0033] 本発明の癌遺伝子治療薬は、ほぼ全ての悪性腫瘍に適用することができ、治療対象となる癌の種類は、卵巣癌、扁平上皮癌 (子宮頸部癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、肺癌等)、消化器癌 (大腸癌、膝癌、肝癌、胃癌等)、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳癌、精巣癌、前立腺癌などが例示される。また、アデノウイルス 34,35型など血液細胞にも感染可能なウィルスを使用することで、本発明の癌遺伝子治療薬は血液性悪性腫瘍にも適用可能である。

[0034] 治療対象となる癌の種類に応じて、オンコリティックウィルスに導入する腫瘍特異的プロモーターの種類を選択するとよい。例えば、卵巣癌に対しては 1A1. 3Bプロモ一ター、脳腫瘍、悪性ダリオ一マなどに対してはミツドカインプロモーター、精巣癌に対しては j8—HCGプロモーター、扁平上皮癌に対しては SCCA1プロモーターおよび SCCA2プロモーター、大腸癌に対しては CEAプロモーター、前立腺癌に対しては PSAプロモーター、肝癌に対しては AFPプロモーター、を使用することができる。勿論、他の公知の腫瘍特異的プロモーター、例えば、種々の悪性腫瘍に対してプロモーター活性を発揮し、広い作用スペクトラムを有する cox— 2プロモーターや、その他ォステオカルシンプロモーター等の各種癌特異性プロモーターを使用してもよ、。上記ミツドカインプロモーターについては、脳腫瘍、悪性ダリオ一マのほか種々の悪性腫瘍に対して使用可能であり、この点において cox— 2プロモーターと同様に広い作用スペクトラムを有する。

[0035] 使用する各プロモーター配列の長さ等については、腫瘍特異的プロモーター活性が得られる限りにおいて特に限定されるものではない。上記 1A1. 3Bプロモーターは、国際公開第 03/025190号パンフレットおよび文献 Cancer Research 63, 2506-2512, 2003の記載にしたがって設計'調製し、ウィルスゲノムに挿入することができる。上記のミツドカインプロモーター、 jS—HCGプロモーター、 SCCA1プロモーターについては、それぞれ、国際公開第 02Z10368号パンフレット、国際公開第 01 Z90344号パンフレット、国際公開第 00Z60068号パンフレットの記載にしたがつて設計'調製し、ウィルスゲノムに挿入することができる。

[0036] 上記 SCCA1プロモーターについては、論文 Biochimica et Biophysica Acta 91522 (2001) 1-8, Molecular cloning of human squamous cell carcinoma antigen 1 gene and characterization of its promoter, Katsuyuki Hamada, Hiroto ¾hinomiya, Yoshihiro Asano, Toshimasa Kihana, Mari Iwamoto, Yasushi Hanakawa, Koji Hashimoto, Susumu Hirose, Satoru Kyo, Masaharu Itoにも詳細な説明がなされている。

[0037] 例えば、オンコリティックアデノウイルスを作製する場合、アデノウイルスの増殖に必須の遺伝子である初期遺伝子 E1Aまたは E1Bの上流に腫瘍特異的プロモーターを挿入するか、あるいは、初期遺伝子 E1Aまたは E1Bプロモーターと置換することにより構築することができる。 HSV— 1、 HSV— 2、レトロウイルス、レオウィルス、水疱性口内炎ウィルス (VSV)など、アデノウイルス以外のウィルスを使用する場合も、同様に、ウィルスの増殖に必要な遺伝子の上流に腫瘍特異的プロモーターを挿入するか、あるいは、当該遺伝子のプロモーターと置換することにより構築することができる。

[0038] もっとも、オンコリティックウィルスは、標的の腫瘍細胞または腫瘍組織にぉヽて特異的に増殖する性質を有する限り、必ずしも腫瘍特異的プロモーターを有するものでなくてもよい。例えば、 ONYX社の E1B遺伝子欠失型のオンコリティックアデノウィルス、あるいは、 UAB大学の E1A遺伝子の一部欠損型の Ad5-A24アデノウイルスなど、腫瘍特異的プロモーターを有しな、オンコリティックウィルスを使用することも可能である。また、オンコリティックウィルスとして野生型アデノウイルス、あるいは、その一部遺伝子を欠失させたものを使用することとしてもよい。

[0039] オンコリティックウィルスをキャリアー細胞に感染させる方法は、常法に従って行えばよく特に限定されるものではないが、例えばキャリアー細胞をディッシュに播き、これにオンコリティックウィルスをすベての細胞に感染可能な量添カ卩し、 95%0、 5%

2

CO、 37°C、牛胎児血清 FCS (—)、 RPMI培地の条件下で 6時間から 36時間程度

2

培養し感染させる方法が簡便である。後述の実施例においては、 A549細胞、 SW6 26細胞、 HT— 3細胞はこの方法で培養し、オンコリティックウィルスを感染させたが、 293細胞に関しては FCS ( + ) 10%、 DMEM培地の条件下で培養し、オンコリテイツクウィルスを感染させた。なお、牛胎児血清 FCSは、 3— 6時間感染の場合は FCS (— )の条件で、それ以上の時間感染させる場合は 3— 6時間 FCS (—)の状態におき、後に FCS 10%をカロえるとよい。

[0040] キャリアー細胞に対するオンコリティックウィルスの感染量および感染時間は、治療対象の腫瘍の大きさ'種類、キャリアー細胞の種類'投与量、使用するオンコリティックウィルスの種類、本遺伝子治療薬の投与方法などに応じて最適な量と時間を選択すればよい。特に限定されないが、一例として、キャリアー細胞に A549細胞を使用した場合、腹腔内投与では約 5— 250vp/cellでおよそ 6— 24時間、腫瘍内投与では約 5— 500vp/cellでおよそ 12— 24時間、 SW626細胞の場合、腹腔内投与では約 250— 2 OOOvp/cellでおよそ 6— 24時間、腫瘍内投与では約 100— 500vp/cellでおよそ 12— 24時間、 293細胞の場合、腫瘍内投与では約 5— 50vp/cellでおよそ 12— 24時間、腹腔内投与では約 0. 1-lOvp/cellでおよそ 6— 24時間、に設定することができる。このようにキャリアー細胞の種類、投与方法に応じて感染量'感染時間も異なるが、上記の例では腹腔内投与のときは約 0. 1— 2000vp/cellでおよそ 6— 24時間、腫瘍内投与のときは約 5— 500vp/cellでおよそ 12— 24時間、の範囲でそれぞれ感染量 ·感染時間を設定することができる。

[0041] キャリアー細胞にオンコリティックウィルスを感染させ、本発明の癌遺伝子治療薬を調製する場合、使用時まではオンコリティックウィルスを感染させなヽ状態でキャリア一細胞を保存しておいてもよい。他方、オンコリテイツクウィルスを感染させ放射線照射したキャリアー細胞を凍結し、これを医療現場で解凍して使用するという製品形態にする場合は、ウィルス感染させたキャリアー細胞を保存しておくことが好ましい。キャリア一細胞の保存は、例えば液体窒素中あるいは 150°C程度の温度にて保存することができる。一方、オンコリティックウィルスは、例えば 80°C程度の温度にて保存することができる。

[0042] 使用時には、前記の方法によりオンコリティックウィルスをキャリアー細胞に感染させ

、得られたウィルス感染キャリアー細胞を、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに本発明の癌遺伝子治療薬となし、ヒト (またはマウス、ラット等の実験動物

)に投与することができる。後述のように、キャリアー細胞投与時に、ァテロコラーゲン

、鉄剤、ボルフイリンィ匕合物のうち、 1又は 2以上を組み合わせてキャリアー細胞と同時に投与することは好ましい。また、 CTL反応を高めるため、キャリアー細胞に、オンコリティックウィルスのみならず、 GM—CSF発現ベクターをも感染させ、いわばウィルスベクターをダブルで感染させたキャリアー細胞を投与することは好ましい。

[0043] 本発明の癌遺伝子治療薬を後述の免疫処置用ウィルスと組み合わせて構成する場合、キャリアー細胞は、免疫処置用ウィルスを投与して力所定期間経過後に投与する。キャリアー細胞に癌細胞を用いる際には、ウィルス感染前または感染後に放射線照射することが好ましい。後述の実施例では、キャリアー細胞に A549細胞、 S W626細胞、 HT— 3細胞を使用した場合、これらの細胞をヌードマウスに投与する前【こそれぞれ 120— 400Gy、 20— 40Gy、 20— 40Gy【こて放射線照射を行った。 A549 細胞に対する放射線の照射量にっ、て検討した結果、 120Gy以上であれば細胞の増殖は観察されな力つたので（図 29)、照射量は 120Gy以上 600Gy以下 (より好ましくは 150Gy以上 400Gy以下)程度に設定することが好まし!/、。

[0044] 本発明の癌遺伝子治療薬は、非経口剤として投与することが好ましいが、経口剤として使用できる可能性もある。非経口剤としての投与は、 in vivo法、 ex vivo法のいずれであってもよい。 in vivo法の場合、腫瘍の大きさ'種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて用量 (換言すれば、ウィルス感染キャリアー細胞の投与量)を調節し、例えば、静注、点滴静注、腫瘍内注射、腹腔注射のような腔内注射などによって投与することができるが、キャリアー細胞は、腫瘍内注射の方法により投与することが好ましい。このような注射剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に生理食塩水、細胞培養液等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えてもよい。これら製剤中のウィルス感染キャリアー細胞の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。

[0045] 勿論、本発明の癌遺伝子治療薬は、数回にわたり患者に投与してもよいし、複数回のクールに分け、一クール当たりの投与回数、投与間隔などを任意に設定してもよい

[0046] 上記のように、ウィルス感染キャリアー細胞の投与量は、腫瘍の大きさ'種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて決定すればよいが、通常の場合、 1回のキヤリア一細胞の投与量をおよそ 10⁷細胞数以上 10^1(>細胞数以下に、キャリアー細胞によるオンコリティックウィルスの 1回の投与量をおよそ 10⁹ウィルス粒子以上 10¹⁴ウィルス粒子以下に設定することができる。

[0047] キャリアー細胞の種類は治療対象の癌の種類などに応じて適宜選択してもよい。また、遺伝子組換え技術によってキャリアー細胞を改変し、例えば標的腫瘍細胞と結合しやすくなるようキャリアー細胞の細胞表面に人為的に特定タンパク質等を発現させてもよいし、キャリアー細胞にセンダイウィルスを感染させる等の処置を行ってもよい。

[0048] オンコリティックウィルスは、細胞間相互作用（cell to cell interatcion)によりキャリア一細胞力標的腫瘍細胞へと感染し、腫瘍細胞内で特異的に増殖し、腫瘍細胞を融解'殺傷する cell lysis作用を発揮することができる。ウィルスによる癌遺伝子治療は、抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていたが、キャリアー細胞を用いると細胞間相互作用により標的腫瘍細胞に直接的に感染が成立することによって頻回投与が可能となり、強力な抗腫瘍効果が期待できる。

[0049] 〔2〕本発明の癌遺伝子治療薬を免疫処置用ウィルス等と組み合わせて構成した場合とその好適な使用例

以下に説明するように、本発明の癌遺伝子治療薬を免疫処置用ウィルス等と組み合わせて構成することは好まヽ。

[0050] 免疫処置用ウィルスと組み合わせる場合、本発明の癌遺伝子治療薬は、キャリアー細胞投与に対する生体の CTL反応を誘導するために投与される免疫処置用ウィルスと、オンコリティックウィルスを感染させ、同ウィルスを生体の腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞とを組み合わせたもの、つまり、予め投与される免疫処置用ウイルスと、その後に投与されるキャリアー細胞との 2種類の薬剤を組み合わせたものであり、予めアデノウイルス等のウィルス投与により免疫処置 (事前免疫 (ィムナイゼーシヨン) )を施した後、オンコリティックウィルスを感染させたキャリアー細胞を投与することで、生体の CTL反応が誘導'惹起され、 in vivoにおいて劇的な抗腫瘍効果を得ることがでさる。

[0051] 実際に免疫機能が正常な syngenicモデルマウスを使った実験において、本発明の癌遺伝子治療薬は劇的な抗腫瘍効果を示した。詳細は後述するが、 (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに卵巣癌細胞 OVHMを皮下移植し、その後、卵巣癌特異的プロモ一ターを導入したオンコリティックアデノウイルスを感染させたキャリアー細胞 (A549 細胞）を局所注射したところ、 3ヶ月前に予めアデノウイルス (Ad- β -gal)により免疫処置を施こしたマウスでは、投与開始後 3-4日で明らかな抗腫瘍効果を示し、 9日後に腫瘍は完全に消失し、リンパ節転移も消失した（図 7および図 18以下参照)。

[0052] このように、抗体産生があるにもかかわらずむしろ免疫力のあるマウスでより強力かつ劇的な抗腫瘍効果が得られたのは、免疫処置用アデノウイルスの投与によって生体の CTL反応 (細胞障害性 T細胞を介した細胞障害活性)が誘導 ·惹起されたためと考えられる。つまり、従来のウィルスによる癌遺伝子治療は、抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていたが、本発明の癌遺伝子治療薬は、生体の免疫機構を利用してウィルスが感染した標的腫瘍細胞を攻撃させることにより、むしろこれを武器に変えるものといえる。

[0053] 免疫処置用ウィルスとオンコリティックウィルスとは同種類のものを使用することが好ましい。免疫処置用ウィルスには非増殖型のものおよび Z又は不活ィ匕したものを使用することが好ましぐ非増殖型のものを更に紫外線照射等により DNAを破壊し不活ィ匕したものがより好ましい。例えば、免疫処置用ウィルスにアデノウイルスを使用する場合は、 E1領域が欠失したものおよび Z又は紫外線照射により DNAを破壊し不活ィ匕したものを使用するとよい。このように、免疫処置用ウィルスには、増殖型ウィルスを紫外線照射等により不活ィ匕したものを使用してもよい。

[0054] 後述の実施例では、免疫処置用ウィルスとして、 E1領域が欠失し、サイトメガロウイルス (CMV)プロモーターの制御下に 13 -galactosidase ( β -gal)をコードする LacZ 遺伝子が組み込まれたアデノウイルス (Ad— 18— gal)を使用した。勿論、免疫処置用ウィルスとしてはこれに限定されるものではなぐ増殖型アデノウイルスを紫外線 (UV )で不活ィ匕したものでもよぐさらに、 LacZ遺伝子ほか何らの遺伝子も組み込まれておらず、 polyA配列のみの非増殖型アデノウイルス (Ad-polyA)を紫外線照射により不活ィ匕して使用することは好まし、。

[0055] 本発明の癌遺伝子治療薬において、免疫処置用ウィルスの投与量は、患者のウイルスに対する抗体価、腫瘍の大きさ'種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて適宜選択すればよいが、ウィルスに対する抗体が陽性か陰性かに応じて投与量を変更することは好ましい。例えば、免疫処置用ウィルスおよびオンコリティックウィルスにタイプ 5のアデノウイルスを使用する場合、当該アデノウイルスに対する抗体陰性 (一)の患者には免疫処置用ウィルスの投与量をおよそ 10⁵ウィルス粒子以上 10¹¹ウイルス粒子以下とする一方、当該アデノウイルスに対する抗体陽性（+ )の患者には免疫処置用ウィルスの投与量をおよそ 10²ウィルス粒子以上 10⁷ウィルス粒子以下 (場合によっては、 10²ウィルス粒子未満または非投与としてもよい。）とする。免疫処置用ウィルスの投与方法は特に限定されるものではないが、皮内注射または皮下注射の方法により投与することが好ましい。

[0056] なお、実験などでマウス、ラット等の動物に対して本発明の癌遺伝子治療薬を投与する場合は、体重差を考慮してヒトに投与する場合のおよそ 1000分の 1量に各薬剤の投与量を設定すればよい。

[0057] 免疫処置用ウィルス投与力キャリアー細胞投与までの期間はおよそ 2週間以上 3 ヶ月以下に設定することができるが、できるだけ短期間であることが望ましい。後述の実施例では、免疫処置用ウィルス (アデノウイルス）を紫外線照射により不活化することで、上記期間を 3週間以上 4週間以下程度に短縮することができるようになった。

[0058] ウィルス感染キャリアー細胞の投与量などについては前述した力キャリアー細胞によるオンコリティックウィルスの 1回の投与量をおよそ 10⁹ウィルス粒子以上 10¹⁴ウイルス粒子以下に、キャリアー細胞に対するオンコリティックウィルスの感染量を、およそ 0. Ivp/cell以上 2000vp/cell以下（より好ましくは 5vp/cell以上 500vp/cell以下、さらに好ましくは 150vp/cell以上 400vp/cell以下）に設定することができる。

[0059] 免疫処置用ウィルスの投与と共に、またはその前後に、腫瘍免疫のため腫瘍細胞（癌細胞）を投与することは好ましい。即ち、免疫処置用ウィルスによるィムナイゼーシヨン時、またはその前後に、腫瘍細胞によるワクチネーシヨンを行う（予め放射線、エタノール、ホルマリン等処理した腫瘍細胞を投与することにより、治療対象の腫瘍細胞に対する生体の免疫応答を高めるようにする）ことは好ま、。

[0060] 上記ワクチネーシヨン (腫瘍免疫）に使用する腫瘍細胞としては、患者由来の腫瘍細胞が望まヽが、それと類似した抗原を提示すると考えられる一般に入手可能な腫瘍細胞を使用してもよい。後述の実施例では、卵巣癌 (OVHM)に対する治療効果を調べる実験で、治療対象の腫瘍細胞とは種類の異なる腫瘍細胞 (扁平上皮癌細胞 SCC7や肺癌細胞 A549細胞）を腫瘍免疫に使用した場合にも、良好な癌治療効果が認められた。 [0061] 上記ワクチネーシヨン (腫瘍免疫）にお、て、腫瘍細胞の投与量は特に限定されるものではないが、例えば、およそ 10⁵細胞数以上 10^1(>細胞数以下に設定することができる。腫瘍細胞への放射線の照射量は、 120Gy以上 600Gy以下 (より好ましくは 2 OOGy以上 500Gy以下)程度に設定することが好ましぐ腫瘍細胞の投与方法は、皮内注射または皮下注射の方法により投与することが好ましい。

[0062] さらに、治療対象の癌におけるウィルス産生量を高めるために、鉄剤の投与および Z又はボルフイリンィ匕合物の投与を行ってもよい。ボルフイリンィ匕合物としては、 5—ァミノレブリン酸 (5— aminolevulinic acid : ALA)、へマトポノレフイリン (hematoporphyrin)、フォトフィリン (photofrin)等が例示される。鉄剤としては、経口剤として硫酸第一鉄（ FeSO )、タエン酸第一鉄、静注用鉄剤としてコンドロイチン硫酸鉄、含糖酸化鉄が例

4

示される。投与方法は特に限定されるものではないが、本発明の癌遺伝子治療薬とともに、注射剤あるいは経口剤として投与することが好ましい。

[0063] 実際に、鉄剤 (Fe)および Z又は 5—アミノレブリン酸 (ALA)を投与することにより、オンコリティックアデノウイルス AdE3-lA1.3Bの癌細胞増殖抑制効果を著しく亢進することができた（図 15—17および図 28参照）。

[0064] キャリアー細胞と共に、ァテロコラーゲン（コラーゲンのテロペプチド結合のみをぺプシン処理などで切断し、分子量を小さくすることで水溶性としたもの）を投与することも好ましい。後述の実施例に示すように、ァテロコラーゲンをキャリアー細胞と同時投与した場合は、副作用による死亡率が激減した（図 24)。これは、ァテロコラーゲンによりオンコリティックアデノウイルスの拡散が抑制されると共に抗アデノウイルス抗体に対するブロックが生じたためと考えられる。

[0065] したがって、ァテロコラーゲンをキャリアー細胞と同時投与することにより副作用を抑え、オンコリティックウィルスの高投与が可能になる。ァテロコラーゲンは、市販品（例えば、株式会社高研の製品）を使用してもよいし、あるいは、コラーゲンをペプシン処理するなどして製造したものを使用してもよい。ァテロコラーゲンは、キャリアー細胞と共に注射液に混ぜて投与することが好ましぐ薬液中濃度 0. 01-3. 0% (wZv)程度で十分効果を発揮すると考えられる。（後述の実施例では、薬液中 0. 1-0. 2%という低濃度でも十分効果が認められた。 ) [0066] また前述したように、免疫反応を高めるため、キャリアー細胞に、オンコリティックウイルスのみならず、 GM— CSF発現ベクターをも感染させ、いわばウィルスベクターをダブルで感染させたキャリアー細胞を投与することは好ましい。（あるいは、両ベクターをそれぞれ個別に感染させたキャリアー細胞を同時に投与する方法としてもよい。）

[0067] GM— CSF発現ベクターには、オンコリティックウィルスと同種類のウィルスベクターを使用することが好ましい。例えば、オンコリティックウィルスにアデノウイルスを使用する場合、 GM— CSF発現ベクターには、 E1領域が欠失し、 GM-CSF ( granulocyte— macropnage colony stimulating factor:顆粒 ¾··マクロファ ~~ンコロニ¹ ~~ 刺激因子）をコードする GM— CSF遺伝子が組み込まれたアデノウイルスを使用することができる。

[0068] また、このようにウィルスベクターをキャリアー細胞に感染させる場合は、オンコリティックウィルスおよび GM— CSF発現ベクターの両者を合わせた感染量を、およそ 5ウイルス粒子 Z細胞以上 2000ウィルス粒子 Z細胞以下とする。

[0069] 実際に GM— CSF発現ベクターを使用することで、非常に優れた癌治療効果が認められた（図 27)。

[0070] その他、 GM— CSF発現ベクターを使用する代わりに、 GM— CSF蛋白をキャリアー細胞と共に注射液に混ぜる、あるいは経静脈的に全身投与する方法も考えられる。

[0071] 本発明の癌遺伝子治療薬の使用方法は、勿論、上述した方法に限定されるものではなぐ様々な使用例が考えられる。例えば、オンコリティックウィルスの感染力を高めるために、本発明の癌遺伝子治療薬を他の杭がん剤あるいは放射線照射などと併用してちょい。

[0072] 本発明の癌遺伝子治療薬の好適な使用例について、（1)免疫処置用ウィルスに対する抗体が陰性の患者の場合と、 (2)同抗体が陽性の患者の場合とに分けて説明する。

[0073] 上記（1)の場合、免疫処置用ウィルスには、例えば、前述の非増殖型アデノウィルスを紫外線照射により不活化して使用する。投与量はおよそ 10⁵vpから ΙΟ^νρ程度とする。免疫処置用ウィルスの投与と共に、腫瘍免疫のため 200Gy程度で放射線処理した患者由来の腫瘍細胞 (癌細胞)をおよそ 10⁵個から 10^1(>個投与する。免疫処置用ウィルスおよび腫瘍細胞の投与方法は、皮内注射または皮下注射とする。

[0074] 免疫処置用ウィルスおよび腫瘍細胞の投与からおよそ 3— 4週後に、キャリアー細胞を腫瘍内注射にて投与する。キャリアー細胞の投与量は、例えば 1回につき、 1 X 10 7個- 1 X 10^1(>個程度とする。キャリアー細胞には A549細胞を使用し、 150Gy力も 4 OOGy程度で放射線処理した後、投与する。オンコリティックウィルスおよび GM— CS F発現ベクターにはアデノウイルスを使用し、キャリアー細胞にはそれぞれ、 250 vp/cell程度、 5— 20vp/cell程度感染させる。注射液には液中濃度およそ 0. 1-0. 2 %となるようァテロコラーゲンを混ぜて投与する。また同時に、鉄 (Fe)を 40-100mg 程度静注する。あるいは、同時に、 ALAを 2-2000mg腫瘍内に投与する。

以上を 1回として、キャリアー細胞等を 1 6回投与する。複数回投与する場合は、連日あるいは 2, 3日おきに投与する。

[0075] 患者が抗体陽性の上記（2)の場合、免疫処置用ウィルスの投与量をおよそ 10⁵vp 以下とする以外は、上記（1)と同様に、本発明の癌遺伝子治療薬を投与すればよい

[0076] 本発明の癌遺伝子治療薬の具体例としては、（1)特定のキャリアー細胞、（2)さらに、キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウィルスを組み合わせたもの、（3)上記（1)又は（2)の組み合わせに、さらに、免疫処置用ウィルスを組み合わせたもの、（

4)上記（1)一（3)の組み合わせに、さらに、ァテロコラーゲンを組み合わせたもの、（

5)上記（1)一（4)の組み合わせに、さらに、 GM— CSF発現ベクターを組み合わせたもの、（6)上記（1)一（5)の組み合わせに、さらに、ウィルス産生量を高めるための鉄剤および Z又はボルフイリンィ匕合物を組み合わせたもの、（7)上記（1)一 (6)の組み合わせに、さらに、腫瘍免疫のため投与される腫瘍細胞を組み合わせたもの、（8)上記（1)一（7)の組み合わせに、保存、感染'培養、医薬製剤の調製などに必要な化合物 (試薬、緩衝液、酵素等)、または容器 (反応用、感染 ·培養用、保存用等)などを組み合わせたもの、を挙げることができる。

実施例

[0077] 以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。 [0078] 〔実施例 1：キャリアー細胞の選別と、抗体存在下における抗腫瘍効果〕既存の癌細胞株のうち、キャリアー細胞として強力な癌細胞増殖抑制効果を発揮する細胞株を選別するため、以下の実験を行った。

[0079] キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウィルスには、アデノウイルス AdE3—l Al. 3Β (ΙΑΙ. 3Β)を使用した。このアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bは、 E1A遺伝子および E3遺伝子を有し、かつ、 E1A遺伝子の上流に腫瘍特異的プロモーターとして卵巣癌特異的 1A1. 3Bプロモーター（IAL 3Bプロモーター）を有するアデノウィルスである。このアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを種々のキャリアー細胞に対し 50 Ovp/cellで 2日間感染させた後、同キャリアー細胞を培養 2日目の卵巣癌細胞株 HE Yに加え、培養 5日目に同細胞株 HEYの in vitro増殖抑制効果を調査した。

[0080] 上記実験結果を図 1に示す。同図グラフの縦軸は、各細胞株について 50%の増殖抑制効果 (IC50)が得られる細胞数を示し、細胞数が少ない細胞株ほど増殖抑制効果が高いことになる。同図に示すように、今回調査した癌細胞株では、 293細胞、 A5 49細胞、 SW626細胞、 HT— 3 (HT— III細胞）細胞の順に高い抗腫瘍効果を示した。 293細胞、 A549細胞および SW626細胞は、従来キャリアー細胞として使用されていた PA— 1細胞に比べて、およそ 100倍程度の高い増殖抑制効果を示した。 HT -3細胞についても、 SW626細胞と同程度の高い増殖抑制効果を示した。

[0081] 次に、オンコリティックウィルス単独の場合とキャリアー細胞を用いた場合とで、ウイルス抗体存在下、増殖抑制効果がどのように変化するかを調べた。キャリアー細胞には 293細胞を用い、この 293細胞に上記アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 2日間感染させ、得られたアデノウイルス AdE3— 1A1. 3B感染 293細胞およびその細胞上清（AdE3- 1A13B 293 cell+SUPT)を、抗アデノウイルス抗体存在下、 12ゥエルプレートに投与した。各ゥエルには前日に 5万個程度の卵巣癌細胞株 HEYがまき込まれている。抗アデノウイルス抗体には、 600倍の抗体価を有するものを様々な抗体価に希釈して用いた。同様に、オンコリティックウィルス単独の場合として、アデノウイルス Ad E3-1A1. 3Bを、抗アデノウイルス抗体存在下、 1ゥエル lOOOvp/cellで 12ゥエルプレートに投与した。そして、それぞれの場合において培養 5日目に癌細胞 (HEY細胞)の増殖抑制効果を調べた。 [0082] 上記実験結果を図 2に示す。同図グラフの縦軸は、 50%の増殖抑制効果 (IC50) が得られるときの抗アデノウイルス抗体の希釈度を示す。つまり、 293細胞を用いた場合は、 5倍程度の希釈（120倍の抗体価)でも 50%の増殖抑制効果が得られ、ァデノウィルス単独の場合は、 600倍程度の希釈（1倍の抗体価）によって 50%の増殖抑制効果が得られた。このように、キャリアー細胞を用いた場合は、抗体価の高い条件下においても増殖抑制効果を発揮することが示された。

[0083] 同様に、抗アデノウイルス抗体存在下、 HEY細胞に対する増殖抑制効果を、（1)ァデノウィルス感染 293細胞の上清と細胞成分 (AdE3-lA13B 293 cell+SUPT)、（2)ァデノウィルスを含む細胞上清（AdE3-lA13B, SUPT)、（3)アデノウイルスを含む細胞上清を 0. 2 mのフィルターで処理したもの（AdE3- 1A13B, SUPT, filter) , (4)アデノウィルス単独（AdE3-lA13B)、のそれぞれの場合について調べた。その結果を図 3 に示す。同図グラフの縦軸は、 50%の増殖抑制効果 (IC50)が得られるときの抗ァデノウィルス抗体の希釈度を示す。同図に示すように、キャリアー細胞（293細胞）を用いた場合に、他の場合と比べてより強力な抗腫瘍効果が得られた。

[0084] さらに上記と同様の実験で、 293細胞、 A549細胞、 SW626細胞、 HT— 3細胞の各キャリアー細胞にっ、て、 600倍の抗体価を有する抗アデノウイルス抗体存在下（ Ab (+) )、または非存在下 (Ab (—) )における、癌細胞株 HEY細胞に対する増殖抑制効果を検討した。その結果を図 4に示す。同図グラフの縦軸は、培養 5日目の癌細胞数を示す。同図に示すように、上記 4種類の細胞のうち、 A549細胞をキャリアー細胞に用いた場合に最も強力な増殖抑制効果を示した。即ち、充分量の抗ァデノウィルス中和抗体存在下にアデノウイルス感染 A549細胞を投与すると、標的癌細胞の増殖は抗体存在下にもかかわらずほぼ完全に抑制された。他の 3種類の細胞についても、抗体存在下、充分な増殖抑制効果が得られた。

[0085] ウィルスによる癌遺伝子治療は、ウィルスに対する中和抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていた力キャリアー細胞を用いることで、細胞間相互作用により標的癌細胞に直接的に感染が成立することによって、頻回投与が可能となる。さらに、キャリアー細胞として上記 4種類の細胞を用いることで、強力な抗腫瘍効果を得ることができる。 [0086] 〔実施例 2：ヌードマウス皮下腫瘍モデルにおける in vivo抗腫瘍効果〕次に、ヌードマウス皮下腫瘍モデルを用いて、本発明の癌遺伝子治療薬の in vivo 抗腫瘍効果を検討した。実験では、生後 5週のヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞 RMG— 1を移植し、 4週間後、直径約 10-15mmになった巨大腫瘍に対し、本発明の癌遺伝子治療薬を 6回腫瘍内注射し、腫瘍体積の変化を観察した。その結果を図 5のグラフに示す。グラフ中、黒四角印の「control」は PBS緩衝液を 6回腫瘍内注射した結果、黒丸印の「AdE3- 1A1.3BJは上記アデノウイルス AdE3— 1A1. 3Bをマウス 1匹に 1 X 10^1Qウィルス粒子投与した結果、黒三角印はアデノウイルス AdE3— 1A1. 3Bを 250vp/cell感染させた SW626細胞をマウス 1匹に 1 X 10⁷個投与した結果、黒菱形印はアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 25vp/cell感染させた 293細胞をマウス 1 匹に I X 10⁷個投与した結果、白四角印はアデノウイルス AdE3— 1A1. 3Bを 50 vp/cell感染させた A549細胞をマウス 1匹に 1 X 10⁷個投与した結果、である。同図に示すように、 293細胞および A549細胞をキャリアー細胞に用いた場合は、投与後 50日経過すると、直径約 10-15mmの巨大腫瘍が完全に消退した。 SW626細胞は、 98%の増殖抑制効果を示した。

[0087] 上記と同様の実験を、生後 5週のヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞 PA— 1を移植して行った。その結果を図 6に示す。同図に示すように、 293細胞および A549細胞をキャリアー細胞に用いると、直径約 10— 15mmの巨大腫瘍が完全に消退した。 S W626細胞は、 5匹中 4匹のマウスにおいて腫瘍が完全に消失した。

[0088] 〔実施例 3：免疫力のある皮下腫瘍モデルマウスにおける in vivo抗腫瘍効果〕

次に、免疫機能が正常な (C57BL/6 X C3/He)Flマウスを用いて本発明の癌遺伝子治療薬の in vivo抗腫瘍効果を検討した。本実験では、 (1) syngenicモデルマウスに対し同種の卵巣癌細胞 OVHMを皮下移植し、その 10日後以降形成された 5— 10mm の皮下腫瘍に対し、上記アデノウイルス AdE3—lAl . 3Bを 250vp/cell感染させた放射線処理 (放射線治療)後の A549細胞を 6回腫瘍内投与した場合、 (2)生後 7週の syngenicモデルマウスを免疫処置用ウィルスであるアデノウイルス投与により予め免疫し、その 3ヶ月後、上記 (1)の場合と同様に、卵巣癌細胞 OVHMを皮下移植し、その 10日後以降、上記アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 250vp/cell感染させた放射線処理後の A549細胞を 6回腫瘍内投与した場合、 (3)コントロールとして PBS緩衝液を 6回腫瘍内投与した場合、のそれぞれの場合にっヽて抗腫瘍効果を検討した

[0089] 上記実験結果を図 7のグラフに示す。グラフ中、黒四角印の「control」は上記 (3)のコントロールの場合の結果であり、黒丸印の「Ad (-)→A549」は上記 (1)の免疫処置用アデノウイルスを投与しな力つた場合の結果であり、黒三角印の「Ad(+)→A549」は上記 (2)の免疫処置用アデノウイルスを投与した場合の結果である。なお、免疫処置用アデノウイルスには、 E1遺伝子を有しない非増殖型のアデノウイルスを使用し、より具体的には、 CMVプロモーターの下流に LacZ遺伝子が挿入されたアデノウイルスを使用した。同図に示すように、予めアデノウイルスによる免疫をしていない上記 (1) の場合では、コントロールに比べて 20%の抗腫瘍効果を示したのに対し、予めアデノウィルスによる免疫処置を施した上記 (2)の場合では、投与開始後 3— 4日で明らかな抗腫瘍効果を示し、 9日後に腫瘍は完全に消失し、リンパ節転移も消失した。このように、抗体産生があるにも関わらずむしろ免疫力のあるマウスでより強力かつ劇的な抗腫瘍効果が得られたのは、免疫処置用アデノウイルスの投与によって生体の CT L反応が誘導 ·惹起されたためと考えられる。

[0090] オンコリティックアデノウイルスは、細胞間相互作用によりキャリアー細胞力標的腫瘍細胞へと感染し、腫瘍細胞内で特異的に増殖し、腫瘍細胞を融解 ·殺傷する cell lysis作用を発揮すると考えられるが、本発明の癌遺伝子治療薬においては、予め免疫処置用アデノウイルスを投与することによって、オンコリティックアデノウイルスに感染した標的腫瘍細胞を排除する生体の強!ヽ CTL反応が誘導され、アデノウイルス感染腫瘍細胞の完全な自然排除が誘導されると考えられる。

[0091] 標的腫瘍細胞へのアデノウイルスの感染方法の 1つとして、アデノウイルスによる細胞融合が考えられる。図 8は、 A549細胞をまき込んだゥエルに、紫外線照射により不活ィ匕したアデノウイルスを 1細胞当たり 10000ウィルス粒子投与し、一晩培養後、顕微鏡により観察した結果を示すものである。同図矢印に示すように、アデノウイルスの投与によって細胞融合が起こり、多核細胞が散見された。アデノウイルスを投与しな力つた A549細胞では、このような変化は観察されな力つた（図 9参照)。 [0092] 細胞融合以外に考えられる感染方法としては、キャリアー細胞の標的細胞への細胞接着さらに局所的なアデノウイルスのバーストあるいはアデノウイルスを含むキヤリァー細胞 fragmentによる標的腫瘍細胞へのアデノウイルスの感染が成立すると考えられる。何れの方法にせよ、アデノウイルスに感染した標的腫瘍細胞においては、腫瘍特異的プロモーターを有するアデノウイルスが増加し強力な免疫原となって (あるヽはアデノウイルスに感染した標的腫瘍細胞が有する癌特異的ペプチドを二次的に抗原認識することによって）、 CTL反応により腫瘍細胞が排除されると考えられる。

[0093] 〔実施例 4：ミツドカインプロモーターを使用した場合の抗腫瘍効果〕

次に、ミツドカインプロモーターを使用した場合の抗腫瘍効果を検討した。図 10 (a) は、 1一 21のヒト手術標本におけるミツドカイン（MK) mRNAの発現を RT— PCRで検討した結果である。同図に示すように、神経膠芽腫 (glioblastoma) , 未分化星細胞腫 (anaplastic astrocytoma)と、つた悪'性グリオ一マ (malignant glioma)および瀰漫性星細胞腫（diffiise astrocytoma)においてミツドカイン mRNAの過剰発現が認められた。このように、ミツドカインは脳腫瘍など多くの癌において過剰発現が認められる

[0094] 図 10 (b)は、上記と同様の方法により、悪性ダリオ一マの 4つの細胞株におけるミツドカイン mRNAの発現を RT— PCRで検討した結果である。同図に示すように、 4つの細胞株のうち、 U87MGでは発現はなぐ U251MG、 LN319、 U373MGではミッドカイン mRNAの過剰発現が認められた。

[0095] 図 10 (c)は、上記各細胞株におけるミツドカイン蛋白の発現をウェスタンブロット解祈によって検討した結果であり、 mRNAと同様に U87MGでは発現はなぐ U251M G、 LN319、 U373MGではミツドカイン蛋白の過剰発現が認められた。

[0096] 次に、ミツドカインのプロモーターアツセィを行った。実験では、長さが異なる 2つのミツドカインプロモーター（600塩基と 2300塩基）の活性を比較した。それぞれのプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたプラスミド（PGL3-MK600および PGL3-MK2300)を上記各細胞株に導入し、それぞれのルシフェラーゼ活性を調べることによりプロモーター活性を評価した。その結果、図 11に示すように、悪性ダリオ一マの細胞株では、長さ 600塩基のほうが長さ 2300塩基より高いプロモーター活性を示した。

[0097] 図 12 (a)は、今回設計した、ミツドカインプロモーターを有するオンコリティック (細胞融解型)アデノウイルスの構造を模式的に示す図である。長さ 600塩基または 2300 塩基のミツドカインプロモーターは、 552bpの位置に導入された。

[0098] 図 12 (b)は、 3種類のアデノウイルスを上記各細胞株に感染させ、それぞれの細胞株における E1A蛋白の発現をウェスタンプロット解析によって検討した結果である。同図に示すように、長さ 600塩基のミツドカインプロモーターを有するアデノウイルス ( AdMK600)を感染させた場合、ミツドカインを発現する U251MG、 LN319、 U373 MGでのみアデノウイルスの El A蛋白の発現が観察された。これに対して、野生型のアデノウイルス (AdWild)では正常脳細胞を含めすベての細胞に E1A蛋白の発現が観察され、コントロールウィルスである AdLacZでは!/、ずれの細胞にぉ、ても E1A 蛋白の発現が観察されな力つた。

[0099] 図 13 (a)は、 3種類のアデノウイルスによる癌細胞増殖抑制効果を比較検討した結果である。野生型のアデノウイルス (AdWild)ではすベての細胞にお!、て強!、増殖抑制効果を示した力ミツドカインプロモーターを有するアデノウイルス (AdMK600 および AdMK2300)では、ミツドカインを発現する U251MG、 LN319、 U373MG においてのみ増殖抑制効果を示し、これらの値は、ミツドカイン mRNAの発現量、プ口モーター活性とよく相関した。また、長さ 2300塩基のミツドカインプロモーターを有するアデノウイルス AdMK2300より AdMK600のほうが強い増殖抑制効果を示した

[0100] 図 13 (b)は、アデノウイルスの E3領域の増殖抑制効果に与える影響を検討した結果であり、同図に示すように、 E3領域のある AdMK600では E3領域のないアデノウィルス (AdMK600- Δ E3)より 10倍程度の強、増殖抑制効果を示した。

[0101] 図 13 (c)は、腫瘍の直径 5— 10mm程度の大きさのヌードマウス皮下移植モデルにおけるアデノウイルスの抗腫瘍効果を検討した結果である。図中、黒菱形印は野生型のアデノウイルス AdWildを投与した結果、黒四角印はミツドカインプロモーターを有するアデノウイルス AdMK600を投与した結果、黒三角印は LacZ遺伝子が挿入されたアデノウイルス Ad- β -galを投与した結果、黒丸印は PBS緩衝液のみ投与した結果である。同図に示すように、ミツドカインを発現しない U87MGでは野生型のアデノウィルスのみ抗腫瘍効果を示し、ミツドカインを発現する U373MGでは AdMK60 0と AdWildは完全に腫瘍の消失をもたらし、 PBS緩衝液のみ注射したコントロールと AdLacZを注射したものとの間には大きな差異は認められなかった。

[0102] さらに、上記ミツドカインプロモーターを有するアデノウイルス（Ad- MK600)をキヤリア一細胞に感染させ本発明の癌遺伝子治療薬を調製し、その抗腫瘍効果を Ad- MK600単独投与の場合と比較した。実験では、 293細胞および A549細胞をキヤリァー細胞に使用した。ヌードマウス 5週令に上記 U373MG細胞を移植し、 3週間後に 10— 15mmの巨大腫瘍が得られた後、本発明の癌遺伝子治療薬または Ad-MK 600のみを投与し、その 4週間後に腫瘍体積の大きさを比較した。その結果を図 14 に示す。図中、「Ad-MK600」は Ad-MK600を単独投与した結果、「293」「A549」はそれぞれ 293細胞、 A549細胞をキャリアー細胞に用いた本発明の癌遺伝子治療薬を投与した結果である。同図に示すように、本発明の癌遺伝子治療薬を投与したときは完全に腫瘍が消失した。一方、 Ad-MK600を単独投与したときはコントロール（ control)と殆ど差は認められなかった。

[0103] これまでの実験結果から、キャリアー細胞に A549細胞、 293細胞などを使用し、ォンコリティックウィルスに 1A1. 3Bプロモーター又はミツドカインプロモーターを有するアデノウイルスを使用することによって、実際に卵巣癌、悪性ダリオ一マに対する良好な治療効果が認められた。ミツドカインプロモーターは、悪性ダリオ一マのほか種々の悪性腫瘍に対して使用可能であり、悪性ダリオ一マ以外の癌治療にも有効と考えられる。

[0104] 〔実施例 5：アデノウイルス AdE3- 1A1.3Bの増殖抑制効果に対する Feおよび ALAの影響〕

卵巣癌細胞 HEYを 12well dishに 10000/well播いた後、翌日に FeSOを 50 μ g/ml

4 、

5 g/ml、 0.5 /z g/ml、 0 /z g/mlの各濃度において入れ、全ての wellに細胞障害型ァデノウィルス AdE3- 1A1.3Bを入れ、 5日後にアデノウイルスの増殖抑制効果を IC50 で評価した。その結果を図 15に示す。図中縦軸は、各場合における IC50のウィルス投与量 (vp/cell)を相対的に示すものである。同図に示すように、 FeSO 50 /z g/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ約 20倍、 FeSO

4

5 g/mlおよびアデノウイルス併用では、アデノウイルス単独に比べ約 8倍の増殖抑制効果を示した。

[0105] 次に、卵巣癌細胞株 HEYを 12well dishに 10000/well播いた後、翌日に

5— aminolevulinic acid (ALA; 50 μ g/ml、 5 μ g/ml、 0.5 μ g/ml、 0 μ g/mlの各度において入れ、全ての wellに細胞障害型アデノウイルス AdE3-lA1.3Bを入れ、 5日後にアデノウイルスの増殖抑制効果を IC50で評価した。その結果を図 16に示す。図中縦軸は、各場合における IC50のウィルス投与量 (vp/cell)を相対的に示すものである。同図に示すように、 ALA 50 g/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、ァデノウィルス単独に比べ約 100倍の増殖抑制効果を示した。

[0106] さらに、卵巣癌細胞株 HEYを 12well dishに 10000/well播いた後、翌日に FeSOを

4

50 μ g/ml、 5 μ g/ml、 0.5 μ g/ml、 0 μ g/mlの各濃度にお!ヽて入れ、各 wellに細胞障害型アデノウイルス AdE3-lA1.3Bおよび 5- aminolevulinic acid (ALA) 50 g/ml、又はコントロールとしてアデノウイルス単独を入れ、 5日後にアデノウイルスの増殖抑制効果を IC50で評価した。その結果を図 17に示す。図中縦軸は、各場合における IC50 のウィルス投与量 (vp/cell)を相対的に示すものである。同図に示すように、 FeSO 50

4 μ g/ml、 ALA 50 g/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ、約 1000倍の増殖抑制効果を示し、 FeSO 5 μ g/ml、 ALA 50 μ g/mlおよ

4

びアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ、約 700倍の増殖抑制効果を示し、 FeSO 0.5 μ g/ml、 ALA 50 μ g/mlおよびアデノウイルスを併用した

4

場合では、アデノウイルス単独に比べ、約 200倍の増殖抑制効果を示した。

[0107] 以上のように、 ALAおよび Feは、オンコリティックアデノウイルス AdE3- 1A1.3Bの増殖抑制効果を著しく亢進することが明ら力となった。この理由は、 j8 -gal assayによりアデノウイルスの感染能力を高めること、 PFU assayによりアデノウイルスの産生量の増加によることが明らかとなっており、 ALAおよび Feは、アデノウイルスの感染力を高め、産生量を増加させること、つまりアデノウイルスの癌細胞内への感染力増加と細胞内における産生量増加とともに抗腫瘍効果を著しく高めることが明らかとなった。

[0108] ALAは、ポルフィリン代謝物で従来より癌細胞に取り込まれ、その代謝物である protoporphyrin IXが蓄積されやすいことが知られており、これが光増感作用を有することよりエキシマダイレーザーと併用され、表在性癌の PDT治療（photodynamic therapy)に用いられてきた。

[0109] 上記 protoporphyrin IXは、 Feと結合することにより hemeとなり、細胞内で cytcrome 等の heme蛋白を形成する。この heme蛋白は、細胞内ミトコンドリアで呼吸器系に関与しており、 ATP産生に働き蛋白合成に関与する。このように、 heme蛋白は、アデノウィルス感染時のアデノウイルス産生のための蛋白合成に関与するため、これらボルフィリン代謝が亢進することは、アデノウイルス産生増加につながる可能性が高いと考えられる。

[0110] したがって、本発明の癌遺伝子治療薬、癌遺伝子治療方法において、これら Feおよび Z又は ALA等のボルフイリンィ匕合物を併用することにより、さらに治療効果を高めることが期待できる。即ち、 Feおよび Z又は ALA等のボルフイリンィ匕合物を併用することにより、直接的な抗腫瘍効果の増カロ、さらには抗体存在下の感染抑制状態において、標的細胞のアデノウイルス産生増加による CTL responseの亢進により、 syngenic mouse modelにおいて抗腫瘍効果が高まり、ヒトにおいても同様な良好な抗腫瘍効果を呈するものと考えられる。

[0111] また、オンコリティックウィルスを用いた癌遺伝子治療において、キャリアー細胞を使用しな、場合であっても、 Feおよび Z又は ALA等のポルフィリン化合物を併用することにより、治療効果を高めることが期待できる。

[0112] 〔実施例 6 :本発明の癌遺伝子治療薬による癌治療法の最適化の検討〕

本発明の癌遺伝子治療薬による癌治療法の最適化を図るため、以下一連の実験を行った。

[0113] まず、図 7に示す実験と同様に、免疫機能が正常な皮下腫瘍モデルマウス（

(C57BL/6 X C3/He)Flマウス）を用いて、本発明の癌遺伝子治療薬の in vivo抗腫瘍効果を検討した。本実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスを免疫処置用ウィルスの投与により事前免疫し、その 12週後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1匹あたり I X 10⁶個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成後、上記アデノウイルス AdE3—l Al . 3Bを 250vp/cell感染させた A549細胞 (Ad— A549)を腫瘍内投与した。免疫処置用ウィルスには、 E1遺伝子を有しない非増殖型のアデノウイルスを使用し、より具体的には、 CMVプロモーターの下流に LacZ遺伝子が挿入されたアデノウイルスであって、紫外線等による不活ィ匕処理を行って、な、アデノウイルス Ad— β galを使用し、この Ad— 18— galをマウス 1匹あたり 1 X 10^1Gvp皮内投与した。また、キャリア一細胞である A549細胞は、 200Gyにて放射線処理後、マウス 1匹につき 1回あたり 5 X 10⁶個、合計 6回腫瘍内投与した。

[0114] 上記実験結果を図 18 (a) (b)に示す。各グラフ中、「Ad- β -gal→Ad-A549jは上記実験結果であり、「Ad-A549」はキャリアー細胞のみ投与した結果、「Ad- |8 - gal」は免疫処置用ウィルスは投与せず、治療として Ad- 18 -galのみ投与した結果、「control」は PBS緩衝液を投与した結果である。各群のマウスの数は n= 5である。（a)のグラフは、各マウスの腫瘍体積を比較的短期間観察した結果であり、（b)のグラフは、各群マウスの生存率を長期間観察した結果である。これらの図に示すように、「Ad- |8 -gal→ Ad-A549jでは強力な in vivo抗腫瘍効果が認められた。

[0115] 次に、免疫処置用アデノウイルス投与力キャリアー細胞投与までの投与間隔について検討を行った。本実験は、この投与間隔を様々なものに変更した点、および、キャリア一細胞である A549細胞にアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/cell感染させた点以外は、図 18に示す実験と同様に行った。

[0116] 上記実験結果を図 19 (a) (b)に示す。各グラフ中、「2—4w」「5— 9w」「10—15w」「 16— 22w」は、それぞれ、上記投与間隔を 2— 4週、 5— 9週、 10— 15週、 16— 22週の間に設定した実験結果であり、各群のマウスの数は n= 5である。これらの図に示すように、上記投与間隔を 10-15週に設定したとき最も良好な抗腫瘍効果が得られた。本実験のように、不活化処理して、な、アデノウイルス Ad— β galを免疫処置用ウイルスに使用した場合には、当該ウィルス投与後およそ 10— 15週にぉヽて T細胞による CTL反応が中和抗体による感染抑制に比べ優位になると考えられる。

[0117] 臨床応用を考慮すると、上記投与間隔は短期間であることが望ましい。そこで、不活ィ匕処理したアデノウイルス Ad— β galを免疫処置用ウィルスに使用することで上記投与間隔を短くすることができないか検討した。その結果図 20に示すように、紫外線 (UV)照射し、不活ィ匕処理したアデノウイルス UV— Ad— β galを免疫処置用ウイルスに使用した場合は、上記投与間隔を 4週または 3週に設定したときに良好な抗腫瘍効果が得られること、すなわち、免疫処置用ウィルスを不活化処理することで、上記投与間隔を 3— 4週程度に短縮できることがわ力つた。

[0118] 上記実験は、不活ィ匕処理したアデノウイルス UV— Ad— β galを免疫処置用ウィルスに使用した点、上記 UV— Ad— 18— galをマウス 1匹あたり 1 X 10⁷vp皮内投与した点、上記投与間隔を 3週、 4週、 5週または 6週に設定した点、および、キャリアー細胞である A549細胞にアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/cell感染させた点以外は、図 18に示す実験と同様に行った。各群のマウスの数は n= 10である。

[0119] 図 21は、上記 UV— Ad— 18— galを免疫処置用ウィルスに使用した場合の当該ウイルスの投与量について検討した結果である。この実験では、上記 UV— Ad— 18— gal の投与量を 1 X 10⁶vpから 1 X ΙΟ^νρの範囲で変更した。また、上記投与間隔は 6週に設定し、それ以外は図 20に示す実験と同様に行った。その結果、 UV-Ad- iS -g alの投与量 I X 10⁷vpのときに最も良好な抗腫瘍効果が得られた。（この結果から、図 20に示す実験では、 UV— Ad— 18— galの投与量を 1 X 10⁷vpに設定した。）

[0120] 図 22 (a) (b)は、腫瘍免疫 (tumor vaccination)の効果を検討した結果である。上記 UV-Ad- 18 -galをマウス 1匹につき 1 X 10⁷vp皮内投与し、その 10日後に腫瘍免疫のため放射線照射した卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 10⁶個皮下移植した。同時に、扁平上皮癌細胞 SCC7または卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 10⁶個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍を形成したマウスに AdE3-lA1.3B感染 A549細胞を 5 X 10⁶個腫瘍内に 6回投与したマウス（図中、「OVHM— RT+Ad— j8— gal→SCC7」「OVHM— RT+Ad— j8— gal→ OVHM」）では、コントロール（図中、腫瘍免疫無しに SCC7腫瘍に対してキャリアー細胞治療した「SCC7」、腫瘍免疫無しに OVHM腫瘍に対してキャリアー細胞治療した「OVHM」）に比べて腫瘍の成長 ·増殖は著しく抑制され、特に放射線照射した OV HMによって腫瘍免疫し OVHM腫瘍形成したマウスにキャリアー細胞による治療を行うと、全てのマウスにおいて腫瘍は消失し、再発は認められな力つた。

[0121] 図 23は、非小細胞性肺癌細胞 A549細胞による腫瘍免疫の効果を検討した結果である。この実験では、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを lOOvp/cell感染させた放射線処理後の A549細胞をマウス 1匹につき 1 X 10⁶個皮下移植し、その 40日後に卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 10⁶個皮下移植した。このマウス（図中、「 AdE3-lA1.3B- infected A549→OVHM」）においても、コントロール（図中、腫瘍免疫無しに OVHM腫瘍形成しキャリアー細胞による治療を行った「OVHM」 )に比べて腫瘍の成長'増殖は著しく抑制され、生存率は大きく改善した。

[0122] 以上の結果から、種類の異なる癌細胞で腫瘍免疫を行っても抗腫瘍効果があることがわかった。

[0123] 次に、キャリアー細胞と共にァテロコラーゲンを投与した場合の効果について検討した。この実験では、生後 5— 10週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウイルス AdE3— 1A1. 3Bを所定量感染させた A549細胞を 5 X 10⁶個投与した力このときァテロコラーゲンを混注して最終濃度を 0. 1%とし、アデノウイルス投与に伴う副作用による死亡率が改善されるかどうかを調べた。その結果を図 24に示す。図中、右側のバーは、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/celほたは 250vp/cell感染させた A549細胞と共にァテロコラーゲンを投与した結果、左側および中央のバーは、ァデノウィルス AdE3— 1A1. 3Bをそれぞれ 5vp/cell、 50vp/cell感染させた A549細胞を投与した結果 (ァテロコラーゲンは混注せず)である。同図に示すように、ァテロコラ一ゲンを同時投与した場合は、副作用による死亡率が激減し、投与量も増加することが可能となった。これは、ァテロコラーゲンによりアデノウイルスの拡散が抑制されると共に抗アデノウイルス中和抗体に対するブロックが生じたためと考えられる。

[0124] 以上の結果から、ァテロコラーゲンをキャリアー細胞と同時投与することによって副作用を抑え、アデノウイルスの高容量の投与が可能になることがわかった。

次に、不活ィ匕処理していない前記アデノウイルス Ad— 18— galを 1、 2、 3回投与し、ブースター効果によりそれぞれ血中抗アデノウイルス抗体が増加したマウスにおける抗腫瘍効果について検討した。この実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウイルス Ad— j8— galを 1回、 2回または 3回投与し (各回 3週おきに、 1 回あたり 1 X 10^1Gvp投与）、その後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1匹あたり 1 X 10⁶個皮下移植し、 5-10mmの腫瘍形成後、放射線処理後のキャリアー細胞を腫瘍内投与した。キャリアー細胞には、 A549細胞単独、または、 A549細胞と 293細胞とを混合したものを使用した。 [0125] A549細胞と 293細胞とを混合したものは、マウス 1匹につき、アデノウイルス AdE3 -1A1. 3Bを 50vp/cell感染させた A549細胞を 3. 75 X 10⁶個、および、アデノウィルス AdE3—lAl. 3Bを lOvp/cell感染させた 293細胞を 3. 75 X 10⁶個腫瘍内投与し、これを 1回として合計 6回腫瘍内投与した。その結果を図 25 (a) (b)に示す。また、 A549細胞単独の場合は、マウス 1匹につき、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 5 Ovp/cell感染させた A549細胞を 7. 5 X 10⁶個腫瘍内投与し、これを 1回として合計 6 回腫瘍内投与した。その結果を図 26 (a) (b)に示す。図 25および図 26において、「 X 1」「 X 2」「 X 3」は、それぞれ、アデノウイルス Ad— β galを 1回、 2回、 3回投与した結果である。これらの図に示すように、アデノウイルス Ad— 18— gal数回投与により抗アデノウイルス抗体プラスのマウスにぉ、ても、キャリアー細胞による抗腫瘍効果が認められた。また今回の実験では、 A549細胞単独に比べて、 A549細胞と 293細胞とを混合したものをキャリアー細胞に使用したほうが成績は良好であった。

[0126] 図 27 (a) (b)は、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bのみならず、 GM— CSF発現べクターを感染させたキャリアー細胞 (A549細胞）を投与し、かつ、このキャリアー細胞と共にァテロコラーゲンを投与した場合の in vivo抗腫瘍効果にっ、て検討した結果である。この実験では、図 26に示す実験と同様に、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Fl マウスに、アデノウイルス Ad— j8— galを 1回、 2回または 3回投与し（各回 3週おきに、 1回あたり 1 X 10^1Gvp投与）、その後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1匹あたり 1 X 10⁶ 個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成後、放射線処理後のキャリアー細胞を腫瘍内投与した。ただし、キャリアー細胞 (A549細胞）には、アデノウイルス AdE3—lAl. 3 Bを 50vp/cell感染させると共に、 GM— CSF発現ベクター（アデノウイルスの E1遺伝子を欠失した部位に CMVプロモーターの下流に GM— CSF遺伝子を挿入したベタター）を 1 Ovp/cell感染させた。こうして調製した放射線処理後の A549細胞を 1回につき 7. 5 X 10⁶個、ァテロコラーゲン (濃度 0. 1%)と共に腫瘍内投与し、合計 3回（ X 3)腫瘍内投与した。

[0127] 図 27 (a) (b)において、「Ad- j8 - gal→AdE3- 1A1.3B + GMCSF」は上記実験結果であり、「Ad- j8 -gal→AdE3-l A1.3BJはアデノウイルス AdE3—lAl . 3Bのみ 50vp/cell 感染させたキャリアー細胞 (A549細胞）を 1回につき 7. 5 X 10⁶個、合計 6回（X 6) 腫瘍内投与した結果である。同図に示すように、「Ad- |8 - gal→AdE3-lA1.3B + GMCSF」では、 3回投与にもかかわらず「AdE3-lA1.3B」6回投与に比べ、アデノウィルス Ad— j8— galを 1回、 2回、 3回投与した場合のいずれも非常に強い in vivo抗腫瘍効果が認められた。

[0128] 以上の結果から、キャリアー細胞にオンコリティックアデノウイルスのみならず、 GM

CSF発現ベクターをも感染させることは、癌治療に非常に有効であることがわかつた。

[0129] 図 28 (a) (b)は、キャリアー細胞投与時に、鉄剤を腹腔内投与した場合の効果について検討した結果である。この実験では、図 27に示す実験と同様に、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウイルス Ad— j8— galを 1回、 2回または 3回投与し (各回 3週おきに、 1回あたり l X 10¹⁽Vp投与）、その後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1匹あたり 1 X 10⁶個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成後、放射線処理後のキヤリア一細胞を腫瘍内投与した。ただし、キャリアー細胞投与時に、鉄剤として鉄デキストラン (Fe— Dextran) 0. Olmgを腹腔内投与した。キャリアー細胞には、アデノウィルス AdE3— 1A1. 3Bを 50vp/cell感染させた A549細胞を使用し、 1回につき 7. 5 X 10⁶個、合計 3回（X 3)腫瘍内投与した (各回、鉄剤も投与した)。

[0130] 図 28 (a) (b)において、「Ad- β - gal→AdE3- 1A1.3B + Fe」は上記実験結果であり、「Ad- β -gal→AdE3-lA1.3Bjはアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/cell感染させたキャリアー細胞 (A549細胞）を 1回につき 7. 5 X 10⁶個、合計 6回（X 6)腫瘍内投与した結果である。同図に示すように、「Ad- _J8 -gal→AdE3-lA1.3B + Fe」では、ァデノウィルス Ad— j8— galを 1回、 2回、 3回投与した場合のいずれもキャリアー細胞による治療は 3回にもかかわらず、 AdE3-lA1.3B感染キャリアー細胞による 6回の治療に比べ非常に強、in vivo抗腫瘍効果が認められた。

[0131] 以上の結果から、キャリアー細胞投与時に、あわせて鉄剤を投与することは、癌治療に非常に有効であることがわ力つた。

[0132] 次に、キャリアー細胞投与前にキャリアー細胞に対して行う放射線処理において照射する線量について検討した。実験には、生後 5週のヌードマウスを使用し、 A549 細胞を異なる線量で放射線処理後、マウス 1匹あたり 1 X 10⁷個皮下移植し、腫瘍の形成'成長を観察した。その結果を図 29に示す。同図に示すように、照射する線量を 120Gy以上とすることで、腫瘍の形成 ·成長は抑制された。

[0133] (C57BL/6 X C3/He)Flマウスを使用した実験で、キャリアー細胞 (A549細胞）を異なる線量で放射線処理した場合の抗腫瘍効果について検討した結果を図 30に示す。この実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウイルス UV— Ad j8— galを 1 X 10^1Gvp投与し、その 5週後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1匹あたり 1 X 10⁶個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成後、線量 50Gy、 100Gy、 200Gyまたは 400Gyで放射線処理したキャリアー細胞を腫瘍内投与した。キャリアー細胞には、ァデノウィルス AdE3— 1A1. 3Bを 50vp/cell感染させた A549細胞を使用し、 1回につき 7. 5 X 10⁶個、合計 6回腫瘍内投与した。その結果、放射線処理において照射する線量は、 200Gyよりも 400Gyのほうが良好な結果が得られた。

[0134] 図 31は、キャリアー細胞に対するオンコリティックウィルスの感染量について検討した結果を示す。この実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウィルス Ad— j8— galを 1 X 10^1(>vp投与し、その 4週後、卵巣癌細胞 OVHMをマウス 1 匹あたり 1 X 10⁶個皮下移植し、 5- 10mmの腫瘍形成後、線量 250Gyで放射線処理したキャリアー細胞を腫瘍内投与した。また、キャリアー細胞 (A549細胞）に対するアデノウイルス AdE3—lAl. 3Bの感染量を、 100vp/cell、 250vp/celほたは 500 vp/cellのいずれかとし、 1回につきキャリアー細胞を 7. 5 X 10⁶個、合計 6回腫瘍内投与した。さらに、キャリアー細胞投与時に、あわせてァテロコラーゲン (濃度 0. 1%) を腫瘍内投与した。その結果、上記感染量は 250vp/cellのときに最も良好な結果が得られ、 150— 400vp/cell程度に設定すれば良好であることがわかった。

[0135] 図 32 (a) (b)は、図 31に示す実験と同様の実験において、腫瘍免疫の効果を検討した結果である。この実験では、生後 5週の (C57BL/6 X C3/He)Flマウスに、アデノウィルス Ad— β galを 1 X 10^1Gvp投与し、その 4週後に腫瘍免疫のため線量 80Gyで放射線処理した卵巣癌細胞 OVHM— RTをマウス 1匹あたり 1 X 10⁶個皮下移植した。さらにこの後、卵巣癌細胞 OVHMを 1 X 10⁶個皮下移植し、 5— 10mmの腫瘍形成後、線量 250Gyで放射線処理したキャリアー細胞を腫瘍内投与した。キャリアー細胞には、アデノウイルス AdE3—lAl. 3Bを 50vp/cell感染させた A549細胞を使用し、 1回につき 7. 5 X 10⁶個、合計 3回腫瘍内投与した。また、キャリアー細胞投与時に、あわせてァテロコラーゲン (濃度 0. 1%)を腫瘍内投与した。その結果、腫瘍免疫を行ったマウス（図中、「OVHM- RT→A549」）では、腫瘍免疫を行わなかったマウス（図中、「A549」）に比べて腫瘍の成長'増殖は著しく抑制され、生存率は大きく改善した

[0136] 以上の結果から、本発明の癌遺伝子治療薬の使用に際し、腫瘍免疫を併用することで良好な抗腫瘍効果が得られることがわ力つた。

産業上の利用可能性

[0137] 以上のように、本発明の癌遺伝子治療薬は、ほぼ全ての悪性腫瘍に適用することができ、卵巣癌、扁平上皮癌 (子宮頸部癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、肺癌等)、消化器癌 (大腸癌、膝癌、肝癌、胃癌等)、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳癌、精巣癌、前立腺癌など各種癌に対する強力な抗腫瘍効果が期待できる。

Claims

請求の範囲 [1] オンコリティックウィルスを感染させ、同ウィルスを腫瘍細胞に作用させるためのキヤリア一細胞を含み、当該キャリアー細胞は以下の（1)一（4)の細胞力選ばれる、癌遺伝子治療薬。

(1) A549細胞

(2) 293細胞

(3) SW626細胞

(4) HT - 3細胞

[2] 上記キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウィルスは、治療対象の癌の種類等に応じて、 1A1. 3Bプロモーター、ミツドカインプロモーター、 j8— HCGプロモータ一、 SCCA1プロモーター、 cox— 2プロモーター、 PSAプロモーター、又はその他の腫瘍特異的プロモーターを有する、請求項 1記載の癌遺伝子治療薬。

[3] 上記オンコリティックウィルスは、アデノウイルス、ヘルぺスウィルス、 HIVウィルス等のレンチウィルス、レトロウイルス、レオウィルス、水疱性口内炎ウィルス（VSV)、又はその他のオンコリティックウィルス力選ばれる、請求項 1又は 2記載の癌遺伝子治療薬。

[4] さらに、キャリアー細胞投与に対する生体の CTL反応を誘導するために投与される免疫処置用ウィルスを備えた、請求項 1記載の癌遺伝子治療薬。

[5] さらに、ァテロコラーゲンを備えた、請求項 1記載の癌遺伝子治療薬。

[6] さらに、投与前にキャリアー細胞に感染させる GM— CSF発現ベクターを備えた、請求項 1記載の癌遺伝子治療薬。

[7] さらに、鉄剤および Z又はボルフイリンィ匕合物を備えた、請求項 1記載の癌遺伝子治療薬。

[8] さらに、腫瘍免疫のため投与される腫瘍細胞を備えた、請求項 1記載の癌遺伝子治療薬。