JP6358831B2 - 新規細胞、それを用いた抗腫瘍効果の誘導剤、癌の遺伝子治療用医薬および抗腫瘍効果の誘導方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規細胞、それを用いた抗腫瘍効果の誘導剤、癌の遺伝子治療用医薬および抗腫瘍効果の誘導方法に関する。

近年、癌治療に関し、キャリアー細胞を用いた遺伝子治療が注目されており、様々な方法が提案されている。この遺伝子治療は、例えば、標的の腫瘍細胞において特異的に増殖するオンコリティックウイルス（殺腫瘍ウイルス）を前記キャリアー細胞に感染させた後、前記キャリアー細胞を腫瘍部位に投与する方法である。

前記キャリアー細胞としては、例えば、卵巣癌細胞ＰＡ−１（非特許文献１、２および３、特許文献１および２参照）、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＧ（非特許文献４参照）、間葉幹細胞（mesenchymal stem cell、非特許文献５）、骨髄腫細胞（myeloma cell、非特許文献６）、自己リンパ球（非特許文献７および８）、肝癌細胞（非特許文献９）等が報告されている。しかしながら、これらのキャリアー細胞では、十分な抗腫瘍効果が得られないという問題がある。その原因として、前記キャリアー細胞が、脆弱であり、前記オンコリティックウイルスの感染後、容易に壊れてしまうこと、また、最も大きな原因として、腫瘍部位に投与した際、血中の中和抗体によって前記オンコリティックウイルスの感染が抑制されることがあげられる。

そこで、本発明者らにより、前記遺伝子治療に適したキャリアー細胞として、Ａ５４９細胞またはＳＷ６２６細胞が報告されている（特許文献３参照）。これらのキャリアー細胞は、前述のような中和抗体の影響を抑制できる。このため、前記オンコリティックウイルスが感染したキャリアー細胞を腫瘍部位に投与すると、前記中和抗体による感染抑制が解除され、抗体存在下においても抗腫瘍効果を得ることができる。しかしながら、安定性および安全性の点、ならびに根治的なより強力な抗腫瘍効果等の点から、臨床医療での実用化において、より優れた新たなキャリアー細胞の提供が求められている。

国際公開第９９／４５７８３号パンフレット 国際公開第０１／２３００４号パンフレット 国際公開第０５/０３７３２１号パンフレット

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そこで、本発明は、安定性および安全性に優れ、例えば、局所投与における根治可能性の向上と投与回数の減少、腹腔内投与および全身投与等も可能である新たなキャリアー細胞の提供を目的とする。

本発明の新規細胞は、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１８１８で特定される新規細胞である。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、オンコリティクウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、前記キャリアー細胞が、前記本発明の新規細胞であることを特徴とする。

本発明の癌の遺伝子治療用医薬は、前記本発明の抗腫瘍効果の誘導剤を含むことを特徴とする。

本発明の抗腫瘍効果の誘導方法は、被検体における抗腫瘍効果の誘導方法であり、被検体に、キャリアー細胞にオンコリティックウイルスを感染させたウイルス感染キャリアー細胞を投与する工程を含み、前記キャリアー細胞が、前記本発明の新規細胞であることを特徴とする。

本発明の新規細胞によれば、前述のような癌の遺伝子治療において、オンコリティックウイルスを感染させて、標的の腫瘍部位に投与するためのキャリアー細胞として使用する際、優れた安定性および安全性を示し、且つ、例えば、腹腔内投与および全身投与等によっても抗腫瘍効果を発揮することが可能である。このため、本発明は、例えば、生命化学分野および臨床分野において、抗腫瘍効果を利用する際、極めて有用な技術といえる。

図１は、実施例1における、抗アデノウイルス抗体の存在下または非存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果を示すグラフである。 図２は、実施例２における、抗アデノウイルス抗体の非存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果を示すグラフである。 図３は、実施例２における、抗アデノウイルス抗体の存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果を示すグラフである。 図４は、実施例３における、抗アデノウイルス抗体の非存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果を示すグラフである。 図５は、実施例３における、抗アデノウイルス抗体の存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果を示すグラフである。 図６は、実施例４における、抗アデノウイルス抗体の非存在下および存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍効果を示すグラフである。 図７は、実施例５における、皮下腫瘍における生存曲線を示すグラフである。 図８は、実施例６における、腹腔内腫瘍における生存曲線を示すグラフである。

＜１．新規細胞＞
本発明の新規細胞は、前述のように、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１８１８で特定される新規細胞である。本発明の新規細胞の用途は、特に制限されないが、例えば、前述のような、腫瘍細胞へのオンコリティックウイルスの感染を利用する抗腫瘍効果の誘導、癌の遺伝子治療等において、前記キャリアー細胞として有用である。以下、本発明の新規細胞を、本発明のキャリアー細胞ともいう。

本発明のキャリアー細胞の寄託の情報を以下に示す。前記キャリアー細胞は、本願の発明者が、愛媛大学において独自に単離した肺癌患者の肺腺癌細胞株から、初めてクローニングした新規細胞である。
寄託の種類：国内寄託
寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名：日本国 郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１８１８
識別のための表示：ＥＨＭＫ−５１
受領日：２０１４年３月７日

また、本発明のキャリアー細胞は、例えば、前記受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１８１８のクローン細胞（以下、「継代細胞」ともいう）も含む。前記クローン細胞としては、例えば、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１５７８で特定される細胞が例示できる。
寄託の種類：国内寄託
寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名：日本国 郵便番号２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１５７８
識別のための表示：ＥＨＭＫ−５１−３５
受領日：２０１３年３月２２日

＜２．抗腫瘍効果の誘導剤および癌の遺伝子治療用医薬＞
本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、前述のように、オンコリティックウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、前記キャリアー細胞が、前記本発明の新規細胞であることを特徴とする。本発明は、前記キャリアー細胞として、前記本発明の新規細胞を使用することが特徴であって、その他の構成および条件等は、制限されない。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、抗腫瘍効果の誘導による癌の治療に使用できることから、癌の遺伝子治療用医薬ということもできる。なお、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤の用途は、癌患者に対する癌の治療には制限されず、例えば、生命化学分野等において、腫瘍細胞または腫瘍組織に対しても使用できる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前述のように、対象の腫瘍細胞または腫瘍組織におけるオンコリティックウイルスの感染を利用する抗腫瘍効果の誘導剤であり、前記キャリアー細胞は、被検体への投与時において、前記オンコリティックウイルスを感染させた状態で使用される。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、前記本発明のキャリアー細胞を使用することにより、例えば、以下のような効果を奏することができる。すなわち、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、凍結保存等の保存によっても安定な抗腫瘍効果を維持でき、前記キャリアー細胞の腫瘍形成能が十分に抑制されることから安全性に優れ、生物個体に投与する際、腫瘍内投与だけでなく、従来のキャリアー細胞では困難であった胸腔内投与、腹腔内投与や全身投与等によっても抗腫瘍効果を発揮でき、また、従来のキャリアー細胞よりも少ないオンコリティックウイルスの感染量であっても、抗腫瘍効果を発揮することができる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、抗腫瘍効果の誘導によって、癌の治療に寄与できることから、癌の遺伝子治療用医薬ともいい、悪性腫瘍治療用医薬ともいう。また、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤の使用方法は、特に制限されず、例えば、後述する、抗腫瘍効果の誘導方法および癌の治療方法における記載を援用できる。なお、本発明の癌の遺伝子治療用医薬は、前述のように、前記本発明の抗腫瘍効果の誘導剤を含むことを特徴とし、その他の構成および条件等は制限されない。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤の標的は、特に制限されず、あらゆる良性腫瘍および悪性腫瘍に適用できる。前記対象の癌は、例えば、卵巣癌、子宮体癌、扁平上皮癌（子宮頚部癌、皮膚癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌、肛門癌等）、消化器癌（大腸癌、小腸癌、直腸癌、膵癌、肝癌、胆嚢胆管癌、胃癌等）、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌等の固形癌、および血液性悪性腫瘍等の悪性腫瘍、ならびに増殖速度の速い髄膜種、神経線維腫、子宮筋腫等の良性腫瘍が例示できる。本発明は、例えば、治療対象の癌の種類に応じて、感染可能な前記オンコリティックウイルスを選択すればよく、癌と前記オンコリティックウイルスとの関係は、出願時の技術常識に基づいて、選択できる。なお、本発明は、癌の種類と前記オンコリティックウイルスの種類との組合せが特徴ではなく、本発明の新規細胞をキャリアー細胞として使用することが特徴である。このため、例えば、癌の種類と前記オンコリティックウイルスの種類との組合せは、公知の組合せには制限されず、本願の出願後に明らかとなった組合せに関しても、本発明を適用できることは、明らかである。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤の投与対象は、特に制限されず、例えば、ヒト、非ヒト動物であり、前記非ヒト動物は、例えば、トリ、マウス、ラット、ウサギ、サル、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ロバ、ラクダ等の哺乳類動物等があげられる。また、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤の投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれでもよく、具体例として、生物個体、採取した細胞、組織または器官、培養した細胞、組織または器官等への投与があげられる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤において、前記キャリアー細胞は、例えば、放射線照射処理した前記本発明の新規細胞でもよいし、放射線照射処理を行っていない前記本発明の新規細胞でもよい。前記キャリアー細胞に前記放射線照射を行う場合、前記オンコリティックウイルスの感染前でもよいし、感染後でもよい。前記放射線照射の条件は、特に制限されず、照射量は、例えば、１２０〜６００Ｇｙ、好ましくは１５０〜４００Ｇｙに設定することが好ましい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤において、前記キャリアー細胞は、例えば、標的の腫瘍細胞と結合しやすくなるように、前記キャリアー細胞の細胞表面に、人為的に特定タンパク質等を発現させてもよく、また、前記キャリアー細胞に、センダイウイルスを感染させる処置等を行ってもよい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤において、前記キャリアー細胞は、前述のように、前記オンコリティックウイルスを感染させた状態で、被検体に投与される。しかしながら、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤に含まれる前記キャリアー細胞は、例えば、前記オンコリティックウイルスに感染した本発明の新規細胞（以下、「ウイルス感染キャリアー細胞」ともいう）でもよいし、被検体への投与まで、前記オンコリティックウイルスに感染していない本発明の新規細胞（以下、「ウイルス未感染キャリアー細胞」ともいう）でもよい。

前者の場合、前記ウイルス感染キャリアー細胞は、例えば、そのまま被検体へ投与できる。前記ウイルス感染キャリアー細胞は、例えば、使用時（被検体への投与）まで、凍結した形態とし、使用時に解凍することが好ましい。また、前記ウイルス感染キャリアー細胞は、例えば、放射線照射処理した上で、凍結した形態でもよい。前記凍結保存の条件は、特に制限されず、例えば、液体窒素での保存、または約−１５０℃での保存等があげられる。

前記ウイルス感染キャリアー細胞の被検体（例えば、生物個体）への投与経路は、特に制限されず、腫瘍内投与でも、腫瘍外投与でもよい。前記腫瘍内投与は、例えば、前記腫瘍組織への直接的な投与である。前記腫瘍外投与は、例えば、局所投与でも、非局所投与（例えば、全身投与）でもよく、具体例として、経口投与等を含む経腸投与、または、経静脈投与、胸腔内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与等の非経口投与等があげられる。

他方、後者の場合、前記ウイルス未感染キャリアー細胞は、例えば、被検体への投与前に、前記オンコリティックウイルスを感染させ、前記ウイルス感染キャリアー細胞として被検体に投与すればよい。前記ウイルス未感染キャリアー細胞は、例えば、使用時（前記オンコリティックウイルスの感染および被検体への投与）まで、常温保存、冷蔵保存または凍結保存してもよく、凍結保存の場合、使用時に解凍することが好ましい。前記凍結保存の条件は、特に制限されず、例えば、液体窒素での保存、または約−１５０℃での保存等があげられる。後者の形態の場合、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、抗腫瘍効果の誘導剤キット、抗腫瘍効果の誘導剤の製造用キット、癌の遺伝子治療用医薬キット、癌の遺伝子治療用医薬の製造用キットということもできる。本発明において、ウイルスまたはベクターの感染は、導入ともいう。

前記オンコリティックウイルスを前記ウイルス未感染キャリアー細胞に感染させる方法は、特に制限されず、常法に従って行うことができる。具体例として、前記ウイルス未感染キャリアー細胞をディッシュに播き、これに対して、全ての前記ウイルス未感染キャリアー細胞に感染可能な量の前記オンコリティックウイルスを添加し、培養する方法があげられる。培養条件は、特に制限されず、例えば、９５％Ｏ_２、５％ＣＯ_２、３７℃、６−７２時間の条件が例示できる。培地は、例えば、ＨｙＱ ＣＤＭ４Ｒｅｔｉｎｏ無血清培地あるいはＲＰＭＩ培地等が例示できる。ＲＰＭＩ培地における牛胎児血清ＦＣＳは、未添加でもよいし、添加でもよく、具体例として、３−６時間、ＦＣＳ未添加で培養した後、ＦＣＳを添加（例えば、１０％）して培養してもよい。

前記ウイルス未感染キャリアー細胞に対する前記オンコリティックウイルスの感染の条件、例えば、感染量および感染時間等は、特に制限されず、例えば、治療対象の腫瘍の大きさ・種類、前記キャリアー細胞の投与量、前記オンコリティックウイルスの種類、前記抗腫瘍効果の誘導剤の投与方法等に応じて、適宜設定できる。前記ウイルス未感染キャリアー細胞に対する前記オンコリティックウイルスの感染量は、例えば、約０．１〜２００（multiplicity of infection：以下、「ＭＯＩ」ともいう。）であり、好ましくは約１〜１００ＭＯＩであり、より好ましくは約５〜５０ＭＯＩであり、さらに好ましくは約５〜２０ＭＯＩである。具体例として、腹腔内投与の場合、前記ウイルス未感染キャリアー細胞に対する前記オンコリティックウイルスの感染量を約２〜２０ＭＯＩ、感染時間を約１６〜３６時間、腫瘍内投与の場合、前記感染量を約５〜５０ＭＯＩ、感染時間を約１６〜３６時間に設定できる。本発明のキャリアー細胞によれば、例えば、同程度の抗腫瘍効果を得る場合、公知のキャリアー細胞（例えば、Ａ５４９細胞）と比較して、前記オンコリティックウイルスの感染量を、約４分の１〜２０分の１に低減できる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記本発明のキャリアー細胞の他に、その他の構成成分を有してもよい。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、抗腫瘍効果の誘導剤キットということもできる。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記本発明のキャリアー細胞と前記その他の成分とを、それぞれ別個の薬剤として備えてもよいし、いずれか２以上の成分を１つの薬剤として備えてもよい。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、１つの薬剤からなる１剤系でもよいし、２つの薬剤からなる２剤系または３以上の複数の薬剤からなる複数剤系でもよい。本発明において、「投与が同時」とは、例えば、２種類以上の薬剤の添加時期が完全に一致することだけでなく、ほぼ一致していることの意味も含む。ほぼ一致とは、例えば、投与した薬剤について、被検体での前記薬剤の効果を実質的に発揮させるための一定時間の放置を行うことなく、さらに、他の薬剤を投与することを意味する。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、さらに、治療対象の腫瘍細胞に作用させる前記オンコリティックウイルスを含んでもよい。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記本発明のキャリアー細胞と前記オンコリティックウイルスとを、それぞれ別個の薬剤としてもよいし、前記キャリアー細胞と前記オンコリティックウイルスとを１つの薬剤としてもよい。

前者の場合、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤に含まれる前記キャリアー細胞は、例えば、前記ウイルス未感染キャリアー細胞であり、前述のように、例えば、被検体への投与前に、前記オンコリティックウイルスを感染させ、前記ウイルス感染キャリアー細胞として被検体に投与すればよい。前記オンコリティックウイルスは、例えば、使用時（前記ウイルス未感染キャリアー細胞への感染）まで、冷凍保存することが好ましく、具体例として、約−８０℃での保存があげられる。

後者の場合、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤に含まれる前記キャリアー細胞は、例えば、前記オンコリティックウイルスが感染した前記ウイルス感染キャリアー細胞である。

前記オンコリティックウイルスは、一般に、細胞間相互作用（cell to cell interaction）によって、キャリアー細胞から標的の腫瘍細胞へと感染し、前記腫瘍細胞内で特異的に増殖し、前記腫瘍細胞を融解して殺傷する細胞融解（cell lysis）作用を発揮することが知られている。従来、ウイルスによる癌の遺伝子治療は、例えば、抗体産生によって頻回投与ができないことが問題とされていたが、前記キャリアー細胞を用いると、細胞間相互作用によって標的の腫瘍細胞に直接的に感染でき、これにより頻回投与が可能となり、より強力な抗腫瘍効果を得ることが可能となる。

前記オンコリティックウイルスは、特に制限されず、例えば、遺伝子導入に使用される従来のウイルスベクターを使用できる。前記オンコリティックウイルスは、例えば、標的の腫瘍細胞または腫瘍組織に感染し、増殖し得るものであり、好ましくは、標的の腫瘍細胞または腫瘍組織において特異的に増殖するものである。前記オンコリティックウイルスの具体例として、例えば、増殖型ウイルスであって、標的の腫瘍細胞において特異的に増殖するようウイルス遺伝子が改変され、標的の腫瘍細胞を融解して殺傷するcell lysis作用を有するものが好ましい。

前記オンコリティックウイルスは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス等のレンチウイルス；マウス白血病ウイルス等のレトロウイルス；レオウイルス；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス、センダイウイルス、コクサッキーウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（venezuelan equine encephalitis virus）、カナリア痘ウイルス（canarypox virus）、ライノウイルス（rhino virus）、鶏痘ウイルス（fowlpox virus）等があげられ、その他のオンコリティックウイルスであってもよい。前記ヘルペスウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）等があげられる。前記アデノウイルスのタイプは、特に制限されない。前記オンコリティックウイルスは、例えば、中でも、アデノウイルスが好ましい。前記オンコリティックウイルスとしての前記アデノウイルスは、例えば、その増殖に必要なＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子に関して、Ｅ１ＡプロモーターおよびＥ１Ｂプロモーターの少なくとも一方が、一部もしくは全て欠失したものがあげられ、この場合、Ｅ１ＡプロモーターあるいはＥ１Ｂプロモーターを、腫瘍特異的プロモーターで置換したもの等があげられる。具体的には、前記アデノウイルスは、例えば、Ｅ１ＡプロモーターおよびＥ１Ｂプロモーターの一方のみが一部または全てを欠失してもよいし、両方のプロモーターが一部または全てを欠失してもよく、また、Ｅ１ＡプロモーターおよびＥ１Ｂプロモーターの一方のみが前記腫瘍特異的プロモーターで置換されてもよいし、両方のプロモーターが前記腫瘍特異的プロモーターで置換されてもよい。前記Ｅ１Ａプロモーターを一部欠失したものは、例えば、Ｅ１Ａプロモーター（Δ２４）があげられる。また、前記アデノウイルスは、例えば、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子の少なくとも一方を欠失するものでもよい。

前記オンコリティックウイルスは、例えば、プロモーターを有することが好ましい。前記プロモーターの具体例は、例えば、１Ａ１．３Ｂプロモーター、ミッドカインプロモーター、β−ＨＣＧプロモーター、ＳＣＣＡ１プロモーター、ＳＣＣＡ２プロモーター、ＣＥＡプロモーター、ｃｏｘ−２プロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＡＦＰプロモーター、オステオカルシンプロモーター、ＣＡ１２−５（Ｍｕｃｉｎ １６）プロモーター、テロメラーゼ（hTERT、human telomerase reverse transcriptase）プロモーター、ネスチンプロモーター、Ｅ２Ｆ−１プロモーター、chemokine SDF-1 receptor （ＣＸＣＲ４）プロモーター、epithelial glycoprotein 2 （ＥＧＰ−２）プロモーター、survivinプロモーター、L-plastinプロモーター、Hexokinase type II （ＨＫ II）プロモーター、Tyrosinaseプロモーター、ＭＵＣ−１プロモーター、Rat probasinプロモーター、Leukoprotease inhibitorプロモーター、Tcf responsiveプロモーター、Calponinプロモーター、Albuminプロモーター、Flt-1プロモーター、Hypoxia responsive elementsプロモーター、β-cateninプロモーター、Uroplakin IIプロモーター、surfactant protein Ｂプロモーター、Ｂ−Ｍｙｂプロモーター、ＤＦ３プロモーター、ＵＬ３８プロモーター、mesothelinプロモーター、prostate specific antigen （PSA）プロモーター、c-erb-2プロモーター、EGFプロモーター、12−o−tetradecanoylphorbol-13-acetate（TPA）プロモーター、SSX4プロモーター、TGFβプロモーター、H19プロモーター、IGF-1プロモーター、DF3プロモーター、MARE（Maf recognition element）配列、MGMTプロモーター、Prostate stem cell antigen (PSCA)プロモーター、CDX2プロモーター、Vascular endothelial growth factor receptor type-1（flt-1プロモーター）、PSF1プロモーター、HURTプロモーター、ガストリン放出ペプチド（GRP）プロモーター、II型ヘキソキナーゼプロモーター、CRI1プロモーター、I.7プロモーター、Prostate-specific membrane antigen (PSMA)プロモーター、Egr-1プロモーター、Matrix Metalloproteinase（MMP）プロモーターおよびTransforming growth factor-β1(TGF-β1)プロモーター等があげられる。

前記オンコリティックウイルスは、例えば、前記プロモーターとして、腫瘍特異的プロモーターを有することが好ましく、前述に列挙したプロモーターが例示できる。前記プロモーターの種類は、特に制限されず、例えば、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤による治療対象の癌に応じて、適宜選択できる。

具体例として、治療対象が卵巣癌の場合は、１Ａ１．３ＢプロモーターまたはＣＡ１２−５（Ｍｕｃｉｎ １６）プロモーター、脳腫瘍および悪性グリオーマの場合は、ミッドカインプロモーター、精巣癌の場合は、β―ＨＣＧプロモーター、扁平上皮癌の場合、ＳＣＣＡ１プロモーターおよびＳＣＣＡ２プロモーター、大腸癌の場合は、ＣＥＡプロモーター、前立腺癌の場合は、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＰＳＣＡプロモーター、肝癌の場合、ＡＦＰプロモーター等がそれぞれ選択できる。また、他の公知の腫瘍特異的プロモーターとして、例えば、種々の悪性腫瘍に対してプロモーター活性を発揮し、広い作用スペクトラムを有するｃｏｘ−２プロモーター、その他オステオカルシンプロモーター等の各種癌特異性プロモーターを使用してもよい。前記ミッドカインプロモーターは、例えば、脳腫瘍、悪性グリオーマの他、種々の悪性腫瘍に対しても使用可能であり、この点において、ｃｏｘ−２プロモーターと同様に、広い作用スペクトラムを有する。

前記プロモーターの条件、例えば、配列および長さ等は、特に制限されず、例えば、腫瘍特異的プロモーター活性が得られる範囲であればよい。

各プロモーターは、特に制限されず、例えば、以下に示す文献等にしたがって、設計および調製し、前記オンコリティックウイルスのゲノムに挿入できる。
１Ａ１．３Ｂプロモーター：国際公開第０３／０２５１９０号パンフレットおよび文献Cancer Research 63，2506−2512，2003
ミッドカインプロモーター：国際公開第０２／１０３６８号パンフレット
β−ＨＣＧプロモーター：国際公開第０１／９０３４４号パンフレット
ＳＣＣＡ１プロモーター：国際公開第００／６００６８号パンフレット、論文Biochimica et Biophysica Acta 91522 （2001） 1-8， Molecular cloning of human squamous cell carcinoma antigen 1 gene and characterization of its promoter， Katsuyuki Hamada， Hiroto Shinomiya， Yoshihiro Asano， Toshimasa Kihana， Mari Iwamoto， Yasushi Hanakawa， Koji Hashimoto， Susumu Hirose， Satoru Kyo， Masaharu Ito

前記オンコリティックウイルスにおける前記腫瘍特異的プロモーターの挿入部位は、特に制限されない。具体例として、アデノウイルスを使用する場合、ウイルスの増殖に必須である初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂの上流に、前記腫瘍特異的プロモーターを挿入してもよいし、または、前記初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂのプロモーターと、前記腫瘍特異的プロモーターとを置換してもよい。アデノウイルス以外、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、レトロウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）等の場合も、同様に、ウイルスの増殖に必要な遺伝子の上流に、前記腫瘍特異的プロモーターを挿入してもよいし、または、前記遺伝子と前記腫瘍特異的プロモーターとを置換してもよい。

前記オンコリティックウイルスは、前記腫瘍特異的プロモーターを有するものには制限されず、例えば、標的の腫瘍細胞または腫瘍組織において特異的に増殖する性質を有する場合、腫瘍特異的プロモーターを有しないものでもよい。このようなオンコリティックウイルスとしては、例えば、ＯＮＹＸ社のＥ１Ｂ遺伝子欠失型のオンコリティックアデノウイルス、アラバマ大学バーミングハム校（ＵＡＢ）のＥ１Ａ遺伝子一部欠失型のAd5-△24アデノウイルス等があげられる。前記オンコリティックウイルスがアデノウイルスの場合、例えば、野生型アデノウイルスでもよいし、その一部の遺伝子を欠失させたものでもよい。

前記オンコリティックウイルスは、例えば、以下のようなウイルスが例示できる。なお、本発明は、これらの例示には制限されない。前記オンコリティックウイルスとしては、例えば、アデノウイルスＡｄＥ３−ｍｉｄｋｉｎｅが使用でき、これは、Ｅ３遺伝子を有し、前記Ｅ１Ａ遺伝子の上流のアデノウイルスtype ５のnucleotide position ４４８−５５２のＥ１Ａ遺伝子プロモーターを欠失した部位に、前記腫瘍特異的プロモーターとして、癌特異的ミッドカインプロモーターを有するウイルスである。前記nucleotite position４４８−５５２は、Ｅ１Ａ遺伝子プロモーター領域とほぼ一致する。このため、前記nucleotite position４４８−５５２欠失型（Ｅ１Ａ遺伝子プロモーター欠失型）のオンコリティックアデノウイルスは、Ｅ１Ａ遺伝子プロモーターが残存しているnucleotide position ５５２に前記腫瘍特異的プロモーターが挿入された（５５２挿入型）オンコリティックアデノウイルスに比べ、Ｅ１Ａ遺伝子プロモーターの影響を受けないため、例えば、腫瘍特異性が高まる。また、前記５５２挿入型のオンコリティックアデノウイルスは、自然発生的に前記腫瘍特異的プロモーターが脱落する可能性がある。このため、前記５５２挿入型のＥ１Ａ遺伝子プロモーター残存型のオンコリティックアデノウイルスは、前記腫瘍特異的プロモーターが脱落した際に、野生型アデノウイルスとなる危険性がある。しかしながら、前記Ｅ１Ａ遺伝子プロモーター欠失型のオンコリティックアデノウイルスでは、前記Ｅ１Ａ遺伝子プロモーターを欠失しているため、例えば、前記腫瘍特異的プロモーターが脱落した際に、前記野生型アデノウイルスとなる危険性がない。そして、前記Nucleotite ４４８−５５２の上流領域のnucleotide ４０４−４４８には、オンコリティックアデノウイルスのパッケージングシグナルがあるため、前記Ｅ１Ａ遺伝子欠失型のオンコリティックアデノウイルスは、前記nucleotide ４０４−５５２欠失型のオンコリティックアデノウイルスに対して、例えば、オンコリティックアデノウイルスの増殖能力が高く、且つ抗腫瘍効果も向上する。また、前記オンコリティックウイルスとしては、例えば、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂ（ＩＡＩ．３Ｂ）が使用でき、これは、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ３遺伝子を有し、かつ、前記Ｅ１Ａ遺伝子の上流のアデノウイルスtype ５のnucleotide position ４４８−５５２のＥ１Ａ遺伝子プロモーターを欠失した部位に、前記腫瘍特異的プロモーターとして、卵巣癌特異的１Ａ１．３Ｂプロモーター（ＩＡＩ．３Ｂプロモーター）を有するウイルスである。また、前記オンコリティックウイルスとしては、例えば、アデノウイルス３４型、３５型等が使用でき、これらは、血液細胞にも感染可能であり、血液性悪性腫瘍等を標的とする場合に好ましい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、さらに、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の発現ベクターを含むことが好ましい。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターにより前記ＧＭ−ＣＳＦを発現させることで、標的の腫瘍細胞または腫瘍組織において、前記ウイルス感染キャリアー細胞と前記ＧＭ−ＣＳＦとを併存でき、これによって免疫反応をさらに向上できる。前記発現ベクターは、例えば、前記オンコリティックウイルスとは、独立したベクターとして用いてもよいし、前記オンコリティックウイルスのゲノムに前記発現ベクターを導入した、ＧＭ−ＣＳＦ導入オンコリティックウイルスとして用いてもよい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤が前記発現ベクターを含む場合、前記キャリアー細胞は、例えば、前記オンコリティックウイルスと前記発現ベクターとを共感染させた状態、または前記ＧＭ−ＣＳＦ導入オンコリティックウイルスを感染させた状態で、被検体に投与でき、また、前記キャリアー細胞は、例えば、前記オンコリティックウイルスを感染させた細胞と前記発現ベクターを感染させた細胞の組合せとして、被検体に投与することもできる。しかしながら、これらの形態において、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤に含まれる前記キャリアー細胞は、例えば、前記発現ベクターに感染した前記ウイルス感染キャリアー細胞、前記発現ベクターに未感染の前記ウイルス感染キャリアー細胞、前記発現ベクターと前記オンコリティックウイルスの両方に未感染の前記ウイルス未感染キャリアー細胞のいずれでもよい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記本発明のキャリアー細胞と前記発現ベクターとを、別個の薬剤として備えてもよいし、前記キャリアー細胞と前記発現ベクターとを１つの薬剤として備えてもよい。前記キャリアー細胞は、いずれの形態であっても、例えば、投与の際に、前記発現ベクターに感染した状態であればよく、具体的には、例えば、投与の際に、前記発現ベクターと前記オンコリティックウイルスの両方が共感染した状態、前記ＧＭ−ＣＳＦ導入オンコリティックウイルスが感染した状態、または前記発現ベクターが感染した細胞と前記オンコリティックウイルスが感染した細胞の組合せの状態であればよい。

前記発現ベクターは、例えば、ベクターに、ＧＭ−ＣＳＦをコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が組み込まれたものである。前記遺伝子を組み込む前記ベクターは、特に制限されず、前記オンコリティックウイルスまたは前記ＧＭ−ＣＳＦ導入オンコリティックウイルスと同種類のウイルスベクターが好ましく、前述の通りであり、好ましくはアデノウイルスである。前記オンコリティックウイルスとしてアデノウイルスを使用する場合、前記発現ベクターは、例えば、前記遺伝子を組み込んだアデノウイルスが好ましい。

前記ウイルス感染キャリアー細胞が、前記発現ベクターと前記オンコリティックウイルスの両方が共感染した細胞、または前記ＧＭ−ＣＳＦ導入オンコリティックウイルスが感染した細胞の場合、前記キャリアー細胞に対する前記発現ベクターと前記オンコリティックウイルスの両者を合わせた感染量は、例えば、約５〜２００ＭＯＩである。

また、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記発現ベクターに代えて、または、さらに、前記ＧＭ−ＣＳＦを含んでもよい。前記ＧＭ−ＣＳＦは、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞と同時に被検体に投与することが好ましい。前記ＧＭ−ＣＳＦの投与経路は、特に制限されず、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞と同じもよいし、経静脈、あるいは皮下、皮内からの全身投与でもよい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記キャリアー細胞と前記ＧＭ−ＣＳＦとを、それぞれ別個の薬剤としてもよいし、一つの薬剤としてもよい。前者の場合、前記キャリアー細胞は、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞でもよいし、前記ウイルス未感染キャリアー細胞でもよい。前記ウイルス未感染キャリアー細胞の場合、前述のように、例えば、被検体への投与前に、前記オンコリティックウイルスを感染させて、前記ウイルス感染キャリアー細胞として被検体に投与すればよく、この際、前記ＧＭ−ＣＳＦを同時に投与することが好ましい。他方、後者の場合、前記キャリアー細胞は、前記ウイルス感染キャリアー細胞であることが好ましい。この場合、１つの薬剤であることから、前記ウイルス感染キャリアー細胞と前記ＧＭ−ＣＳＦとを、同時に被検体に投与できる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、さらに、アテロコラーゲンを含むことが好ましい。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、前記アテロコラーゲンを含むことで、例えば、副作用を十分に抑制でき、これに伴い、被検体に対する前記オンコリティックウイルスの投与量を、さらに増加できる。前記アテロコラーゲンによる副作用の抑制は、例えば、標的の腫瘍細胞または腫瘍組織からの前記オンコリティックウイルスの拡散の抑制、および、抗オンコリティックウイルス抗体に対するブロック等によると推測される。なお、本発明は、この推測には制限されない。

前記アテロコラーゲンは、例えば、コラーゲンのテロペプチド結合のみを切断した組成物であり、コラーゲンよりも分子量が小さく、水溶性である。前記アテロコラーゲンは、例えば、市販品（例えば、株式会社高研の製品）を使用してもよいし、コラーゲンをペプシン等で処理した組成物を使用してもよい。

前記アテロコラーゲンは、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞と同時に被検体に投与することが好ましい。前記アテロコラーゲンの投与経路は、特に制限されず、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞と同じである。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記キャリアー細胞と前記アテロコラーゲンとを、それぞれ別個の薬剤としてもよいし、一つの薬剤としてもよい。前者の場合、前記キャリアー細胞は、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞でもよいし、前記ウイルス未感染キャリアー細胞でもよい。前記ウイルス未感染キャリアー細胞の場合、前述のように、例えば、被検体への投与前に、前記オンコリティックウイルスを感染させて、前記ウイルス感染キャリアー細胞として被検体に投与すればよく、この際、前記アテロコラーゲンを同時に投与することが好ましい。他方、後者の場合、前記キャリアー細胞は、前記ウイルス感染キャリアー細胞であることが好ましい。この場合、１つの薬剤であることから、前記ウイルス感染キャリアー細胞と前記アテロコラーゲンとを、同時に被検体に投与できる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、さらに、ウイルス産生増加剤を含んでもよい。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、前記ウイルス産生増加剤を含むことで、例えば、標的の腫瘍細胞または腫瘍組織における前記オンコリティックウイルスの産生量を、さらに向上できる。

前記ウイルス産生増加剤は、例えば、鉄含有化合物およびポルフィリン化合物であり、いずれか一方を含んでもよいし、両方を含んでもよい。前記鉄含有化合物は、例えば、硫酸第一鉄（FeSO₄）、クエン酸第一鉄、コンドロイチン硫酸鉄、含糖酸化鉄等が例示できる。前記鉄含有化合物は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上の併用でもよい。前記鉄含有化合物の種類は、特に制限されず、例えば、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤の投与形態によって、適宜選択できる。具体例として、例えば、経口剤の場合、硫酸第一鉄（FeSO₄）またはクエン酸第一鉄等があげられ、静注剤の場合、コンドロイチン硫酸鉄または含糖酸化鉄等があげられる。前記ポルフィリン化合物は、例えば、５−アミノレブリン酸（5-aminolevulinic acid：ＡＬＡ）、ヘマトポルフィリン（hematoporphyrin）、フォトフィリン（photofrin）等があげられ、ＡＬＡが好ましい。前記ウイルス産生増加剤として、前記鉄含有化合物と前記ポルフィリン化合物とを併用する場合、その組合せは特に制限されない。また、前記ウイルス産生増加剤は、HDAC inhibitorでもよい。

前記ウイルス産生増加剤は、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞と同時に被検体に投与することが好ましい。前記ウイルス産生増加剤の投与経路は、特に制限されず、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞と同じである。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記キャリアー細胞と前記ウイルス産生増加剤とを、それぞれ別個の薬剤としてもよいし、一つの薬剤としてもよい。前者の場合、前記キャリアー細胞は、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞でもよいし、前記ウイルス未感染キャリアー細胞でもよい。前記ウイルス未感染キャリアー細胞の場合、前述のように、例えば、被検体への投与前に、前記オンコリティックウイルスを感染させて、前記ウイルス関連キャリアー細胞として被検体に投与することが好ましく、この際、前記ウイルス産生増加剤を同時に投与することが好ましい。他方、後者の場合、前記キャリアー細胞は、前記ウイルス感染キャリアー細胞であることが好ましい。この場合、１つの薬剤であることから、前記ウイルス感染キャリアー細胞と前記ウイルス産生増加剤とを、同時に被検体に投与できる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、さらに、免疫処置用ウイルスを含んでもよい。前記免疫処置用ウイルスは、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞を感染させる前に、被検体に感染させて、事前に免疫（イムナイゼーション）を施すためのウイルスである。前記免疫処置用ウイルスを含む本発明の抗腫瘍効果の誘導剤によれば、例えば、予め、被検体に前記免疫処置用ウイルスを投与して免疫処置を施した後、前記ウイルス感染キャリアー細胞を投与することで、前記オンコリティックウイルスが標的の腫瘍細胞に感染して直接的な抗腫瘍効果をもたらし、さらに、感染した前記腫瘍細胞に対する、生体のＣＴＬ反応（細胞傷害性Ｔ細胞を介した細胞傷害活性）が、誘導または惹起され、結果として、より優れた抗腫瘍効果を実現できる。

前記免疫処置用ウイルスは、特に制限されず、例えば、前記オンコリティックウイルスと同種類のものが好ましく、より好ましくは、非増殖型ウイルスまたは不活化ウイルスであり、特に好ましくは、非増殖型ウイルス等である。前記非増殖型アデノウイルスは、例えば、増殖に関与するＥ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子の両方が欠失した非増殖型ウイルスがあげられる。前記不活化は、例えば、増殖型ウイルスまたは非増殖型ウイルスを紫外線等で処理し、ＤＮＡを破壊することにより行える。

前記免疫処置用ウイルスとしてアデノウイルスを使用する場合、例えば、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子の両方が欠失したウイルス、紫外線照射等によりＤＮＡを破壊し不活化したウイルス、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ１Ｂ遺伝子の両方が欠失し且つＤＮＡを破壊し不活化したウイルス等があげられる。前記免疫処置用ウイルスの具体例として、例えば、Ｅ１領域が欠失し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にβ-galactosidase（β gal）をコードするＬａｃＺ遺伝子が組み込まれたアデノウイルス（Ad-β gal）があげられる。なお、本発明は、これに限定されず、例えば、増殖型アデノウイルスを紫外線照射等で不活化したものでもよく、また、ＬａｃＺ遺伝子等の他の遺伝子が組み込まれておらず、ｐｏｌｙＡ配列のみの非増殖型アデノウイルス（Ａｄ−ｐｏｌｙＡ）を紫外線照射等で不活化したものでもよい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記キャリアー細胞と前記免疫処置用ウイルスとを、それぞれ、別個の薬剤とすることが好ましい。前記免疫処置用ウイルスは、例えば、前記被検体に対して、前記ウイルス感染キャリアー細胞を投与する前に、投与することが好ましい。

前記免疫処置用ウイルスの投与経路は、特に制限されず、例えば、皮下投与または皮内投与があげられる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤が前記免疫処置用ウイルスを含む場合、例えば、腫瘍免疫（ワクチネーション）のため、腫瘍細胞を併用することが好ましい。前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞は、例えば、被検体における治療対象の腫瘍細胞に対する免疫応答をより向上することから、予め、放射線等の前処理を施した腫瘍細胞が好ましい。前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞は、例えば、患者由来の腫瘍細胞が好ましく、また、前記患者由来の腫瘍細胞に代えて、例えば、前記患者由来の腫瘍細胞と類似した抗原を提示すると考えられる、一般に入手可能な放射線照射した腫瘍細胞でもよい。前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞は、例えば、治療対象の腫瘍細胞とは異なる種類の腫瘍細胞でもよい。前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞は、例えば、前記免疫処置用ウイルスの投与と共に、または、その前後に、被検体に投与することが好ましい。そこで、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、さらに、前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞を含んでもよく、好ましくは、前記放射線照射した前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞を含んでもよい。

前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞への放射線照射の条件は、特に制限されず、例えば、約１２０〜６００Ｇｙ、好ましくは約２００〜４００Ｇｙである。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、前記キャリアー細胞と前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞とを、それぞれ別箇の薬剤とすることが好ましい。

前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞の投与経路は、特に制限されず、例えば、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与または皮内投与等があげられる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、前述のように、前記１剤系、前記２剤系および前記複数剤系のいずれでもよい。前記各薬剤は、例えば、いずれか１種類の前記成分を含んでもよいし、２種類以上の前記成分を含んでもよい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、前述のように、前記本発明のキャリアー細胞（Ａ１）を必須の成分とし、好ましくは、さらに、下記（Ｂ１）または（Ｂ３）を含み、より好ましくは、さらに、下記（Ｂ２）、（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｄ１）および（Ｄ２）からなる群から選択された少なくとも一つの成分を含む。
（Ａ１）前記キャリアー細胞
（Ｂ１）前記オンコリティックウイルス
（Ｂ２）前記ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター
（Ｂ３）前記ＧＭ−ＣＳＦ導入オンコリティックウイルス
（Ｃ１）前記ＧＭ−ＣＳＦ
（Ｃ２）前記アテロコラーゲン
（Ｃ３）前記ウイルス産生増加剤
（Ｄ１）前記免疫処置用ウイルス
（Ｄ２）前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤において、前記各成分の組合せとしては、例えば、以下の組合せが例示できる。
（１）前記（Ａ１）キャリアー細胞
（２）前記（１）と、前記（Ｂ１）オンコリティックウイルスとの組合せ
（３）前記（１）または（２）と、前記（Ｂ２）ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターとの組合せ
（４）前記（１）または（２）と、前記（Ｃ１）ＧＭ−ＣＳＦとの組合せ
（５）前記（１）と、前記（Ｂ３）ＧＭ−ＣＳＦ導入オンコリティックウイルスとの組合せ
（６）前記（１）〜（５）のいずれかと、前記（Ｃ２）アテロコラーゲンとの組合せ
（７）前記（１）〜（６）のいずれかと、前記（Ｃ３）ウイルス産生増加剤との組合せ
（８）前記（１）〜（７）のいずれかと、前記（Ｄ１）免疫処置用ウイルスとの組合せ
（９）前記（１）〜（８）のいずれかと、前記（Ｄ２）腫瘍免疫用の腫瘍細胞との組合せ
（１０）前記（１）〜（９）のいずれかと、後述する添加剤との組合せ
（１１）前記（１）〜（１０）のいずれかと、後述する容器との組合せ

前記（Ｂ１）、（Ｂ２）および（Ｂ３）の成分は、それぞれ、前述のように、例えば、被検体への投与前に、前記（Ａ１）のキャリアー細胞に感染させる成分である。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤において、前記（Ｂ１）、（Ｂ２）および（Ｂ３）は、それぞれ、例えば、前記（Ａ１）のキャリアー細胞と別個の薬剤であってもよいし、前記（Ａ１）のキャリアー細胞と同じ薬剤、すなわち、前記キャリアー細胞に感染した状態で含まれてもよい。後者の場合、前記（Ａ１）のキャリアー細胞は、例えば、前記（Ｂ１）および（Ｂ２）が共感染した細胞でもよいし、前記（Ｂ１）が感染した細胞と、前記（Ｂ２）が感染した細胞との組合せでもよいし、前記（Ｂ３）が感染した細胞でもよい。

前記（Ｃ１）、（Ｃ２）および（Ｃ３）の成分は、それぞれ、前述のように、例えば、前記オンコリティックウイルスが感染した前記（Ａ１）のキャリアー細胞を被検体に投与する際、同様に前記被検体に投与する薬剤である。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤において、前記（Ｃ１）、（Ｃ２）および（Ｃ３）は、それぞれ、例えば、前記（Ａ１）のキャリアー細胞と別個の薬剤でもよいし、前記（Ａ１）のキャリアー細胞と同じ１つの薬剤であってもよい。前者の場合、前記（Ｃ１）−（Ｃ３）は、それぞれ、前記（Ａ１）のキャリアー細胞と同時に、被検体に投与されることが好ましい。

前記（Ｄ１）および（Ｄ２）の成分は、それぞれ、前述のように、例えば、前記オンコリティックウイルスが感染した前記（Ａ１）のキャリアー細胞を被検体に投与する前に、予め前記被検体に投与する薬剤である。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤において、前記（Ｄ１）および（Ｄ２）は、それぞれ、例えば、前記（Ａ１）のキャリアー細胞と別個の薬剤であることが好ましい。

前記キャリアー細胞が、例えば、前記オンコリティックウイルス（Ｂ１）および任意で前記ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター（Ｂ２）に感染したウイルス感染キャリアー細胞（Ａ１）の場合、前記（Ｃ１）、（Ｃ２）および（Ｃ３）の成分は、任意で、前記ウイルス感染キャリアー細胞（Ａ１）と同じ薬剤（第１薬剤）とすることができる。前記免疫処置用ウイルス（Ｄ１）および前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞（Ｄ２）は、それぞれ、例えば、同じ薬剤（第２薬剤）、または、別箇の薬剤（第２薬剤および第３薬剤）とすることもできる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、そのまま投与可能な形態であってもよいし、前述のように、製造用キットの形態、すなわち、被検体への投与前に、投与可能な形態への処理を行うものであってもよい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤の形態は、特に制限されない。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤を被検体へ投与する際の形態は、例えば、被検体の種類に応じて、適宜決定でき、例えば、液状、固形状、液状薬剤と固形状薬剤との組み合わせでもよい。

前記被検体が生物個体の場合、前記本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、非経口用および経口用のいずれでもよく、また、両者の組み合わせでもよい。前記非経口用の場合、その形態は、例えば、注射剤等があげられる。また、その投与方法は、例えば、注射等があげられ、具体例としては、静注、点滴静注、腫瘍内注射、腹腔注射、胸腔内注射等の腔内注射等があげられる。前記経口用の場合、その形態は、例えば、液状、固形状のいずれでもよい。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤を被検体に投与する際、前記誘導剤の投与量、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与量は、特に制限されず、例えば、腫瘍の種類・大きさ、症状の程度、患者の年齢・性別、体重等に応じて調節できる。前記本発明の抗腫瘍効果の誘導剤が注射剤の場合、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞を含んでいればよく、常法に従って製造できる。前記ウイルス感染キャリアー細胞の希釈剤としては、例えば、生理食塩水、生理食塩緩衝液、細胞培養液、アルブミン製剤等が使用できる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、さらに、添加物を含んでもよい。前記添加物は、例えば、本発明の抗腫瘍効果の誘導剤の形態、投与方法、投与部位等に応じて適宜選択でき、例えば、ウイルスまたは発現ベクターの感染、細胞の培養、保存、医薬製剤の調製等に使用する添加剤があげられる。前記添加物は、例えば、緩衝液、酵素、試薬、製剤用担体、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等が例示できる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、さらに、容器を含んでもよい。前記容器は、例えば、ウイルスまたは発現ベクターの感染、細胞の培養、保存等のための容器があげられる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤において、各成分の含有量、含有濃度、含有比等は、特に制限されず、例えば、後述する本発明の抗腫瘍効果の誘導方法における記載を援用できる。

本発明の抗腫瘍効果の誘導剤は、例えば、被検体の抗腫瘍効果の誘導、被検体の癌の治療等に使用できる。本発明の抗腫瘍効果の誘導剤の使用方法は、例えば、後述する本発明の抗腫瘍効果の誘導方法における記載を援用できる。

本発明の癌の遺伝子治療用医薬は、前述のように、前記本発明の抗腫瘍効果の誘導剤を含むことを特徴とする。本発明の癌の遺伝子治療用医薬は、例えば、癌患者の治療に使用でき、前記本発明の抗腫瘍効果の誘導剤についての記載、および、後述する本発明の抗腫瘍効果の誘導方法における記載を援用できる。

＜３．抗腫瘍効果の誘導方法＞
本発明の誘導方法は、前述のように、被検体における抗腫瘍効果の誘導方法であり、被検体に、キャリアー細胞にオンコリティックウイルスを感染させたウイルス感染キャリアー細胞を投与する工程（Ａ１）を含み、前記キャリアー細胞が、前記本発明の新規細胞であることを特徴とする。本発明の誘導方法は、例えば、治療対象の腫瘍細胞におけるオンコリティックウイルスの感染を利用する抗腫瘍効果の誘導において、本発明の新規細胞を前記キャリアー細胞として使用することが特徴であって、その他の構成および条件等は、特に制限されない。

本発明の誘導方法は、例えば、前記本発明の抗腫瘍効果の誘導剤を用いて行うことができる。特に示さない限り、本発明において被検体に投与する各成分は、前記本発明の抗腫瘍効果の誘導剤における記載を援用できる。

前記ウイルス感染キャリアー細胞の被検体への投与経路は、特に制限されず、前述の通りである。

前記ウイルス感染キャリアー細胞は、例えば、前記オンコリティックウイルスと前記ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを共発現させた細胞でもよい。また、前記ウイルス感染キャリアー細胞は、例えば、前記ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを感染させた前記ウイルス未感染キャリアー細胞と組合せて、前記被検体に投与してもよい。前記ウイルス感染キャリアー細胞は、前述のように、前記本発明のキャリアー細胞に前記オンコリティックウイルスを感染させることで調製できる。

本発明の誘導方法は、例えば、さらに、前記ＧＭ−ＣＳＦを投与する工程（Ｃ１）を含んでもよい。前記ＧＭ−ＣＳＦの投与工程（Ｃ１）は、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与工程（Ａ１）と同時であることが好ましい。前記ＧＭ−ＣＳＦは、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞とＧＭ−ＣＳＦとを含む注射剤として投与してもよく、また、経静脈から全身投与してもよい。

本発明の誘導方法は、例えば、さらに、前記アテロコラーゲンを投与する工程（Ｃ２）を含んでもよい。前記アテロコラーゲンの投与工程（Ｃ２）は、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与工程（Ａ１）と同時であることが好ましい。前記アテロコラーゲンは、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞と前記アテロコラーゲンとを含む注射剤として投与してもよい。

本発明の誘導方法は、例えば、さらに、前記ウイルス産生増加剤を投与する工程を含んでもよい。前記ウイルス産生増加剤の投与工程（Ｃ３）は、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与工程（Ａ１）と同時であることが好ましい。前記ウイルス産生増加剤は、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞と前記ウイルス産生増加剤とを含む注射剤として投与してもよい。

本発明の誘導方法は、例えば、さらに、前記免疫処置（イムナイゼーション）用ウイルスを投与する工程を含んでもよい。前記免疫処置用ウイルスによって、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与に対する被検体のＣＴＬ反応を誘導できることから、前記免疫処置用ウイルスの投与工程（Ｄ１）は、例えば、前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与工程（Ａ１）よりも前に行うことが好ましい。具体的には、例えば、被検体に前記免疫処置用ウイルスを投与し、所定期間経過後、前記被検体に、さらに前記ウイルス感染キャリアー細胞を投与することが好ましい。前記所定期間は、特に制限されないが、例えば、約２週間〜約３ヵ月、約２週間〜約１３週間、好ましくは３週間〜４週間であり、短期間が望ましい。前記免疫処置用ウイルスの投与方法は、特に制限されず、例えば、皮内注射または皮下注射が好ましい。

本発明の誘導方法は、例えば、さらに、前記腫瘍免疫（ワクチネーション）のための腫瘍細胞を投与する工程（Ｄ２）を含んでもよい。前記腫瘍細胞の投与工程（Ｄ２）は、例えば、前記免疫処置用ウイルスの投与工程（Ｄ１）と同時、その前、またはその後に行うことが好ましい。前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞の投与方法は、特に制限されず、例えば、皮内注射または皮下注射が好ましい。

前記ウイルス感染キャリアー細胞および前記その他の各成分の投与対象である被検体は、例えば、ヒトまたは非ヒト動物への投与であり、前記非ヒト動物は、例えば、前述の通りである。また、前記投与は、例えば、in vivo、ex vivoおよびin vitroのいずれでもよく、具体例として、生物個体、採取した細胞、組織または器官、培養した細胞、組織または器官等への投与があげられる。

本発明の誘導方法において、各成分の投与条件は、特に制限されず、例えば、以下のような条件が例示できる。なお、本発明は、これらの例示に制限されない。

前記被検体に対する前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与量は、特に制限されず、例えば、前述のように、腫瘍の種類・大きさ、症状の程度、患者の年齢・性別、体重等に応じて調節できる。前記被検体がヒト個体の場合、前記ウイルス感染キャリアー細胞の１回の投与量は、例えば、約１×１０^６〜約１×１０^９細胞数とし、前記ウイルス感染キャリアー細胞による前記オンコリティックウイルスの１回の投与量は、例えば、約５×１０^６〜約２×１０^１１plaque forming unit（ＰＦＵ）である。なお、前記ウイルス未感染キャリアー細胞に対する前記オンコリティックウイルスの感染量は、特に制限されず、前述のように、例えば、約０．１〜２００ＭＯＩであり、好ましくは約１〜１００ＭＯＩ、より好ましくは約５〜２０ＭＯＩに設定できる。

前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与回数は、特に制限されず、例えば、投与期間において、１回の投与でもよいし、２回以上の複数回の投与でもよく、複数回のクールに分け、１クール当たりの投与回数および投与間隔等を任意に設定することもできる。また、前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与日数も、特に制限されない。前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与回数に応じて、例えば、他の成分の投与回数も設定できる。

前記被検体に対する前記アテロコラーゲンの投与量は、特に制限されない。前記アテロコラーゲンは、前記ウイルス感染キャリアー細胞と共に投与することが好ましく、この場合、前記ウイルス感染キャリアー細胞と前記アテロコラーゲンとを含む前記抗腫瘍効果の誘導剤を使用することが好ましく、その形態は、注射剤が好ましい。前記抗腫瘍効果の誘導剤が注射剤の場合、前記アテロコラーゲンの濃度は、特に制限されず、例えば、約０．０１〜３．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．１〜０．２％（ｗ／ｖ）でも、十分な効果が得られる。

前記被検体に対する前記ＧＭ−ＣＳＦの投与量は、特に制限されない。前記ＧＭ−ＣＳＦは、前記ウイルス感染キャリアー細胞と共に投与することが好ましく、この場合、前記ウイルス感染キャリアー細胞と前記ＧＭ−ＣＳＦとを含む前記抗腫瘍効果の誘導剤を使用することが好ましく、その形態は、注射剤が好ましい。

前記被検体に対する前記免疫処置用ウイルスの投与量は、特に制限されず、例えば、被検体の前記ウイルスに対する抗体価、腫瘍の大きさ・種類、症状の程度、患者の年齢・性別、体重等に応じて適宜選択でき、また、前記被検体について、前記ウイルスに対する抗体が、陽性であるか陰性であるかに応じて、投与量を変更することが好ましい。
前記被検体が、抗体陰性（−）の前記ヒト個体の場合、例えば、約１×１０^１０〜１×１０^１２ＰＦＵであり、抗体陽性（＋）の前記ヒト個体の場合、例えば、約１×１０^８〜１×１０^１０ＰＦＵ、約１×１０^８ＰＦＵ未満または非投与とすることができる。具体例として、前記免疫処置用ウイルスおよび前記オンコリティックウイルスとして、タイプ５のアデノウイルスを使用する場合、前記免疫処置用ウイルスの投与量は、例えば、上述のような条件が好ましい。

前記被検体に対する前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞の投与量は、特に制限されず、例えば、約１×１０^５〜１０^８細胞数に設定できる。

以下に、前記免疫処置用ウイルスに対する抗体が陰性の被検体と、前記抗体が陽性の被検体とにわけて、前記免疫処置用ウイルスおよび前記腫瘍免疫用腫瘍細胞の投与について、例示する。なお、本発明は、この例示には制限されない。

抗体陰性の被検体の場合、前記免疫処置用ウイルスとして、例えば、前記非増殖型アデノウイルスを使用する。前記被検体への投与量は、例えば、約１×１０^１０〜１×１０^１２ＰＦＵである。前記免疫処置用ウイルスの投与と共に、前記腫瘍免疫用の腫瘍組織として、例えば、約２００Ｇｙで放射線処理した患者由来の腫瘍細胞（癌細胞）を、約１×１０^５〜１０^１０細胞数投与することが好ましい。前記免疫処置用ウイルスおよび前記腫瘍免疫用の腫瘍細胞の投与方法は、皮内注射または皮下注射が好ましい。

そして、前記免疫処置用ウイルスおよび腫瘍免疫用の腫瘍細胞の投与から、約３〜４週後、前記ウイルス感染キャリアー細胞を腫瘍内注射で投与する。前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与量は、例えば、１回あたり、約１×１０^６〜１×１０^９細胞数である。前記ウイルス感染キャリアー細胞は、例えば、約１５０〜４００Ｇｙで放射線処理した後、投与することが好ましい。前記ウイルス感染キャリアー細胞は、前記ウイルス未感染キャリアー細胞に、前記オンコリティックウイルスおよび前記ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを、それぞれ、例えば、約５〜２００ＭＯＩ、約５〜５０ＭＯＩの条件で感染させて調製することが好ましい。前記オンコリティックウイルスと前記ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターは、それぞれ、アデノウイルスが好ましい。前記ウイルス感染キャリアー細胞は、注射剤が好ましく、さらに、約０．１〜０．２％のアテロコラーゲンが混合されていることが好ましい。また、前記ウイルス感染キャリアー細胞の投与と同時に、例えば、前記ウイルス産生増加剤として、約４０〜１００ｍｇの鉄（Ｆｅ）を静注する、または、同時に、前記ウイルス産生増加剤として、約２−２０００ｍｇのＡＬＡを腫瘍内に投与することが好ましい。また、HDAC inhibitorを約５−５００ｍｇ経口投与することが望ましい。これらの一連の投与を、例えば、１クールの投与として、前記ウイルス感染キャリアー細胞を１〜６回投与することが好ましい。前記複数回の投与は、例えば、連日あるいは２，３日おきに行うことが好ましい。

前記抗体陽性の被検体の場合、前記免疫処置用ウイルスの投与量を、約１×１０^１２ＰＦＵ以下とすることが好ましく、その他は、例えば、前記抗体陰性と同様の条件で処理できる。

前記各成分の投与量として、ヒト個体を例にあげたが、ヒト以外の非ヒト動物個体に対しては、例えば、ヒトとの体重の違いを考慮して、投与量を適宜設定できる。前記非ヒト動物が、例えば、マウスまたはラット等の場合、前記各成分の投与量を約１／１０００に設定できる。

本発明の誘導方法は、例えば、前記オンコリティックウイルスの感染力をより向上するために、他の抗がん剤の投与または放射線照射療法、手術療法等と併用することもできる。

＜４．癌の治療方法＞
本発明の癌の治療方法は、患者に、キャリアー細胞にオンコリティックウイルスを感染させたウイルス感染キャリアー細胞を投与する工程（Ａ１）を含み、前記キャリアー細胞が、前記本発明の新規細胞であることを特徴とする。本発明の治療方法は、投与対象が患者であり、具体的な方法は、例えば、前記本発明の抗腫瘍効果の誘導方法における記載を援用できる。

前記患者は、例えば、ヒトまたは非ヒト動物であり、前記非ヒト動物は、例えば、前述の通りである。

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。

［実施例１］
愛媛大学医学部で独自に単離した肺癌患者の肺腺癌細胞（ＥＨＭＫ細胞）を限界希釈して、ＥＨＭＫ−５１細胞を取得し、抗腫瘍効果を確認した。

（１）限界希釈法
９６ウェルディッシュに、０．２５細胞／１００μＬ培地／ｗｅｌｌまたは０．５細胞／１００μＬ培地／ｗｅｌｌとなるように細胞培養液を調製し、前記ＥＨＭＫ細胞を播種した。前記培地は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩを使用した。そして、倒立顕微鏡（ECLIPS TS100、Nikon社製）により前記各ウェルの細胞を観察し、１細胞／ｗｅｌｌとなっているウェルのみ、限界希釈の対象とした。そして、前記対象となった細胞の培養を行い、細胞の形状、アポトーシスの状況、増殖状況に基づき、増殖に安定性がある細胞を、キャリアー細胞候補群ＩのＥＭＨＭ−５１細胞として選抜し、液体窒素に凍結保存した。前記培養の間、１〜２週間に１度の間隔で、各ウェルに前記培地を適宜補充し、培養条件は、３７℃ ５％ＣＯ_２とした（以下同様）。

（２）キャリアー細胞の作製
６ウェルディッシュに、１×１０^６細胞／２ｍＬ培地／ｗｅｌｌとなるよう、前記キャリア細胞候補群ＩのＥＭＨＭ−５１細胞をそれぞれ播種し、一晩培養した。前記培地は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩを使用した。前記培養後、前記ウェル内の培地を吸引除去し、オンコリティックウイルスとして、アデノウイルスＡｄＥ３−ｍｉｄｋｉｎｅを添加して、３時間の培養により、前記アデノウイルスを前記細胞に感染させた。前記アデノウイルスは、５００ＭＯＩ／１ｍＬ培地／ｗｅｌｌとした。この際、前記培地は、ＦＣＳ未添加のＲＰＭＩを使用した。そして、前記感染後、各ウェルに、２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩを１ｍＬ添加し、２日間培養を行った。そして、前記ウェル内の培地を吸引除去し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄を行った後、トリプシン１ｍＬで、前記ウェル内の細胞を回収した。回収した細胞をＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞とした。

（３）抗腫瘍効果の確認
得られたＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞について、抗アデノウイルス抗体の非存在下および存在下における抗腫瘍効果を確認した。

まず、９６ウェルディッシュに、１×１０^３細胞／１００μＬ培地／ｗｅｌｌとなるよう、卵巣癌細胞ＨＥＹ（入手元：MD Anderson Cancer Center）を播種し、１日培養した。そして、回収した前記ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞を、４×１０^３細胞／ｗｅｌｌから４倍で連続希釈し、前記ＨＥＹを播種したウェルに、前記連続希釈したＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞を、それぞれ播種した。

つぎに、前記ウェル内の前記ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞を、抗アデノウイルス抗体の存在下または非存在下で、５日間培養を行った。抗アデノウイルス抗体は、グロベニン−Ｉ（日本製薬社製）を使用し、添加量は、２０μＬ（抗体価６００倍）／ウェルとした。前記培養後、前記ウェルの培地を吸引除去し、２００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう２０％エタノールを添加した０．５％クリスタルバイオレット含有染色液を添加し、室温で１時間染色した。前記染色後、前記ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、残存するＰＢＳを除去し、前記９６ウェルディッシュを逆さにして室温で３０分間乾燥した。

そして、乾燥後のウェルについて、５５０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計を用いて測定し、ＩＣ_５０（ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞／ｗｅｌｌ）を算出した。

比較例として、前記ＥＨＭＫ−５１細胞に代えて、公知のＡ５４９細胞（入手元：独立行政法人 医薬基盤研究所 生物資源バンク）を用いた以外、同様にして、ＩＣ_５０を算出した。そして、前記Ａ５４９のＩＣ_５０を１とし、前記ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞のＩＣ_５０の比を求め、これを前記ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞の抗腫瘍効果（ＥＨＭＫ−５１／Ａ５４９）として算出した。これらの結果を図１に示す。

図１は、抗アデノウイルス抗体の存在下（抗体（＋））または非存在下（抗体（−））における抗腫瘍効果を示すグラフである。図１において、横軸は、細胞の種類を示し、縦軸は、抗腫瘍効果（ＩＣ_５０、Ａ５４９／ＥＨＭＫ−５１、Ａ５４９＝１）を示す。

図１に示すように、抗アデノウイルス抗体の非存在下および存在下のいずれにおいても、ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞が、卵巣癌細胞ＨＥＹに対して、極めて優れた抗腫瘍効果を奏した。この結果は、前記Ａ５４９キャリアー細胞の抗腫瘍効果に対して、抗体非存在下で約３．４±１．９倍の抗腫瘍効果であり、抗体存在下で約４．５±１．１倍の抗腫瘍効果であった。これらの結果から、ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞が、極めて優れた抗腫瘍効果を発揮するキャリアー細胞であることがわかった。

［実施例２］
前記実施例１で得られたＥＨＭＫ−５１細胞について、継代による抗腫瘍効果の変化を確認した。

前記ＥＨＭＫ−５１細胞を、継代０代目とした。そして、以下のようにして、継代を繰り返し、継代１〜２０代目のＥＨＭＫ−５１細胞を作製した。前記継代１〜２０代目のＥＨＭＫ−５１細胞は、１０ｍＬディッシュに、１０ｍＬ培地／ｄｉｓｈとなるよう培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下でsubconfluentの状態になるまで培養した。前記培地は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩを使用した。前記培養後、前記ディッシュをＰＢＳで２回洗浄を行った後、トリプシン１ｍＬで、前記継代１〜２０代目のＥＨＭＫ−５１細胞を回収した。１ｍＬの前記回収液のうち５０−１００μＬについて継代を行い、残りの前記回収液について、前記培地１ｍＬを添加した後に、前記実施例１と同様にして、抗アデノウイルス抗体の存在下または非存在下での抗腫瘍効果を算出した。また、内部標準として、各継代時に、前記継代０〜２０代目のＥＨＭＫ−５１細胞に代えてＡ５４９細胞を用いた以外は、同様にして抗腫瘍効果を算出した。そして、前記継代０〜２０代目のＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞の抗腫瘍効果について、各継代時のＡ５４９の抗腫瘍効果で補正した。そして、継代０代目（ＥＨＭＫ−５１）のＩＣ_５０を１とし、各継代のＩＣ_５０の比を求め、これを各継代のキャリアー細胞の抗腫瘍効果として算出した。これらの結果を図２および図３に示す。

図２は、抗アデノウイルス抗体の非存在下における抗腫瘍効果を示すグラフであり、図３は、抗アデノウイルス抗体の存在下における抗腫瘍効果を示すグラフである。図２および図３において、横軸は、細胞の種類を示し、縦軸は、抗腫瘍効果（ＩＣ_５０、継代０代目＝１）を示す。

図２に示すように、前記抗アデノウイルス抗体の非存在下において、継代２０代目においても、十分な抗腫瘍効果が維持できた。また、図３に示すように、前記抗アデノウイルス抗体の存在下において、継代２０代目においても、十分な抗腫瘍効果が維持できた。

［実施例３］
前記実施例１で得られたＥＨＭＫ−５１細胞を限界希釈して、さらに、ＥＨＭＫ−５１細胞由来のクローン細胞群を取得し、抗腫瘍効果を確認した。

前記キャリアー細胞候補群Ｉに代えて、前記ＥＨＭＫ−５１細胞を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、限界希釈を行い、４０種類の前記ＥＨＭＫ−５１細胞のクローン細胞群を作製した。そして、前記実施例１と同様にして、前記クローン細胞群について、抗アデノウイルス抗体の存在下または非存在下における前記クローン細胞群のＩＣ_５０を計算した。そして、前記ＥＨＭＫ−５１細胞のＩＣ_５０を１とし、前記クローン細胞群のキャリアー細胞のＩＣ_５０の比を求め、これを前記キャリアー細胞候補群の抗腫瘍効果として算出した。これらの結果を図４および図５に示す。

図４は、抗アデノウイルス抗体の非存在下における抗腫瘍効果を示すグラフであり、図５は、抗アデノウイルス抗体の存在下における抗腫瘍効果を示すグラフである。図４および図５において、横軸は、細胞の種類を示し、縦軸は、抗腫瘍効果（ＩＣ_５０、ＥＨＭＫ−５１＝１）を示す。

図４および図５に示すように、抗アデノウイルス抗体の非存在下および存在下のいずれにおいても、前記クローン細胞群の全てのキャリアー細胞が、卵巣癌細胞ＨＥＹに対して、極めて優れた抗腫瘍効果を奏した。中でも、ＥＨＭＫ−５１−３２細胞およびＥＨＭＫ−５１−３５キャリアー細胞は、特に高い抗腫瘍効果を奏し、前記ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞の抗腫瘍効果に対して、抗体非存在下で、それぞれ、約２．８±０．８倍および約３．１±１．５倍の抗腫瘍効果であり、抗体存在下で、それぞれ、約２．６±０．８倍および約２．８±０．９倍の抗腫瘍効果であった。これらの結果から、ＥＨＭＫ−５１細胞由来のクローン細胞は、いずれも、極めて優れた抗腫瘍効果を発揮するキャリアー細胞であることがわかった。

［実施例４］
キャリアー細胞として、ＥＨＭＫ−５１細胞、それのクローン細胞であるＥＨＭＫ−５１−３２細胞およびＥＨＭＫ−５１−３５細胞を使用し、それぞれの抗腫瘍効果を比較した。

キャリアー細胞として、ＥＨＭＫ−５１細胞、ＥＨＭＫ−５１−３２細胞およびＥＨＭＫ−５１−３５細胞を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、それぞれの細胞のＩＣ_５０を計算した。また、比較例として、前記実施例１と同様に、Ａ５４９を使用し、同様に、ＩＣ_５０を計算した。そして、前記Ａ５４９のＩＣ_５０を１とし、前記実施例１と同様にして、各キャリアー細胞の抗腫瘍効果を計算した。この結果を図６に示す。

図６は、抗アデノウイルス抗体の非存在下および存在下における抗腫瘍効果を示すグラフである。図７において、横軸は、細胞の種類を示し、縦軸は、抗腫瘍効果（ＩＣ_５０、Ａ５４９＝１）を示す。

図６に示すように、抗アデノウイルス抗体の非存在下および存在下のいずれにおいても、ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞、ＥＨＭＫ−５１−３２キャリアー細胞およびＥＨＭＫ−５１−３５キャリアー細胞は、極めて優れた抗腫瘍効果を示した。そして、前記Ａ５４９細胞の抗腫瘍効果に対して、抗体非存在下で、それぞれ、約３．４±１．９倍、約９．５±３．０倍、約１０．５±５．０倍の抗腫瘍効果を示し、抗体存在下で、それぞれ、約４．５±１．１倍、約１１．９±３．７倍、約１２．５±４．３倍の抗腫瘍効果を示した。これらの結果から、ＥＨＭＫ−５１キャリアー細胞およびそのクローン細胞、特にＥＨＭＫ−５１−３５キャリアー細胞が、極めて優れた抗腫瘍効果を発揮するキャリアー細胞であることがわかった。

これらの結果から、本発明のキャリアー細胞を使用することで、良好な抗腫瘍効果が得られることがわかった。

［実施例５］
前記実施例３で得られたクローン細胞ＥＨＭＫ−５１−３５をキャリアー細胞とし、免疫力のある皮下腫瘍モデルマウスにおけるin vivoでの抗腫瘍効果を確認した。

免疫機能が正常なであるＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに、同種の高転移性卵巣癌細胞ＯＶＨＭを皮下移植し、その１０日後以降に形成された５−１０ｍｍの皮下腫瘍に対し、アデノウイルスAd-β galによる事前免疫を行った。そして、事前免疫の３週間後、前記皮下腫瘍に、３日間毎日、前記キャリアー細胞を腫瘍内投与して、治療を行う、生存率を確認した。前記マウスは、各群あたり１０匹とした。前記キャリアー細胞は、オンコリティックアデノウイルスＡｄＥ３−ｍｉｄｋｉｎｅを感染させたものと、ＡｄＥ３−ｍｉｄｋｉｎｅおよびアデノウイルス−ｍＧＭ−ＣＳＦ（Ａｄ-ｍＧＭ-ＣＳＦ）を感染させたものを、それぞれ使用した。

また、皮下腫瘍に対して、キャリアー細胞による治療を行っていない群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、キャリアー細胞による治療を行っていない群（ＡｄＥ３−ｍｉｄｋｉｎｅ）、前記キャリアー細胞としてＡ５４９細胞を使用した群（Ａ５４９（ＡｄＥ３-ｍｉｄｋｉｎｅ）、Ａ５４９（ＡｄE3-ｍｉｄｋｉｎｅ＋Ａｄ−ｍＧＭ−ＣＳＦ））についても、同様にして生存率を確認した。

これらの結果を図７に示す。図７は、マウスの生存率を示すグラフであり、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存曲線で表した。図７において、縦軸が生存率（％）、横軸が日数を示す。図７に示すように、未治療のＣｏｎｔｒｏｌおよびＡｄＥ３−ｍｉｄｋｉｎｅは、１００日目前後で生存率が０％となった。また、Ａ５４９キャリアー細胞を使用した群は、生存率が、約３０％および約６０％でプラトーに達した。これに対して、前記ＥＨＭＫ−５１細胞のクローンキャリアー細胞によれば、生存率を約８０％と約１００％に維持することができた。中でも、オンコリティックアデノウイルスおよびアデノウイルス−ｍＧＭ−ＣＳＦを共感染した前記クローンキャリアー細胞の場合、生存率が約１００％と極めて優れた結果が得られた。

［実施例６］

前記実施例３で得られたクローン細胞ＥＨＭＫ−５１−３５をキャリアー細胞とし、免疫力のある腹腔内腫瘍モデルマウスにおけるin vivoでの抗腫瘍効果を確認した。

免疫機能が正常であるＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに、アデノウイルスAd-β galによる事前免疫を行い、同種の高転移性卵巣癌細胞ＯＶＨＭを腹腔内移植した。４日後以降に形成された腹腔内腫瘍に対し、２日毎に３回の腹腔内治療を行った以外は、前記実施例５と同様にして、生存率を確認した。

これらの結果を図８に示す。図８は、マウスの生存率を示すグラフであり、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存曲線で表した。図８において、縦軸が生存率（％）、横軸が日数を示す。図８に示すように、未治療のＣｏｎｔｒｏｌ、ＡｄＥ３−ｍｉｄｋｉｎｅおよびＡ５４９キャリアー細胞を使用した群は、いずれも、５０日目前後で生存率が０％となった。これに対して、前記ＥＨＭＫ−５１細胞のクローンキャリアー細胞によれば、生存率を約４０％と約７０％に維持することができた。中でも、オンコリティックアデノウイルスおよびアデノウイルス−ｍＧＭ−ＣＳＦを共感染した前記クローンキャリアー細胞の場合、生存率が約７０％と極めて優れた結果が得られた。

これらの結果から、本発明のキャリアー細胞を使用することで、良好な抗腫瘍効果が得られることがわかった。

以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。

以上のように、本発明の新規細胞によれば、癌の遺伝子治療において、オンコリティックウイルスを感染させて、標的の腫瘍部位に投与するためのキャリアー細胞として使用する際に、優れた安定性および安全性を示し、且つ、例えば、腹腔内投与および全身投与等によっても抗腫瘍効果を発揮することが可能である。このため、本発明は、抗腫瘍効果を利用する生命化学分野および臨床分野において、極めて有用な技術である。

Claims (26)

1. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１８で特定される新規細胞。
2. オンコリティクウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、
   前記キャリアー細胞が、請求項１記載の新規細胞またはそのクローン細胞であることを特徴とする抗腫瘍効果の誘導剤。
3. さらに、腫瘍細胞に作用させるオンコリティックウイルスを含む、請求項２記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
4. 前記キャリアー細胞が、腫瘍細胞に作用させるオンコリティックウイルスが感染した細胞である、請求項２または３記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
5. 前記オンコリティックウイルスが、アデノウイルスである、請求項２から４のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
6. 前記アデノウイルスが、
   Ｅ１ＡプロモーターあるいはＥ１Ｂプロモーターの少なくとも一方が一部もしくは全て欠失したアデノウイルス、および、Ｅ１Ａ遺伝子あるいはＥ１Ｂ遺伝子の一方を欠失したアデノウイルスの少なくとも一方である、請求項５記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
7. 前記オンコリティックウイルスが、プロモーターを有する、請求項２から６のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
8. 前記プロモーターが、腫瘍特異的プロモーターである、請求項７記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
9. 前記プロモーターが、１Ａ１．３Ｂプロモーター、ミッドカインプロモーター、β−ＨＣＧプロモーター、ＳＣＣＡ１プロモーター、ＳＣＣＡ２プロモーター、ＣＥＡプロモーター、ｃｏｘ−２プロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＡＦＰプロモーター、オステオカルシンプロモーター、ＣＡ１２−５（Mucin 16）プロモーター、テロメラーゼ（hTERT、human telomerase reverse transcriptase）プロモーター、ネスチンプロモーター、Ｅ２Ｆ−１プロモーター、chemokine SDF-1 receptor（ＣＸＣＲ４）プロモーター、epithelial glycoprotein 2（ＥＧＰ−２）プロモーター、survivinプロモーター、L-plastinプロモーター、Hexokinase type II（ＨＫ II）プロモーター、Tyrosinaseプロモーター、ＭＵＣ−１プロモーター、Rat probasinプロモーター、Leukoprotease inhibitorプロモーター、Tcf responsiveプロモーター、Calponinプロモーター、Albuminプロモーター、Flt-1プロモーター、Hypoxia responsive elementsプロモーター、β-cateninプロモーター、Uroplakin IIプロモーター、surfactant protein Ｂプロモーター、Ｂ−Ｍｙｂプロモーター、ＤＦ３プロモーター、およびＵＬ３８プロモーター、mesothelinプロモーター、prostate specific antigen（PSA）プロモーター、c-erb-2プロモーター、EGFプロモーター、12−o−tetradecanoylphorbol-13-acetate（TPA）プロモーター、SSX4プロモーター、TGFβプロモーター、H19プロモーター、IGF-1プロモーター、DF3プロモーター、MARE（Maf recognition element）配列、MGMTプロモーター、Prostate stem cell antigen (PSCA)プロモーター、CDX2プロモーター、Vascular endothelial growth factor receptor type-1（flt-1プロモーター）、PSF1プロモーター、HURTプロモーター、ガストリン放出ペプチド（GRP）プロモーター、II型ヘキソキナーゼプロモーター、CRI1プロモーター、I.7プロモーター、Prostate-specific membrane antigen(PSMA)プロモーター、Egr-1プロモーターおよびMatrix Metalloproteinase（MMP）プロモーターからなる群から選択された少なくとも一つのプロモーターである、請求項７または８記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
10. さらに、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはその発現ベクターを含む、請求項２から９のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
11. 前記キャリアー細胞が、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の発現ベクターを導入した細胞である、請求項２から１０のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
12. さらに、アテロコラーゲンを含む、請求項２から１１のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
13. さらに、鉄含有化合物、ポルフィリン化合物およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（HDAC inhibitor）からなる群から選択された少なくとも一つを含む、請求項２から１２のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
14. さらに、免疫処置用のウイルスを含む、請求項２から１３のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
15. さらに、腫瘍免疫用の腫瘍細胞を含む、請求項２から１４のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果の誘導剤。
16. 癌の遺伝子治療用医薬である、請求項２から１５のいずれか一項に記載の抗腫瘍効果の誘導剤を含むことを特徴とする癌の遺伝子治療用医薬。
17. 非ヒト動物に、キャリアー細胞にオンコリティックウイルスを感染させたウイルス感染キャリアー細胞を投与する工程を含み、
    前記キャリアー細胞が、請求項１記載の新規細胞であることを特徴とする被検体における抗腫瘍効果の誘導方法。
18. 前記オンコリティックウイルスが、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス、水泡性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus）、レオウイルス、センダイウイルス、コクサッキーウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（venezuelan equine encephalitis virus）、カナリア痘ウイルス（canarypox virus）、ライノウイルス（rhinovirus）、鶏痘ウイルス（fowlpox virus）、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１７記載の誘導方法。
19. 前記ウイルス感染キャリアー細胞が、前記キャリアー細胞に前記オンコリティックウイルスと顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の発現ベクターを共感染させた細胞、または顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を導入したオンコリティックウイルスを感染させた細胞である、請求項１７または１８記載の誘導方法。
20. さらに、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を投与する工程を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の誘導方法。
21. さらに、アテロコラーゲンを投与する工程を含む、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の誘導方法。
22. さらに、鉄含有化合物、ポルフィリン化合物およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（HDAC inhibitor）からなる群から選択された少なくとも一つを投与する工程を含む、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の誘導方法。
23. さらに、キャリアー細胞をポリエチレングリコール結合脂質あるいはアルギン酸カルシウムヒドロゲルで加工する工程を含む、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の誘導方法。
24. さらに、免疫処置用のウイルスを投与する工程を含む、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の誘導方法。
25. さらに、腫瘍免疫用の腫瘍細胞を投与する工程を含む、請求項１７から２４の誘導方法。
26. 前記被検体への投与が、in vivo、ex vivoおよびin vitroのいずれかでの投与である、請求項１７から２５のいずれか一項に記載の誘導方法。

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