JP2002511846A

JP2002511846A - Ｈｓｖアンプリコンベクターによる自家腫瘍ワクチンの迅速な産生

Info

Publication number: JP2002511846A
Application number: JP54583098A
Authority: JP
Inventors: フォン，ユマン; フェダーオフ，ハワード; ローゼンブラット，ジョセフ，ディ．
Original assignee: University of Rochester
Current assignee: University of Rochester
Priority date: 1997-03-21
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2002-04-16
Also published as: US6051428A; AU7357098A; WO1998042855A1; EP0968299A1; CA2287156A1; US20040157299A1; US20040047837A1; WO1998042855A9

Abstract

(57)【要約】免疫調節タンパク質を細胞に一過性に発現させるために、免疫調節タンパク質に対する遺伝子を含む単純ヘルペスウイルス・アンプリコンを腫瘍細胞に形質導入することによって、腫瘍細胞に対する自家ワクチンを産生する。腫瘍細胞は単純ヘルペス・アンプリコンをエクスビボまたはインビボで形質導入してもよい。適した免疫調節タンパク質には、例えばインターロイキン類、インターフェロン類のようなサイトカイン、およびランテス（RANTES）のようなケモカイン、例えばICAM-1のような細胞間接着分子、およびB7.1のような共刺激因子が含まれる。腫瘍細胞はまた、２つ以上の異なる免疫調節タンパク質に対する遺伝子を含む１つ以上の種のアンプリコンを形質導入してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 HSVアンプリコンベクターによる自家腫瘍ワクチンの迅速な産生説明本明細書に記述の研究は一部、NIH交付金CA76416、CA72632、HD31300、DK5316 0、およびPO1 CA59326の支援を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する。発明の背景腫瘍細胞へのサイトカイン遺伝子の移入は、腫瘍の免疫原性を増強して、その結果宿主による認識を増強し、腫瘍を消失させることを目的として、これらの免疫調節タンパク質の局所産生を増加させるために用いられている(ドラノフら(Dr anoff)、1993；ガンスバッチャーら(Gansbacher)、1992)。インターロイキン-2( IL-2)、ガンマ・インターフェロン(γ-IFN)、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）のようなサイトカインを分泌する、放射線照射した分裂しない腫瘍細胞は、悪性疾患の治療に対して考えられる治療戦略となっており、その一つは現在臨床試験での評価が行われている(ロッツェら(Lotze)、1994；セイグラーら(Seigler)、1994；ローゼンバーグら(Rosenberg)、1992)。遺伝子の移入に関しては多くの方法が検討されているが(ダビッドソンら(Davldson)、199 3；ドラザンら(Drazan)、1994；ヤンら(Yang)、1995；パケリウ＆レカム(Paquer eau & Le Cam)、1992；ヤマジンら(Jamagin)、1992)、最も成功したのはレトロウイルスベクターを用いた移入であった(ドラノフら(Dranoff)、1993；ガンスバッチャーら(Gansbacher)、1992)。自家腫瘍ワクチン産生の障害となっているのは、摘出した新鮮な腫瘍に対する遺伝子移入を取り巻くロジスティックな問題であった。最も広く用いられている腫瘍への遺伝子移入のアプローチは、レトロウイルス・ベクターに依存しており、これは比較的効率が悪く、遺伝子発現のために細胞の複製を必要とする(ウィルソンら(Wilson)、1988)。レトロウイルス・ベクターを用いた自家ワクチンの産生には、摘出した腫瘍を組織培養してからインビトロで形質導入して、選別し、遺伝子移入が成功した少数の細胞を単離する必要がある。したがって、そのようなプロセスは長々しく、費用もかさみ、初代細胞培養を確立して維持する際に技術的な問題を伴う。これらの難しさのために、研究者たちはやむなく、別のワクチン戦略として、確立された同種異系サイトカイン分泌腫瘍細胞株の投与(パテルら(Patel)、1994)、アデノウイルス・ベクターのような他のベクターを遺伝子移入に利用すること(ドラザンら(Drazan)、1994；ヤンら(Yang)、1995)、またはサイトカイン産生繊維芽細胞株を自家腫瘍細胞と共に投与すること（ロッツェら (Lotze)、1994)を検討するに至った。さらに、多くのタイプの腫瘍の治療には多種の療法、すなわち、１種以上の蛋白質を発現するよう細胞を形質導入した療法を用いることが好ましいかも知れない。そのようなプロセスにレトロウイルス・ベクターを使用するためには、遺伝子のそれぞれの組合せに対して特異的なベクターを構築する必要がある。多遺伝子ベクターの構築は複雑で、利用できる可能性がある多種療法の多様性を現実的に制限する可能性がある。本発明の目的は、複数の免疫調節タンパク質を発現する自家腫瘍ワクチンの迅速かつ効率的な産生法を提供する。本発明のもう一つの目的は、迅速に、数時間内に、例えば４時間以内に完了して、腫瘍患者を迅速に治療することができる、ケモカイン、細胞間接着分子、または共刺激因子、またはそれらを組合せて発現する自家腫瘍ワクチンを迅速に産生する方法を提供することである。本発明のさらにもう一つの目的は、腫瘍材料の外科的な摘出を必要とすることなく、インビボで腫瘍細胞に適用することができる自家腫瘍ワクチンの迅速な産生法を提供することである。本発明のさらなる目的は、本発明の方法において有用な組成物を提供することである。発明の概要本発明に従って、腫瘍細胞に対する自家ワクチンは、細胞による一過性の免疫調節蛋白質の発現を得るために、免疫調節蛋白質に対する遺伝子または複数の遺伝子およびさらなる治療遺伝子を含む、単純ヘルペスウイルス・アンプリコンを腫瘍細胞に形質導入することによって産生される。腫瘍細胞は、エクスビボまたはインビボにおいて、単純ヘルペス・アンプリコンを形質導入してもよい。発明の方法において個別に用いてもよい一例としての免疫調節蛋白質は、ランテス(R ANTES)のようなケモカイン、ICAM-1のような細胞間接着分子、およびB7.1のような共刺激因子が含まれる。本発明の特に重要な局面は、２つ以上の異なる免疫調節タンパク質、例えばインターロイキン-2とインターロイキン12、またはRANTES とB7.1の遺伝子を含むアンプリコンの組合せによって、腫瘍細胞が容易に形質導入されるという事実である。これによって、多標的療法を目的として多重形質導入細胞を産生することが容易になる。図面の簡単な説明図1A〜Eは、発明のHSVアンプリコンを用いた遺伝子移入の効率に関する試験結果を要約している；図2A〜Cは、遺伝子移入の効率に及ぼす放射線照射の影響を要約している；図3A〜Cは、HSVアンプリコン形質導入腫瘍細胞の脾臓内注射によって処置したマウス脾細胞の殺腫瘍活性を示す；図４は、発明のHSVアンプリコンを用いた遺伝子移入の効率に関する試験結果を要約する；図５は、腫瘍の増殖に及ぼす形質導入細胞の影響を図示する；図６は、肝切除による腫瘍形成に及ぼす形質導入細胞の影響を図示する；図７は、形質導入細胞の細胞培養上清に認められるヒトICAM-1の量を示す；図８は、HSV-hICAM1を形質導入した肝癌細胞に対するリンパ球の接着に関する接着指数を対照と比較して示す；図９は、HSV-hICAM1を形質導入した肝癌細胞を注射したラットにおける腫瘍の増殖を対照と比較して示す；図10は、放射線照射した（非生存）HSVhICAM-1形質導入肝癌をワクチン接種した後に生存肝癌細胞をチャレンジした後のラット肝臓に形成された腫瘍結節を示す。図11は、発明のいくつかの免疫調節タンパク質アンプリコンの構造を示す；図12A〜Cは、HSVB7.1を形質導入したEL4細胞のB7.1発現を対照と比較して示す；図13AおよびBは、腫瘍内処置した腫瘍および反対側の腫瘍におけるそれぞれの腫瘍の大きさを示す、そして図14A〜Dは、HSVB7.1もしくはHSVrantesを単独で、または併用して投与したマウスの脾細胞に認められたCTL活性を、HSV lac対照を投与した場合と比較して示す。発明の詳細な説明単純ヘルペスウイルス（HSV）は、多様な細胞タイプを迅速かつ効率よく感染させることができるDNAウイルスである(ライブ＆オリビオ(Leib & Olivio)、199 3；ゲラー＆フェデロフ(Geller & Federoff)、1991)。HSVに由来するプラスミドに基づくウイルスベクターは、アンプリコンと呼ばれ、容易に構築されて、ウイルス粒子の中にパッケージングされる。本発明は、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を含む単純ヘルペスウイルスアンプリコンを用いて、エクスビボまたはインビボのいずれかにおいて高率で腫瘍細胞を形質導入する。本明細書で用いられるように、「免疫調節タンパク質」とは、それが標的細胞によって発現されると、その細胞に対する免疫応答の産生を増強するあるクラスのタンパク質またはペプチド分子を指す。この語には、ケモカインを含むサイトカイン、細胞間接着分子、およびBまたはT細胞の活性化に必要な共刺激因子が含まれる。発明において免疫調節タンパク質として用いてもよいサイトカインは、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-12（IL-12）のようなインターロイキン；インターフェロン、例えば、ガンマ・インターフェロン(γ-インターフェロン )；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）および腫瘍壊死因子α（T NF-α）を含むが、これらに限定しない。免疫調節タンパク質はまた、単球およびマクロファージに対する化学誘引物質または活性化剤として機能する、βまたはC-Cケモカインであるランテスのようなケモカインであってもよい。MCP-1、-2 および-3、DC-CK1ならびにMIP-α、-3α、βおよび-3β、およびαのようなその他のC-Cケモカイン、またはIL-8、SDF-1β、8DF-1α、GRO、 PF-4およびMIP-2のようなC-X-Cケモカインも同様に使用することができる。本方法において有用なその他のケモカインはCファミリー、例えば、リンポタクチンおよびCX3Cファミリー、例えば、フラクタルカイン、ケモカインである。細胞間接着分子は、白血球の、血管内皮細胞および相互に対する接着のメディエータとして作用するIgスーパーファミリーに属する膜通過タンパク質である。発明において用いられる好ましい細胞間接着分子は、ICAM-1（CD54としても知られる）であるが、ICAM-2および-3を含む、TまたはB細胞に結合する他の細胞接着分子も用いることができる。本発明において免疫調節タンパク質として用いてもよい共刺激因子は、抗原受容体以外の細胞表面分子、および抗原に対してリンパ球が効率よく反応するために必要なそのリガンドである。そのような共刺激因子の例にはB7（CD80としても知られる）が含まれる。 HSVベクターシステムは、腫瘍細胞に対する遺伝子移入にとって有効な媒体である。HSVlacを用いた実験では、標的細胞の50％以上がMOI1を用いて形質導入された。導入効率はさらに、HSVil2形質導入細胞によって産生されたIL-2が高レベルであることによって反映される。１μg/10⁶個/24時間以上の産生レベルが認められるが、これはレトロウイルスによって産生されるワクチンによって得られる場合の30倍以上である(パテルら(Patel)、1994；ガンスバッチャーら(Gansbache r)、1992)。さらに、HSVil2形質導入ヒト腫瘍による実験データは、単離した新鮮な腫瘍細胞へのHSV-媒介遺伝子移入が成功すればそれを用いて、生物活性IL-2 の有意な量を分泌する遺伝子操作細胞を産生することができることを証明している。遺伝子移入にHSVベクターを用いる主な長所は、複製しないまたは複製が遅い細胞を形質導入できることである(ゲラー＆フェデロフ(Geller & Federoff)、19 91)。HSVのこの物理的特性は臨床上の重要な長所となる。単離した新鮮な腫瘍細胞は、細胞複製に至る組織培養環境を提供する必要なく、形質導入してもよい。この長所は、現在の実験において、採取した新鮮なヒト腫瘍が迅速に形質導入されることから明らかに証明される。20分以内に、有効な遺伝子移入が行われ、このことは、この方法によって調製したワクチンが、１回の操作技法によって患者に投与する準備ができることを示唆している。そのHSV-媒介遺伝子移入は細胞分裂とは無関係で、このことは、導入効率が腫瘍細胞に対する前回の放射線照射によって低下しないことから支持される。このように、腫瘍細胞への遺伝子移入は、放射線照射源の利用度に応じて放射線照射の前後いずれに行ってもよく、臨床での患者のケアに、より柔軟に利用できる。 HSV-免疫調節タンパク質アンプリコンおよびそのようなアンプリコンで形質導入した細胞は、インビボでの腫瘍増殖から保護する特異的抗腫瘍免疫を与えることができる。アンプリコンは、形質導入した細胞を生体または患者（ヒトを含む哺乳類）に投与することによって間接的に導入してもよい。またはHSV-免疫調節アンプリコンは、腫瘍の大きさが減少するような抗腫瘍免疫を産生するために、生体または患者の腫瘍組織に直接導入してもよい(例えば腫瘍周囲注射)。後者のアプローチは例えば、手術不可能な腫瘍の場合には有用である。本発明に従って、HSV-免疫調節タンパク質アンプリコンは、治療および／または予防的利益を提供するために、個々の種として直接または間接的に投与してもよい。例えば、本明細書に記述の例に記述のように、IL2、GM-CSFおよびランテスのようなサイトカイン、ICAM-1のような細胞間接着分子およびB7.1のような共刺激因子をコードするHSV-免疫調節タンパク質アンプリコンの投与は全て、既存の腫瘍の大きさの減少、後のチャレンジ後の腫瘍増殖から保護するワクチン効果、またはその双方の形で治療効果を提供する。 HSV-免疫調節タンパク質アンプリコンはまた、他の種のHSV-免疫調節物質による形質導入細胞と共に、またはサイトカイン療法と組み合わせて、直接または間接的に投与してもよい。そのような投与は同時であっても、または連続的に行ってもよい。このように、発明の一つの態様において、HSVアンプリコン、または免疫調節タンパク質をコードするHSVアンプリコンで形質転換した細胞を、サイトカインの治療的有効量で前処置した後に生体または患者に注射する。HSVil2およびHSVgm-csfはいずれも、γ-IFNを前処置した後に投与すると、効率を増加させることが示されている。発明のもう一つの態様において、HSVアンプリコン、または異なる多数の免疫調節タンパク質をコードするHSVアンプリコンを形質導入した細胞の集団を被験者に共に投与してもよい。例えば、HSVil2およびHSVil12で形質導入した腫瘍細胞の集団を同時に投与してもよい。例に示すように、そのような同時投与は個々の集団の投与よりいくぶん有効である。しかし、これらの２つのサイトカインを発現する細胞の同時投与は、異なる２つのサイトカインをコードするアンプリコンを形質導入した細胞の単一の集団を用いる場合には、最も有効であるように思われる。複数のHSV-免疫調節タンパク質アンプリコンを同時投与する利益に関するもう一つの例は、ケモカインであるランテスおよび共刺激因子B7.1の場合に認められる。HSVB7.1またはHSVrantesのいずれかを腫瘍周囲に投与すると、有意な数の試験被験者に腫瘍の拒絶が起こるが、これらの２つの免疫調節タンパク質をコードするHSVアンプリコンを組み合わせると、腫瘍を拒絶する動物数が増加する。２つ以上の免疫調節タンパク質を発現する細胞集団は、個別のアンプリコン種、すなわち免疫調節タンパク質をコードするアンプリコン、または複数の免疫調節タンパク質をコードする単一のアンプリコン種、のいずれかによって行うことができる。多数の免疫調節タンパク質を産生するよう細胞を形質導入するために、個別のアンプリコン種を使用することができることは、遺伝子材料の標的細胞への導入にレトロウイルスベクターを使用していた従来の方法より主な長所となる。これらの従来の方法では、導入効率は非常に低く、２つ以上の異なるウイルスベクターを用いても、適度の割合の細胞に多数の遺伝子を形質導入できなかった。したがって、このタイプの療法は、多標的遺伝子療法のそれぞれの異なる形に対して、多数の遺伝子を含む独自の複雑な構築物の調製を必要とする。しかし、本発明の方法を用いれば、各標的遺伝子をそれ自身のアンプリコンの中に構築することができ、多形質導入細胞を、望ましいアンプリコン種の単なる混合組合せによって生成することができる。より広い意味において、発明は、免疫調節タンパク質および治療遺伝子産物を細胞に一過性に発現させるために、免疫調節タンパク質に対する遺伝子および少なくとも１つのさらなる治療遺伝子を含む、１種以上の単純ヘルペスウイルス・アンプリコンを腫瘍細胞に形質導入することを含む、腫瘍細胞に対する自家ワクチンの産生法を提供する。本出願の特殊な例に示されているように、さらなる遺伝子は第二の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。しかし、治療遺伝子産物は免疫調節タンパク質に限定されず、自家腫瘍ワクチン細胞によって発現されることが望ましいいかなるタンパク質またはペプチドを含んでもよい。このように、例えば、遺伝子は、プロドラッグ変換に用いられる酵素(例えば、チミジン・キナーゼ)、またはアポトーシスを促進するタンパク質（BAXまたはBCLXs）をコードしてもよい。発明はまた、細胞に免疫調節タンパク質を一過性に発現させるために、少なくとも１つの免疫調節タンパク質に対する遺伝子を含む単純ヘルペスウイルスアンプリコンを腫瘍細胞に形質導入する工程を含む、患者（動物またはヒト）の腫瘍細胞に対する保護的免疫応答を誘導する方法も提供する。腫瘍細胞は、エクスビボでアンプリコンを形質導入してもよく、この場合、方法は形質導入した腫瘍細胞を患者に導入する工程をさらに含む。腫瘍細胞はまた、HSVアンプリコンを腫瘍細胞の部位に注射することによってインビボで形質導入してもよい。発明はまた、１つ以上の免疫調節タンパク質に対する遺伝子を含むHSVアンプリコン、およびそのようなアンプリコンで形質導入した細胞を提供する。さて、発明は、以下に述べる特定の例を参考にしてさらに記述する。しかし、これらは単に例として提供するに過ぎず、発明の範囲を制限すると解釈してはならないと理解すべきである。このように、特に言及していない他の免疫調節タンパク質、および３つ以上の免疫調節タンパク質の組合せを含む他の免疫調節タンパク質の組合せを用いてもよく、これらは本出願の請求の範囲に定義されるように本発明の範囲内であると考えられる。例１ヘルペスウイルス・ベクター：構築およびパッケージング：ヒトIL-2を発現する複製欠損HSVアンプリコン・ベクターは、Sac IおよびEco RIによってr-IL-2（サイトウら(Saito)、1994）から切除した遺伝子を、同じ酵素で消化したHSV PrP UC（ベルゴルドら(Bergold)、1993）に指向的にクローニングすることによって構築した。β-ガラクトシダーゼを発現するHSVベクター（HSVlac ）については、既に記述されている(ゲラー＆ブレークフィールド(Geller & Bre akefield)、1988)。両アンプリコン・ベクターを、既に記述のとおりにパッケージングした(フェデロフ(Federoff)、1996；ゲラー＆ブレークフィールド(Geller & Breakefield)、1988)。HSVPrPUCは、HSV即時型初期4/5プロモーター、多クローニング部位、およびSV40 A配列を含み、これは既に記述されている(パターソン＆エベレット(Paterson & Everett)、1990；ジョンソンら(Johnson)、1992；ユら(Xu)、1994；リニックら(Llnnik)、1995；ベルゴルド(Bergold)、1993)。HS Vアンプリコンのパッケージングに用いるRR1細胞は、高グルコース(HG、4.5g/L) 、10％FCS、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび400μg/ml生物活性ゲネチシン（G418、ギブコ社）を含むダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）中で、 37℃、５％CO₂下で維持した。RR1細胞はHSV IE3遺伝子を安定にトランスフェクトしたBHK細胞であり、ポール・ジョンソン（Paul Johnson）博士から入手した( ジョンソンら(Johnson)、1992)。D30 EBAヘルパーウイルスは、RR1細胞上での増殖によって調製した。D30EBAは、コドン83〜1236を欠失した株17由来IE3変異体で、ロジャー・エベレット（Roger Everett）博士から入手した(パターソン＆エベレット(Paterson & Everett)、1990)。アンプリコン・ベクターをパッケージングするために、10％FCSを含む培地中で３×10⁶個のRR1細胞を播種して、４時間後にリポフェクチン（ギブコ-BRL社）40μlを加えてトランスフェクトさせ、５分待ってからアンプリコンDNA溶液を滴下して加えた(30μg、DMEM中で１μg/ μl)。６時間後、プレートに５％FCSを含む培地を加えた。トランスフェクションの約20時間後、感染多重度（MOI）が0.2となるようにD30EBAウイルス50〜100 μlを加えた。１時間後、５％FCSを含む完全な培地５mlを各プレートに加えた。アンプリコン・ウイルス・ストックを２日後に回収した。-70℃で一晩保存した後、新鮮なRR1細胞（４×10⁶個／60mmプレート）を、超音波処理して加温した（ 34℃）ウイルスストックに感染させた。２日後、ストックを回収して次に使用するまで保存した。HSVlacウイルスストックの力価を発現アッセイによって調べた。簡単に述べると、NIH 3T3細胞（２×10⁵個/ ウェル、24ウェルプレート）を播種して、１試料あたり２本ずつ、HSVアンプリコン・ウイルス・ストックの漸増量に感染させる。感染の24時間後、細胞を固定して、定法（ゲラー＆ブレークフィールド(Geller & Breakeneld)、1988）を用いて、発色基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβD-ガラクトシダーゼ（X-gal ）で染色した。X-gal陽性（青色）細胞数を計数した。力価は青色形成単位/mlの数として表記する。各ストック中のD30 EBAヘルパーウイルスの力価は、RR1細胞上のプラークアッセイによって測定した。HSVil2は、先に記述したようにスロット・ブロット・アッセイによって力価を測定した(ゲッシュウィンドら(Geschwin d)、1994)。スロット・ブロット分析については、パッケージングしたウイルスから、フェノール／クロロホルムによってウイルスDNAを２回抽出し、担体として１本鎖ウシ胸腺DNAと共にエタノール沈殿させ、室温で0.2N NaOH、0.5M NaCl によって10分変性させて、スロット・ブロット装置のナイロン・メンブレン上に載せた。メンブレンを次に65℃で２時間乾燥させ、pBR322からのβラクタマーゼ遺伝子の一部（ヌクレオチド3733〜4168）を含む[³²P]標識435bp SspIおよびPvu I断片をプローブとして調べた。ストリンジェントな洗浄（0.1×SSC、15分を２回）後、ブロットをX線フィルムに露光して、様々な時間の暴露を行って、密度測定計でスキャンした(LKBウルトロスキャン)。HSVlacとHSVil2のバンドの密度を比較して、この後者のアンプリコンの力価を発現アッセイ（NIH 3T3細胞上での青色形成単位）によって調べたと仮定して、HSVil2の力価をHSVlacと比較した密度から計算した。HSVil2の力価は粒子/mlとして表記する。アンプリコン・ストックの力価：HSVlac力価は、NIH 3T3細胞上での発現およびX-gal組織化学によって力価を測定したところ、２×10⁶青色形成単位/mlの間であった。スロット・ブロット（上記）によって測定したHSVil2力価は、0.8〜２×10⁶粒子lmlの範囲であった。ストック中のD30EBA力価は、５×10⁶〜６×10⁷ プラーク形成単位/mlの範囲であった。野生型復帰変異体の組換えはVero細胞上でのプラークアッセイによってモニターし、その発生率は１×10^-6であった。例２マウス肝癌細胞を、例１で調製したアンプリコンを用いてエクスビボで形質導入した。マウスHEPA1-6肝癌細胞（ATCC、ロックビル、メリーランド州）をDMEM ＋HG＋10％FCS中で維持した。これは、非免疫原性肝癌細胞株である(エングバルら(Engvall)、1977)。全てのウイルス発現試験について、２または10×10⁵個/ml のいずれかで細胞を播種した。実験によっては、細胞を播種した２時間後に放射線照射して、HSVアンプリコン・ストックで感染させた。別の実験では、HSVアンプリコン・ストックで感染させた１時間後に細胞を放射線照射した。肝癌細胞は、６mVバリアンCL6.100線型加速器を用いて100rads/分の線量速度で室温で放射線照射した。HSVアンプリコン遺伝子移入の迅速性を評価するために、肝癌細胞にベクター・ストックを20分または60分間のいずれかを暴露して、十分に洗浄して培養した。さらに48時間後、細胞をX-gal（HSVlac）で組織化学染色するか、または培地をIL-2（HSVil2）に関してアッセイした。実験によっては、0.15M Na Cl、50mMトリス、１％NP-40、４mM NaF、pH=８を含む溶液に懸濁することによって、腫瘍細胞溶解液を調製し、IL-2についてアッセイした。さらに、代表的な試料を処置の48時間後に回収し、生存腫瘍細胞を計数した。本発明の遺伝子移入の効率に及ぼすこれらの実験結果を図1AおよびBに要約した。図に示すように、HSVlacおよびHSV-IL-2アンプリコン・ストックは、MOIが１以上で最大移入効率を示した。HSVlac感染培養では(図1A)、肝癌細胞の50％以上がリポーター遺伝子であるβ-ガラクトシダーゼを発現した。MOI 0.5で感染させると、βガラクトシダーゼを発現した細胞はより少なかった(30％)。HSVil2感染培養（図1B、MOI 1.0）は、24時間に1,200±160ng/10⁶個を分泌した。ELISAによって検出した免疫反応性IL-2は、CMLアッセイによって生物活性であることを確認した。免疫反応性IL-2のそれぞれ50pgは、生物活性の約１単位と同等であった。遺伝子移入の程度は、ウイルス暴露が20分間であっても60分間であっても同等で、このことは実質的に全ての感染性HSVビリオンが20分以内に細胞に吸着したことを示している。さらに、発現は調べた両MOIについても20分と60分の暴露期間で同等であったため、迅速な遺伝子移入はMOIの関数ではなかった(0.5および1.0、図1CおよびD)。 HSVil-2感染肝癌細胞からのIL-2分泌速度は認識可能で、これまでに免疫調節性であると証明された範囲内であったが、さらなるIL-2が細胞内分画に残っている可能性があった。この問題に取り組むために、感染した細胞溶解液についてIL -2測定を行い、これらの細胞によって慣らされた培地に認められたレベルと比較した(図1E)。24時間で分泌されたIL-2の量は細胞含有量の約10倍で(培地：1400 ±100ng/10⁶個124時間、溶解物：100±9ng/10⁶個/24時間)、これはマウス肝癌細胞がサイトカインを効率よく分泌することを示唆している。腫瘍細胞の放射線処置は、分裂しない腫瘍ワクチン産生の重要な部分として見なされているため、HSV感染に対する細胞の放射線照射のタイミングが遺伝子移入の効率に及ぼす影響を調べた。図2Aおよび2Bに示すように、HSV感染の前（破線）または直後（実線）の放射線照射は、同様の遺伝子移入効率を生じた。放射線照射の前に感染させた細胞では遺伝子移入および発現レベルが高い傾向を認めたが、この差は有意ではなかった。放射線照射の前に感染させた細胞で遺伝子移入が高率であるこの傾向は、細胞生存率の差ではなかった(表２)。特に興味深いことは、異なる線量を照射した細胞は、放射線を照射していない細胞と同等レベルのIL-2を分泌した(図2C)。その上、放射線照射は細胞の複製機能に影響を及ぼすが、分泌されたIL-2の生物発生に影響を及ぼさないように思われる。例３例１に従って産生したインターロイキン-2遺伝子を含むアンプリコンを用いて、ヒト腫瘍細胞をインビトロで形質導入した。この試験は、スローン・ケタリング記念癌センターの院内審査委員会の承認を受け、そのガイドラインに従って実施した。肝胆管悪性腫瘍のために肝切除を受ける患者４人から約５gの腫瘍生検を得た。患者の特徴を表１に記載する。全ての標本は、何らかの血管離断またはプリングル操作を行う前に摘出した。全ての症例について、腫瘍の組織学的確認を行った。腫瘍標本を研究室に輸送するために冷（４℃）RPMI-1640に直ちに入れた。各標本を細切して、0.125％トリプシン／0.125％EDTAのCa⁺⁺またはMg⁺⁺を含まないPBS溶液で５分間処置した。次に処置した腫瘍を裂いて滅菌した85μmナイロンメッシュを通じて、10％ヒト血清を含むRPMI-1640培地（４℃ ）に濾過した。新しく単離した細胞懸濁液を、６mVバリアンCL6-100線型加速器を用いて線量速度100rads/分、10,000radsで室温で放射線照射した。腫瘍細胞のアリコット10⁶個をHSVアンプリコン・ストックで20分間感染させた。放射線非照射細胞のアリコットを同様に処置して、対照とした。ウイルスに暴露した後、腫瘍細胞を２回洗浄して、37℃、５％CO₂で培養した。形質導入の48時間後、各ウェルから培地を回収して、IL-2の有無をアッセイした。 IL-2はHSVil2感染の前ではこれらの腫瘍細胞のいずれからも産生されなかったが(表１)、HSVil1に感染させると、４個全ての腫瘍細胞からIL-2が産生された。さらに、マウス肝癌細胞株の場合と同様に、遺伝子発現の効率は10,000radによる放射線照射によって影響を受けなかった。最後に、照射時間を含む全技法に要する時間は４時間未満で、術中の自家ワクチン産生に匹敵する時間であり、これによって同じ手術技法の間に、暴露した腫瘍部位への再移植がおそらく可能となる。例４ HSVil-2を形質導入した腫瘍細胞からの培地および細胞溶解物を48時間目に回収し、アッセイするまで-70℃で直ちに凍結した。免疫反応性IL-2レベルは標準的なサンドイッチELISAによって決定した(バイオソース・インターナショナル社、カマリオ、カリフォルニア州)。細胞培養の48時間で産生された総IL-2を２つに分けて、24時間あたりの産生量が平均となるようにした。上清または細胞溶解物中のインターロイキン-2の生物活性もまた、標準的な細胞媒介リンパ球溶解（ CML）アッセイ（ジール(Zier)、1982）においてCTLL-2細胞の増殖誘発能を評価することによって決定した。簡単に説明すると、５×10⁵個のCTLL-2細胞を試験試料の連続希釈液と混合し、37℃、５％CO₂で培養した。24時間後、細胞生存率をMTT(臭化3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2.5-ジフェニルテトラゾリウム；５mg/ml)取り込みによって測定した。組換え型ヒトIL-2（カイロン・コーポレーション、エメリービル、カリフォルニア州）を内部標準として用いる。単位はシータス（Cetus）単位で表示する。例５導入効率を評価するために、HSVlacを形質導入した腫瘍細胞上で組織化学分析を行った。細胞を48時間目に固定し、X-galで組織化学染色した(ダネンバーグ＆スガ(Dannenberg & Suga)、1981)。簡単に説明すると、形質導入細胞を含むプレートを１％グルタルアルデヒドで５分間固定して、PBSで３回洗浄し、次にX-gal 溶液(２mM MgCl₂、５mM K₃Fe(CN)₆および５mM K₄Fe(CN)₆・3H₂Oを含むPBSに溶解したX-gal(pH＝7.4)[1mg/ml])と共にインキュベートした。総細胞および青色細胞を計数して、導入効率を青色細胞の総細胞数の割合として表記した。例６ HSV媒介遺伝子移入を用いて産生された腫瘍ワクチンのインビボ効果を調べるために、10,000radを照射して、感染多重度（MOI）１でHSVil2に20分間暴露したマウスHEPA 1-6肝癌細胞を用いて同系C57BL/6jマウスを免役した。20分間のウイルス暴露後、肝癌細胞（10⁶個）を培地で３回洗浄し、1)皮下、2)腹腔内、または3)脾臓内に直ちに注射した。動物に１回注射または３日間連続して毎日注射（全３回）のいずれかを行った。対照として、動物に1)培地(培地対照)、または2) HSV-lacに暴露した（MOI=１）同程度の数の放射線照射腫瘍細胞、すなわちサイトカイン遺伝子を有していないHSV（HSV対照）を注射した。３週間後に動物を屠殺して、脾細胞を回収し、特異的殺腫瘍活性を評価するために肝癌と共に、NK活性を評価する場合にはK562赤芽球細胞株と共に、または非特異的殺腫瘍活性をさらに評価するためには同系結腸直腸腫瘍細胞株CO51（ATCC；ロックビル、メリーランド州）と共にインキュベートすることによって特異的および非特異的殺腫瘍細胞作用を評価した。 HSV-改変腫瘍ワクチンによるワクチン接種がインビボでの腫瘍に対する反応を変化させるか否かを調べるために、1)サイトカイン遺伝子を有しないHSV（HSV- 対照）に暴露した放射線照射した腫瘍細胞10⁶個、または2)放射線照射したIL-2分泌肝癌細胞10⁶個を脾臓内注射することによって、C57Bl/6jマウスを免役した。３週間後、腫瘍に対する宿主の応答を調べるために、複製する肝癌細胞10⁶個を動物の門脈内に注射した。この腫瘍チャレンジの３週間後、動物を全て屠殺して、肝臓における腫瘍の増殖を評価した。脾細胞の単離は以下のように行った。ペントバルビタールで麻酔した動物から滅菌状態で脾臓を摘出した。PBS 10mlを含むペトリ皿に各脾臓を入れて、フード内で10％FCS＋50μg/mlゲンタマイシンを含むRPMI 10mlを加えた新しいペトリ皿に移した。培地を繰り返し注入して脾臓から脾細胞を洗い出した。細胞を遠心して(300g、５分)、赤血球溶解溶液（pH=7.4）(0.15M NH₄Cl、1.0mM KHCO₃、0.1mM Na₂EDTA)５ml中に再懸濁した。１分後、溶液を10％FCSを含むRPMI５mlで希釈した。細胞を遠心して(300g、10分)、培地で２回洗浄した。次に細胞を10％FCS＋5 0μg/mlゲンタマイシン＋30U./ml IL-2（カイロン・コーポレーション、エメリービル、カリフォルニア州）を含むRPMI 30mLに再懸濁して、使用するまで２日間培養した。アッセイの前に細胞を遠心して、再懸濁して、計数し、適当な濃度に容量を調節した。皮下経路または腹腔内経路によって、注射の経路および注射回数が免疫に及ぼす影響を調べる上記で要約した実験から、特異的腫瘍免疫を得るためには３回の注射が必要であることが示された。しかし、脾臓内経路に関しては、調べた肝癌細胞株は、１回の注射によって特異的免疫を誘導した(図3A〜C、図3Aは、HEPA1 〜６標的に関するデータを表し；図3BはK562標的および図3Cは、CO51標的に関するデータを表す)。これが、インビボ腫瘍の増殖に及ぼす免疫の影響を調べるその後の実験に脾臓内経路を用いた理由である。次に、1)放射線照射したHSV-処置腫瘍(HSV対照)、または2)放射線照射したHSV il2処置腫瘍のいずれかの脾臓内注射によって前処置したマウスに、複製する腫瘍細胞10⁶個を門脈内注射によってチャレンジし、腫瘍増殖に及ぼす免疫の影響を調べた。HSV-媒介遺伝子移入によって産生した放射線照射したIL-2分泌腫瘍細胞を用いた免疫によって、インビボで抗腫瘍効果が得られた。HSV対照で処置した動物では、肝癌細胞10⁶個をチャレンジした動物10匹中７匹が肝臓腫瘍を発症し、腫瘍の大きさの平均値は1.5±0.4g（体重の６±２％）であった。しかし、HSVil2で前処置した動物に関しては、腫瘍を発症した動物は10匹中１匹に過ぎず(HSV対照と比較してP＝0.02)、腫瘍の大きさも0.2g（体重の0.9％）であった。例７ K562または腫瘍細胞を、インビトロ・ユーロピウム放出細胞障害性アッセイにおいて標的として用いた。培養した５×10⁶個を緩衝液１（pH=7.4）(50mM Hepes 、93mM NaCl、５mM KCl、２mM MgCl₂)で２回洗浄して、氷浴中で標識溶液（K562 ：EuCl₃ 30mL、DTPA 10mL、硫酸デキストラン250mLの緩衝液１溶液；Hep：EuCl₃ 35mL、DTPA 10mL、硫酸デキストラン100mLの緩衝液１溶液）においてインキュベートし、５分毎に緩く攪拌した。15分後、100mM CaCl₂20mLを加えて、混合物を５分インキュベートした。修復用緩衝液９mL（緩衝液１、２mM CaCl₂、10mMグルコース）を加えた。細胞を遠心して（200g、10分）修復用緩衝液で４回洗浄して、培地で３回洗浄した。次に細胞を再懸濁して、エフェクター対標的比100:１、50:１、25:１、および12.5：１でエフェクター細胞を含む、96ウェルU底プレート（コスター・コーポレーション、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のウェルにおいてウェルあたり５×10⁴個/100mLの濃度で播種した。プレートを遠心して(10g、５分)、インキュベートし(４〜６時間、37℃)、そして遠心した(100g 、５分)。上清20μlを、デルフィア増強用溶液（ワラック・オイ社、トゥルク、フィンランド）180μlを既に含む96ウェル平底プレート（コスター・コーポレーション）に移した。プレートを1232デルフィア蛍光光度計（ワラック・オイ社）で読みとった。最大放出は細胞を１％トライトンXで溶解することによって測定した。特異的溶解百分率は、（実験放出−自然放出）／（最大放出＋自然放出） ×100に等しかった。自然放出は最大値の５〜15％の間で変化した。例８ IL-2（HSVil2）またはLacZ（HSVlac）のいずれかに対する遺伝子を含むHSVベクターを例１に従って構築した。両脇腹に肺扁平細胞腫瘍を有するフィッシャー系ラット25匹を、移植後５、７および９週目に、HSVil2、HSVlac、生理食塩液の左脇腹の注射、または注射を行わない群に無作為割付した。腫瘍の体積を週に３回、６週間測定した。HSVlac、生理食塩液、および非注射群では、腫瘍の増殖および体積に有意差を認めなかった。６週目では、HSVil2群では、注射した左脇腹の腫瘍体積が対照と比較して81％減少した。反対側の注射していない脇腹の平均腫瘍容積も88％減少し、このことは、サイトカイン遺伝子を含むHSVベクターによる腫瘍のインビボト・ランスフェクションが、全身性の抗腫瘍反応を刺激するために有効であることを示している。HSVil2-処置動物５匹中４匹が臨床反応動物であった。LacZに関する染色試験から、腫瘍のトランスフェクションおよび周辺の間質細胞が治療側に限って存在することが判明した。例９既にゲラーら（Geller、1990）が記述したように、マウスGM-CSF、ヒトIL-2およびLacZ遺伝子を、HSV即時型初期4/5プロモーター、多クローニング部位、およびSV40 A配列を含むHSVprPUCに指向的にクローニングし、パッケージングした。 RR1細胞（HSV IE3細胞で安定にトランスフェクトしたBHK細胞）(20)を、D30 EBA ヘルパーウイルス（コドン83〜1236を欠失する株17由来IE3変異体で、高グルコース[HG、4.5g/L]、10％FCS、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および400 μg/ml生物活性ケネチシン[G418；ギブコBRL社、ガイサースバーグ、メリーランド州]を含むダルベッコ改変イーグル培地（DME）中で、37℃、５％CO₂で維持したもの）と共に、HSVアンプリコンのパッケージングに用いた。アンプリコン・ベクターをパッケージングするために、10％FCSを含む培地に３×10⁶個RRI細胞を播種して、リポフェクチン（ギブコ社）40μlを加えて４時間後にトランスフェクトさせ、５分待ってからアンプリコンDNA溶液（30μg、DME中で１μg/μl）を滴下して加えた。６時間後、プレートに５％FCSを含む培地を加えた。トランスフェクションの20時間後、D30 EBAウイルスの50〜100μlを、MOIが0.2となるように各プレートに加えた。１時間後に５％FCSを含む完全な培地５mlを各プレートに加えて、アンプリコン・ウイルス・ストックを２日後に回収した。70℃で一晩保存した後、新鮮なRR1細胞（４×10⁶個/60mmプレート）を、加温（34℃）して超音波処理したウイルスストックに感染させた。２日後、ストックを回収して使用するまで保存した。HSVlacストックの力価は、播種して(24ウェルプレートで２×10⁵個／ウェル)、漸増量のウイルス・ストックに感染させたNIH 3T3細胞を用いた発現アッセイによって測定した。感染の24時間後、細胞を固定して、定法を用いて5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-D-ガラクトシド（X-gal）で染色した。X-gal陽性（青色）細胞を計数して、青色形成単位／mlの数として力価を表記した。各ストック中のD30 EBAヘルパーウイルスの力価を、RR1細胞上でのプラークアッセイによって測定し、サイトカイン含有ベクターの力価をスロット・ブロット分析によって測定した。スロット・ブロット分析に関しては、ウイルスDNAをパッケージングしたウイルスからフェノール／クロロホルムによって２回抽出し、１本鎖ウシ胸腺DNAを担体としてエタノール沈殿させ、室温で0.2N NaOH、0.5M NaClによって10分変性させ、スロット・ブロット装置のナイロンメンブレンに載せた。メンブレンを65℃で２時間乾燥させ、pBR322からのβラクタマーゼ遺伝子の一部(ヌクレオチド3733〜4168)を含む[³²P]標識435bp SspIおよびPvuI断片をプローブとして調べた。ストリンジェントな洗浄（0.1×SSCで15分を２回）の後、ブロットをX線フィルムに露光して、様々な露光時間の後、密度測定法によってスキャンした(LKBウルトロスキャン；ファルマシアLKBバイオテクノロジー・インク、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州)。この後者のアンプリコンを発現アッセイによって力価を測定すると仮定して、HSVlacと比較した密度から計算したHSVi l2およびHSV GM-CSFのバンドの密度および力価（粒子/mlとして表記）を比較した。HSVlac力価は、NIH 3T3細胞上での発現およびX-gal生化学によって測定すると、1〜2×10⁶の青色形成単位/mlであった。HSVil2およびHSV GM-CSFの力価は１〜２×10⁶粒子/mlの範囲であった。D30 EBAヘルパーウイルス対アンプリコンの比は、アンプリコンに対して２：１〜５：１MOIであった。野生型復帰変異体の組換えを、Vero細胞上でのプラークアッセイによってモニターしたところ、その発生率は１×10⁶であった。サイトカインのインビトロ産生を評価するために、肝癌細胞10⁶個／２mlを６ウェルプレート（コスター社）に播種して、10,000radを照射し、１時間放置した。次に細胞をHSV-IL12、HSV GM-CSF、HSVlac、または培地にMOI１および２で20分暴露して、培地で２回洗浄した。細胞培養上清を暴露の１、２、４および７日目に回収して、サイトカインの量をELISA（IL-2、R&Dシステムズ、ミネアポリス社、ミネソタ州；GM-CSF、ゲンザイム・コーポレーション、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）によって測定した。図４に示すように、サイトカイン遺伝子含有ベクターに暴露していない対照細胞はサイトカインを産生せず、しかもサイトカインはGSVil2およびGSV gm-csfでの形質導入および洗浄の直後では認めないことから、タンパク質が腫瘍細胞と共に注射されたのではないことを示している。HSVil2またはHSVgm-csfに暴露した細胞は、ワクチン接種後、これらのサイトカインを10⁶個あたりナノグラム量を産生し、これは１日目をピークとしてその後減少した。例10 培養肝癌細胞に10,000radを照射して、１時間放置した後にHSVil2、HSV GM-CS F、HSVlacまたは培地にMOI１で20分暴露した。次に細胞を培地で２回洗浄し、10⁶ 個/200μlを脾臓内に注射した。さらなる対照群に、培地単独の注射を行った。 18日目、各群の半数の動物に５×10⁴Uのγ-IFN、または生理食塩液のいずれかを３日間腹腔内投与した。21日目に全ての動物に肝癌細胞５×10⁵個／200μlの脾臓内チャレンジを行った後、肝癌細胞が肝臓に移行するために十分な時間経過した10分後に脾臓を摘出した。動物を20日後に屠殺し、腫瘍結節を計数した。別の動物にワクチン接種して、ワクチン後２日目および18日目に屠殺して、心臓、肺、肝臓、腎臓および血清を採取し、ELISAによってインビボ・サイトカイン産生を評価した。培地単独でワクチン接種した場合と比較して、放射線照射細胞によるワクチン接種、またはHSVlacで形質導入した放射線照射細胞によるワクチン接種により、腫瘍の増殖に有意な影響を認めなかった。図５に示すように、IL-2またはGM-CSF 分泌細胞で免役した動物、またはγ-IFNを前処置した動物は３つの全ての対照群より腫瘍の結節が少なかった。IL-2またはGM-CSF分泌細胞による治療とγ-IFNによる前処置を組み合わせると、単独の治療の場合より有効であった。完全な反応はIL-2動物11例中８例に認め、GM-CSF動物では12例中４例に認めた。 γ-IFN単独で処置した動物には全て腫瘍を認めた。例11 部分肝切除（免疫抑制的で、肝腫瘍の増殖を促進することが知られている）後の腫瘍増殖に及ぼすワクチン接種の影響を評価するために、上記のように産生した肝癌のワクチン（HSVil2、HSV GM-CSF、HSClac）の脾臓内投与によって動物を免役した。18日目に、各群の半数の動物にIFN ５×104 Uまたは生理食塩液のいずれかを３日間腹腔内投与した。21日目に全ての動物に肝癌細胞５×10⁵個/200 μlを脾臓内にチャレンジして10分後に脾臓を切除した。各群半数の動物に、腫瘍注射の１時間後に70％部分肝切除を行った。対照群１群にはワクチン接種を行わず、部分肝切除も行わなかった。腫瘍チャレンジの18日後に動物を屠殺して、結節を計数した。先の実験において、表面結節の数は、水置換によって測定すると腫瘍の体積と正比例することが示された。図６に示すように、IL-2またはGM.CSF分泌細胞株による処置、またはγ-IFNによる前処置は、肝癌誘発腫瘍の増殖を抑制した。肝切除を行わない動物の結果と比較可能な最善の結果は、IL-2またはGM-CS分泌細胞株のいずれかをγ-IFNによる前処置と組み合わせて用いた場合に得られた。例12 脾細胞およびクッパー細胞（KC）の機能に及ぼすワクチン接種およびIFNの影響を評価するために、動物にワクチン接種を行い、例11に記述のようにIFN処置を行い、脾細胞およびKCをワクチン接種後21日目に回収した。殺腫瘍活性は、インビトロ・アッセイにおいてエフェクターをユーロピウム標識腫瘍細胞と混合することによって評価した。標識した細胞を、様々なエフェクター対標的比でエフェクター細胞を含む96ウェルU底プレート（コスター社）ウェルあたり５×10⁴個 /100μlの濃度で播種した。プレートを遠心して(200rpm、５分)、インキュベートして(４時間、37℃)、再度遠心した(500rpm、５分)。上清20 μlを、既にデルフィア増強用溶液（ワラック・オイ社、トゥルク、フィンランド）180μg/ウェルを含む96ウェル平底プレート（コスター社）に移した。プレートを1232デルフィア蛍光光度計（ワラック・オイ社）で読みとった。最大溶解は細胞を１％トライトンXで溶解することによって測定した。特異的溶解百分率は実験放出−自然放出／最大放出＋自然放出×100に等しい。自然放出は最大放出の５〜15％であった。実験は試料１本あたり３本ずつ行った。 HSVlacまたは照射細胞によるワクチン接種は、KC機能または脾細胞活性のいずれにも有意な影響を及ぼさなかった。HSVil2またはHSVgm-csfでワクチン接種した動物の脾細胞は、対照またはγ-IFN処置動物の脾細胞より有意に大きい標的の殺作用を示した。γ-IFNは脾細胞活性に影響を及ぼさないように思われた。γ-I FNで前処置したラットのKCは、対照のKCより有意に大きい標的の殺作用を示した。HSVil2でワクチン接種したラットのKCもまた、対照のKCより有意に大きい標的の殺作用を示したが、γ-IFN処置ラットのKCほど大きくなかった。GM-CSFを分泌するワクチンはKC活性に影響を及ぼさないように思われた。例13 マウスIL12 m35、マウスIL12m40、ヒトIL2およびLacZ遺伝子を、これまでに記述の通りにHSV/PRPucに指向的にクローニングして、パッケージングした(ゲラーら（Geller）1990、ゲラー＆ブレークフィールド（Geller and Breakefield）(1 988)、フェデロフ（Federoff）(1966))。HSVm75、m35およびm40を産生するために、遺伝子を適当な制限酵素を用いて、IRES断片によって分離したHSV/PRPucに指向的にクローニングした。HSVPrPUCは、HSV即時型初期4/5プロモーター、多クローニング部位、およびSV40 A配列を含む。HSVアンプリコンのパッケージングに用いたRR1細胞は、高グルコース(HG、4.5g/L)、10％FCS、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび400μg/ml生物活性ゲネチシン（G418，ギブコ社）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で37℃、５％CO₂で維持した。RR1細胞はHSV IE3遺伝子で安定にトランスフェクトしたBHK細胞で、ポール・ジョンソン（Paul Johnson）博士から入手した。ジョンソンら(Johnson、1992)。D30 EBAヘルパーウイルスは RR１細胞上での増殖によって調製した。D30EBAは、コドン83〜1236を欠失した株 17に由来するIE3変異体で、ロジャー・エベレット（Roger Everett）博士から入手した(パターソン＆エベレット(Paterson & Everett)、1990)。アンプリコン・ベクターをパッケージングするために、10％FCSを含む培地中でRR1細胞３×10⁶ 個を播種して、４時間後にリポフェクチン（ギブコ-BRL社）40μlを加えてトランスフェクトさせ、５分待ってから、次にアンプリコンDNA溶液を滴下して加えた(30μg、DMEM中で１μg/μl)。６時間後、プレートに５％FCSを含む培地を加えた。トランスフェクションの約20時間後、感染多重度（MOI）が0.2となるようにD30 EBAウイルス50〜100μlを加えた。１時間後、５％FCSを含む完全な培地５ mlを各プレートに加えた。アンプリコン・ウイルス・ストックを２日後に回収した。-70℃で一晩保存した後、新鮮なRR1細胞（４×10⁶個／60mmプレート）を、超音波処理して加温（34℃）したウイルス・ストックに感染させた。２日後、ストックを回収して次に使用するまで保存した。HSVlacウイルス・ストックの力価は発現アッセイによって調べた。簡単に述べると、NIH 3T3細胞（２×10⁵個/ウェル、24ウェルプレート）を播種して、１試料あたり２本ずつ、HSVアンプリコン・ウイルス・ストックの漸増量に感染させた。感染の24時間後、細胞を固定して、定法（ゲラー＆ブレークフィールド(Geller & Breakefield）、1990)を用いて、発色基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβD-ガラクトシダーゼ（X-gal）で染色した。X-gal陽性（青色）細胞数を計数した。力価は青色形成単位/mlの数として表記する。各ストック中のD30 EBAヘルパーウイルスの力価は、RR1細胞上のプラーク・アッセイによって測定し、HSVil2は先に記述したようにスロット・ブロット・アッセイによって力価を測定した。スロット・ブロット分析については、パッケージングしたウイルスからフェノール／クロロホルムによってウイルスDNAを２回抽出し、担体として１本鎖ウシ胸腺DNAと共にエタノール沈殿させ、室温で0.2N NaOH、0.5M NaClによって10分変性させて、スロット・ブロット装置のナイロン・メンブレン上に載せた。メンブレンを次に65℃で２時間乾燥させ、 pBR322からのβラクタマーゼ遺伝子の一部（ヌクレオチド3733〜4168）を含む[³²P]標識435bp SspIおよびPvuI断片をプローブとして調べた。ストリンジェントな洗浄（0.1×SSC、15分を２回）後、ブロットをX線フィルムに露光して、様々な時間の暴露を行って、密度測定計でスキャンした(LKBウルトロスキャン) 。HSVlacおよびHSVil2のバンドの密度を比較して、この後者のアンプリコンの力価を発現アッセイ（NIH 3T3細胞上での青色形成単位）によって調べたと仮定して、HSVil2の力価をHSVlacと比較して密度から計算した。HSVil2の力価は粒子/m lとして表記する。アンプリコンストックの力価：HSVlac力価は、NIH 3T3細胞上での発現およびX -gal組織化学によって力価を測定したところ、２×10⁶青色形成単位/mlの間であった。スロット・ブロット（上記）によって測定したHSVil2の力価は、0.8〜２ ×10⁶粒子/mlの範囲であった。ストック中のD30EBAの力価は、５×10⁶〜６×10⁷ プラーク形成単位/mlの範囲であった。野生型復帰変異体の組換えをVero細胞上でのプラークアッセイによってモニターしたところ、その発生率は１×10^-6であった。例14 HSVm35＋HSVm40対HSVm75による導入効率は、サイトカインのインビトロ産生を測定することによって評価した。サイトカインのインビトロ産生を評価するために、肝癌細胞10⁶個/２mlを６ウェルプレート（コスター社）に播種して、10,000 radを照射し、１時間放置した。次に細胞をHSVm35、HSVm40、HSVm35＋HSVm40、H SVm75、HSVla、または培地に、MOI１〜４で20分暴露した後、培地で２回洗浄した。細胞培養上清を暴露の１、２、４、５および７日目に回収して、サイトカインレベルをヘテロダイマー・タンパク質に特異的なELISAによって測定した。サイトカイン遺伝子含有ベクターに暴露していない対照細胞は、サイトカインを産生しない。IL-12産生はHSVm35またはHSVm40のいずれか単独によって形質導入した細胞では検出されなかった。２ベクターを用いた形質導入によって、両遺伝子を有する単一のベクターを用いた形質導入と同程度のIL12レベルを産生したが、これは１日目をピークとしてその後減少した。例15 肝腫瘍の増殖に及ぼすワクチン接種の影響を調べるために、肝癌培養細胞に10 000radの放射線を照射して、１時間放置し、HSVil2、HSVm75、HSVil2＋HSVm75、 HSVm35＋HSVm40または培地にMOI１〜４で20分暴露した。細胞を培地で２回洗浄して10⁶個/200μlを脾臓内注射した。さらなる群に２つの細胞集団、すなわちHS Vil2を形質導入した細胞10⁶個およびHSVm75形質導入細胞10⁶個を投与した。21日目に、全ての動物に肝癌細胞５×10⁵個1200μlを脾臓内にチャレンジし、10分後に脾臓を摘出した。このモデルは、腫瘍チャレンジの20日後に計数することができる一定数の腫瘍を肝臓内に生じる。手術技法は、腹部正中切開によってペントバルビタール麻酔（25mg/kg腹腔内投与）下で実施した。動物を20日目に屠殺して腫瘍結節を計数した。 HSVm35＋HSVm40、HSVm75またはHSVil2によって形質導入した細胞で免役した動物は、腫瘍の結節が対照より有意に少なかった。２つの腫瘍細胞集団、すなわち１つはIL-2を分泌し、もう一つはIL-12を分泌する細胞によるワクチン接種は、サイトカイン分泌細胞の単一集団によるワクチン接種より有効であった。HSVil2 およびHSVm75の双方によって形質導入した細胞の単一集団によるワクチン接種は、最も有効な治療で、単一の治療または２集団の治療より有意に良好であった。例16 脾細胞およびKC機能に及ぼすワクチン接種の影響を評価するために、動物に例 15に記述のワクチン接種を行い、ワクチン接種後21日目に脾細胞およびKCを回収し、標準的なユーロピウム放出アッセイによって殺腫瘍活性を評価した。簡単に述べると、殺腫瘍活性はエフェクターをインビトロでユーロピウム標識腫瘍細胞と混合することによって評価した。標識した細胞を５×10⁴個/100μl/ウェルの濃度で様々なエフェクター対標的比のエフェクターをウェルに含む96ウェルＵ底プレート（コスター社）に播種した。プレートを遠心して(200rpm、５分）、インキュベートし(４時間、37℃)、そして遠心した(500rpm、５分)。上清20μlを、デルフィア増強用溶液（ワラック・オイ社、トゥルク、フィンランド）の180μl/ウェルを既に含む96ウェル平底プレート（コスター・コーポレーション）に移した。プレートは1232デルフィア蛍光光度計（ワラック・オイ社）で読みとった。最大溶解は細胞を１％トライトンXで溶解することによって測定した。特異的溶解百分率は（実験−自然放出）／（最大放出＋自然放出）×10 0に等しい。自然放出は最大放出の５〜15％であった。実験は試料１本あたり３本ずつ行った。 HSVil2またはHSVm75のいずれかでワクチン接種した動物からの脾細胞は、放射線照射した細胞によってワクチン接種した動物からの脾細胞より有意に大きい殺標的作用を示した。HSVm75とHSVil2を形質導入した細胞によってワクチン接種した動物の脾細胞は、エフェクター対標的比100：１で単一のサイトカインによってワクチン接種した動物の脾細胞より有意に大きい殺標的作用を示した。 HSVil2またはHSVm75でワクチン接種したラットのKCは、エフェクター対標的比 50：１で、対照のKCより有意に大きい（p＜0.05）殺腫瘍活性を示した。HSVm75 とHSVil2を形質導入した細胞によってワクチン接種した動物のKC細胞は、エフェクター対標的比100：１で単一のサイトカインによってワクチン接種した動物のK Cより有意に大きい標的の殺腫瘍活性を示した。例17 ヒトICAM-1および大腸菌β-ガラクトシダーゼcDNAを、HSV即時型初期4/5プロモーター、多クローニング部位、およびSV40 A配列を含み、例１に記述したようにパッケージングしたHSVPrPuc（それぞれ、HSVhicam1およびHSVlac）に指向的にクローニングした。RR1細胞（HSV IE3遺伝子で安定にトランスフェクトしたBH K細胞）をD30 EBAヘルパーウイルス(コドン83〜1236を欠失した株17に由来するI E3変異体で、高グルコース[HG、4.5g/L]、10％FCS、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および400μg/ml生物活性ゲネチシン[G418；ギブコBRL社、ガイサースバーグ、メリーランド州]を含むダルベッコ改変イーグル培地（DME）で、37 ℃、５％CO₂で維持した)と共にHSVアンプリコンのパッケージングに用いた。アンプリコン・ベクターをパッケージングするために、10％FCSを含む培地中で３×10⁶個のRRI細胞を播種して、４時間後にリポフェクチン（ギブコ社）40μ lを加えてトランスフェクトさせ、５分待って、次にアンプリコンDNA溶液を滴下して加えた(30μg、DMEM中で１μg/μl)。６時間後、プレートに５％FCSを含む培地を加えた。トランスフェクションの約20時間後、感染多重度（MOI）が0.2となるようにD30 EBAウイルス50〜100μlを加えた。１時間後、５％FCSを含む完全な培地５mlを各プレートに加えた。アンプリコン・ウイルス・ストックを２日後に回収した。70℃で一晩保存した後、新鮮なRR1細胞（４×10⁶個／60mmプレート）を、超音波処理して加温（34℃）したウイルス・ストックに感染させた。２日後、ストックを回収して次に使用するまで保存した。HSVlacウイルス・ストックの力価は、NIH 3T3細胞（２×10⁵個/ウェル、24ウェルプレート）を播種して１試料あたり２本ずつウイルス・ストックの漸増量を感染させる発現アッセイによって力価を調べた。感染の24時間後、細胞を固定して、定法を用いて、発色基質 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβD-ガラクトシダーゼ（X-gal）で染色した。X -gal陽性（青色）細胞数を計数した。力価は青色形成単位/mlの数として表記した。各ストック中のD30 EBAヘルパーウイルスは、RR1細胞上のプラークアッセイによって力価を測定し、HSVil2は先に記述したようにスロット・ブロット・アッセイによって力価を測定した。スロット・ブロット分析については、パッケージングしたウイルスからフェノール／クロロホルムによってウイルスDNAを２回抽出し、担体として１本鎖ウシ胸腺DNAと共にエタノール沈殿させ、室温で0.2N NaOH 、0.5M NaClによって10分変性させて、スロット・ブロット装置のナイロン・メンブレン上に載せた。メンブレンを次に65℃で２時間乾燥させ、pBR322からのβ ラクタマーゼ遺伝子の一部（ヌクレオチド3733〜4168）を含む[³²P]標識435bp S spIおよびPvuI断片をプローブとして調べた。ストリンジェントな洗浄（0.1×SS C、15分を２回）後、ブロットをX線フィルムに露光して、様々な時間の暴露を行って、密度測定計でスキャンした(LKBウルトロスキャン)。バンドの密度、およびHSClacと比較した密度から計算した HSVhicam1の力価（粒子/mlとして表記）を、この後者のアンプリコンの力価を発現アッセイによって調べたと仮定して、比較した。HSVlacの力価は、NIH 3T3細胞上での発現およびX-gal生化学によって力価を測定したところ、１〜２×10⁶青色形成単位lmlの間であった。HSVhicam1の力価は、１〜２×10⁶粒子/mlの範囲であった。D30EBAヘルパーウイルスとアンプリコンの比は、２：１〜５：１の範囲であった。野生型復帰変異体の組換えをVero細胞上でのプラークアッセイによってモニターしたところ、その発生率は１×10^-6であった。例18 腫瘍細胞株モリス肝癌McA-RH7777(ATCC CRL 1601)を培養によって(DME、6.25 ％FCS、20％ウマ血清、２mM L-グルタミン)で維持し、確実に腫瘍を形成するようにバッファロー系のラットの脇腹に定期的に移植した。この細胞株は検査したところ、マイコプラズマおよびウイルス感染症にかかっていなかった。培養肝癌細胞に放射線10,000radを照射して、１時間放置した。次に細胞をHSV hicaml、HSVlacにMOI１で、37℃で20分間暴露、または暴露しなかった。次に細胞を培地で２回洗浄して、分析するまで培養して維持した。hICAM1の細胞表面での発現を評価するために、細胞を形質導入後１、２、５および７日目に採取して 10mM HEPESを含むHBSSで２回洗浄した。次に細胞の別のアリコットを氷上で抗ヒトICAM-1(クローンMEM111、カルタグ社、ビュリンゲーム、カリフォルニア州）およびPEまたはFITCと結合した抗ラットICAM-1（クローン1A29、カルタグ社、ビュリンゲーム、カリフォルニア州）抗体と共に20分間インキュベートした。さらなる細胞のアリコットを、アイソタイプ対照（カルタグ社、ビュリンゲーム、カリフォルニア州）と共にインキュベートして、抗体の非特異的結合とした。次に細胞をFACスキャナ（ベクトン・ディッキンソン社）によってヒトおよびラットI CAMの有無を分析した。 PE標識により、正常な無処置ラット肝癌細胞の90％以上が細胞表面上にラット ICAMを発現し、平均蛍光強度は200〜288の範囲であった。形質導入細胞と非形質導入細胞との間でラットICAM発現に差はなかった。HSVlacで形質導入した細胞または形質導入しなかった細胞は、検出可能な表面ヒトICAM-1を示さなかった。HSVhicam1で形質導入したラット肝癌細胞のフロー・サイトメトリー分析によって、MOI＝１で20分の暴露により、腫瘍細胞の表面上にヒトICAM の高レベル発現を生じることが示された。ヒトICAM-1に関する最大細胞表面陽性率は、形質誘導の24時間後に認められ、その後１週間の間に減少した(hICAM1の陽性細胞の割合は形質導入後１、２、および５日目でそれぞれ25％、16％、および９％であった。HSVhicam-1形質導入細胞上でのヒトICAM-1の平均蛍光強度は１、２、および５日目でそれぞれ450、271、および124であった。HSVhicam1の形質導入後７日目では、細胞生存率は限られているが、生存細胞の約４％が表面hICA M1に対して陽性であった。図７は、形質導入した細胞の細胞培養上清に認められる可溶性のヒトICAMの定量を図示する。可溶性のヒトICAMは、HSVlacで形質導入した細胞の上清にも、形質導入しなかった細胞の上清にも検出されなかった。形質導入した細胞の上清でのレベルは形質導入の48時間後にピークに達し、７日までに検出レベルに達した。例19 ICAM-1を形質導入した肝癌細胞がリンパ球により強く結合するか否かを明らかにするために、これまでに報告された接着アッセイ（ミキら(Miki)、1993）を改変して実施した。簡単に述べると、肝癌細胞に10,000radを照射してHSVhicam1、 HSVlacを37℃で20分間暴露して、または何も暴露しないで、培地で２回洗浄した。次に細胞を96ウェルプレート中でほぼコンフルエントの単層に播種した。各アッセイの１日前に脾細胞を正常なバッファロー系ラットから回収して、10％FCS 、50U/ml IL-2(カイロン・コーポレーション、エメリービル、カリフォルニア州 )、５μg/ml ConA（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）および50ng/ml PMA （ホルボル12-ミリステート13-アセテート）(シグマ社、セントルイス、ミズーリ州)を含む完全なRPMI（0.01mM NEAA、１mMピルビン酸ナトリウム、２mM L-グルタミン、50μM 2-ME、ペニシリン／ストレプトマイシン）で一晩培養した。アッセイ日に非接着脾細胞を10⁶個/ccの濃度で回収し、MTT（５mg/ml PBS）によって容量比３：１（脾細胞：MTT）で標識した。脾細胞をMTTと共に37℃で６時間、30分毎に軽く攪拌しながらインキュベートした。次に、標識したリンパ球を肝癌標的を含むウェル中で10⁶個/100 μlの濃度で播種した。次に細胞を37℃で30分共にインキュベートした。非接着脾細胞をPBSで緩く洗浄して落とした。接着したリンパ球をDMSOで溶解して、570 nmで分光光度計によって読みとった。代表的なウェルを用いて各実験群について存在する肝癌標的の数を計数した。ウェルあたりの脾細胞数に関する標準曲線を作製するために、さらなる標識脾細胞を異なる濃度で播種して、溶解し、分光光度計によって読みとった。接着指数を肝癌標的細胞あたりの接着リンパ球の数として計算し、８ウェルの平均値を記録した。 hICAM1遺伝子移入が、腫瘍によるリンパ球結合を変化させるか否かを明らかにするために、インビトロリンパ球結合アッセイを用いた。HSVhicam-1形質導入細胞を含むウェル中の肝癌標的細胞あたりの接着リンパ球数は、lac形質導入および無処置細胞と比較して有意に増加した(図８)。このリンパ球結合の倍加は、統計学的に有意であった(図８)。例20 ICAM-1遺伝子による肝癌細胞の形質導入がインビトロ増殖特性を変化させるか否かを調べるために、細胞増殖アッセイを行った。複製しつつあるラット肝癌細胞をHSVhicam1、HSVlacにMOI１で、37℃で20分暴露した、または何も暴露しなかった。次に細胞を24ウェルプレートに生存細胞10⁴個/ml/ウェルの濃度で播種した。播種後１、２および４日目に細胞をトリプシン分離によって回収し、トリパン・ブルー色素排除法によって計数した。それぞれの時点での８ウェルの平均数を比較した。HSVhicam1を形質導入した細胞はHSVlac形質導入細胞および無処置細胞と比較して培養中で同程度の増殖を示し、このことはインビボ腫瘍増殖の変化（例21参照）が、改変した腫瘍の固有の増殖速度の変化では説明できないことを示している。例21 雄性バッファロー系ラット（ハーラン・スプレージ・ドーリー系）を、温度（22℃）および湿度調節環境において１ケージあたり２匹ずつ収容し、水およびラット用標準試料（PMIミルズ社、セントルイス、ミズーリ州）を自由に与えた。動物は12時間照明／消灯ナイクルで維持した。外科技法は全て、ペントバルビタール（50mg/kg）の腹腔内投与による麻酔下で、正中線での開腹術によって行った。主な腹部手術では、術後に意識を回復させるために0.9％生理食塩液３ml を腹腔内投与した。動物は全てスローン・ケタリング・記念癌センター施設内動物取り扱いならびに使用委員会のガイドラインを遵守して、承認されたプロトコルに従って飼育した。腫瘍発生実験 ICAM-1過剰発現が肝癌細胞のインビボ増殖特徴に及ぼす影響を分析するために、脇腹の腫瘍発生実験を行った。動物（１群５匹）をHSVhicam1、HSVlacで形質導入した(MOIが１)、または形質導入しない生存ラット肝癌細胞10⁶個を左脇腹に皮下注射する群に無作為割付した。反対の右側の脇腹では、全ての動物に、生存している非形質導入細胞10⁶個の脇腹皮下注射を行った。動物の体重を測定して、ノギスによって週に２回腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の測定は２つの垂直方向に行ってこれを平均した。腫瘍の体積は等式4/3πr³を用いて計算した。 HSVhicam-1形質導入細胞を注射した動物の左脇腹における腫瘍の増殖は、外照と比較して有意に減少した(図９)。実験終了時の腫瘍の体積を比較した。HSVhic am-1を形質導入した腫瘍(1,397±1296mm³)は、HSVlac(7,109±2118mm³)および無処置腫瘍（13,556±3354mm³）と比較すると体積が有意に（P＜0.05）小さかった。反対側の無処置脇腹では、全ての群が進行性の腫瘍増殖を示したがこれらは有意差がなかった。免疫組織化学腫瘍退縮について考えられる免疫メカニズムを評価するために、腫瘍における細胞浸潤物の免疫組織化学分析を行った。さらなる腫瘍発生実験では、細胞を注射した１週間後および３週間後に動物から腫瘍を切除し(それぞれの時点でn＝５ )、これを10％ホルマリン緩衝液に直ちに入れた。24時間後、標準的な技法を用いて腫瘍をパラフィンに抱埋した。５μmの切片を作製した。標準的な技法を用いてヘマトキシリン・エオジン染色を施した。以下の抗体を免疫組織化学分析に用いた：マウスモノクローナル抗ラットCD4抗体(IgG₁、クローンW3/25、セロテック社、オックスフォード、イギリス)、マウスモノクローナル抗ラットCD8 抗体(IgG₁、クローンOX-8、カルタグ社、ビュリンゲーム、カリフォルニア州)、およびラットMHCクラスIIを認識するマウスモノクローナル抗ラット1-A抗体(IgG₁ 、クローンOX-6、セロテック社、オックスフォード、イギリス)。使用した第二抗体は、ラット吸着ビオチン結合抗マウスIgG（ベクター社、ビュリンゲーム、カリフォルニア州）であった。CD4およびCD8染色に用いたスライドガラスをマイクロ波中で１mM EDTA（pH８）によって10分前処置した。MHS II染色に関しては、スライドガラスを0.05％プロテアーゼXXIV（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）のトリス塩酸緩衝液、pH7.6溶液で10分間前処置した。次に３％H₂O₂中で５分インキュベートすることによって内因性ペルオキシドを消失させた。PBSで洗浄した後、スライドガラスを0.05％ウシ血清アルブミン中に１分間入れた。スライドガラスを乾燥させて、全ウマ血清を２％ウシ血清アルブミン中で20倍希釈して加え、10分間インキュベートした。血清を吸引して除去して、一次抗体150 μlを加えた。一次抗体を４℃で16〜18時間湿潤チャンバー内でインキュベートした。PBSで洗浄した後、二次抗体を１％ウシ血清アルブミン中で500倍希釈してスライドガラスに適用し、室温の湿潤チャンバー内で60分インキュベートした。次にスライドガラスをPBSで洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを１％ウシ血清アルブミン中で500倍希釈して適用した。次にスライドガラスをP BSで洗浄し、0.06％ジアミノベンジジン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）浴に５〜15分移した。スライドガラスを水で洗浄して１％酸アルコールで脱色し、アンモニア水中で青色にした。エタノールおよびキシレンによる乾燥は、標準的な技法を用いて行い、スライドガラスをパーマウント封入培地（フィッシャー社、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）で封入した。実験内容を知らない病理学者１人がスライドガラスを調べて以下のように分類した。腫瘍細胞をMHC II染色の有無に関して評価した。MHC II染色非腫瘍細胞によって腫瘍浸潤の程度を１〜４に分類した。CD4およびCD8陽性リンパ球の総数によって腫瘍の浸潤の程度を１〜４に分類した。CD4およびCD8陽性細胞の相対的割合を調べて、比として表記した。ラット脾臓組織を各実験の陽性対照として用いた。 CD4およびCD8がいずれも陽性であるTリンパ球による腫瘍の浸潤量は１および３週間目では処置群で差はなかった。CD4およびCD8陽性T細胞の総数に対するCD4 の比は、１週目では群による差がなかったが、３週目では、HSVhicam-1処置動物ではHSVlacおよび無処置動物と比較してこの比は有意に増加した(0.42対0.25および0.24、p<0.05>。１週目および３週目での治療群の間では、MHC II染色免疫細胞による腫瘍の浸潤の程度に有意差はなかった。腫瘍細胞はいずれの場合でも MHC II発現を示す陽性染色を示さなかった。例22 ICAM-1を形質導入した肝癌細胞に対する前回の暴露が親腫瘍のその後のチャレンジから保護するか否かを明らかにするために、ワクチン接種実験を行った。全腫瘍細胞ワクチンを以下のように調製した。ラット肝癌細胞に10,000radの放射線を照射して、HSVhICAM1、HSVlacにMOI１で、37℃で20分暴露、または暴露せずに、培地で２回洗浄した。動物（１群n＝19）を、いずれかのタイプの細胞10⁶個 /200μl培地を１日目に脾臓内注射する群に無作為割付した。対照動物には培地2 00μlを脾臓内投与した。ワクチン接種の３週間後、動物に５×10⁵個の複製しつつある肝癌細胞を脾臓内注射してチャレンジした。10分後、全ての動物に脾臓摘出を行った。チャレンジの３週間後、動物を屠殺して、肝表面の腫瘍結節を計数した。体重を記録して、実験の間、週に２回毛づくろい動作をモニターした。実験を通じて、全ての治療群の体重増加に差はなく、全ての動物は正常な毛づくろい動作を維持した。図10に示すように、HSVhicam1細胞をワクチン接種した動物では、全ての対照と比較して取り込みおよび肝転移増殖の有意な減少を認めた(p≦0.05)。HSVlac形質導入細胞、放射線照射細胞単独、または培地でワクチン接種した動物では差を認めなかった。例22 ヒトB7.1またはヒトランテスのコード配列をpHSVPrPUCプラスミドのポリリンカー領域にクローニングした。HSV-B7.1アンプリコンを形成するために、pBJ.hu B7.1プラスミド(ルイス・ラニエ(Lewis Lanier)博士からの供与、DNAX、パロアルト、カリフォルニア州)をHind IIIで消化して、これを塞いで平滑末端を作製した。次に、このプラスミドをXbaIで消化した。ヒトB7.1 cDNAをコードするHin dIII平滑/XbaI断片をゲル精製して、ベクターとのライゲーションのインサートとして用いた。HSVアンプリコン・ベクターpHSVPrPUCプラスミドをEcoRIで消化してクレノウで塞ぎ、平滑末端を作製した後XbaIで消化した。EcoRI平滑/XbaIベクター断片をゲル精製して、インサートとライゲーションした。構築されたアンプリコン・プラスミドをHSV-1 IE4/5プロモーターに関してhuB7.1のコード配列の方向に関して分析し、このアンプリコンをHSVB7.1アンプリコン・ウイルスの作製に用いた。 HSV-RANTESアンプリコンを形成するために、SK+pBS-RANTESプラスミド（トム・シャール（Tom Schall）博士からの供与、ケモセントリックス社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）をKpn Iで部分消化した後Xba I消化した。ヒトRANT ES cDNAをコードするKpn I/Xba I断片をゲル精製して、Kpn IおよびXba Iで消化したHSVアンプリコン・ベクターpHSVPrPUCプラスミドとのライゲーションにおいてインサートとして用いた。HSV-1 IE4/5プロモーターに関するhuRANTESのコード配列の方向性を確認し、このアンプリコンをHSV rantesアンプリコン・ウイルスの作製に用いた。HSVアンプリコンを図11に図示する。例23 プラスミドDNA５μgを、製造元（ギブコ-BRL社）の推奨通りにリポフェクタミンと共にRR1細胞にトランスフェクトすることによって、アンプリコンDNAをHSV- 1粒子にパッケージングした。24時間インキュベートした後、トランスフェクトした単層を、感染多重度（MOI）0.2で、HSV株17、IE3欠失変異体ウイルスD30EBA （パターソン（Paterson）ら、1990）に重複感染させた。感染した単層に細胞変性変化を認めた後、細胞を回収して凍結融解を行って、カップ超音波装置（ミソニックス・インク）を用いて超音波処理した。ウイルス上清を5000gで10分遠心することによって透明にしてから、RR1細胞上で継代を繰り返した。この２回目のウイルス継代を上記のように回収して、既に記述のように（ツンら(Tung)、1996）25％蔗糖勾配での超遠心によって一晩濃縮した。ウイルスのペレットをPBS（Ca²⁺およびMg²⁺不含）に再懸濁し、今後使用するまで- 80℃で保存した。標準的なプラークアッセイ法によって、ストックの力価をヘルパー・ウイルスに関して調べた。アンプリコン力価を以下のように決定した：NI H 3T3細胞を24ウェルプレートに１×10⁵個/ウェルの密度で播種し、ウイルスに感染させた。ウイルス感染の24時間後、単層をPBSで２回洗浄して、４％パラホルムアルデヒドで固定してX-gal組織化学（５mMフェリシアン化カリウム；５mM フェロシアン化カリウム；0.02％NP-40；0.01％デオキシコール酸ナトリウム；２mM MgCl₂および１mg/ml XgalのPBS溶液）によって染色するか、または溶解緩衝液（100mM NaCl、10mMトリス、pH8.0、25mM EDTA、0.5％SDS）を用いて総DNA を回収した後にフェノール／クロロホルム抽出を行ってエタノール沈殿を行った。以下の条件下でアンプリコン・プラスミド中に存在するβ-ガラクトシダーゼ遺伝子に対応するプライマーを用いて１試料あたり２本ずつPCRを行った：94℃ 、２分；その後94℃(30秒)、58℃(30秒)、その後72℃（７分）を20、23または26 サイクル。初期および後期のサイクルからのPCR産物を１％エチジウム・ブロマイドゲル上に流し、450bpのバンドの強度をFOTDODYNE FOTO/ECLIPSE（登録商標）システム（フォトダイル・インク、ハートランド、ウィスコンシン州）および COLLAGE（登録商標）画像解析ソフトウェアを用いて評価した。HSVB7.1およびHS V rantesの力価はHSVlacウイルスを標準として比較することによって概算した。これらの測定から得られたプラーク形成単位（pfu/ml）およびアンプリコン（bf u/ml）力価を用いてアンプリコン力価を計算し、このようにして実験的ウイルス輸送を標準化した。異なるウイルス調製物におけるアンプリコンカ価は１〜10× 10⁷bfu/mlの範囲で、ヘルパー力価は５〜15×10⁷pfu/mlの範囲であった。例24 EL4細胞をインビトロで、MOI0.5〜1.5pfu/細胞で、HSVB7.1またはHSVlacアンプリコン・ウイルスのいずれかに感染させた。詳しく述べると、EL4細胞10⁶個を、0.5mlの容量で37℃、５％CO₂で４時間アンプリコンウイルスに吸着させた。４時間終了時、新鮮なID-10培地0.5mLを加え、インキュベーションをさらに12時間継続した。感染した細胞を16時間終了後に回収し、細胞10⁶個を冷PBS溶液0.1ml 中で10倍希釈したフィコエリスリン（PE）結合抗B7.1抗体（抗-CD80 PE、ベクトン・ディッキンソン社）によって４℃で30分間染色した。非感染EL4細胞(陰性対照として)、またはB7.1を安定に発現するEL4細胞（陽性対照としてEL4-B7.1細胞）も抗CD80 PE抗体で同時に染色した。染色した細胞をEPICSフロー・サイトメトリー機器を用いてフロー・サイトメトリーによって分析した。対照の非感染EL4細胞またはHSVlacで感染させたEL4細胞はB7.1発現に関して陰性であった(図12A&B)。対照的に、推定MOI１で感染したEL4細胞の約95％がB7.1 発現に関して染色陽性であった(図12C)。細胞１個あたりでは、HSV-B7.1アンプリコン・ウイルス感染細胞は、レトロウイルス形質導入によって確立されたEL4- B7.1細胞株について認められた場合より有意に高いB7.1発現レベルを示した。HS VB7.1感染細胞におけるB7.1の発現は感染後60時間まで維持された。例25 HSVベクター発現B7.1の生物活性をインビトロ増殖アッセイにおいて調べた。マウスT-細胞をマウスT細胞濃縮カラム（R&Dシステムズ）によって濃縮した、T- 細胞10⁵個をγ線を照射した刺激細胞５×10⁴個の存在下でインキュベートした。 HSV.B7.1で感染させたEL4またはCHO細胞を刺激細胞として用いた。レトロウイルスによって形質導入したEL4-B7.1、またはCHO-B7.1（ピーター・リンスレー（Pe ter Linsley）博士からの供与）をB7.1発現の陽性対照として用い、親EL4または CHO細胞を陰性対照として用いた。セシウム・ガンマ線源を用いて、刺激細胞に延べ7500radの放射線を照射した。ハイブリドーマ細胞培養上清の50倍希釈として用いる抗CD3抗体(2C11)、またはホルボルミリステート（10ng/ml）をイオノフォア（0.1ng/ml）と共に加えて、細胞を37℃で５％CO₂ インキュベーター内で３日間培養した。これらの刺激した細胞における増殖反応をアッセイするために、１試料あたり３本ずつの培養を１μCi ³H-チミジン（NE N、２Ci/mmol、最終濃度１μCi/0.2ml）によって16時間標識した。セル・ハーベスタ（パッカードインストルメンツ）を用いて、グラスファイバーフィルター上に細胞を回収し、取り込まれた33H放射活性を、βカウンターを用いて測定した( パッカード・インストルメンツ)。結果を（１試料あたり３本の培養の）平均値 ±標準偏差として表記した。T-細胞増殖指数（標準化したcpm）を、非刺激対照培養に対する刺激培養において取り込まれた³H-チミジンの比として決定した。「シグナル１」を提供するために、抗CD3抗体（2C11）またはホルボル・ミリステートアセテート(PMA)とイオノフォアとの混合物で刺激すると、HSVB7.1と共培養したT細胞では有意な増殖反応を認めたが、HSVlac感染刺激細胞と共培養した場合には認めなかった。HSVB7.1感染EL4細胞の場合に認められたB7.1依存的T- 細胞増殖反応は、レトロウイルスによって形質導入した対照刺激細胞EL4-B7.1またはCHO-B7.1の場合に認めた反応と同等であった。例26 EL4細胞をHSV rantesまたはHSVlacアンプリコンにMOI１で感染させた。EL4細胞１×10⁶個を0.5mlの容量で37℃、５％CO₂で４時間アンプリコン・ウイルスに吸収させ、次に新鮮な培地0.5mlを加えて、インキュベーションをさらに20時間継続した。細胞培養上清を24時間終了時に回収して、培養上清中のランテスをランテス捕獲するための抗ランテス抗体(R&Dシステムズ)、および検出するためのビオチン結合抗ランテス（R&Dシステムズ）を用い、その後アルカリフォスファターゼ結合アビジンを用いたサンドイッチELISAにおいて、上清中のランテスの有無を調べた。燐酸パラニトロフェニルを基質として用いて、405nmで読みとる吸収による発色をBIORAD ELISAリーダーにおいて読みとった。標準組換え型ヒトランテス（R&Dシステムズ）の連続２倍希釈液を１試料あたり２本ずつ作製して、感染細胞の培養上清におけるランテスの量を定量するために平行して測定した。非感染EL4細胞またはHSVlacで形質導入した細胞では、検出可能なランテス分泌は、培養上清中に認めなかった。MOI 0.5でHSVrantesで感染させた細胞は、10⁶ 個あたり24時間でランテス3.1ng/mlを産生した。認められたランテスのレベルは、ランテスを1.45ng/ml/24時間/10⁶個の濃度で分泌した、プールしたG418分泌レトロウイルスによって形質導入したEL4-RANTES細胞において測定した場合より高かった。例27 成体C57BL6(H-2^b)雌性マウス（８週齢）をチャールス・リバー・ラボラトリーズ（MA）から得て、ロチェスター大学メディカルセンターの動物施設で飼育した。マウスは、承認された実験動物取り扱いおよびケア・プロトコルの下で取り扱った。マウス（１群６〜12匹）の後肢背側の毛を刈って、エクスビボでHSVB7.1 、HSVrantes、またはHSVlacアンプリコン・ウイルスを感染させた生存EL4細胞または非感染EL4細胞10⁶個を皮下（sc）接種した。実験によっては、非感染EL4細胞10⁶個を同時に他の後肢の反対側に皮下接種した。腫瘍の増殖はノギスを用いて２〜３日毎に測定し、大きさをミリメートル（mm）の直径で報告した。腫瘍の大きさが22〜23mmに達したときに動物を屠殺した。 HSV感染EK4細胞の増殖、および反対側のEL4腫瘍の増殖に及ぼすこれらの実験の結果を表３および図13Aおよび13Bに要約する。20日目に、EL4-HSVB7.1形質導入EL4細胞を接種したマウス６匹中３匹において、腫瘍の完全な退縮を認めた。H SVrantesを形質導入したEL4細胞を接種したマウス６匹中２匹もまた、最初は腫瘍増殖を示したが、その後HSV-RANTESに感染させたEL4を接種したマウスでは完全な退縮を認めた。EL4細胞をHSVB7.1およびHSVrantesの双方で感染させると、マウス６匹中５匹が最初の腫瘍増殖後完全な退縮を示した。対照EL4細胞またはH SVlacベクターに感染させたEL4細胞は、マウスの100％に腫瘍の増殖を示した(６匹中６匹)。安定に形質導入したEL4-B7.1細胞は20日までに全てのマウスにおいて腫瘍増殖の証拠を認めなかった。これらの結果は、HSVB7.1またはHSVrantesアンプリコン感染細胞は腫瘍特異的免疫応答によって拒絶されたという結論を支持する。同様の結果は、HSVベクター形質導入細胞の接種が、同時に反対側に接種した親の非形質導入EL4細胞の増殖を阻害するか否かを評価する実験においても認められた。マウス５匹中３匹において、エクスビボHSVB7.1感染EL4腫瘍の退縮は、反対側のEL4腫瘍の退縮と一致した(図13A)。HSVlac感染EL4細胞および反対側の親EL4細胞はいずれも、調べた動物５匹中５匹において腫瘍を発症した(図13B)。これらのデータは、親EL4細胞に対する全身腫瘍特異的免疫が、EL4-HSVB7.1形質導入EL4細胞を接種したマウスのサブセットに得られたという結論を支持する。 HSVアンプリコンの腫瘍内接種を用いて、HSVB7.1およびHSVrantesの既に確立した腫瘍に対する有効性を調べるために、毛を刈った後肢の背側に生存EL4細胞1 0⁶個を皮下接種して、腫瘍を５〜６mm（６〜７日）の大きさまで増殖させた。この時点で、マウスを詳分けして、50μl中にウイルス粒子を含むアンプリコンが２×10⁶個の濃度になるようにPBSで希釈したHSVB7.1、HSVrantes、HSVB7.1+HSVr antes、またはHSVlacアンプリコンウイルスのいずれかを腫瘍内に接種した(１群あたりマウス10〜12匹)。既に確立したEL4腫瘍を有する対照動物には希釈したPB Sのみを投与した。HSVアンプリコンの２回目の接種は14日目に行い、腫瘍の増殖を２〜３日毎に測定した。腫瘍を最大で22〜23mmの大きさまで増殖させ、この時点で動物を屠殺した。完全な腫瘍の退縮は、HSVB7.1ベクターのみを注射したマウスでは26匹中17匹、HSVrantesを注射したマウスでは22匹中11匹、およびHSVB7.1とHSVrantesを共に注射したマウスでは26匹中23匹に認めた。３回の異なる実験の結果は、表４に示ナように類似の結果を生じた。腫瘍の退縮が全身免疫およびメモリーT細胞免疫の発達と相関するか否かを肩べるために、完全な腫瘍の退縮を示したマウスの、一次接種とは反対側のもう一方の後肢に、親EL4を再チャレンジした。親EL4細胞を再チャレンジした全てのマウスが腫瘍の増殖を示さず(表４)、このように、前回のHSVB7.1および／またはH SVrantesの既に確立した腫瘍内への直接腫瘍内輸送によって、腫瘍特異的免疫が確立されたことを示している。例28 HSVアンプリコンベクターによる腫瘍内投与によって形質導入したマウスにCTL 反応が誘導されるか否かを調べるために、例27のマウスの脾細胞を評価した。EL 4細胞を接種して、HSVB7.1またはHSVrantes単独または併用のいずれかを腫瘍内に注射したC57BL/6マウスから脾臓を採取した。HSVlacウイルスを腫瘍内接種したマウスまたはPBS希釈液のみを接種したマウスから対照脾細胞を得た。定法に従って脾細胞を調製し、ＡＫＣ溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解した。細胞溶解性Ｔ細胞を得るために、脾細胞懸濁液（２×1066個/mlのRP-10溶液）を、ガンマ線照射（7500rad）EL4細胞（0.5×10⁶個/ml）と共に25cm²フラスコ内で５％CO₂ 、37℃で６日間培養した。これらのインビトロ共培養脾細胞を次にCTLアッセイのエフェクター細胞として用いた。アッセイ日に、EL4標的細胞をPBSで洗浄し、 1.5〜２×10⁶個/mlの濃度でRP10培地（0.1ml）に再懸濁し、Na⁵¹CrO₄（NEN）100 μCi；ストック濃度１mCi/ml）を37℃で90分間加えた。これらの細胞をPBSで３回洗浄し、RP-101mlに懸濁して、血球計算盤を用いて生存細胞数を得た。⁵¹Cr標識標的細胞（10⁴個/0.1ml）をV型96ウェルプレートに加えて、エフェクター細胞の３倍連続希釈を１試料あたり３本ずつ行うと、最終のエフェクター・標的細胞比（E/T比）は100：１、33：１、11：１、３：１、および１：１となった。標識した標的細胞からの放射活性の自然放出は、６ウェルにおいて標的細胞を培地単独と培養することによって測定した。放射活性の総放出は標的細胞を２％トライトンX-100界面活性剤で溶解することによって決定した。プレートを1Kで２分間遠心し、37℃、５％CO₂で４時間インキュベートした。プレートを2Kで４分間遠心し、培養上清の半分（100μl）について、ガンマ・カウンター（パッカード・インストルメンツ）で⁵¹Cr放出を計数した。同じ試料のウェルについて平均値を計算し、結果を以下の式に従って％特異的溶解として表記する：ウイルス感染および非感染対照の平均自然放出は総カウントの10〜20％の範囲であった。有意な特異的CTL活性は、HSVB7.1またはHSVrantes単独または併用を投与したマウスの脾細胞に認められた(図14A〜D)。CTL反応は、HSVB7.1および／またはHS Vrantesアンプリコンを既に確立された腫瘍に直接輸送した後にEL4腫瘍が退縮したマウスに限って認められた。CTL活性のレベルは、HSVB7.1およびHSVrantesベクターを共に投与したマウスではより大きかった。CTL活性の最高レベルは親EL4 細胞を再チャレンジしたマウスにおいて認められた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月２日（１９９９．１．２）【補正内容】請求の範囲１．免疫調節タンパク質および治療遺伝子産物を細胞に一過性に発現させるために、免疫調節タンパク質に対する遺伝子および少なくとも１つのさらなる治療遺伝子を含む１種以上の単純ヘルペスウイルスアンプリコンを腫瘍細胞に形質導入することを含む、腫瘍細胞に対する自家ワクチンを産生する方法。２．腫瘍細胞が単純ヘルペス・アンプリコンによってエクスビボで形質導入される、請求項１に記載の方法。３．腫瘍細胞が単純ヘルペスアンプリコンによってインビボで形質導入される請求項１に記載の方法。４．免疫調節タンパク質および治療遺伝子産物を細胞に一過性に発現させるために、免疫調節タンパク質に対する遺伝子および少なくとも１つのさらなる治療遺伝子を含む、１種以上の単純ヘルペスウイルス・アンプリコンを腫瘍細胞に形質導入する工程を含む、患者に対して腫瘍細胞に対する保護免疫応答を誘導する方法。５．形質導入した腫瘍細胞を患者に導入する工程をさらに含む、腫瘍細胞がエクスビボでアンプリコンによって形質導入される、請求項４に記載の方法。６．アンプジコンをインビボで腫瘍細胞の部位に注射する、請求項４に記載の方法。７．免疫調節タンパク質がサイトカインである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．サイトカインがインターロイキン-2である、請求項７に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フォン，ユマンアメリカ合衆国，ニューヨーク，ニューヨーク，ヨークアベニュー 1275，メモリアルスローンケッタリングキャンサーセンター，オフィスオブインダストリアルアフェアーズ (72)発明者フェダーオフ，ハワードアメリカ合衆国，ニューヨーク，ロチェスター，ホワイトウッドレーン 66 (72)発明者ローゼンブラット，ジョセフ，ディ. アメリカ合衆国，ニューヨーク，ロチェスター，エルムウッドアベニュー 601, ユニバーシティオブロチェスター，ボックス 3704

Claims

【特許請求の範囲】１．免疫調節タンパク質および治療遺伝子産物を細胞に一過性に発現させるために、免疫調節タンパク質に対する遺伝子および少なくとも１つのさらなる治療遺伝子を含む１種以上の単純ヘルペスウイルスアンプリコンを腫瘍細胞に形質導入することを含む、腫瘍細胞に対する自家ワクチンを産生する方法。２．腫瘍細胞が単純ヘルペス・アンプリコンによってエクスビボで形質導入される、請求項１に記載の方法。３．腫瘍細胞が単純ヘルペス細胞によってインビボで形質導入される請求項１に記載の方法。４．免疫調節タンパク質および治療遺伝子産物を細胞に一過性に発現させるために、免疫調節タンパク質に対する遺伝子および少なくとも１つのさらなる治療遺伝子を含む、１種以上の単純ヘルペスウイルス・アンプリコンを腫瘍細胞に形質導入する工程を含む、患者に対して腫瘍細胞に対する保護免疫応答を誘導する方法。５．形質導入した腫瘍細胞を患者に導入する工程をさらに含む、腫瘍細胞がエクスビボでアンプリコンによって形質導入される、請求項４に記載の方法。６．アンプリコンをインビボで腫瘍細胞の部位に注射する、請求項４に記載の方法。７．免疫調節タンパク質がサイトカインである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．サイトカインがインターロイキン-2である、請求項７に記載の方法。９．サイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項７に記載の方法。 10．免疫調節タンパク質がケモカインである、請求項７に記載の方法。 11．ケモカインがランテス（RANTES）である、請求項10に記載の方法。 12．免疫調節タンパク質が細胞間接着分子である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 13．細胞間接着分子がIACM-1である、請求項12に記載の方法。 14．免疫調節タンパク質が共刺激因子である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 15．共刺激因子がB7.1である、請求項14に記載の方法。 16．腫瘍細胞の集団が、免疫調節タンパク質に対する遺伝子およびさらなる治療遺伝子を含む複数の種のアンプリコンによって形質導入される、請求項１〜15のいずれかに記載の方法。 17．さらなる治療遺伝子が第二の免疫調節タンパク質をコードする、請求項１〜 16のいずれかに記載の方法。 18．腫瘍細胞が少なくとも２種のナイトカインをコードして発現するアンプリコンによって形質導入される、請求項17記載の方法。 19．腫瘍細胞がインターロイキン-2およびインターロイキン-12に対する遺伝子を含むアンプリコンによって形質導入される、請求項18に記載の方法。 20．腫瘍細胞が、サイトカインおよび共刺激天子をコードおよび発現するアンプリコンによって形質導入される、請求項18に記載の方法。 21．腫瘍細胞が、ランテスおよびB7.1に対する遺伝子を含むアンプリコンによって形質導入される、請求項20に記載の方法。 22．腫瘍細胞が肝癌細胞またはリンパ腫細胞である、請求項１〜21のいずれかに記載の方法。 23．少なくとも１つの免疫調節タンパク質に灯する遺伝子を含む第一の種のアンプリコンおよびさらなる治療遺伝子産物に対する遺伝子を含む第二の種のアンプリコンを含む、複数種の単純ヘルペスウイルスアンプリコンを含む混合物。 24．免疫調節タンパク質がサイトカインである、請求項23に記載の混合物。 25．サイトカインがインターロイキン-2または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項24に記載の混合物。 26．免疫調節タンパク質がケモカインである、請求項23に記載の混合物。 27．ケモカインがランテスである、請求項26に記載の混合物。 28．免疫調節タンパク質が細胞間接着分子である、請求項23に記載の混合物。 29．細胞間接着分子がIACM-1である、請求項28に記載の混合物。 30．免疫調節タンパク質が共刺激因子である、請求項23に記載の混合物。 31．共刺激因子がB7.1である、請東項30に記載の混合物。 32．さらなる治療遺伝子が第二の免疫調節タンパク質をコードする、請求項23〜 31のいずれかに記載の混合物。 33．第一および第二の種のアンプリコンがランテスおよびB7.1をコードする遺伝子を含む、請求項23〜32のいずれかに記載の混合物。 34．第一および第二の種のアンプリコンが少なくとも２種のサイトカインをコードする遺伝子を含む、請求項23〜32のいずれかに記載の混合物。 35．アンプリコンがインターロイキン-2およびインターロイキン-12をコードする遺伝子を含む、請求項34記載の混合物。 36．請求項１〜22のいずれかの方法に従って形質導入された腫瘍細胞。 37．請求項23〜35のいずれかによる単純ヘルペスウイルス・アンプリコンを形質導入した腫瘍細胞。 38．免疫調節タンパク質がケモカイン、細胞間接着分子、および共刺激因子から選択される、免疫調節タンパク質を細胞に一過性に発現させるために、免疫調節タンパク質に対する遺伝子を含む単純ヘルペスウイルス・アンプリコンを腫瘍細胞に形質導入することを含む、腫瘍細胞に対する自家ワクチンを産生する方法。 39．腫瘍細胞がエクスビボで単純ヘルペスアンプリコンによって形質導入される、請求項１に記載の方法。 40．腫瘍細胞がインビボで単純ヘルペス細胞によって形質導入される、請求項１に記載の方法。