BR112021009929B1 - Adenovírus recombinante, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e seus usos para tratamento de câncer - Google Patents

Adenovírus recombinante, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e seus usos para tratamento de câncer Download PDF

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Abstract

adenovírus e métodos para utilização de adenovírus. essa invenção está relacionada aos métodos e materiais para liberação de ácido nucleico, vacinação e/ou tratamento de câncer. mais especificamente, métodos e materiais para liberação de ácido nucleico, vacinação e/ou tratamento de câncer com o uso de um ou mais adenovírus recombinantes (ads) como um agente oncolítico são fornecidos.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[001]Essa invenção está relacionada aos métodos e materiais para liberação de ácido nucleico, vacinação e/ou tratamento de câncer. Por exemplo, a invenção engloba adenovírus (Ads) e métodos para a utilização de adenovírus para tratar condições médicas como, por exemplo, câncer. Em um aspecto da invenção, um adenovírus fornecido nesse relatório descritivo pode ser usado como um agente oncolítico.
[002]Apesar de grandes esforços, o câncer permanece uma questão de saúde pública importante nos Estados Unidos com mais de 1,6 milhões de novos casos, somente em 2017 (“National Cancer Institute”, “Cancer Stat Facts: Cancer of Any Site”, seer.câncer.gov/statfacts/html/all.html). As terapias tradicionais, por exemplo, quimioterápicos, radioterapia e cirurgia, frequentemente fracassam, especialmente quando o câncer está avançado. Uma das razões para isso é que as células de câncer podem eliminar ou modificar os componentes que são direcionados por essas terapias e evitar eficazmente serem mortas.
[003]A viroterapia oncolítica pode fornecer uma abordagem alternativa ao tratamento de câncer por utilização de vírus que replicam seletivamente para destruir tumores, ativam respostas imunes adaptativas, e asseguram a imunidade por toda a vida contra os tumores (Russell et al., 2017 Molecular Therapy 25: 1.107-1.116).
[004]Essa invenção fornece métodos e materiais para liberação de ácido nucleico, vacinação e/ou tratamento de câncer. Por exemplo, essa invenção fornece métodos e materiais para o tratamento de câncer por administração de um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste) como um agente oncolítico. Em uma modalidade, um Ad recombinante pode ser derivado de um primeiro Ad (por exemplo, pode incluir um genoma de um primeiro Ad, por exemplo, Ad6, também referido como o arcabouço de Ad recombinante) e pode incluir HVRs de héxon de um segundo Ad como, por exemplo, Ad57. Quando um Ad recombinante inclui um genoma de Ad6 e HVRs de héxon de Ad57, o Ad recombinante pode ser um Ad quimérico referido como Ad657 (veja Nguyen, et al. Oncolytic Virotherapy 7: 43-51, 2018).
[005]Em um aspecto, essa invenção fornece métodos para vacinação contra doença infecciosa com o uso de um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste). Em um aspecto, essa invenção fornece métodos para o tratamento de câncer com o uso de um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste) como um agente oncolítico. Em alguns casos, um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais Ad657s) podem ser usados para reduzir o número de células de câncer (por exemplo, por infecção e morte de células de câncer) em um mamífero. Em alguns casos, um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste) podem ser usados para estimular respostas imunes anticâncer em um mamífero. Em alguns casos, um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste) podem ser usados para estimular respostas imunes contra doenças infecciosas em um mamífero.
[006]Como demonstrado nesse relatório descritivo, quando Ad657 é liberado por injeção intravenosa a camundongos que possuem tumores subcutâneos de câncer de próstata humano DU145, Ad657 infecta primeiro o fígado e depois alcança tumores distantes. Tanto Ad6 quanto Ad657 medeiam retardos significantes no crescimento tumoral e extensão da sobrevida com Ad6 mediando eficácia maior.
[007]Essa invenção fornece métodos e materiais para liberação de ácido nucleico, vacinação e/ou tratamento de câncer. Por exemplo, essa invenção fornece métodos e materiais para o tratamento de câncer por administração de um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste) como um agente oncolítico. Em uma modalidade, um Ad recombinante pode ser derivado de um primeiro Ad (por exemplo, pode incluir um genoma de um primeiro Ad, por exemplo, Ad6, também referido como o arcabouço de Ad recombinante) e pode incluir HVRs de héxon de um segundo Ad como, por exemplo, Ad57. Quando um Ad recombinante inclui um genoma de Ad6 e HVRs de héxon de Ad57, o Ad recombinante pode ser um Ad quimérico referido como Ad657. Em um aspecto, essa invenção fornece métodos para vacinação contra doença infecciosa com o uso de um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste). Em um aspecto, essa invenção fornece métodos para o tratamento de câncer com o uso de um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste) como um agente oncolítico. Em alguns casos, um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais Ad657s) podem ser usados para reduzir o número de células de câncer (por exemplo, por infecção e morte de células de câncer) em um mamífero. Em alguns casos, um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste) podem ser usados para estimular respostas imunes anticâncer em um mamífero. Em alguns casos, um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, um ou mais de Ad657 e variantes deste) podem ser usados para estimular respostas imunes contra doenças infecciosas em um mamífero.
[008]Como demonstrado nesse relatório descritivo, quando Ad657 é liberado por injeção intravenosa a camundongos que possuem tumores subcutâneos de câncer de próstata humano DU145, Ad657 infecta primeiro o fígado e depois alcança tumores distantes. Tanto Ad6 quanto Ad657 medeiam retardos significantes no crescimento tumoral e extensão da sobrevida com Ad6 mediando eficácia maior.
[009]Além disso, o sequestro no fígado é um problema considerável para praticamente qualquer vírus oncolítico se ele é usado como uma terapia sistêmica intravenosa. Se o vírus infecta hepatócitos e os mata, isso resultará em dano hepático em doses baixas e morte em doses maiores. Notavelmente, a administração dos Ads da invenção, ou seja, vetor de Ad657 quimérico e variantes deste, mediou dano hepático menor inesperado do que Ad5 ou Ad6. Dessa forma, a combinação única de plataforma de Ad6 com as HVRs 1-7 de Ad657 mediou alterações na biodistribuição e terapia não observadas em vírus naturais.
[010]Além disso, como demonstrado nesse relatório descritivo, a imunização de macacos Rhesus com vacinas de adenovírus replicante de ciclo único (SC-Ad657) que expressam apenas gp160 de HIV-1 clado B por via intranasal (IN) e intramuscular (IM) foi comparada com vias mucosas e sistêmicas de vacinação. As vacinas SC-Ad por elas próprias geraram titulações significantes de anticorpo circulante contra Env após apenas uma única imunização. Animais imunizados somente pela via IM tinham células T helper foliculares periféricas (pTfh) altas no sangue, mas Tfh baixas em linfonodos, e tinham atividade de anticorpo de citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) menor. Animais imunizados pela via IN tinham Tfh altas em linfonodos, mas pTfh baixas no sangue, e tinham anticorpos de ADCC mais elevados. Quando animais imunizados foram desafiados por via retal com SHIVSF162P3, eles todos se tornaram infectados, mas animais sensibilizados por via mucosa tinham cargas virais acentuadamente menores em seus tratos gastrintestinais. Similarmente, Ad657 que carrega genes para antígenos de hepatite C é capaz de gerar respostas de linfócitos T citotóxicos (CTL) contra hepatite e citomegalovírus. Ad657 é capaz de liberar e expressar genes terapêuticos, incluindo citocinas como, por exemplo, 4-1BBL, fator estimulante de granulócitos-macrófagos (GMCSF), e IL- 21. Os resultados fornecidos nesse relatório descritivo demonstram que Ads recombinantes podem ser usados como um veículo de liberação local ou sistêmica para ácido nucleico, vacinas e/ou viroterapia oncolítica para cânceres.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[011]Em geral, um aspecto dessa invenção apresenta Ad recombinante que compreende: (a) um genoma de Ad de uma primeira cepa de Ad e (b) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de héxon de uma segunda cepa de Ad, em que uma ou mais das regiões hipervariáveis (HVRs) do polipeptídeo de héxon são diferentes das HVRs codificadas pelo genoma de Ad. A primeira cepa de Ad pode ser uma primeira cepa de Ad humano, e a segunda cepa de Ad pode ser uma segunda cepa de Ad humano que é diferente da primeira cepa de Ad humano. A primeira cepa de Ad e a segunda cepa de Ad podem ser de sorotipos distintos. A primeira cepa de Ad pode ser uma cepa Ad6 humana, e a segunda cepa de Ad pode ser uma cepa Ad57 humana. O Ad recombinante também pode incluir um ou mais polipeptídeos de direcionamento, polipeptídeos antigênicos, enzimas, substituições de aminoácidos, PEGuilação, ligantes, tags e semelhantes.
[012]Um Ad recombinante pode ser usado como um vetor para vacinação à base de gene, para aplicação/liberação de terapia gênica, ou para viroterapia oncolítica.
[013]Em uma modalidade adicional, o Ad recombinante compreende: (a) um genoma de Ad de uma primeira cepa de Ad e (b) um ácido nucleico que codifica pelo menos um polipeptídeo de héxon de uma ou mais cepas de Ad, em que as regiões hipervariáveis (HVRs) do polipeptídeo de héxon das (uma ou mais) cepas de Ad são diferentes das HVRs codificadas pelo genoma do primeiro Ad.
[014]Em uma modalidade adicional, o Ad recombinante pode ser um Ad replicação-competente ou condicionalmente replicante (por exemplo, um CRAd).
[015]Em outro aspecto, essa invenção apresenta um Ad recombinante e/ou quimérico que compreende: (a) ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo de héxon e (b) um segundo polipeptídeo de héxon, em que a sequência de aminoácido do primeiro polipeptídeo de héxon é diferente da sequência de aminoácido do segundo polipeptídeo de héxon. A sequência de aminoácido de uma região hipervariável (HVR) do primeiro polipeptídeo de héxon pode ser diferente da sequência de aminoácido de uma região hipervariável do segundo polipeptídeo de héxon. O ácido nucleico pode ser de uma primeira cepa de Ad, e o segundo polipeptídeo de héxon pode ser de uma segunda cepa de Ad. A primeira cepa de Ad pode ser uma primeira cepa de Ad humano, e a segunda cepa de Ad pode ser uma segunda cepa de Ad humano diferente da primeira cepa de Ad humano. A primeira cepa de Ad e a segunda cepa de Ad podem ser de sorotipos distintos. A cepa de Ad pode ser uma cepa Ad6 humana, e a segunda cepa de Ad pode ser uma cepa Ad57 humana. O Ad recombinante também pode incluir um polipeptídeo de direcionamento. O polipeptídeo de direcionamento pode incluir a sequência de aminoácido TARGEHKEEELI (ID. DE SEQ. N°: 1).
[016]Em uma modalidade adicional, o Ad recombinante compreende: a) ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo de héxon e (b) um segundo polipeptídeo de héxon de uma ou mais cepas de Ad, em que a sequência de aminoácido do primeiro polipeptídeo de héxon é diferente da sequência de aminoácido do segundo polipeptídeo de héxon das (uma ou mais) cepas de Ad.
[017]Em uma modalidade adicional, o Ad recombinante pode ser um Ad replicação-competente ou Ad condicionalmente replicante (por exemplo, um CRAd).
[018]Em outro aspecto, a invenção fornece materiais e métodos para o tratamento de um mamífero que possui câncer. Os métodos podem incluir ou consistir basicamente na administração a um mamífero que possui câncer, de um Ad recombinante que compreende: (a) um genoma de Ad de uma primeira cepa de Ad e (b) pelo menos um polipeptídeo de héxon de uma ou mais cepas de Ad, em que uma ou mais das regiões hipervariáveis (HVRs) do polipeptídeo de héxon são diferentes das HVRs codificadas pelo genoma de Ad e/ou um Ad que compreende: (a) ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo de héxon e (b) um segundo polipeptídeo de héxon, em que a sequência de aminoácido do primeiro polipeptídeo de héxon é diferente da sequência de aminoácido do segundo polipeptídeo de héxon. O mamífero pode ser um humano. O câncer pode ser câncer de próstata, câncer ovariano, câncer de pulmão, carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer renal, melanoma, câncer cerebral, câncer do cólon, linfoma, mieloma, leucemia linfocítica ou leucemia mielógena. A administração pode incluir administração sistêmica ou local (por exemplo, administração intravenosa, intratumoral, intramuscular, intra-órgão, intralinfonodo).
[019]É demonstrado nesse relatório descritivo que Ad657 e variantes deste são capazes de liberar genes terapêuticos às células para expressão de polipeptídeos terapêuticos. Dessa forma, Ads recombinantes, incluindo Ads quiméricos, podem ser usados como um veículo de liberação local ou sistêmica para ácido nucleico, vacinas e/ou viroterapia oncolítica para cânceres.
[020]Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentadas nos exemplos e desenhos em anexo, bem como na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da descrição e desenhos, e a partir das reivindicações. Um adenovírus recombinante (Ad) que compreende: (a) um genoma de Ad que codifica polipeptídeos de héxon de uma primeira cepa de Ad e (b) um ácido nucleico que codifica pelo menos um polipeptídeo de héxon de uma ou mais cepas de Ad diferentes, em que pelo menos uma região hipervariável (HVR) do polipeptídeo de héxon é diferente das HVRs codificadas pelo genoma de Ad da primeira cepa de Ad.
[021]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que a primeira cepa de Ad e as (uma ou mais) cepas de Ad diferentes são de sorotipos distintos.
[022]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que a primeira cepa de Ad é uma cepa Ad6 humana, e em que uma segunda cepa de Ad é uma cepa Ad57 humana.
[023]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo que ainda compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de direcionamento, antígeno, enzima, receptor, ligante ou tag.
[024]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que o polipeptídeo de direcionamento compreende uma sequência de aminoácido selecionada do ID. DE SEQ. N°: 1-41 e ID. DE SEQ. N°: 46-47.
[025]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que o referido Ad recombinante é um Ad replicação-competente.
[026]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que o Ad replicação- competente é a Ad de ciclo único ou Ad condicionalmente replicante (CRAd).
[027]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um adenovírus recombinante (Ad) desse tipo que compreende: (a) polipeptídeos do capsídeo de Ad de uma primeira cepa de Ad e (b) pelo menos um polipeptídeo de héxon de uma ou mais cepas de Ad diferentes, em que regiões hipervariáveis (HVRs) do polipeptídeo de héxon ou polipeptídeos do capsídeo são diferentes das HVRs ou polipeptídeos do capsídeo da primeira cepa de Ad.
[028]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um adenovírus recombinante (Ad) desse tipo que compreende: (a) um ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo de héxon e (b) um ácido nucleico que codifica um segundo polipeptídeo de héxon, em que a sequência de aminoácido do primeiro polipeptídeo de héxon é diferente da sequência de aminoácido do segundo polipeptídeo de héxon.
[029]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que o ácido nucleico que codifica pelo menos um polipeptídeo de héxon é diferente da sequência de aminoácido de uma região hipervariável do referido segundo polipeptídeo de héxon.
[030]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que o referido ácido nucleico é de uma primeira cepa de Ad, e em que o referido segundo polipeptídeo de héxon é de uma segunda cepa de Ad.
[031]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que a referida primeira cepa de Ad é uma primeira cepa de Ad humano, e em que a referida segunda cepa de Ad é uma segunda cepa de Ad humano diferente da referida primeira cepa de Ad humano.
[032]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que a referida primeira cepa de Ad e a referida segunda cepa de Ad são de sorotipos distintos.
[033]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que a referida primeira cepa de Ad é uma cepa Ad6 humana, e em que a referida segunda cepa de Ad é uma cepa Ad57 humana.
[034]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, que ainda compreende um polipeptídeo de direcionamento.
[035]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que o referido polipeptídeo de direcionamento compreende uma sequência de aminoácido TARGEHKEEELI (ID. DE SEQ. N°: 1).
[036]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que o referido Ad recombinante é um Ad replicação-competente.
[037]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um Ad recombinante desse tipo, em que o referido Ad replicação-competente é um Ad de ciclo único ou Ad condicionalmente replicante (CRAd).
[038]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um método para o tratamento de um mamífero que possui câncer, em que o referido método compreende a administração, ao referido mamífero, de um adenovírus recombinante (Ad) como descrito nesse relatório descritivo.
[039]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um método desse tipo, em que o referido câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de próstata, câncer ovariano, câncer de pulmão, carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer renal, melanoma, câncer cerebral, câncer do cólon, linfoma, mieloma, leucemia linfocítica eleucemia mielógena.
[040]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um método desse tipo, em que a referida administração compreende administração sistêmica.
[041]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um método desse tipo, em que a administração sistêmica compreende administração intramuscular, intranasal ou intravenosa.
[042]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um método desse tipo, em que a referida administração compreende administração local.
[043]Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um método desse tipo, em que a referida administração local compreende injeção intratumoral.
[044]Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem os mesmos significados como comumente compreendidos por aqueles técnicos no assunto à qual essa invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos nesse relatório descritivo possam ser usados para a prática da invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas nesse relatório descritivo são incorporados por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, predominará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não visam ser limitantes.
[045]Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partir da descrição e desenhos, e a partir das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[046]A Figura 1 mostra uma tradução de peptídeos contexto-específicos de fago em adenovírus. A) Diagrama de uma biblioteca de apresentação em fago que contém as folhas- β HI de fibra do Ad5 que restringem estruturalmente uma biblioteca aleatória de peptídeo de 12-mer. É mostrado abaixo uma representação do sítio estruturalmente similar entre as folhas β7 e β8 no héxon de Ad5 HVR5. B) Alinhamentos de aminoácidos primários de 12.51 e 12.52 na biblioteca HI e sua localização quando inseridos em HVR5 de héxon. C) Representação de vírus que expressam Ad5 GFP-Luc modificados com os peptídeos.
[047]A Figura 2 mostra transdução in vitro. A) Expressão de GFP por microscopia fluorescente de células C2C12 infectadas com 104 vp/célula dos vetores indicados 2 dias após infecção. B) Atividade de luciferase de células C2C12 2 dias após infecção com MOIs variadas dos Ads indicados.
[048]A Figura 3 mostra transdução in vivo em camundongos. A) O imageamento de luciferase de camundongos 1 dia após injeção pela via intravenosa (IV) ou intramuscular (IM). Camundongos injetados por via IM receberam 109 vp em cada quadríceps. Camundongos injetados por via IV receberam 1010 vp pela veia da cauda. B) Quantificação da atividade de luciferase por imageamento nos dias indicados após injeção. * p < 0,05 por ANOVA de uma-via. *** p < 0,001 por ANOVA de uma-via.
[049]A Figura 4 mostra transdução in vivo em hamsters. A) Atividade de luciferase nos músculos de hamsters 1 dia após injeção com 1010 vp pela via IM. ** p < 0,01 por teste- T.
[050]A Figura 5 mostra respostas imunes à base de gene 16 semanas após imunização IM única. Camundongos da Fig. 3 foram sangrados 16 semanas após injeção IM e seus soros foram analisados em diluições seriais por ELISA para detectar anticorpos contra proteína GFP. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 por ANOVA de uma-via. **** p < 0,0001 por ANOVA de uma-via. Todos os camundongos injetados com Ad geraram anticorpos anti-GFP significantes, quando comparados com o grupo de PBS em diluições dos soros de 1:10.000 até o 1:1.000. Comparações de Ad5-GL-HVR-12.51 e 12.52 com Ad5-GL são mostradas com asteriscos pretos. A comparação entre Ad5- GL-HVR-12.51 e Ad5-GL-HVR-12.52 é mostrada com um asterisco cinza. Uma linha cinza tracejada e pontilhada em OD 0,06 mostra o intervalo de confiança de 95% que discrimina anticorpos que são diferentes do grupo de PBS.
[051]A Figura 6 mostra uma árvore filogenética de sequências do genoma inteiro de sorotipos de adenovírus humano.
[052]A Figura 7 mostra um alinhamento de Ad5, 6 e 57 que mostra variação em héxon e regiões E3. (A) Um alinhamento de DNA de Pustell dos genomas de Ad6 e Ad57. Caixas indicam héxon e regiões E3 nas quais a variação é a maior entre os dois vírus. (B) O alinhamento ClustalW de aminoácidos da região hipervariável em proteínas do héxon de Ad5, Ad6 e Ad57. Os alinhamentos foram realizados em MacVector.
[053]A Figura 8 mostra um esquema da construção de Ad657 por substituição das HVRs de Ad6 com HVRs de Ad57. Abreviação: HVRs, regiões hipervariáveis.
[054]A Figura 9 mostra atividade oncolítica in vitro. Células LNCaP e DU145 foram tratadas com os vírus indicados com as vp/célula indicadas por 5 dias. As células foram coradas com violeta cristal e a viabilidade celular foi medida por OD595. A viabilidade celular (%) foi calculada por divisão da OD das amostras pela OD média de células de controle não tratadas na mesma placa de 96 poços e multiplicação desse número por 100. (A) Morte de células LNCaP. (B) Morte de DU145. Abreviação: vp, partícula viral.
[055]A Figura 10 mostra os efeitos de Ads oncolíticos sobre o dano hepático. Camundongos C57BL/6 (n = 6 por grupo) foram injetados com 1011 vp de cada vírus pela veia da cauda. (A) Sobrevida de Kaplan-Meier. (B) Sangue foi retirado para medições de ALT 3 dias após injeção (**** p < 0,001 por ANOVA). Abreviações: ALT, alanina aminotransferase; vp, partícula viral.
[056]A Figura 11 mostra a atividade anticâncer de Ad6 e Ad657 em xenoenxertos de tumor DU145 em camundongos nude após administração i.v. única. Camundongos nude (n = 9 por grupo) que abrigam tumores DU145 estabelecidos foram injetados i.v. com uma única dose de 3 x 1010 vp dos vírus indicados ou com PBS. (A) Efeito de uma única injeção i.v. sobre o crescimento tumoral. As dimensões do tumor foram medidas com compassos de calibre e o volume tumoral foi calculado como largura2 x comprimento x 1/2. Os dados são mostrados como média ± SE. * p <0,05, **** p = 0,0001 por ANOVA ou por teste-T como descrito no texto. Asteriscos pretos com uma seta preta apontando para cima indicam a diferença estatística entre o grupo de Ad6 e o grupo de PBS em um dia selecionado descrito no texto. Asteriscos cinzas e uma seta apontando para cima indicam diferenças entre o grupo de Ad657 e o grupo de PBS no dia indicado. Os asteriscos brancos sombreados com uma seta cinza apontando para baixo indica a diferença estatística entre os grupos de Ad6 e Ad657 no dia indicado. (B) Efeito de uma única injeção i.v. sobre a sobrevida. Os animais eram sacrificados quando o volume tumoral alcançava 2.000 μl ou quando outros critérios de sacrifício eram atendidos (por exemplo, ulceração) e curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram traçadas (* p <0,05, ** p <0,01 por análise de log-rank). Abreviação: i.v., intravenosa.
[057]A Figura 12 mostra o imageamento de luciferase camundongos nude. Quatro dias após injeção i.v. única de 3 x 1010 vp de Ad6 e Ad657-GFP-Luc com deleções de parte de 12,5K, 6,7K, 19K, 11,6K (ADP), 10,4K (RIDα), 14,5K (RIDβ) e 14,7K e uma deleção parcial de E4 34K. Abreviações: i.v., intravenosa; vp, partícula viral.
[058]A Figura 13 mostra o imageamento de luciferase camundongos nude. Observações: catorze dias após injeção i.v. única de 3 x 1010 vp de Ad657-GFP-Luc. Abreviações: i.v., intravenosa; vp, partícula viral.
[059]A Figura 14 mostra titulações plasmáticas de ligação de Env de HIV. Imunizações com diferentes SC-Ads e proteínas gp140 são mostradas acima do gráfico com setas grandes. Titulações de ligação de gp140 F8 no ponto médio por ELISA são mostradas para cada animal antes e depois de cada imunização. A linha tracejada indica o limite de detecção mínimo para anticorpos nesse ensaio. Os símbolos foram espalhados na direção x em cada ponto do tempo para permitir que medições individuais fossem observadas. SC-Ad6- Ebov é uma vacina de Ad de controle negativo. Esse grupo de animais não foi reforçado com gp140. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 por ANOVA de uma-via em comparação com o grupo de SC-Ad6-Ebov.
[060]A Figura 15 mostra titulações plasmáticas neutralizantes de HIV. A neutralização dos vírus indicados foi realizada usando o ensaio de neutralização de TZM-bl. Todos os valores foram calculados em comparação com poços somente com vírus. Cada ponto representa o valor médio para cada animal.
[061]A Figura 16 mostra atividade de ADCC plasmática. Amostras de plasma foram testadas com células efetoras CD16- KHYG-1 para matar células-alvo CEM.NKR.CCR5.CD4+-Luc infectadas com SHIVSF162P3. Cada ponto representa o valor médio para cada animal. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 por ANOVA de uma-via vs. o grupo de SC-Ad6-Ebov.
[062]A Figura 17 mostra atividade de ADCC mucosa. Amostras de lavado vaginal e de saliva foram testadas com células efetoras CD16-KHYG-1 para matar células-alvo CEM.NKR.CCR5.CD4+-Luc infectadas com SHIVSF162P3. Cada ponto representa o valor médio para cada animal. * p < 0,05 por ANOVA de uma-via vs. o grupo de SC-Ad6-Ebov.
[063]A Figura 18 mostra Células Secretoras de IFN-Y de PBMCs e Linfonodos. PBMCs e células de linfonodo foram analisadas por ELISPOT por coloração por IFN-Y. Anti-Env indica células que foram estimuladas com peptídeos Env de HIV conservados, e SC-Ads. O número total de células formadoras de spot (SFCs) em cada um dos poços estimulados foi contado e ajustado para meio de controle como nível de fundo. Cada ponto representa o valor médio para cada animal. * p < 0,05 por ANOVA de uma-via.
[064]A Figura 19 mostra tráfego e ativação de células T mucosas. Células T foram colhidas de biópsias retais coletadas após o segundo reforço de proteína e analisadas por citometria de fluxo para CD4, CD8, integrina α4β7, CD69 e FoxP3. Cada ponto representa o valor médio para cada animal.
[065]A Figura 20 mostra resposta de células Tfh no sangue e em linfonodos. PBMCs e células de linfonodo coletadas na semana 40 foram estimuladas com proteína Env de HIV-1 e depois examinadas para co-expressão de CD3+, CD4+, CXCR5+ e IL-21. Cada ponto representa o valor médio para cada animal. * p < 0,05 por ANOVA de uma-via.
[066]A Figura 21 mostra proteção contra desafio retal repetido com SHIVSF162P3. Os grupos indicados foram desafiados por via retal com 4,3 TCID50 (em PBMCs de Rhesus) de SHIVSF162P3 semanalmente. Amostras de plasma foram analisadas para cópias de RNA viral de SHIV. Animais com cópias de RNA acima de 10 foram considerados infectados e o número de desafios necessário para infectar aquele animal foram usados como eventos para análise de sobrevida de Kaplan-Meier.
[067]A Figura 22 mostra aquisição de SHIVSF162P3 e cargas virais. A) Animais da Figura 8 foram agrupados por sua via de sensibilização SC-Ad (IM ou IN) inicial gerando grupos de 8 e análise de Kaplan-Meier foi realizada. B) Os níveis plasmáticos de RNA viral de SHIVSF162P3 ao longo do estudo de desafio.
[068]A Figura 23 mostra carga viral de SHIV em tecidos. RNA de PBMCs e tecidos post-mortem foram coletados e qPCR foi realizada para detectar analisados para RNA viral de SHIV.
[069]A Figura 24 mostra vacinas de adenovírus de ciclo único usadas no Exemplo 7. A) Esquema de sorotipos de SC-Ad 6 e 657 que carregam genes do envelope de HIV F8 e G4 clado B. B) Alinhamento de héxons de Ad clado C, incluindo os héxons de Ad6 e 57 exibidos em vacinas.
[070]A Figura 25 mostra titulações de ligação na saliva e vaginais de env de HIV. Os níveis de ELISA OD450 são mostrados para as amostras indicadas nas diluições indicadas quando testadas contra F8. O nível baixo de anticorpos nessas amostras mucosas impede alcançar a saturação do ensaio. Por essa razão, os valores de EC50 não puderam ser calculados confiavelmente para a maioria dos animais. O macaco Rhesus Rh13-091 no grupo IN-IM-IM foi o único animal no qual uma EC50 pode ser calculada (EC50 = 4.580). Resultados similares foram observados em ELISAs usando gp140 de SF162.
[071]A Figura 26 mostra genes de Ad657 que expressam antígeno de gB de hepatite C e citomegalovírus (CMV) que geram atividade de linfócitos T citotóxicos (CTL) in vivo. É mostrada a morte de células-alvo carregadas com peptídeo C de hepatite em camundongos vacinados com Ad657-HCV, e não gB de CMV.
[072]A Figura 27 mostra a expressão de GMCSF humano por Ad657 que induz proliferação de eritroblastos humanos TF-1 GMCSF-dependentes.
[073]A Figura 28 é um gráfico que mostra injeção IV única de Ad6 vs. tumores de pulmão A549.
[074]A Figura 29 é um gráfico que mostra injeção IV ou IT única de Ad6 vs. tumores pancreáticos Panc1.
[075]A Figura 30 é um gráfico que mostra injeção IV única de Ad6 vs. câncer renal em hamsters imunocompetentes.
[076]A Figura 31 é um gráfico que mostra atividade de luciferase em células de tumor/câncer de melanoma B16 e de pulmão A549 por Ads que exibem peptídeos de ligação à célula 12.51 em HVR5 do héxon.
[077]A Figura 32 é um gráfico que mostra a atividade de luciferase em carcinoma hepatocelular e câncer renal por Ads que exibem peptídeos de ligação à célula 12.51 em HVR5 do héxon.
[078]A Figura 33 mostra um esquema que combina a inserção de HVRs individuais de diferentes sorotipos de Ad com a inserção de peptídeos de direcionamento/desvio de direcionamento (detargeting) a células ou novos aminoácidos como, por exemplo, cisteína, no héxon para modificação química e blindagem direcionadas. São retratadas construções quiméricas de HVR que combinam diferentes HVRs de diferentes sorotipos de Ad para modular interações naturais com células e fatores sanguíneos que aprimoram a farmacologia, combinadas com a inserção de peptídeos de ligação às células e desvio de direcionamento de células em diferentes HVRs para alterar a entrada na célula e evasão de células. Se uma HVR é substituída de 100 Ads, isso criaria 100 quimeras de héxon diferentes. Se cada uma de todas as 7 HVRs recebe uma HVR de Ad diferente, essa biblioteca combinatória equivaleria a 7100 variantes. Se um peptídeo fosse introduzido em 7 HVRs, isso equivaleria a 7 X 7100 variantes. Se 10 peptídeos diferentes fossem introduzidos em 7 HVRs, isso equivaleria a 10 X 7 X 7100 variantes etc.
[079]A Figura 34 mostra mapas de plasmídeos para héxons combinatórios e combinações de peptídeos representativos. São mostrados héxons de HVR1 de Ad6 e HVRs 2-7 de Ad57, bem como inserções de peptídeos de direcionamento celular em HVRs individuais.
[080]A Figura 35 mostra construções quiméricas de HVR que combinam diferentes HVRs de diferentes sorotipos de Ad para modular interações naturais com células e fatores sanguíneos que aprimoram a farmacologia, combinadas com inserção de peptídeos de ligação às células e desvio de direcionamento de células em diferentes HVRs para alterar a entrada na célula e evasão de células. Nesse exemplo, um único aminoácido cisteína é inserido nas HVR1 e HVR5 de Ad657 para modular a farmacologia e permitir a conjugação direcionada de polímeros como, por exemplo, polietileno glicol ou outras porções como, por exemplo, agentes de imageamento como, por exemplo, fluoróforos.
[081]A Figura 36 mostra a conjugação de polietileno glicol (PEG) a Ad657-HVR1-C. A) SDS-PAGE de proteínas de Ad com e sem PEGuilação. Setas mostram aumentos de tamanho em decorrência da adesão química de PEG ao héxon. B) Efeitos da PEGuilação direcionada por maleimida-PEG e NHS-PEG não- direcionamento sobre infecção pelo vírus.
[082]A Figura 37 mostra a conjugação de polietileno glicol (PEG) a Ad657-HVR5-C. A) SDS-PAGE de proteínas de Ad com e sem PEGuilação. B) Imageamento por infravermelho próximo de SDS-PAGE de proteínas de Ad com e sem PEGuilação e com e sem o tag de imageamento de fluorescência no infravermelho próximo IR800. C) Transdução in vivo após injeção intraperitoneal de Ad657-HVR5-C maleimida-PEGuilado por imageamento de luciferase.
[083]A Figura 38 mostra o imageamento de luciferase de camundongos nude. A) 1, 4, 7, 14, 28 e 42 dias após injeção I.V. única de tratamento com Ad6 vs. tumores de próstata DU145 distantes. B) 3, 7 e 19 dias após injeção I.V. de Ad5- GFPLUC replicante em camundongos que abrigam tumores de próstata LNCaP.
[084]A Figura 39 mostra uma representação esquemática de Ads condicionalmente replicantes câncer-específicos (CRAds) dl1101+dl1107 que possuem uma modificação no gene E1A.
[085]A Figura 40 é um gráfico que mostra que Ad6 e Ad657 podem, ambos, ser usados como CRAds para terapia direcionada do câncer.
[086]A Figura 41 é uma representação esquemática que mostra ciclos terapêuticos de Ad. A) Uma representação esquemática de mudança de sorotipo com Ads. B) Uma representação esquemática de um ciclo terapêutico exemplar no qual Ad6 e Ad657 podem ser usados para várias rodadas de tratamento por mudança de sorotipo em combinação com conjugação covalente de polímero.
[087]A Figura 42 demonstra mudança de sorotipo e atividade de luciferase no alvo nos tumores de próstata DU145 após uma única injeção IV de Ad6 e Ad6-F35 com deleções nos genes E3A (12,5K, 6,7K, 19K, 11,6K), mas retenção de genes E3B (10,4K, 14,5K e 14,7K) e retenção de E4 34K. Camundongos cujos tumores resistiram à injeção IV única prévia com Ad657 e CRAd657, ambos com genes E3 intactos foram injetados com os vetores indicados por injeção IV única.
[088]A Figura 43 é uma representação esquemática de um Ad replicação-competente (RC-Ad), em que a expressão de E1 é controlada pelo promotor de E1 nativo; um CRAd-Probasina- E1A variante (Ad-PB), em que a expressão de E1 é controlada pelo promotor de probasina próstata-específico; CRAd-dl1101, em que a ligação à via de p300 é removida, suscetível à via de IFN em células normais; CRAd-dl1107, em que a ligação à pRB removida permite que o vírus mate células de câncer com rupturas da via de RB, mas está reprimida em células normais RB+; CRAd-dl1101/07, em que a ligação à via de p300 é removida, suscetível à ligação de pRB à via de IFN removida, permite que o vírus mate células de câncer com rupturas da via de RB, mas está reprimida em células normais RB+.
[089]A Figura 44 (A e B) mostra o efeito da infecção com Ad5, Ad6, Ad657 replicação-competentes em células não cancerosas e modificação de Ad6 e Ad657 para serem Ads condicionalmente replicantes (CRAds).
[090]A Figura 45 demonstra a morte de células cancerosas por Ad5, Ad6, Ad657 replicação-competentes, e pelos CRAds indicados.
[091]A Figura 46 demonstra a modificação de Ad6 e Ad657 para serem Ads condicionalmente replicantes (CRAds).
[092]A Figura 47 demonstra a modificação de Ad6 e Ad657 para serem Ads condicionalmente replicantes (CRAds).
[093]A Figura 48 demonstra efeitos in vivo de Ad6 replicação-competente ou dos CRAds indicados sobre o crescimento de tumores DU145 em camundongos.
[094]A Figura 49 demonstra os efeitos in vivo de Ad657 replicação-competente e Ad657-dl1101/07 condicionalmente replicante, ambos com regiões E3 intactas in vivo após uma única injeção intravenosa em camundongos que abrigam tumores de próstata humanos.
[095]A Figura 50 demonstra que a PEGuilação desvia o adenovírus do fígado in vivo.
[096]A Figura 51 demonstra a modificação de Ad657 com a fibra mais curta de AdC68 de chimpanzé e a adição de um gene E4 34K com oscilação de códons altera a eficácia in vitro.
[097]A Figura 52 demonstra morte por vírus 6/56/6 de células de câncer de próstata humano com e sem modificações de CRAd.
[098]A Figura 53 demonstra a produção de respostas de anticorpo contra o receptor de folato alfa de antígeno de câncer humano após uma única imunização intramuscular de camundongos BALB/c por CRAd657-dl1101/07-FOLR com uma região E3 intacta.
[099]A Figura 54 retrata sítios em HVRs de Ad que podem ser modificados, por exemplo, por PEGuilação ou “BAPilação” com peptídeos aceitadores de biotina (BAPs).
[100]A Figura 55 é uma representação esquemática de variantes de Ads que possuem mutações na proteína E1 para converter o vírus em um Ad condicionalmente replicante (CRAd).
[101]A Figura 56 mostra sequências de aminoácidos da porção do terminal-N do polipeptídeo E1A do tipo-selvagem e o terminal-N de E1A das variantes de CRAd, dl1101, dl1107 e dl1101/1107.
[102]A Figura 57 mostra uma representação esquemática de diferentes genes de evasão imune E3 em espécies de Ad C exemplares Ad6 e espécies de Ad D exemplares Ad26. Ambos os Ads expressam variantes de tamanho e sequência de genes E3 12,5K, 6,7K, 19K, 10,4K (RIDα), 14,5K (RIDβ) e 14,7K, bem como uma representação das funções dessas proteínas codificadas por E3.
[103]A Figura 58 demonstra os efeitos da PEGuilação e deleção de E3 sobre a atividade antitumoral viral oncolítica por vírus Ad6-Luc em hamsters imunocompetentes. Ad6-Luc e Ad6-Luc-20K PEG possuem todos os genes E3 e E4 34K intactos. Ad6-deltaE3-Luc possui deleção parcial de E3 12,5K e E4 34K e deleção completa de genes E3 6,7K, 19K, 11,6K (ADP), 10,4K (RIDα), 14,5K (RIDβ) e 14,7K. A eficácia oncolítica é perdida no modelo em animal imunocompetente quando esses genes de evasão imune não estão presentes em adenovírus oncolítico.
[104]A Figura 59 é um mapa de plasmídeos de Ad657 com deleção parcial de E3 12,5K e E4 34K e deleção completa de genes E3 6,7K, 19K, 11,6K (ADP), 10,4K (RIDα), 14,5K (RIDβ) e 14,7K.
[105]A Figura 60 retrata construções de CRAd 657 com e sem modificações de CRAd dl1101/1107 e com e sem deleções de genes de evasão imune E3 selecionados.
[106]A Figura 61 retrata CRAd657 com sítio de inserção de E3. Estes são com e sem modificações de CRAd dl1101/1107 descritas nesse relatório descritivo e com e sem modificações de evasão imune E3.
[107]A Figura 62 retrata Fibra de CRAd657 Ad35 +/- ou peptídeo de Fibra C68 +/- K7 de Chimpanzé. Esses com e sem modificações de CRAd dl1101/1107 descritas em slides prévios e com e sem modificações de evasão imune E3. Em alguns casos, um gene de oscilação de códons E4 34K é incluído após E4 e antes da fibra para compensar deleção parcial de E4 34K quando genes E3B deletados.
[108]A Figura 63 retrata Fibra de CRAd657 Ad35 +/- ou peptídeo de Fibra C68 +/- K7 de Chimpanzé. Esses são com e sem modificações de CRAd dl1101/1107 descritas em slides prévios e com e sem modificações de evasão imune E3.
[109]A Figura 64 retrata Fibra de CRAd657 Ad35 +/- ou peptídeo de Fibra C68 +/- K7 de Chimpanzé que Expressa Receptor alfa de Folato.
[110]A Figura 65 retrata Fibra de CRAd657 Ad35 +/- ou peptídeo de Fibra C68 +/- K7 de Chimpanzé que Expressa Fator Estimulante de Colônia de Granulócitos-Macrófagos (GMCSF).
[111]A Figura 66 retrata Fibra de CRAd657 Ad35 +/- ou peptídeo de Fibra C68 +/- K7 de Chimpanzé que Expressa 4- 1BBL ou GMCSF ou IL21 ou CD40L e combinações em um vírus.
[112]A Figura 67 retrata Fibra de Ad6/57 com HVR1 de Ad6 e HVRs 2-7 de Ad57 +/- Ad35 ou peptídeo de Fibra C68 +/- K7 de Chimpanzé.
[113]A Figura 68 retrata Fibra de Ad6/57/6 com HVR1 de Ad6, HVRs 2-6 de Ad57, HVR7 de Ad6 +/- Ad35 ou peptídeo de Fibra C68 +/- K7 de Chimpanzé.
[114]A Figura 69 retrata Fibra de Ad6/57/6 com HVR1 de Ad6, HVRs 2-6 de Ad57, HVR7 de Ad6 +/- Ad35 ou peptídeo de Fibra C68 +/- K7 de Chimpanzé que expressa GFP-Luciferase.
[115]A Figura 70 mostra o imageamento de luciferase após mudança de sorotipo. Camundongos que abrigam tumores de próstata LNCaP em seus flancos foram tratados por uma única injeção IV de Ad657 ou CRAd657. Camundongos com tumores residuais 5 meses após injeção IV única foram tratados por mudança de sorotipo das variantes de Ad6/57/6 indicadas que expressam GFP-Luciferase com e sem fibras variantes e um gene E4 34K códon-otimizado. As variantes de Ad6/57/6 indicadas incluem vírus Ad6/57/6 que possui diferentes modificações de fibras, incluindo uma 7 lisina adicionada na fibra (K7), fibra de chimpanzé C68 enxertada sobre fibra de Ad6 após seu domínio de flexibilidade KKTK e com uma fibra de Ad35. Camundongos tiveram imagens obtidas quanto à atividade de luciferase 7 dias mais tarde.
[116]A Figura 71 mostra células de câncer de pulmão humano A549 que foram tratadas com as partículas virais (vp) indicadas por célula de Ad6/57/6 com e sem fibras variantes e um gene E4 34K códon-otimizado. Sete dias mais tarde, as células foram coradas com violeta cristal e os poços foram analisados em uma leitora de placas. OD alta indica a presença de células viáveis. OD baixa indica morte e perda de células aderentes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[117]Essa invenção fornece métodos e materiais para liberação de ácido nucleico, vacinação e/ou tratamento de câncer. Por exemplo, essa invenção fornece métodos e materiais para liberação de ácido nucleico de proteínas/polipeptídeos, vacinação e/ou tratamento de câncer com o uso de um ou mais Ads recombinantes (por exemplo, Ad657 e variantes deste) como um agente oncolítico.
[118]Um adenovírus icosaedro é constituído por 720 cópias de sua proteína de héxon. O vírus não usa essa proteína para se ligar aos receptores, mas essa grade nano de proteínas de repetição fornece uma matriz para interações (por exemplo, interações naturais e interações não naturais) com proteínas, células e fármacos. Anticorpos que podem neutralizar Ads podem visar regiões hipervariáveis (HVRs) do polipeptídeo de héxon em Ads.
[119]Em alguns casos, essa invenção fornece Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer. Por exemplo, um Ad recombinante pode ser derivado de um primeiro Ad e pode incluir HVRs de héxon de um ou mais Ads diferentes. As HVRs podem ser derivadas de Ads C de qualquer espécie, por exemplo, Ad1, Ad2, Ad5, Ad6 e Ad57. Em uma modalidade, um Ad recombinante pode ser derivado de um primeiro Ad e pode incluir uma ou mais HVRs de héxon de pelo menos outro Ad, em que pelo menos uma HVR de héxon é diferente da(s) HVR(s) do primeiro Ad. A primeira cepa de Ad pode ser uma cepa Ad6 humana, e a segunda cepa de Ad pode ser uma cepa Ad57 humana. Mapas de plasmídeos carreadores de héxon (Figura 34) exibem a combinação da inserção de HVRs individuais de diferentes sorotipos de Ad com a inserção de peptídeos de direcionamento/desvio de direcionamento celular ou novos aminoácidos como, por exemplo, cisteína, no héxon para modificação química e blindagem direcionadas. Em uma modalidade, os Ads recombinantes compreendem substituições de aminoácidos, por exemplo, substituição de cisteínas em polipeptídeos, e modificações como, por exemplo, PEGuilação e BAPilação. A habilidade para direcionar polímero e outras modificações químicas às cisteínas inseridas no héxon de Ad657 é demonstrada nesse relatório descritivo.
[120]É demonstrado Ad657 como um oncolítico contra câncer de próstata humano. As HVRs de Ad6 foram substituídas com aquelas de Ad57 para gerar um vírus oncolítico da espécie C quimérico denominado Ad657. Ad657 e Ad6 foram testados como terapias oncolíticas sistêmicas por injeção i.v. única em camundongos nude que abrigam tumores cancerosos humanos. Ad657 pode ser usado como uma viroterapia oncolítica local ou sistêmica para cânceres. Esses dados também demonstram efeitos surpreendentes de mudança de sorotipo com Ads oncolíticos da espécie C.
[121]Em alguns casos, essa invenção fornece métodos para a utilização de um ou mais Ads recombinantes fornecidos nesse relatório descritivo para tratar um mamífero que possui, ou em risco de ter, câncer, uma doença infecciosa e/ou uma doença genética. Por exemplo, um ou mais Ads recombinantes podem ser administrados a um mamífero que possui, ou em risco de ter, câncer, para reduzir o número de células de câncer (por exemplo, por infecção e morte de células de câncer) no mamífero (por exemplo, um humano). Por exemplo, um ou mais Ads recombinantes podem ser administrados a um mamífero que possui, ou em risco de ter, câncer, para estimular respostas imunes anticâncer no mamífero (por exemplo, um humano).
[122]Em alguns casos, os Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657 recombinante e variantes deste) não são destruídos pelo sistema imune de um mamífero. Por exemplo, um Ad recombinante não é destruído por células apresentadoras de antígeno (APCs), macrófagos, e/ou outras células imunes em um mamífero no qual o Ad recombinante é administrado.
[123]Em alguns casos, os Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657 recombinante e variantes deste) podem ser administrados por múltiplas (por exemplo, duas ou mais) rodadas de tratamento. Por exemplo, um primeiro Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode evitar anticorpos que podem neutralizar um segundo Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo, e vice-versa. Quando um mamífero que possui câncer é tratado com um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo, o mamífero pode receber a administração de uma primeira rodada de tratamento com um primeiro Ad recombinante e pode subsequentemente receber a administração de uma segunda rodada de tratamento com um segundo Ad recombinante.
[124]Em alguns casos, os Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657 recombinante e variantes deste) podem ser Ads replicação-competentes (RC-Ads). Por exemplo, um RC-Ad pode ser um RC-Ad que inclui um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo E1 (por exemplo, um E1+ RC-Ad). Por exemplo, um RC-Ad pode ser um Ad de ciclo único (SC-Ad) que inclui uma deleção de um ou mais ácidos nucleicos que codificam um ou mais polipeptídeos associados à produção de prole viral infecciosa (por exemplo, pIIIa e E3). Por exemplo, um RC-Ad pode ser um Ad condicionalmente replicante (CRAd). Exemplos de Ads de ciclo único e como produzi-los e utilizá-los são fornecidos em outro lugar (Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO2009/111738).
[125]Em alguns casos, os Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657 recombinante e variantes deste) podem ser Ads com replicação defeituosa (RD-Ads). Por exemplo, um RD-Ad pode ser um RD-Ad que inclui uma deleção de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo E1 (por exemplo, um RD-Ad com E1 deletado).
[126]É demonstrado nos exemplos apresentados nesse relatório descritivo que CRAd 657 e variantes deste são Ads condicionalmente replicantes (CRAds) em células cancerosas e que a infecção de células com CRAd 657 e variantes deste reduz a viabilidade celular e o volume tumoral. Dessa forma, CRAd 657 e variantes deste pode ser usado como uma viroterapia oncolítica local ou sistêmica em indivíduos com câncer.
[127]Além disso, é demonstrado que CRAds podem ser usados para expressão de antígenos e usados como uma vacina para vacinação contra vírus, por exemplo, contra Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), Vírus do Papiloma Humano (HPV) e Vírus da Hepatite C (HCV).
[128]Em alguns casos, os Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657 recombinante e variantes deste) podem se ligar a um receptor da superfície celular (por exemplo, para facilitar a entrada viral em uma célula). Por exemplo, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode se ligar a receptores de coxsackie-adenovírus (CARs) e/ou receptores Fc (por exemplo, FcμR e FCYR), receptores de complemento (por exemplo, CR3 e/ou C2qR).
[129]Em um aspecto da invenção, CRAds podem compreender ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos heterólogos para o Ad, por exemplo, antígenos, receptores da superfície celular, polipeptídeos de direcionamento celular e semelhantes. Por exemplo, CRAd-657-dl1101/1107-FolR é um Ad recombinante que compreende E3 intacta e que expressa o receptor de folato alfa humano. É demonstrado nesse relatório descritivo que CRAds podem ser usados para gerar anticorpos contra antígenos de câncer conhecidos, por exemplo, receptor de folato alfa.
[130]Em alguns casos, os Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante) podem evitar a ligação (por exemplo, não se ligam) a um receptor scavenger (por exemplo, para facilitar a entrada viral em uma célula). Por exemplo, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo evita a ligação a receptores SREC e/ou receptores SR-A.
[131]Em alguns casos, os Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante) podem evitar a fagocitose.
[132]Em alguns casos, os Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante) são não patogênicos (por exemplo, a um mamífero que está sendo tratado como descrito nesse relatório descritivo).
[133]Em alguns casos, os Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante) podem infectar células em divisão (por exemplo, podem infectar somente células em divisão).
[134]Um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode ser qualquer Ad recombinante apropriado (por exemplo, um Ad recombinante que possui atividade oncolítica anticâncer) gerado por tecnologia e métodos de DNA recombinante conhecidos por aqueles técnicos no assunto. Um Ad recombinante pode ser qualquer Ad gerado por material de recombinação (por exemplo, ácido nucleico e/ou polipeptídeo) de qualquer organismo diferente do Ad do qual o Ad recombinante é derivado. Por exemplo, um Ad recombinante pode incluir um ou mais materiais que não ocorrem naturalmente naquele Ad (por exemplo, não ocorrem naturalmente naquele Ad antes da recombinação). Em alguns casos, um Ad recombinante fornecido nesse relatório descritivo pode ser um Ad quimérico (por exemplo, pode incluir elementos virais de dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou mais) genomas de Ad diferentes).
[135]Essas modalidades foram aplicadas também no contexto de Ads que combinam diferentes HVRs de Ads diferentes (ou seja, embaralhamento de HVRs). Por exemplo, HVR1 de Ad6 com HVRs 2-7 de Ad57 ou HVR 1 e 7 de Ad6 com HVRs 2-6 de Ad57, ou HVRs 1 e 7 de Ad6 e HVRs 2-6 de Ad657.
[136]Ácidos nucleicos e/ou polipeptídeos que não ocorrem naturalmente no Ad podem ser de qualquer fonte apropriada. Em alguns casos, um ácido nucleico e/ou um polipeptídeo que não ocorre naturalmente naquele Ad pode ser de um organismo não viral. Em alguns casos, um ácido nucleico e/ou um polipeptídeo que não ocorre naturalmente naquele Ad pode ser de um vírus diferente de um Ad. Em alguns casos, um ácido nucleico e/ou um polipeptídeo que não ocorre naturalmente naquele Ad pode ser de um Ad obtido de uma espécie diferente. Em alguns casos, um ácido nucleico e/ou um polipeptídeo que não ocorre naturalmente naquele Ad pode ser de uma cepa de Ad diferente (por exemplo, cepas de sorotipos distintos). Em alguns casos, um ácido nucleico e/ou um polipeptídeo que não ocorre naturalmente naquele Ad pode ser um ácido nucleico sintético e/ou um polipeptídeo sintético.
[137]Um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, um Ad recombinante que possui atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, um Ad657 recombinante) pode ser derivado de (por exemplo, pode incluir um arcabouço genômico de) qualquer Ad apropriado. Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode ser derivado de um Ad que possui soroprevalência baixa. Por exemplo, 50% ou menos (por exemplo, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou menos) de mamíferos (por exemplo, humano) podem ter sido expostos a um Ad do qual um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo é derivado. Com relação à soroprevalência, adenovírus da espécie C, Ad6 e Ad657, possuem prevalência menor do que vírus de arquétipo Ad5. Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode ser derivado de um Ad que possui efeitos colaterais reduzidos ou eliminados (por exemplo, fagocitose e dano hepático). Um Ad recombinante pode ser derivado de um Ad isolado de qualquer espécie de animal apropriada. Por exemplo, Ads podem ser isolados de humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos como, por exemplo, espécies de macacos do Velho Mundo como, por exemplo, macacos Rhesus), peixes, sapos e cobras. Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode ser derivado de um Ad humano (HAd ou HAdV). Um Ad recombinante pode ser derivado de qualquer espécie de Ad (por exemplo, A, B, C, D, E, F ou G). Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode ser derivado de um Ad espécie C (por exemplo, um Ad humano espécie C (HAd-C)). Um Ad recombinante pode ser derivado de qualquer sorotipo apropriado de Ad (por exemplo, 2, 5, 6 ou 57). Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode ser derivado de um sorotipo de Ad 6 (Ad6; por exemplo, a Ad6 humano).
[138]Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, um Ad recombinante que possui atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, um Ad657 recombinante e variantes deste) pode incluir um genoma de Ad que contém uma ou mais modificações em um ou mais ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo (ou fragmentos deste) e/ou um ou mais elementos virais do genoma de Ad. As (uma ou mais) modificações podem ser qualquer modificação apropriada. Em alguns casos, uma modificação pode ser eficaz para inibir a habilidade do polipeptídeo modificado para se ligar a outro polipeptídeo como, por exemplo, p300 e/ou pRB. Em alguns casos, uma modificação pode ser eficaz para neutralizar uma ou mais vias de interferon. Exemplos de modificações que podem ser feitas a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou a um elemento viral incluem, sem limitação, substituições, deleções, inserções e mutações.
[139]Ads, por exemplo, Ad657 e variantes deste, podem ser modificados e reter todos os genes E1A, ou modificados para deletar regiões e funções selecionadas de suas proteínas codificadas.
[140]A Figura 57 mostra uma representação esquemática de diferentes genes de evasão imune E3 em uma espécie de Ad C exemplar Ad6 e em uma espécie de Ad D exemplar Ad26, bem como uma representação das funções dessas proteínas codificadas por E3. Ambos os Ads expressam variantes de tamanho e sequência de genes E3 12,5K, 6,7K, 19K, 10,4K (RIDα), 14,5K (RIDβ) e 14,7K. 19K reduz a apresentação de proteínas MHC I e MIC na superfície celular para proteger células infectadas de células T e células NK. Proteínas RID protegem as células infectadas de ligantes de indução de morte (FAS, TRAIL, TNFR e EGFR). 14,7K inibe a ativação intrínseca de apoptose em células infectadas. Ads da espécie C também expressam o 11,6K conhecido como a proteína de morte dos adenovírus (ADP). A superexpressão de ADP acelera a morte celular, mas a morte global celular é igual. Vírus da espécie D também expressam duas novas variantes denominadas 49K e 31K. A forma secretada de 49K se liga a CD46 em células T e células NK, levando à infra-regulação dessas células e morte celular menos eficiente de células deficientes em MHC classe I por células NK. Plasmídeos de Ad657 foram modificados para reter todos os genes de evasão imune E3 nativos (12,5K, 6,7K, 19K, 11,6K (ADP), 10,4K (RIDα), 14,5K (RIDβ) e 14,7K) e E4 34K ou para deletar regiões selecionadas. Ad657 e suas variantes também são modificados com a adição de 49K e 31K para fornecer essas funções extras a essas plataformas de espécie viral C.
[141]Ads, por exemplo, Ad657 e variantes deste, podem ser modificados para reter todos os genes de evasão imune E3, ou para deletar regiões e funções selecionadas de suas proteínas codificadas. Com relação às mutações de E3: 19k infra-regula proteínas MHCI e MIC em células infectadas; a superexpressão de ADP acelera a morte celular, mas não aumenta o número de células que são mortas; as proteínas 10k e 14k (RIDα e RIDβ) combinam para bloquear a morte celular por proteínas de apoptose extrínsecas como, por exemplo, FAS, TRAIL, TNF, TNFR e EGFR; a proteína 14,7k inibe a sinalização de apoptose intrínseca.
[142]A retenção dessas proteínas E3 pode permitir que os oncolíticos persistam por mais tempo, e sua deleção pode aumentar a estimulação imune.
[143]Dados de testagem da eficácia oncolítica sugerem que E3 intacta medeia uma eficácia melhor.
[144]As construções DE3 deletavam parte de 12,5k através e incluindo 14,7k, construções DE3A deletavam parte de E3 12,5k através e incluindo 19k, e construções DE3ADP deletavam parte de E3 12,5k através e incluindo ADP.
[145]Surpreendentemente, a deleção de todos os genes E3 torna o vírus oncolítico menos eficaz na repressão do crescimento tumoral.
[146]Em uma modalidade, a invenção engloba adenovírus de ciclo único, por exemplo, SC-Ad657 e variantes deste. Vírus SC-Ad recombinantes com ácidos nucleicos heterólogos que codificam polipeptídeos foram avaliados para uso como uma vacina. Vacinas de SC-Ad657 por elas próprias geraram titulações significantes de anticorpo circulante contra uma proteína do envelope de HIV após apenas uma única imunização.
[147]Similarmente, Ad657 que carrega genes para antígenos de hepatite B e C é capaz de gerar respostas de linfócitos T citotóxicos (CTL) contra hepatite e citomegalovírus.
[148]Ad657 foi modificado por inserção de peptídeos sintéticos de vírus do papiloma humano em HVR5. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido do héxon de Ad657- HVR5-HPV variante é definida no ID. DE SEQ. N°: 57. A modificação permite a apresentação desse antígeno para fins de vacina, bem como redirecionando por ligação às proteínas que interagem com peptídeos de HPV.
[149]Em uma modalidade adicional, a expressão de Fator Estimulante de Colônia de Granulócito-Macrófago Humano (GMCSF) por Ad657 é demonstrada nesse relatório descritivo.
[150]Dessa forma, a partir dos exemplos apresentados nesse relatório descritivo, é demonstrado que Ads recombinantes, por exemplo, Ad657 e variantes deste, podem ser utilizados para expressão de proteínas heterólogas, por exemplo, antígenos polipeptídicos e polipeptídeos de direcionamento celular.
[151]Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, um Ad recombinante que possui atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, um Ad657 recombinante) pode incluir um genoma de Ad que contém uma ou mais substituições. Por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo (ou fragmentos deste) e/ou um ou mais elementos virais codificados pelo genoma de Ad podem ser substituídos. Uma substituição pode ser qualquer substituição apropriada. Em alguns casos, um ou mais ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo do capsídeo de um genoma de um primeiro Ad podem ser substituídos com um ou mais ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo do capsídeo de um segundo Ad para gerar um Ad quimérico. Por exemplo, quando um Ad recombinante inclui um genoma de um primeiro Ad no qual um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo do capsídeo no genoma é substituído por um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo do capsídeo de um segundo Ad (por exemplo, um Ad diferente do arcabouço de Ad), o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo do capsídeo do segundo Ad pode expressar um ou mais polipeptídeos do capsídeo, e o polipeptídeo (ou polipeptídeos) do capsídeo expresso pode ser incorporado no capsídeo do Ad recombinante. Exemplos de polipeptídeos do capsídeo incluem, sem limitação, polipeptídeos de héxon, polipeptídeos da fibra, polipeptídeos penton-base, polipeptídeos IIIa, polipeptídeos IX e polipeptídeos pVI.
[152]A proteína da fibra do Ad é um complexo de três subunidades aparentemente idênticas que medeiam a etapa inicial de adesão à célula. A proteína da fibra de Ad6 nativa compreende a sequência de aminoácido apresentada no ID. DE SEQ. N°: 60 e se liga ao CAR.
[153]Em um aspecto da invenção, Ads recombinantes e quiméricos com fibra modificada que possuem proteínas da fibra que não são nativas para o Ad parental ou de “arcabouço” foram gerados.
[154]Um Ad quimérico, quimera de fibra de AdF35, possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 61 e é mais curto do que proteínas da fibra de Ad5 e de Ad6 e redireciona o vírus para CD46.
[155]Um Ad recombinante com fibra modificada, que compreende Fibra K7 que possui a sequência do ID. DE SEQ. N°: 62, direciona o vírus para proteoglicanos de sulfato de heparina e cargas negativas nas células.
[156]Um Ad quimérico, recombinante, Fibra 6/FC68, que compreende a sequência do ID. DE SEQ. N°: 63, é um Ad quimérico que possui uma proteína da fibra de adenovírus de chimpanzé C68. A proteína da fibra é mais curta do que proteínas da fibra de Ad5 ou Ad6 e se liga ao CAR.
[157]Um Ad quimérico, recombinante, Fibra 6/FC68-K7, que compreende a sequência do ID. DE SEQ. N°: 64, é um Ad quimérico que possui uma proteína da fibra de adenovírus de chimpanzé C68. A proteína da fibra é mais curta do que proteínas da fibra de Ad5 ou Ad6. A Fibra 6/FC68-K7 se liga ao CAR e é redirecionada para sulfato de heparina e cargas negativas.
[158]Um Ad quimérico, recombinante, Fibra 6/FC68-HI-K7, que compreende a sequência do ID. DE SEQ. N°: 65, é um Ad quimérico que possui uma proteína da fibra de adenovírus de chimpanzé C68. A proteína da fibra é mais curta do que proteínas da fibra de Ad5 ou Ad6. A Fibra 6/FC68-HI-K7 se liga ao CAR e é redirecionada para sulfato de heparina e cargas negativas.
[159]Em alguns casos, um Ad recombinante pode incluir um genoma de um primeiro Ad no qual um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de héxon (por exemplo, HVRs de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de héxon) no genoma é substituído por um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de héxon (por exemplo, HVRs de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de héxon) de um segundo Ad. Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode incluir um genoma de um primeiro Ad que possui uma ou mais HVRs que são substituídas por uma ou mais HVRs de um segundo Ad. Por exemplo, um Ad recombinante pode ser uma quimera, em particular Ad657 (por exemplo, pode incluir um genoma de Ad6 no qual as HVRs de héxon são substituídas por HVRs de héxon de Ad57). Quando um Ad recombinante inclui um genoma de um primeiro Ad no qual um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de héxon no genoma é substituído por um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de héxon de um segundo Ad, o Ad recombinante pode incluir cerca de 1 até cerca de 720 polipeptídeos de héxon do segundo Ad. Por exemplo, quando um Ad recombinante é um Ad657, o Ad657 pode incluir um genoma de Ad6 e 720 polipeptídeos de héxon que incluem HVRs de héxon de Ad57.
[160]Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, um Ad recombinante que possui atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, um Ad657 recombinante) pode incluir um genoma de Ad que contém uma ou mais deleções de ácidos nucleicos. Uma deleção de ácido nucleico pode ser qualquer deleção de ácido nucleico apropriada. Uma deleção de ácido nucleico pode ser uma deleção completa (por exemplo, deleção de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo) ou uma deleção parcial (por exemplo, deleção de um ou mais nucleotídeos dentro de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo). Uma deleção de ácido nucleico pode reduzir ou eliminar a transcrição e tradução de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico deletado. Qualquer ácido nucleico apropriado pode ser deletado. Em alguns casos, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo associado à produção de prole infecciosa pode ser deletado. Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser deletados e/ou modificados em um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo que pode codificar E1 (por exemplo, E1A e E1B), E2, E3, E4, pIIIA, fibra, E1B, e incluem intensificadores e promotores virais. Por exemplo, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, um Ad recombinante que possui atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, um Ad657 recombinante) pode incluir um genoma de Ad que contém uma deleção de um ou mais nucleotídeos dentro de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo E1. Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode incluir uma ou mais substituições em um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo E1.
[161]Em modalidades particulares, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo é modificado para compreender um promotor de probasina que compreende, por exemplo, um ácido nucleico do ID. DE SEQ. N°: 48; um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo é modificado para compreender uma deleção dl1101 em um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo E1; um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo é modificado para compreender uma deleção dl1107 em um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo E1; um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo é modificado para compreender uma deleção dl1101 e uma deleção dl1107. Veja os exemplos apresentados nesse relatório descritivo e a Figura 56 para sequências de aminoácidos do terminal-N do polipeptídeo E1A, por exemplo, Ad E1A do tipo-selvagem, e variantes CRAd-657- dl1101, CRAd-657-dl1107 e CRAd-657-dl1101/1107.
[162]Em uma modalidade, uma variante CRAd-657- dl1101/1107-FolR compreende E3 intacta e expressa o receptor de folato alfa humano encontrado em células de câncer.
[163]Em geral, Ads podem ser modificados para incluir modificações de CRAd descritas nesse relatório descritivo.
[164]Em alguns casos, um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, um Ad recombinante que possui atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, um Ad657 recombinante) pode incluir um genoma de Ad que contém uma ou mais inserções de ácidos nucleicos. Por exemplo, uma inserção de ácido nucleico pode incluir um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. Um ácido nucleico pode ser inserido em qualquer localização apropriada dentro de um genoma de um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo. Em alguns casos, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo pode ser inserido em uma HVR (por exemplo, alça 5 da HVR) de um genoma de um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo. Por exemplo, quando um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo é inserido em uma HVR de um genoma de um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo, o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo pode expressar um ou mais polipeptídeos, e o(s) polipeptídeo(s) expresso(s) pode ser incorporado no capsídeo do Ad recombinante. Quando um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo é inserido em uma HVR de um genoma de um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo, o Ad recombinante pode apresentar de cerca de 1 até cerca de 720 polipeptídeos codificados pelo ácido nucleico inserido em sua superfície. Uma inserção de ácido nucleico pode ser um ácido nucleico que codifica qualquer polipeptídeo apropriado. Em alguns casos, uma inserção de ácido nucleico pode codificar um antígeno polipeptídico.
[165]Em alguns casos, uma inserção de ácido nucleico pode codificar um polipeptídeo de direcionamento. Exemplos de polipeptídeos de direcionamento que podem ser incluídos em um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo incluem, sem limitação, peptídeo 12.51 (TARGEHKEEELI; ID. DE SEQ. N°: 1), peptídeo 12.52 (LRQTGAASAVWG; ID. DE SEQ. N°: 2), 12.53 (ARRADTQWRGLE; ID. DE SEQ. N°: 3), VSV (GTWLNPGFPPQSCGYATVT; ID. DE SEQ. N°: 4), RGD (CDCRGDCFC; ID. DE SEQ. N°: 5), peptídeo de ligação à integrina-alfa-4 (NMSLDVNRKA; ID. DE SEQ. N°: 6), Met 3-4 (ISLSSHRATWVV; ID. DE SEQ. N°: 7), L10.1F (WTMGLDQLRDSSWAHGGFSA; ID. DE SEQ. N°: 8), L10.1RGDF (WTMGLDQLRGDSSWAHGGFS; ID. DE SEQ. N°: 9), L10.2F (RSVSGTEWVPMNEQHRGAIW; ID. DE SEQ. N° : 10), L10.5F (TELRTHTSKELTIRTAASSD; ID. DE SEQ. N°: 11), S5.1 (DRAIGWQDKLYKLPLGSIHN; ID. DE SEQ. N°: 12), DU9C.1 (MGSWEKAALWNRVSASSGGA; ID. DE SEQ. N°: 13), DU9C.2 (MAMGGKPERPADSDNVQVRG; ID. DE SEQ. N°: 14), DU9A.7 (MASRGDAGEGSTQSNTNVPS; ID. DE SEQ. N°: 15), XS.1 (GPEDTSRAPENQQKTFHRRW; ID. DE SEQ. N°: 16), REDVmyc (MGREDVGEQKLISEEDLGGS; ID. DE SEQ. N°: 17), RGD-4C (ACDCRGDCFCG; ID. DE SEQ. N°: 18), REDV-4C (ACDCREDVCFCG; ID. DE SEQ. N°: 19), SKBR5C1 (GQIPITEPELCCVPWTEAFY; ID. DE SEQ. N°: 20), 231R10.1 (PQPPNSTAHPNPHKAPPNTT; ID. DE SEQ. N°: 21), HepaCD8 (VRWFPGGEWGVTHPESLPPP; ID. DE SEQ. N°: 22), K20 (KKKKKKKKKKKKKKKKKKK; ID. DE SEQ. N°: 23), BAP (GLNDIFEAQKIEWH; ID. DE SEQ. N°: 24), CALM BP (CAAARWKKAFIAVSAANRFKKIS; ID. DE SEQ. N°: 25), EBV (EDPGFFNVEIPEFP; ID. DE SEQ. N°: 26), #1-5 (GGHGRVLWPDGWFSLVGISP; ID. DE SEQ. N°: 27), ##4*-5 (MARTVTANVPGMGEGMVVVPC; ID. DE SEQ. N°: 28), 1-1 (GVSKRGLQCHDFISCSGVPW; ID. DE SEQ. N°: 29), 1-2 (NQSIPKVAGDSKVFCWWCAL; ID. DE SEQ. N°: 30), 1-3 (QSTPPTKHLTIPRHLRNTLI; ID. DE SEQ. N°: 31), 1-4 (DMSFQLVTPFLKALPTGWRG; ID. DE SEQ. N°: 32), 1-5 (GGHGRVLWPDGWFSLVGISP; ID. DE SEQ. N°: 33), 1-5con (FSLVGISP; ID. DE SEQ. N°: 34), 1-6 (QIMMGPSLGYYMPSESIFAY; ID. DE SEQ. N°: 35), 2-11 (ISWDIWRWWYTSEDRDAGSA; ID. DE SEQ. N°: 36), 2-14 (VWGMTTSDHQRKTERLDSPE; ID. DE SEQ. N°: 37), 220 (MTSAQTSEKLKAETDRHTAE; ID. DE SEQ. N°: 38), 2-9 (MGSRSAVGDFESAEGSRRP; ID. DE SEQ. N°: 39), 3b-6 (MGRTVQSGDGTPAQTQPSVN; ID. DE SEQ. N°: 40), 4*-5 (MARTVTANVPGMGEGMVVVP; ID. DE SEQ. N°: 41), peptídeos CLL, PD-1, polipeptídeos GLA (por exemplo, Fator X), genes de antígeno, proteínas de fusão, glicoproteínas fusogênicas, anticorpos de cadeia única, e proteínas do capsídeo de outros vírus. Um polipeptídeo de direcionamento pode visar qualquer tipo de célula apropriado. Exemplos de tipos de células que podem ser visadas por um polipeptídeo de direcionamento incluído em um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo incluem, sem limitação, células musculares (por exemplo, células musculares esqueléticas), tumores, células de câncer, células renais, células hepáticas, células mucosas, carboidratos e membranas celulares.
[166]Esse exemplo demonstra que peptídeos selecionados em um contexto estrutural compatível em bibliotecas de fagos podem ser traduzidos na proteína do héxon de Ad. Por exemplo, para o peptídeo 12.51, esse sítio de inserção aumenta a transdução muscular diminuindo, ao mesmo tempo, a infecção fora do alvo no fígado. Dessa forma, um Ad recombinante desse tipo que visa tecido muscular pode ser usado como um vetor para vacinação muscular à base de gene ou para aplicação/liberação de terapia gênica ao músculo.
[167]Em alguns casos, uma inserção de ácido nucleico pode desviar o vírus (por exemplo, por ruptura de interações de célula e proteína que ocorrem em certa HVR). Em alguns casos, uma inserção de ácido nucleico pode codificar um marcador detectável. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, sem limitação, fluoróforos (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), mCherry e mBFP), e enzimas (por exemplo, luciferase, DNAses, proteases, transportadores e polimerases).
[168]Também são fornecidos nesse relatório descritivo vetores de expressão que contêm um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, um Ad recombinante que possui atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, um Ad657 recombinante e variantes deste). Vetores da expressão podem carregar um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo em outra célula (por exemplo, uma célula de câncer), onde ele pode ser replicado e/ou expresso. Um vetor de expressão, também comumente referido como uma construção de expressão, é tipicamente um plasmídeo ou vetor que possui uma região intensificadora/promotora que controla a expressão de um ácido nucleico específico. Quando introduzido em uma célula, o vetor de expressão pode usar o maquinário celular de síntese de proteína para produzir o vírus na célula. Em alguns casos, vetores de expressão que contêm Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo podem ser vetores virais. Por exemplo, um vetor de expressão que contém um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo pode ser um vetor retroviral. Em alguns casos, vetores de expressão que incluem um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo também podem ser projetados para permitir a inserção de um ou mais transgenes (por exemplo, em um sítio multiclonagem). Por exemplo, vetores de expressão que incluem um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo também podem incluir um ácido nucleico que codifica um marcador detectável. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, sem limitação, fluoróforos (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), mCherry e mBFP), e enzimas (por exemplo, luciferase, recombinases, nucleases, e fatores de transcrição).
[169]Essa invenção também fornece métodos e materiais para utilização de um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante). Em alguns casos, um Ad recombinante fornecido nesse relatório descritivo pode ser usado para o tratamento de um mamífero que possui, ou em risco de ter, câncer. Por exemplo, métodos para o tratamento de um mamífero que possui, ou em risco de ter, câncer podem incluir a administração de um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo ao mamífero. Em alguns casos, os métodos para o tratamento de um mamífero que possui, ou em risco de ter, câncer podem incluir a administração de um ou mais vetores de expressão que codificam um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo ou ácido nucleico que codifica um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo ao mamífero. Em alguns casos, um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo podem ser administrados a um mamífero para reduzir o número de células de câncer no mamífero (por exemplo, suprimir e/ou retardar o crescimento tumoral) e/ou para aumentar a sobrevida do mamífero.
[170]É demonstrado o direcionamento a um tumor canceroso por adenovírus oncolíticos com mudança de sorotipo. Camundongos que abrigam tumores de próstata DU145 ou LNCaP em seus flancos foram tratados por uma injeção intravenosa (IV) com Ad657. Esses camundongos foram tratados uma segunda vez com variantes alternativas do vírus oncolítico Ad6 ou Ad6/57/6 com modificações de fibras e que expressam GFP- Luciferase, e a atividade de luciferase foi medida por imageamento. Ad6 possui héxon e fibra de Ad6 que visa CAR. Ad6-F35 possui héxon de Ad6 e a fibra de Ad35 que visa CD46. Ad6/57/6 possui HVR 1 e 7 de Ad6 e HVRs 2-6 de Ad57. Vírus Ad6/57/6 possuem fibra de Ad6, fibra de AdC68 ou fibra de Ad35. Esses dados na Figura 9 mostram a habilidade surpreendente para oncolíticos com mudança de sorotipo com direcionamento dos vírus ao tumor com infecção fora do alvo menor do fígado.
[171]Em outro exemplo de mudança de sorotipo, camundongos que abrigam tumores de próstata LNCaP em seus flancos foram tratados por uma única injeção intravenosa (IV) com Ad657 ou CRAd657. Esses camundongos foram tratados uma segunda vez 5 meses mais tarde com vírus oncolítico Ad6/57/6 alternativo que expressa GFP-Luciferase e variantes de fibra K7 (com 7 lisinas adicionadas), F35 (com a fibra de Ad35) ou KKTK-C68 (fibra de chimpanzé C68 fundida após o domínio de flexibilidade de Ad6 KKTK. O vírus KKTK-C68 também possui um gene E4 34K códon-otimizado adicionado para aumentar a produtividade viral. A atividade de luciferase foi medida por imageamento. Todos os Ad6/57/6s possuem um héxon com HVR1 e 7 de Ad6 e HVRs 2-6 de Ad57. Ad6/57/6 e KKTK-C68 possuem fibras que visam CAR. Ad6/57/6-F35 possui a fibra de Ad35 que visa CD46. K7 aumenta a ligação às cargas negativas nas células, incluindo ligação a proteoglicanos de sulfato de heparina. A Figura 70 demonstra a capacidade para oncolíticos com mudança de sorotipo com vírus que visam um tumor com infecção fora do alvo menor do fígado.
[172]Qualquer mamífero apropriado que possui, ou em risco de ter, câncer, uma doença infecciosa e/ou uma doença genética pode ser tratado como descrito nesse relatório descritivo. Por exemplo, humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos), cavalos, espécies bovinas, espécies suínas, cães, gatos, camundongos, ratos e animais de criação que possuem câncer, uma doença infecciosa e/ou uma doença genética podem ser tratados para câncer como descrito nesse relatório descritivo. Em alguns casos, um humano que possui câncer pode ser tratado. Em alguns casos, um mamífero (por exemplo, um humano) tratado como descrito nesse relatório descritivo não é um hospedeiro natural de um Ad usado para gerar um Ad recombinante descrito nesse relatório descritivo (por exemplo, um Ad recombinante que possui atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, um Ad657 recombinante). Por exemplo, um ser humano tratado com um Ad657 recombinante descrito nesse relatório descritivo pode não possuir nenhuma imunidade adaptativa preexistente ao Ad6.
[173]Um mamífero que possui qualquer tipo de câncer pode ser tratado como descrito nesse relatório descritivo. Em alguns casos, um câncer pode incluir um ou mais tumores sólidos. Em alguns casos, um câncer pode ser um câncer sanguíneo. Exemplos de cânceres que podem ser tratados como descrito nesse relatório descritivo incluem, sem limitação, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer de pulmão, carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer renal, melanoma, câncer cerebral, câncer do cólon, linfoma, mieloma e leucemias (por exemplo, leucemias linfocíticas e leucemias mielógenas).
[174]Em alguns casos, os métodos descritos nesse relatório descritivo também podem incluir a identificação de um mamífero como tendo câncer. Exemplos de métodos para a identificação de um mamífero como tendo câncer incluem, sem limitação, exame físico, testes laboratoriais (por exemplo, sangue e/ou urina), biópsia, testes de imageamento (por exemplo, raios-X, PET/CT, MRI e/ou ultrassom), varreduras de medicina nuclear (por exemplo, varreduras ósseas), endoscopia e/ou testes genéticos. Uma vez identificado como tendo câncer, uma doença infecciosa e/ou uma doença genética, um mamífero pode receber a administração ou ser instruído para autoadministrar um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante) ou um ácido nucleico (por exemplo, um vetor de expressão) que codifica um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante).
[175]Um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante) podem ser administrados por qualquer via apropriada. Em alguns casos, a administração pode ser administração local. Em alguns casos, a administração pode ser administração sistêmica. Exemplos de vias de administração incluem, sem limitação, a administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, oral, intranasal, por inalação, transdérmica, parenteral, intratumoral, retro- ureter, subcapsular, vaginal e retal. Quando várias rodadas de tratamento são administradas, uma primeira rodada de tratamento pode incluir a administração de um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo a um mamífero (por exemplo, um humano) por uma primeira via (por exemplo, por via intravenosa), e uma segunda rodada de tratamento pode incluir a administração de um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo a um mamífero (por exemplo, um humano) por uma segunda via (por exemplo, por via intramuscular).
[176]Como usado nesse relatório descritivo, o termo “composição farmacêutica” se refere à combinação de um ou mais Ads recombinantes e/ou quiméricos da presente invenção com um carreador, inerte ou ativo, tornando a composição especialmente adequada para uso terapêutico. Um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante) podem ser formulados em uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) para administração a um mamífero (por exemplo, um mamífero que possui, ou em risco de ter, câncer). Por exemplo, um ou mais Ads recombinantes podem ser formulados em uma composição farmaceuticamente aceitável para administração a um mamífero que possui, ou em risco de ter, câncer. Em alguns casos, um ou mais Ads recombinantes podem ser formulados juntos com um ou mais carreadores (aditivos) e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Uma composição farmacêutica pode ser formulada para administração em forma sólida ou líquida incluindo, sem limitação, soluções estéreis, suspensões, formulações de liberação sustentada, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, wafers e grânulos. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis, enchimentos e veículos que podem ser usados em uma composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo incluem, sem limitação, solução salina (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, trocadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, por exemplo, albumina sérica humana, substâncias-tampão como, por exemplo, fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeos parciais de ácidos graxos saturados vegetais, água, sais ou eletrólitos, por exemplo, sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, carboximetilcelulose sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno- polioxipropileno, polietileno glicol e lanolina. Carreadores farmacêuticos adequados são descritos em “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin, 18a Edição. A seleção e uso de excipientes adequados são ensinados em Gennaro, ed., “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20a Edição (Lippincott Williams & Wilkins 2003).
[177]Uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) que inclui um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657s recombinante) pode ser administrada a um mamífero (por exemplo, um mamífero que possui, ou em risco de ter, câncer) como uma vacina. Uma vacina pode ser profilática ou terapêutica.
[178]Em alguns casos, os métodos descritos nesse relatório descritivo também podem incluir a administração a um mamífero (por exemplo, um mamífero que possui câncer) de um ou mais agentes adicionais usados para tratar um câncer. Os (um ou mais) agentes adicionais usados para tratar um câncer podem incluir qualquer tratamento de câncer apropriado. Em alguns casos, um tratamento de câncer pode incluir cirurgia. Em alguns casos, um tratamento de câncer pode incluir radioterapia. Em alguns casos, um tratamento de câncer pode incluir a administração de uma farmacoterapia como, por exemplo, uma quimioterapia, terapia hormonal, terapia direcionada e/ou terapia citotóxica. Por exemplo, um mamífero que possui câncer pode receber a administração de um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo (por exemplo, Ads recombinantes que possuem atividade oncolítica anticâncer como, por exemplo, Ad657 recombinante e variantes deste) e também de um ou mais agentes adicionais usados para tratar um câncer. Quando um mamífero que possui câncer é tratado com um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo e é tratado com um ou mais agentes adicionais usados para tratar um câncer, uma doença infecciosa e/ou uma doença genética, os agentes adicionais usados para tratar um câncer, uma doença infecciosa e/ou uma doença genética podem ser administrados ao mesmo tempo ou independentemente. Por exemplo, um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo e um ou mais agentes adicionais usados para tratar um câncer, uma doença infecciosa e/ou uma doença genética podem ser formulados juntos para formar uma única composição. Em alguns casos, um ou mais Ads recombinantes descritos nesse relatório descritivo podem ser administrados primeiro, e os (um ou mais) agentes adicionais usados para tratar um câncer, uma doença infecciosa e/ou uma doença genética administrado depois, ou vice-versa.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: ADENOVÍRUS
[179]Por 50 anos, havia apenas quatro espécies conhecidas de Ads humanos, espécie C, incluindo Ad1, Ad2, Ad5 e Ad6 (veja, por exemplo, Weaver et al., 2011 Virology. 412: 19-27). Em 2001, um quinto adenovirus da espécie C foi identificado como cepa de isolado de campo #16700, e a testagem de neutralização viral com antissoros contra Ad1, 2, 5 e 6 demonstrou níveis elevados de neutralização (titulações recíprocas de 500-16.000) quando cada um dos antissoros era usado contra seu vírus cognato (Lukashev et al., 2008 J. Gen. Virol. 89: 380-388). Em contraste, anticorpos anti-Ad1, 2 e 5 possuem reatividade cruzada fraca contra #16700 (titulações recíprocas de 32-64). Soros anti- Ad6 demonstraram reatividade cruzada maior contra #16700, mas a neutralização necessitava de concentrações de soros 10 vezes maiores para neutralizar #16700, quando comparado com o Ad6 propriamente dito. Comparações de sequências subsequentes confirmaram #16700 como um novo adenovírus da espécie C e o renomearam Ad57 (veja, por exemplo, Walsh et al., 2011 J. Clin Microbiol. 49: 3.482-3.490).
[180]Quinze Ads humanos foram avaliados quanto à atividade oncolítica contra malignidades da mama, ovarianas, hepáticas, prostáticas, renais e de célula B. Em testes contra tumores de próstata humanos DU145, a espécie C Ad6 foi mais potente após injeção intratumoral ou intravenosa (i.v.) única do que vírus da espécie C Ad5 ou da espécie B Ad11 e Ad35. Ad6 também foi mais eficaz do que Ad5 e Ad11 em hamsters sírios imunocompetentes.
CONSTRUÇÃO DE ADENOVÍRUS RECOMBINANTES
[181]Adenovírus recombinantes foram construídos por tecnologia de DNA recombinante utilizando métodos conhecidos por aqueles técnicos no assunto. Um Ad recombinante é derivado de um primeiro Ad (por exemplo, pode incluir um genoma de um primeiro Ad, por exemplo, Ad6) e pode incluir HVRs de héxon de um segundo Ad como, por exemplo, Ad57. Quando um Ad recombinante inclui um genoma de Ad6 e HVRs de héxon de Ad57, o Ad recombinante pode ser um Ad quimérico referido como Ad657.
[182]Para obter Ad657, uma sequência de HVR de Ad57 foi sintetizada e inserida no héxon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT-Zeocin®-FRT entre pVI e héxon. Este foi recombinado em vários plasmídeos pAd6 para gerar Ad657 e variantes deste. A sequência de aminoácido do héxon de Ad657 é apresentada no ID. DE SEQ. N°: 49. Veja as Figuras 34 e 59-65 para mapas de plasmídeos de variantes de Ad657.
[183]Com relação às variantes de Ad657, a sequência de HVR de Ad57 foi sintetizada com HVR1 modificada com uma cisteína, aminoácidos de flexibilidade e sítios de restrição para permitir inserções de outros peptídeos. Esta foi inserida no héxon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT- Zeocin®-FRT entre pVI e héxon. Este foi recombinado em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657 com cisteína em HVR1, a variante referida como Ad657-HVR1-XXA compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 50.
[184]Com relação às variantes de Ad657, a sequência de HVR de Ad57 foi sintetizada com HVR5 modificada com uma cisteína, aminoácidos de flexibilidade e sítios de restrição para permitir inserções de outros peptídeos. Esta foi inserida no héxon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT- Zeocin®-FRT entre pVI e héxon. Este foi recombinado em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657 com cisteína em HVR5, a variante referida como Ad657-HVR5-XXA compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 51.
[185]Com relação às variantes de Ad657, a sequência de HVR de Ad57 foi sintetizada com HVR1 modificada com uma cisteína, aminoácidos de flexibilidade e sítios de restrição para permitir inserções de outros peptídeos. Esta foi inserida no héxon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT- Zeocin®-FRT entre pVI e héxon. Este foi recombinado em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657 sem cisteína em HVR1, mas com sítios de restrição que permitem inserções de peptídeos em HVR1, a variante referida como Ad657-HVR1- XA compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 52.
[186]Com relação às variantes de Ad657, a sequência de HVR de Ad57 foi sintetizada com HVR5 modificada com uma cisteína, aminoácidos de flexibilidade e sítios de restrição para permitir inserções de outros peptídeos. Esta foi inserida no héxon de Ad6 em um plasmídeo com um cassete FRT- Zeocin®-FRT entre pVI e héxon. Este foi recombinado em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657 sem cisteína em HVR5, mas com sítios de restrição que permitem inserções de peptídeos em HVR5, a variante referida como Ad657-HVR5- XA compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 53.
[187]Com relação às variantes de Ad657, a sequência de HVR1-XA de Ad657 foi modificada por inserção de um peptídeo aceitador de biotina em HVR1. Esta foi recombinada em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657 com um BAP em HVR1, a variante referida como Ad657-HVR1-PSTCD compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 54.
[188]A inserção de um peptídeo aceitador de biotina desvia as variantes do vírus do fígado, permite que o vírus seja redirecionado com avidina ou estreptavidina e ligantes biotinilados, e permite que o vírus seja purificado em colunas monoméricas de avidina ou estreptavidina.
[189]Com relação às variantes de Ad657, a sequência de HVR1-XA de Ad657 foi modificada por inserção de um peptídeo aceitador de biotina em HVR1. Esta foi recombinada em vários plasmídeos pAd6 para gerar variantes de Ad657 com um BAP em HVR1, a variante referida como Ad657-HVR5-PSTCD compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 55.
[190]Com relação às variantes de Ad657, a sequência de HVR5-XA de Ad657 foi modificada por inserção de uma alça V1/V2 sintética do envelope de HIV em HVR5, a variante referida como Ad657-HVR5-V1/V2 compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 56.
[191]A inserção de uma alça V1/V2 sintética do envelope de HIV permite a apresentação desse antígeno para servir como uma vacina, bem como redirecionando por ligação às proteínas que interagem com o envelope de HIV.
[192]Com relação às variantes de Ad657, a sequência de HVR5-XA de Ad657 foi modificada por inserção de peptídeos sintéticos de vírus do papiloma humano em HVR5, a variante referida como Ad657-HVR5-HPV compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 57.
[193]A inserção de peptídeos sintéticos de vírus do papiloma humano permite a apresentação de peptídeos de HPV como antígenos para fins de vacina, bem como para redirecionamento por ligação às proteínas que interagem com peptídeos de HPV.
[194]Em outro aspecto da invenção, foram gerados Ads quiméricos que possuem uma HVR1 de Ad6 e HVRs 2-7 de Ad57, a quimera, referida como quimera Ad6/57 HVR, compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 58.
[195]Ainda em outro aspecto da invenção, foram gerados Ads quiméricos que possuem HVR 1 e 7 de Ad6 e HVRs 2-6 de Ad57, a quimera, referida como Ad6/57/6 HVR quimera, compreende o héxon que possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 59.
EXEMPLO 2: ADENOVÍRUS RECOMBINANTE REDIRECIONADO E DESVIADO PARA LIBERAÇÃO DE GENES
[196]Adenovírus são vetores robustos para liberação de genes e imunização à base de genes. O arquétipo de adenovírus usado por grande parte desse pedido foi o adenovírus humano da espécie C sorotipo 5 (HAdV-C5 ou Ad5). In vitro, Ad5 se liga e entra nas células por meio das interações combinadas de sua fibra e proteínas penton-base com receptores da superfície celular. A fibra trimérica se liga ao receptor de coxsackie-adenovírus (CAR), e células desprovidas de CAR são relativamente resistentes à infecção, a menos que também expressem integrinas αv que podem ser ligadas por um motivo RGD na penton-base.
[197]In vivo, essas interações ainda são utilizadas, mas sua importância varia pela via da injeção. Se injetadas diretamente em um tecido ou tumor sólido, as interações de CAR e integrina dominam. Se injetadas por via intravenosa (IV), essas interações se tornam secundárias em decorrência dos efeitos da ligação de Ad5 aos fatores de coagulação sanguínea dependentes de vitamina K. O fator sanguíneo X (FX) se liga com afinidade subnanomolar aos héxons de Ad5 e, consequentemente, capacita Ad5 para transduzir eficientemente hepatócitos do fígado após injeção IV. Na ausência de FX, a transdução hepática é drasticamente reduzida.
[198]Vetores adenovirais são um tanto únicos em sua habilidade para carregar sequências de cDNA muito grandes de até 36 pares de quilobases (kbp), quando comparados com outros vetores como, por exemplo, vetores de vírus adenoassociado (AAV) com somente 4,5 kb de sequência de DNA. Essa capacidade de carga justificava a exploração inicial de vetores de Ad para terapia gênica muscular quando se liberam transgenes muito grandes como, por exemplo, o cDNA de distrofina de 14 kbp. A administração IV em camundongos recém-nascidos pode mediar a liberação de genes aos músculos, mas essa habilidade é perdida em camundongos adultos. A transfecção diminuída com a idade é causada, em parte, pelo tamanho muito grande de vírions de Ad (ou seja, 100 nm), bem como pela perda de receptor CAR em células musculares com o envelhecimento. A via intramuscular (IM) é, de longe, a via mais popular para vacinas à base de genes, quando se utilizam Ad5 e outros sorotipos, apesar do fato de que CAR está ausente em células musculares esqueléticas.
[199]Portanto, a transdução muscular de Ad5 e de outro sorotipo de Ad pode ser adequada para terapia gênica ou vacinação à base de gene. No entanto, a ausência do receptor primário do vírus no músculo reduz a eficácia do vírus e exige que mais vetor seja liberado para obter efeitos desejados.
CONSTRUÇÃO DE HÉXONS MODIFICADOS COM PEPTÍDEOS EM ADENOVÍRUS
[200]Peptídeos de 12 aminoácidos (12-mer) em células musculares de camundongo C2C12 foram selecionados de uma biblioteca aleatória de peptídeos apresentada entre as folhas-β H e I da região knob de Ad5 (Figura 1A). Peptídeos 12.51 (TARGEHKEEELI; ID. DE SEQ. N°: 1) e 12.52 (LRQTGAASAVWG; ID. DE SEQ. N°: 2) foram selecionados contra mioblastos com pré-depuração contra células-não-alvo para obter peptídeos que seriam específicos para ligação às células musculares. Na maioria dos casos, peptídeos pequenos possuem afinidade relativamente baixa. Foi, portanto, ponderado que a apresentação desses peptídeos selecionados por músculos nas 720 cópias do héxon de Ad5 talvez permita uma melhor liberação de genes aos músculos. Esse sítio de inserção também pode ter o benefício de inativação da ligação de FX ao héxon para “desviar” o vetor do fígado, se qualquer vetor extravasa do sangue após injeção IM.
[201]Com a inserção desses peptídeos selecionados por músculos entre duas outras folhas-β, o que também restringe uma alça hipervariável no vírus, a habilidade dos Ads modificados para modular o tropismo foi avaliada. Peptídeos 12.51 e 12.52 foram introduzidos na alça da região hipervariável (HVR) 5 restringida pelas folhas β7 e β8 no héxon de Ad5. A habilidade in vivo desses vírus para transduzir tecidos após injeções intravenosas e intramusculares em camundongos e em hamsters foi avaliada.
ADENOVÍRUS
[202]Ad5-GL E1-deletado (RD-Ad5-GL) expressa uma proteína de fusão proteína fluorescente verde-luciferase (GFP-Luciferase, GL), como descrito em outro lugar (veja, por exemplo, Crosby et al., 2002 J. Virol., 76: 6.893-6.899; Khare et al., 2011 Mol. Ther., 19: 1.254-1.262; e Khare et al., 2012 J. Virol., 86: 2.293-2.301). Peptídeos selecionados por músculos 12.51 e 12.52 foram inseridos no lugar de HVR5 no héxon de Ad5 entre suas folhas β7 e β8, que são estruturalmente similares às folhas-β H e I da região knob de Ad5 (Figura 1A), de acordo com métodos conhecidos por aqueles técnicos no assunto. Os peptídeos com um líder de flexibilidade substituíram toda a alça de HVR5 em Ad5 (Figura 1B). Essas sequências de héxon modificadas foram introduzidas em Ad5 com replicação defeituosa que expressa uma proteína de fusão proteína fluorescente verde-luciferase (RD-Ad5-GL) por recombinação Red em bactérias (veja, por exemplo, Campos et al., 2004 Hum. Gene Ther., 15: 1.1251.130). Ads com peptídeo modificados foram construídos por inserção de oligonucleotídeos anelados que codificam os peptídeos 12.51 e 12.52 (Figura 1B) na apresentação de plasmídeo pHVR5 (Figura 1A, inferior) para gerar Ads recombinantes, Ad5-HVR5-12.51 e Ad5-HVR5-12.52.
[203]Os plasmídeos resultantes foram digeridos e usados para recombinação Red em pAd5-GL. Esses vetores foram resgatados em células 293, purificados em dois gradientes de CsCl consecutivos e foram dessalinizados em colunas de cromatografia Econopac 10-DG (Bio-Rad) em 50 mM de Tris pH 8 com 0,5 M de sacarose e armazenados a -80°C.
TESTAGEM DO VÍRUS IN VITRO
[204]Mioblastos de camundongos C2C12 foram adquiridos de “American Type Tissue Culture” (Manassas, VA). Células 293 foram obtidas de Microbix, Toronto, Ontário, Canadá. As células foram mantidas em DMEM com FBS 10% Invitrogen.
[205]Células musculares C2C12 foram colocadas em placas de 6 poços (Corning) no dia anterior à infecção. Os vírus foram usados para infectar células em DMEM com FBS 5%. As células foram incubadas por 2 dias antes de observação sob fluorescência verde.
[206]Experimentos animais foram realizados com aprovação pelo “Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee” sob as disposições do “Animal Welfare Act”, “PHS Animal Welfare Policy” e princípios das diretrizes do NIH para os “Cuidados e Uso de Animais de Laboratório”. Camundongos CD-1 (Charles River) fêmeas foram anestesiados e injetados por via intramuscular (IM) ou por via intravenosa (IV) com 1010 vp dos vírus indicados nos tempos indicados. Os animais foram anestesiados e injetados com 3 mg de d- luciferina (Molecular Imaging Products) e tiveram imagens obtidas em um sistema de imageamento Xenogen. Nos tempos mais avançados, os animais foram anestesiados e sangue foi coletado em separadores de soro para ELISA.
[207]ELISA foi realizado da seguinte forma: placas Immulon 4 HBX (Thermo) foram incubadas com 100 ng por poço de proteína GFP em 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4°C de um dia para o outro, lavadas e bloqueadas com leite 5% em solução salina tamponada com TRIS com Tween 20 0,1% (TBST) em temperatura ambiente por 2 horas. Diluições de 1:100.000 até 1:1.1000 de cada amostra de soro foram preparadas em tampão de bloqueio. Os poços foram lavados e 100 μl de cada foram adicionados às placas revestidas com GFP em triplicata e incubados por 3 horas em temperatura ambiente. Os poços foram lavados e uma diluição de 1/10.000 de anticorpo secundário de cabra anti-camundongo-HRP (Pierce Chemical) foi adicionada a cada poço. As placas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente, lavadas, e 50 μl de 1 Step Ultra TMB ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc.) foram adicionados para detecção de HRP, seguidos por 50 μl de 2 M H2SO4. A absorbância a 450 nm foi determinada com um Beckman Coulter DTX 880.
[208]As análises estatísticas foram realizadas com Prism (Graphpad). A significância estatística foi calculada por ANOVA de uma-via, seguido por HSD de Tukey.
TRANSDUÇÃO IN VITRO EM CÉLULAS MUSCULARES DE CAMUNDONGO C2C12
[209]RD-Ad5-GL, RD-Ad5-GL-HVR5-12.51 e RD-Ad5-HVR5- 12.52 foram usados para infectar células de mioblastos de camundongo C2C12 em multiplicidades de infecção variadas (MOI) em termos de partículas virais (vp)/célula. Quando a fluorescência verde da proteína de fusão GFP era observada por microscopia de fluorescência, ambos os vetores com peptídeo modificado mediaram transdução significantemente melhor do que RD-Ad5-GL (Figura 2A). Quando a atividade de luciferase foi medida, aumentos significantes foram observados em células infectadas por RD-Ad5-GL-12.51 e 12.52 (Figura 2B). Quando um dos peptídeos, 12.51, foi inserido de volta na região knob de Ad5, o peptídeo aumentou a transdução in vitro 14 vezes em mioblastos C2C12.
TRANSDUÇÃO IN VIVO APÓS INJEÇÃO INTRAMUSCULAR EM CAMUNDONGOS
[210]Um x 109 vp de Ad5-GL, Ad5-GL-HVR5-12.51 e Ad5-GL- HVR5-12.52 foram injetadas pela via IM em ambos os músculos quadríceps em camundongos e o imageamento de luciferase foi realizado em momentos variados (Figura 3A, superior). Ad5- GL-HVR5-12.51 produziu atividade de luciferase 2 a 3 vezes maior do que Ad5-GL em todos os pontos do tempo (p < 0,05 no dia 1 por ANOVA de uma-via) (Figura 3B, esquerda). A atividade de Ad5-GL-HVR5-12.52 no músculo foi menor do que tanto Ad5-GL quanto HVR5-12.51 em contraste com sua atividade mais forte in vitro.
TRANSDUÇÃO IN VIVO APÓS INJEÇÃO INTRAVENOSA EM CAMUNDONGOS
[211]Três x 1010 vp de Ad5-GL, Ad5-GL-HVR5-12.51 e Ad5- GL-HVR5-12.52 foram injetadas pela via IV em camundongos e o imageamento de luciferase foi realizado (Figura 3A, inferior). Em contraste com os resultados no músculo, somente Ad5-GL não modificado mediou forte transdução no fígado. A transdução no fígado por Ad5-GL foi 60 vezes maior do que tanto Ad5-GL-HVR5-12.51 quanto Ad5-GL-HVR5-12.52 (p < 0,001 no dia 1 por ANOVA de uma-via) (Figura 3B, direita), o que demonstra que os Ads recombinantes visam tecido muscular diminuindo, ao mesmo tempo, a infecção fora do alvo no fígado.
TRANSDUÇÃO IN VIVO APÓS INJEÇÃO INTRAMUSCULAR EM HAMSTERS
[212]Para testar se o vetor 12.51 modificado funciona em outras espécies além de camundongos, 1010 vp de Ad5-GL e Ad5- GL-HVR5-12.51 foram injetadas IM em ambos os quadríceps de hamsters sírios maiores e o imageamento de luciferase foi realizado 24 horas mais tarde (Figura 4). Nesse caso, Ad5- GL-HVR5-12.51 mediou atividade de luciferase 7 vezes maior do que Ad5-GL (p < 0,01 no dia 1 por ANOVA de uma-via).
IMUNIZAÇÃO À BASE DE GENES APÓS INJEÇÃO INTRAMUSCULAR EM CAMUNDONGOS
[213]Dezesseis semanas após injeção IM, soros foram coletados dos camundongos tratados como descrito acima e como mostrado na Figura 3, e analisados em diluições seriais por ELISA para anticorpos contra GFP codificada por transgene (Figura 5). Todos os camundongos injetados com Ad geraram anticorpos anti-GFP significantes, quando comparados com o grupo de PBS em diluições dos soros de 1:10.000 até o 1:1.000 (p < 0,0001 por ANOVA de uma-via). No entanto, Ad5-GL-HVR- 12.51 produziu anticorpos maiores do que Ad5 ou Ad5-HVR5- 12.52. Em diluições de soros de 1:1.000 até 1:10.000, Ad5- GL-HVR-12.51 foi significantemente maior do que Ad5-GL (p < 0,01 até 0,0001 por ANOVA de uma-via). Em uma diluição de 1:1.000 de soros, 12.51 foi significantemente maior do que 12.52 (p < 0,05). Ad5-GL-12.52 foi significantemente maior do que Ad5-GL em diluições de soros de 1:1.000 e 1:10.000 (p < 0,05 até 0,001).
[214]Esse exemplo demonstra que peptídeos selecionados em um contexto estrutural compatível em bibliotecas de fagos podem ser traduzidos na proteína do héxon de Ad. Por exemplo, para o peptídeo 12.51, esse sítio de inserção aumenta a transdução muscular diminuindo, ao mesmo tempo, a infecção fora do alvo no fígado. Dessa forma, um Ad recombinante desse tipo que visa tecido muscular pode ser usado como um vetor para vacinação muscular à base de gene ou para aplicação/liberação de terapia gênica ao músculo.
[215]Um aspecto adicional da invenção está relacionado aos Ads recombinantes e/ou quiméricos que compreendem outros peptídeos de direcionamento celular inserido em HVRs de Ad657 e em alças HI de Ad6 e C68 são descritos na Tabela 1. Tabela 1: Outros peptídeos de direcionamento celular inseridos em HVRs de Ad657 e em alças HI de Ad6 e C68 HI
[216]Peptídeos de câncer de célula B selecionados 1-1 GVSKRGLQCHDFISCSGVPW (ID. DE SEQ. N° : 29); 1-2 NQSIPKVAGDSKVFCWWCAL (ID. DE SEQ. N° : 30); 1-3 QSTPPTKHLTIPRHLRNTLI (ID. DE SEQ. N° : 31); 1-4 DMSFQLVTPFLKALPTGWRG (ID. DE SEQ. N° : 32); 1-5 GGHGRVLWPDGWFSLVGISP (ID. DE SEQ. N° : 33); 1-6 QIMMGPSLGYYMPSESIFAY (ID. DE SEQ. N° : 35); 2-11 ISWDIWRWWYTSEDRDAGSA (ID . DE SEQ . N° : 36); 2-14 VWGMTTSDHQRKTERLDSPE (ID . DE SEQ . N° : 37); 2-20 MTSAQTSEKLKAETDRHTAE (ID . DE SEQ . N° : 38); 2-9 MGSRSAVGDFESAEGSRRP (ID. DE SEQ. N°: 39); 3b-6 MGRTVQSGDGTPAQTQPSVN (ID. DE SEQ. N°: 40); 4*-5 MARTVTANVPGMGEGMVVVP (ID. DE SEQ. N°: 41).
[217]DNA que codifica os peptídeos indicados e seu DNA complementar foi sintetizado flanqueado por extremidades coesivas para ligação em plasmídeos de Ad, por exemplo, plasmídeos de héxon XA ou plasmídeos carreadores de fibra pAd6-NdePfl. Esses oligonucleotídeos anelados foram ligados em HVRs ou na alça HI de Ads. Esses plasmídeos foram usados para recombinar em vários plasmídeos de arcabouço de Ad.
[218]Alguns peptídeos servem para visar novos receptores em células. Outros, como BAP pequeno, podem ser usados para direcionamento e purificação de avidina se o vírus é desenvolvido em células que expressam biotina-ligase bacteriana BirA. O peptídeo calmodulina permite que o vírus se ligue à calmodulina ou proteínas de fusão de calmodulina para redirecionamento ou para purificação do vírus.
[219]Dessa forma, esses Ads recombinantes que visam tecidos/receptores celulares específicos podem ser usados como um vetor para aplicação em vacinação à base de gene ou para terapia gênica nas células e/ou tecidos visados.
EXEMPLO 3: INSERÇÃO DE HVRS INDIVIDUAIS DE DIFERENTES SOROTIPOS DE AD COM A INSERÇÃO DE PEPTÍDEOS DE DIRECIONAMENTO/DESVIO CELULAR OU NOVOS AMINOÁCIDOS
[220]Mapas de plasmídeos carreadores de héxon (Figura 34) mostram a combinação da inserção de HVRs individuais de diferentes sorotipos de Ad com a inserção de peptídeos de direcionamento/desvio de direcionamento celular ou novos aminoácidos como, por exemplo, cisteína, no héxon para modificação química e blindagem direcionadas.
[221]Em certas modalidades, os peptídeos de ligação à célula 12.51, VSV, RGD (veja Tabela 1) são inseridos em HVR 1 ou HVR 5, cujas modalidades servem como exemplos de inserção desses e de outros peptídeos em qualquer uma das HVRs de um Ad (Figura 34). Outro exemplo mostra a inserção de um peptídeo aceitador de biotina (BAP) que é inserido nessas HVRs permitindo o redirecionamento do vetor com avidina ou estreptavidina e ligantes biotinilados ou com proteínas de fusão de avidina ou estreptavidina. A inserção de BAP também permite que os vírus sejam purificados em colunas monoméricas de avidina ou estreptavidina para produção de vetor. Da mesma forma, Ad57-HVR1-XXA e XA mostram o exemplo de inserção de uma cisteína nesse sítio para permitir a modificação química direcionada com maleimida ou outros agentes reativos à cisteína (Figura 34).
[222]Essas modalidades foram aplicadas também no contexto de Ads que combinam diferentes HVRs de Ads diferentes (ou seja, embaralhamento de HVRs). Por exemplo, HVR1 de Ad6 com HVRs 2-7 de Ad57 ou HVR1 e 7 de Ad6 com HVRs 2-6 de Ad57. Em uma modalidade adicional, a vírus 6/56/6 possui HVRs 1 e 7 de Ad6 e HVRs 2-6 de Ad657.
EXEMPLO 4: CONJUGAÇÃO QUÍMICA DIRECIONADA DE AD657-HVR5C MODIFICADO COM CISTEÍNA COM HÉXON MODIFICADO
[223]A Figura 35 é uma representação de variantes de Ad que exibem a combinação de inserção de HVRs individuais de diferentes sorotipos de Ad com a inserção de novos aminoácidos como, por exemplo, cisteína, no héxon para modificação química e blindagem direcionadas.
[224]Comparação dos efeitos de conjugação química não direcionada com conjugação química direcionada sobre a blindagem e função de Ad657-HVR1C modificado com cisteína com héxon modificado (Figura 36). Esse exemplo demonstra a habilidade para direcionar polímero e outras modificações químicas às cisteínas inseridas em um héxon de Ad. PEG não direcionado inativa a infecção pelo vírus, enquanto a PEGuilação com direcionamento de cisteína retém as funções do vírus.
[225]Em um aspecto da invenção, é contemplado o uso de polímeros ou peptídeos/proteínas inseridos para desviar, redirecionar e blindar de anticorpos, proteínas, células. A Figura 54 retrata sítios de HVRs de Ad que podem ser modificados, por exemplo, por PEGuilação ou “BAPilação”.
[226]Em uma modalidade, os diferentes sorotipos de Ad e/ou variantes compreendem blindagem de polímero para permitir a multidosagem de variantes de Ad6 e Ad657. Um ciclo terapêutico exemplar no qual Ad6 e Ad657 podem ser usados para várias rodadas de tratamento por mudança de sorotipo em combinação com conjugação covalente de polímero é mostrado (Figura 41B).
[227]Ad657-HVR1C que expressa GFP-Luciferase foi produzido por células e purificado em gradientes de CsCl. O vírus foi modificado covalentemente com polietileno glicol de 5 kDa (PEG). O vírus foi tratado com NHS-PEG que reage aleatoriamente com aminas/lisinas em proteínas virais ou com maleimida-PEG que reage especificamente com cisteína que foi inserida em HVR1 usando o plasmídeo carreador XXA. Esses vírus não modificados ou modificados foram então purificados por uma rodada final de CsCl, seguida por dessalinização. Os vírus indicados foram separados em géis de SDS-PAGE, corados com SyproRuby, e visualizados por imageamento (Figura 36A). Isso mostra que a NHS-PEGuilação modifica aleatoriamente muitas proteínas virais, como demonstrado por aumentos na massa aparente das proteínas (indicados por setas). Em contraste, a reação de maleimida-PEG direcionada com a cisteína em HVR1 modifica somente o héxon e não danifica outras proteínas do capsômero viral. Os efeitos da PEGuilação sobre a função do vírus foram avaliados.
[228]Os vírus indicados foram incubados com células A549 e sua habilidade para infectar as células foi medida por ensaio de luciferase. Isso mostra que a NHS-PEGuilação aleatória reduz a atividade do vírus em mais do que 90%, enquanto maleimida-PEG não o faz (Figura 36B).
[229]Hamsters sírios imunocompetentes foram enxertados com tumores subcutâneos de câncer renal HaK. Quando esses alcançaram um volume de 200 μl, eles foram injetados uma única vez pela via intravenosa com os vírus Ad6 indicados construídos com e sem E3 (DE3) e com ou sem NHS-PEGuilação aleatória. Os tamanhos do tumor foram medidos ao longo do tempo. Os dados mostram que uma deleção de todos os genes E3 no vírus oncolítico Ad6-deltaE3-Luc torna o vírus menos eficaz na redução do volume tumoral do que o vírus oncolítico parental, Ad6-Luc. Os dados também mostram que Ad6 pode ser PEGuilado e reter eficácia (veja Ad6-Luc vs. Ad6-Luc-PEG de 20 kDa) (Figura 58).
[230]Conjugação química direcionada de Ads modificado com cisteína com héxon modificado, por exemplo, Ad657-HVR5C. Ad657-HVR5C que expressa GFP-Luciferase foi produzido por células e purificado em gradientes de CsCl. O vírus foi modificado covalentemente com maleimida-fluoróforo do infravermelho próximo IR800, maleimida-biotina ou maleimida- PEG de 5 kDa que reage especificamente com cisteína que foi inserida em HVR5 usando seu plasmídeo carreador XXA. Os Ads indicados e Ads modificados foram separados em géis de SDS- PAGE, corados com SyproRuby, e visualizados por imageamento (Figura 37A). SDS-PAGE de proteínas virais, seguida por imageamento no infravermelho próximo, demonstra que a HVR-C pode ser marcada com um agente de imageamento (Figura 37B). Os efeitos da PEGuilação sobre a função do vírus Ad in vivo foram demonstrados por injeção de vírus Ad PEGuilado por via intraperitoneal. A habilidade para infectar células em camundongos com tumor é demonstrada por atividade de luciferase detectável por imageamento. A Figura 37C demonstra a habilidade para direcionar polímero e outras modificações químicas às cisteínas inseridas na região do héxon de Ad657. Além disso, é demonstrado que a PEGuilação desvia o adenovírus para o fígado in vivo (Figura 50).
EXEMPLO 5: EXPRESSÃO DE FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIA DE GRANULÓCITO-MACRÓFAGO HUMANO (GMCSF) POR AD657
[231]Ad657 que carrega o cDNA para GMCSF humano foi usado para infectar células A549 e quantidades variadas do sobrenadante foram adicionadas às células TF-1 com crescimento GMCSF-dependente. O número aumentado de células indica expressão da citocina humana funcional (Figura 27). Os dados demonstram que Ads recombinantes podem ser utilizados para expressão de proteínas heterólogas.
EXEMPLO 6: ADENOVÍRUS ONCOLÍTICO AD657 PARA VIROTERAPIA SISTÊMICA CONTRA CÉLULAS DE CÂNCER
[232]Um alinhamento de genomas de Ad inteiros selecionados produz uma árvore filogenética que agrupa Ad57 com outros vírus da espécie C, com a maior homologia com Ad6 é mostrado na Figura 6.
[233]Ad57 parece quase idêntico ao Ad6, com divergência de sequência em regiões hipervariáveis do héxon (HVRs) e em genes de evasão imune E3 (Figura 7). Outras proteínas virais do capsídeo expostas, incluindo da fibra, penton-base, IIIa e IX, são praticamente idênticas entre Ad6 e Ad57. Os dados de neutralização são consistentes com o fato de que a maioria dos anticorpos neutralizantes de adenovírus visa as HVRs em Ads. Acredita-se que a baixa reatividade cruzada entre antissoros de Ad6 e Ad57 seja causada por anticorpos que podem visar sua proteína da fibra comum (Lukashev et al., 2008 J. Gen. Virol. 89: 380-388).
[234]Nesse exemplo, a utilidade de Ad657 como um oncolítico contra câncer de próstata humano é demonstrada. As HVRs de Ad6 foram substituídas com aquelas de Ad57 para gerar um vírus oncolítico da espécie C quimérico denominado Ad657. Ad657 e Ad6 foram testados como terapias oncolíticas sistêmicas por injeção i.v. única em camundongos nude que abrigam tumores de câncer de próstata humano. O tropismo pelo fígado e pelo tumor desse vírus foi avaliado em modelos em camundongo de câncer de próstata da forma seguinte.
[235]Células de carcinoma da próstata humano DU145 foram adquiridas de “American Type Culture Collection” (ATCC; Manassas, VA, EUA) e verificadas como sendo livres de patógenos específicos por testagem IMPACT por RADIL. Células 293 foram obtidas de Microbix, Toronto, Ontário, Canadá. As células foram mantidas em DMEM com FBS 10% (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA).
[236]O genoma de Ad6, Cepa Tonsil 99 (ATCC VR-1083), foi clonado como descrito em outro lugar (veja, por exemplo, Weaver et al., 2013 PLoS One. 8:e73313). Um cassete que corresponde ao héxon de Ad57 entre os sítios ApaI e SacI naturais foi sintetizado por Genscript. Esse fragmento foi clonado no plasmídeo carreador pUC57-Ad6 Héxon-FZF que contém os genes de pVI e héxon de Ad6 com um cassete de gene de resistência a FRT-Zeocin®-FRT entre eles para recombinação homóloga em bactérias, como descrito em outro lugar (veja, por exemplo, Campos et al., 2004 Hum. Gene Ther. 15: 1.125-1.130; e Khare et al., 2012 J. Virol. 86: 2.2932.301). O fragmento Apal-SacI de Ad6 foi substituído com o fragmento de Ad57 gerando o plasmídeo pUC57-Ad6/57 Héxon- FZF. Este foi recombinado no genoma de Ad6 por recombinação Red (Campos et al., 2004 Hum. Gene Ther. 15: 1.125-1.130). A Figura 59 mostra um mapa de plasmídeos de Ad657 com deleção de E3. Os vírus foram resgatados por transfecção em células 293 e produzidos por uma placa 10 CellStack (Corning Life Sciences, Lowell, MA, EUA). Vírus que expressam uma proteína de fusão proteína fluorescente verde-luciferase (GFP-Luc) possuem um cassete de expressão CMV-GFP-Luc inserido entre a fibra do Ad e E4 e uma deleção de E3 para abrir espaço para essa inserção. Os vírus foram purificados em dois gradientes de CsCl, e os números de partículas virais (vp) foram calculados por OD260.
[237]Para examinar a atividade oncolítica in vitro, as células foram tratadas nas multiplicidades de infecção (MOI) indicadas em termos de vp/célula em DMEM com FBS 5% e antibiótico-antimicótico (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). Cinco dias mais tarde, o meio foi removido e as células foram tratadas com violeta cristal (violeta cristal 0,05%, formaldeído 3,7%, em solução salina tamponada com fosfato; Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) por 10 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS e depois incubadas de um dia para o outro a 37°C em dodecil sulfato de sódio 0,1% em PBS para solubilizar o violeta cristal. A absorbância do violeta cristal foi medida em OD595 em uma leitora de placas Beckman Coulter DTX 880. A viabilidade celular (%) foi calculada por divisão da OD das amostras pela OD média de células de controle não tratadas na mesma placa de 96 poços e multiplicação desse número por 100.
[238]Os animais foram abrigados na “Mayo Clinic Animal Facility” sob as diretrizes da “Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care”. Os estudos foram aprovados pelo “Mayo Clinic Animal Use and Care Committee” sob as disposições do “Animal Welfare Act”, “PHS Animal Welfare Policy”. Tumores subcutâneos foram iniciados em camundongos nude com 4 semanas de idade (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN, EUA) por injeção por via subcutânea (s.c.) com 1 x 107 células DU145 em 100 μl de DMEM/Matrigel 50% (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Os volumes tumorais foram calculados usando a equação largura2 x comprimento x 1/2. Quando os tumores alcançavam aproximadamente 200 μl de volume, os camundongos foram distribuídos em grupos diferentes e foram tratadas por uma única injeção i.v. na veia da cauda. Os animais eram sacrificados quando o volume tumoral alcançava 2.000 μl ou se os animais estivessem moribundos, em sofrimento, ou se a pele rompesse sobre o tumor.
[239]Para medições de alanina aminotransferase (ALT) no sangue, grupos de seis camundongos C57BL/6 foram injetados i.v. com 1011 vp de Ad5, Ad6 ou Ad657 pela veia da cauda e sangue foi coletado 3 dias mais tarde para medição de ALT usando o Ensaio de Atividade de ALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).
[240]A análise estatística foi realizada com Prism (Graphpad) por ANOVA de medições repetidas ou ANOVA de uma- via, seguido por teste HSD de Tukey. Curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram traçadas e comparadas por teste de logrank.
[241]Os genes do capsômero de Ad57 são quase idênticos aos de Ad6, com a exceção de suas HVRs de héxon (Figuras 6 e 7). Para gerar um vírus quimérico de Ad57 e Ad6, um cassete que corresponde às HVRs do héxon de Ad57 foi recombinado no genoma de Ad6 do tipo-selvagem (Figura 8). Esse vírus foi resgatado e produzido em células 293 e purificado em gradientes de CsCl. Considerando que o genoma viral de base é Ad6, esses vírus quiméricos de héxon são referidos como Ad657 (Figura 59).
[242]A atividade oncolítica in vitro foi avaliada por infecção de células LNCap e DU145 com 10, 100 ou 1.000 vp/célula. Para comparar o dano hepático por Ad5, Ad6 e Ad657, uma dose alta de 1011 vp de cada vírus foi injetada pela veia da cauda em camundongos C57BL/6 imunocompetentes. Os animais injetados com Ad5 ficaram moribundos dentro de 2 dias e tiveram que ser sacrificados (Figura 10A). A sobrevida para Ad5 e Ad6 foi significantemente menor, quando comparada com PBS (p = 0,0001 e 0,0009, respectivamente, por análise de log-rank). A sobrevida para Ad657 também foi reduzida, quando comparada com PBS (p = 0,0578). A sobrevida após exposição a Ad6 ou Ad657 foi significantemente melhor do que em camundongos tratados com Ad5 (p = 0,0001 e 0,0001, respectivamente). As sobrevidas para Ad6 e Ad657 não foram estatisticamente diferentes (p = 0,248).
[243]ALT foi medida no sangue 3 dias após injeção em animais sobreviventes de Ad6 e Ad657. Os animais tratados com Ad5 não foram testados, na medida em que a maior parte do grupo precisou ser sacrificada. Esse ensaio mostrou que Ad6 provocou níveis relativamente baixos de dano hepático em termos de liberação da enzima hepática ALT no sangue (Figura 10B). Os grupos tanto de Ad6 quanto de Ad657 tiveram níveis de ALT baixos, mas significantes, quando comparados com camundongos tratados com PBS (p < 0,001 por ANOVA de uma-via com teste de comparação múltipla de Tukey para ambos os vírus). Ad657 teve níveis de ALT menores do que Ad6 (p < 0,001 por ANOVA). Isso é consistente com níveis maiores de infecção por Ad6 no fígado do que Ad657 após injeção i.v. de vírus que expressam luciferase (Figura 12). Um animal de Ad657 foi perdido após sangramento no dia 3. Por volta de 6 dias, a maioria dos animais de Ad6 ficou moribunda (Figura 10A). Em contraste, 50% dos animais Ad657 sobreviveram além de 2 semanas do tratamento.
[244]Para comparar a atividade oncolítica de Ad6 e Ad657 contra tumores de próstata humanos DU145, camundongos nude foram enxertados s.c. com células DU145. Os animais foram distribuídos em grupos com tamanhos similares de tumor, com 200 μl em média, e grupos de nove camundongos foram tratados uma única vez pela via i.v. com uma dose de 3 x 1010 vp de Ad6 ou Ad657 (Figura 11).
[245]Essa injeção i.v. única de Ad6 e Ad657 reduziu os tamanhos tumorais, quando comparado com animais de controle injetados com PBS. Os tumores foram significantemente menores no grupo de Ad6 dentro de 7 dias, quando comparados com o grupo de PBS (p < 0,05 por ANOVA de duas-vias com teste de comparação múltipla de Tukey). Os tumores no grupo de Ad657 eram significantemente diferentes daqueles no grupo de PBS por volta do dia 14 (p < 0,01 por ANOVA). Tanto Ad6 quanto Ad657 mantiveram diferenças significantes com PBS até o dia 38 (p < 0,0001 por ANOVA de duas-vias). Essa comparação terminou no dia 38, quando o primeiro animal no grupo de PBS teve que ser sacrificado, na medida em que uma comparação posterior seria distorcida em função da alteração nos números de animais. Os tamanhos tumorais nos grupos de Ad6 e Ad657 não foram significantemente diferentes até o dia 38, quando Ad657 tinha um volume tumoral significantemente maior (p < 0,05) por ANOVA de duas-vias (Figura 11A). Essa diferença entre os tamanhos tumorais de Ad6 e Ad657 persistiu até o dia 52 (p = 0,04 por teste-T), e depois os tumores não foram significantemente diferentes após esse momento.
[246]Quando a sobrevida por todas as causas foi avaliada, tanto Ad6 quanto Ad657 estenderam significantemente a sobrevida, quando comparados com animais tratados com PBS (Figura 11B, p < 0,01 e 0,05, respectivamente, por análise de log-rank). A sobrevida de Ad6 por todas as causas foi significantemente melhor do que Ad657 (p < 0,05). No entanto, este foi um artefato da sobrevida atribuído sobretudo pelo fato de que três dos animais de Ad657 tiveram que ser sacrificados de acordo com as diretrizes do “Institutional Animal Care and Use Committee” (IACUC), em função da formação de úlceras na pele sobre o tumor, e não por um tamanho excessivo do tumor. Em alguns casos, a ulceração está, na verdade, associada com controle eficaz do tumor. Como Ad6, Ad657 que expressa GFP-luciferase, produziu atividade de luciferase significante em tumores DU145 subcutâneos distantes após uma única injeção i.v. (Figura 12 e Figura 13). Isso sugere que tanto Ad6 quanto Ad657 podem mediar efeitos oncolíticos em tumores de próstata após um único tratamento sistêmico.
[247]Esse exemplo demonstra que Ad657 pode ser usado como uma viroterapia oncolítica local ou sistêmica para cânceres de próstata. Esses dados também demonstram efeitos surpreendentes de mudança de sorotipo com Ads oncolíticos da espécie C.
[248]A atividade oncolítica de Ads foi avaliada em células tumorais e/ou tumores cancerosos. Uma injeção IV única de Ad6 vs. células tumorais pulmonares A549 foi avaliada (Figura 28); injeção IV ou intratumoral (IT) única de Ad6 vs. tumores pancreáticos Panc1 foi avaliada (Figura 29), e injeção IV única de Ad6 vs. câncer renal em hamsters imunocompetentes foi avaliada (Figura 30).
[249]A Figura 38 mostra o imageamento de luciferase de camundongos nude. A) 1, 4, 7, 14, 28 e 42 dias após injeção I.V. única de tratamento com Ad6 vs. tumores de próstata DU145 distantes. B) 3, 7 e 19 dias após injeção I.V. de Ad5- GFPLUC replicante em camundongos que abrigam tumores de próstata LNCaP.
[250]Pode ser concluído que Ad6 atinge células-alvo distantes após injeção IV.
[251]Em outra modalidade, Ads que expressam luciferase com e sem peptídeos 12.51 e 12.52 gerados pela biblioteca de peptídeos inseridos em HVR5 de héxon foram incubados nas linhagens de células indicadas, células de melanoma B16 e células de carcinoma de pulmão A549, com os números indicados de partículas virais (vp), e a atividade de luciferase foi medida. A infecção aumentada de células de câncer por Ads que abrigam héxons modificados com peptídeos é demonstrada (Figura 31).
INFECÇÃO AUMENTADA DE CÉLULAS DE CÂNCER POR ADS QUE ABRIGAM HÉXONS MODIFICADOS COM PEPTÍDEOS
[252]Ads que expressam luciferase com e sem peptídeos 12.51 e 12.52 gerados pela biblioteca de peptídeos inseridos em HVR5 de héxon foram incubados nas linhagens de células de carcinoma hepatocelular indicadas com 104 vp de cada vírus e a atividade de luciferase foi medida. A infecção aumentada de células de câncer por Ads que abrigam héxons modificados com peptídeos é demonstrada (Figura 32).
EXEMPLO 7: RESPOSTAS IMUNES DIVERGENTES DIRIGIDAS AO HIV-1 GERADAS POR IMUNIZAÇÃO SISTÊMICA E MUCOSA COM ADENOVÍRUS REPLICANTES DE CICLO ÚNICO EM MACACOS RHESUS
[253]A maioria das vacinas de adenovírus à base de genes consiste em vetores de Ad (RD-Ad) com replicação defeituosa que possuem seu gene E1 deletado para evitar que eles repliquem e causem infecções por Ad. Adenovírus helper- dependentes (HD-Ads) possuem todos os genes de Ad deletados e também têm replicação defeituosa. Uma vacina de Ad com E1 deletado pode infectar uma célula, liberar uma cópia de um gene de antígeno, e expressar uma cópia única (por exemplo, “1X”) desse antígeno. Elas são seguras, mas não replicam transgenes ou sua expressão.
[254]Em contraste, uma vacina de Ad E1+ replicação- competente (RC-Ad) pode infectar a mesma célula, replicar o DNA do gene de antígeno 10.000 vezes, produzir substancialmente mais antígeno, e provocar respostas imunes mais fortes do que vetores com E1 deletado. Embora RC-Ad seja mais potente do que RD-Ad, Ads replicação-competentes podem correr o risco real de causar infecções por adenovírus verdadeiras em humanos.
[255]Para tirar proveito da replicação de DNA de transgene, mas evitar o risco de infecções por adenovírus, vetores de Ad de ciclo único (SC-Ad) com uma deleção de um gene para uma proteína viral tardia crucial, pIIIa, foram desenvolvidos (Crosby et al., 2014. Virology 462-463: 158165; Crosby et al., 2015 J. Virol. 89: 669-675; Anguiano- Zarate et al., 2018 J. Infectious Dis. 218: 1.883-1.889; e Crosby et al., 2017 Genes (Basel) 8: E79). SC-Ads retêm seus genes E1 para permitir que ele replique seu genoma, mas a ausência de pIIIa bloqueia a produção de vírus infecciosos na prole. SC-Ads replicam seus genomas e transgenes tão bem quanto RC-Ad (até 10.000 vezes; Crosby et al., 2014. Virology 462-463: 158-165). RC-Ad e SC-Ad produzem mais proteína de transgene do que vetores de RD-Ad (Crosby et al., 2014. Virology 462-463: 158-165). SC-Ads geram respostas imunes mais robustas e mais persistentes do que RD-Ad ou RC-Ads (Crosby et al., 2015 J. Virol. 89: 669-675). Em comparações de igual-para-igual, SC-Ad produz significantemente mais anticorpos e melhor proteção contra o vírus influenza (Crosby et al., 2017 J. Virol. 91: e00720-16).
[256]Nesse estudo, macacos Rhesus foram imunizados com SC-Ads que expressam sequências do envelope do clado B que foram obtidas de um paciente com HIV-1 antes e depois de sua resposta de anticorpo ter passado por uma expansão da amplitude de neutralização. Os macacos foram imunizados por uma imunização sistêmica IM única ou por imunização mucosa intranasal (IN) única. Os animais foram então reforçados pelas mesmas vias ou por vias alternativas com Ad SC-6, seguido por reforço de proteína. Esse exemplo descreve como essas várias estratégias de imunização com SC-Ad afetavam a geração de ligação ao HIV, citotoxicidade celular anticorpo- dependente (ADCC) e anticorpos neutralizantes, bem como seus efeitos sobre respostas imunes celulares, incluindo células T helper foliculares (pTfh) no sangue e linfonodos.
ADENOVÍRUS DE CICLO ÚNICO QUE EXPRESSA PROTEÍNA DO ENVELOPE DE HIV-1 GP140
[257]Sequências do envelope do Clado B de gp160 que surgiram antes (G4) e que precedem imediatamente um pico na expansão da amplitude de neutralização de anticorpo (F8) do paciente com HIV VC10014 (Malherbe et al., 2014 J. Virol. 88: 12.949-12.967) foram usadas como imunógenos. Sequências de gp160 G4 e F8 motivo-otimizadas foram recombinadas em SCAds baseados nos sorotipos de Ad humano 6 e 57 (veja, por exemplo, Crosby et al., 2014. Virology 462-463: 158-165; Crosby et al., 2015 J. Virol. 89: 669-675; Anguiano-Zarate et al., 2018 J. Infectious Dis. 218: 1.883-1.889; e Nguyen et al., 2018 Oncolytic Virotherapy 7: 43-51) . Um SC-Ad de controle que expressa glicoproteína de Ebola também foi usado. Os vírus foram resgatados e purificados como descrito em outro lugar (veja, por exemplo, Crosby et al., 2014. Virology 462-463: 158-165; Crosby et al., 2015 J. Virol. 89: 669-675; e Anguiano-Zarate et al., 2018 J. Infectious Dis. 218: 1.883-1.889).
[258]O gene do envelope F8 clonado por um indivíduo infectado por HIV Clado B usado no vetor de SC-Ad foi motivo- otimizado e modificado por mutagênese sítio-dirigida para expressar gp140 trimérica, não clivada. Detalhes da expressão, purificação e caracterização antigênica foram descritos em outro lugar (veja, por exemplo, Malherbe et al., 2014 J. Virol. 88: 12.949-12.967).
[259]Fêmeas adultas de macacos Rhesus (Macaca mulatta) de origem indiana foram mantidas no “Michael Keeling Center for Comparative Medicine and Research” na “University of Texas MD Anderson Cancer Center”, Bastrop TX, na colônia reprodutiva livre de patógenos específicos. Toda a manipulação dos animais foi feita de acordo com as políticas e procedimentos da “Mayo Clinic” e da “University of Texas MD Anderson Cancer Center”, com as disposições do “Animal Welfare Act”, “PHS Animal Welfare Policy”, com os princípios do “NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”.
[260]Os macacos foram anestesiados com quetamina e imunizados pela via intranasal (IN) ou intramuscular (IM) com 2 x 1010 partículas virais (vp) da vacina de SC-Ad indicada. Os animais foram reforçados com 50 μg de gp140 F8 trimérica recombinante purificada, combinada com adjuvante AdjuplexTM pela via IM, como descrito em outro lugar (veja, por exemplo, Malherbe et al., 2014 J. Virol. 88: 12.94912.967; e Hessell et al., 2016 J. Immunol. 196: 3.064-3.078).
[261]Amostras de sangue venoso periférico foram coletadas em EDTA. Antes do isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), o plasma foi separado e armazenado imediatamente a -80°C. PBMCs foram preparadas do sangue em gradientes de densidade Ficoll- Hypaque. Esfregaços de saliva e vaginais coletados com Wek- Cel Spears em 1 ml de PBS contendo inibidores de protease, centrifugados, e os sobrenadantes foram coletados após centrifugação a 2.000 rpm, como descrito em outro lugar (veja, por exemplo, Kozlowski et al., 1997 Infect. Immun. 65: 1.387-1.394). As amostras foram mantidas congeladas a -80°C até uso posterior.
ENSAIO ELISPOT PARA DETECÇÃO DE CÉLULAS PRODUTORAS DE IFN-Y ANTÍGENO-ESPECÍFICO
[262]PBMCs recém isoladas foram estimuladas com proteína gp140 F8 (1 μg/ml) ou Ad6 inativado pelo calor (7,0 x 108 vp/poço) para determinar os números de células produtoras de IFN—Y pelo ensaio “Enzyme Linked Immuno Spot” (ELISPOT) usando a metodologia descrita em outro lugar (veja, por exemplo, Nehete et al., 2017 Comp. Med. 67: 67-78; Nehete et al., 2013 PLoS One 8: e79836; e Nehete et al., 2017 J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 56: 509-519). Resumidamente, alíquotas de PBMcs (105/poço) foram semeadas em poços em duplicata de placas de 96 poços (placas forradas com difluoreto de polivinilideno, MAIP S 45, Millipore, Bedford, MA) pré-revestidos com o anticorpo primário para IFN-Y e os linfócitos foram estimulados com con A, proteína gp140 F8 ou Ad6 inativado pelo calor. Após incubação por 30-36 horas a 37°c, as células foram removidas e os poços foram cuidadosamente lavados com PBS e desenvolvidos de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. os resultados são expressos como células formadoras de spot (SFcs) de IFN-Y por 105 PBMcs após subtração dos poços em duplicata somente com meio (controle negativo) e são considerados positivos caso maior do que duas vezes o nível de fundo e maior do que 5 SFcs/105 PBMcs.
ELISAS DE ANTIcoRPo
[263]Titulações de anticorpo de ligação ao envelope de HIV-1 foram medidas em amostras de plasma coletadas em intervalos regulares contra gp140 F8 ou gp140 de SF162, como descrito em outro lugar (Malherbe et al., 2014 J. Virol. 88: 12.949-12.967; e Hessell et al., 2016 J. Immunol. 196: 3.064- 3.078).
ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO
[264]A neutralização de HIV foi realizada usando o ensaio de neutralização de TZM-bl como descrito em outro lugar (Malherbe et al., 2014 J. Virol. 88: 12.949-12.967; e Hessell et al., 2016 J. Immunol. 196: 3.064-3.078). Todos os valores foram calculados comparados com poços somente com vírus.
CITOTOXICIDADE CELULAR ANTICORPO-DEPENDENTE (ADCC)
[265]Células-alvo CEM.NKR.CCR5.CD4+-Luc foram infectadas com 50 ng de SHIVSF162P3 e cultivadas por 4 dias, como descrito em outro lugar (veja, por exemplo, Alpert et al., 2012 PLoS Pathog. 8: e1002890). Diluições seriais de duas vezes de cada amostra foram adicionadas aos alvos infectados por 20 minutos em temperatura ambiente. Células efetoras CD16-KHYG-1 foram adicionadas em uma proporção de efetoras para alvo de 10:1, e essas foram incubadas por mais 8 horas. As células foram lisadas e a atividade de luciferase foi medida na leitora de placas Bio-Tek.
CITOMETRIA DE FLUXO
[266]Células coletadas de biópsias retais e de linfonodos foram incubadas de um dia para o outro com 0,2 μg de gp140 ou somente meio na presença de GolgiPlugTM (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) pelas últimas 4 horas. Após cultura, as células foram colhidas e incubadas no gelo por 45 minutos com um painel de anticorpos humanos que reagem de forma cruzada com amostras de macaco Rhesus. Os painéis incluíam os seguintes anticorpos marcados com fluorócromo: CD8 (Qdot655), α4β7 (PE) e CXCR5 (PE), todos obtidos do “Nonhuman Primate Reagente Resource”; CD69 (BV737, clone FN50) e FoxP3 (PECy5, clone: PCH101) obtido de eBioscience, IL-21 (BV421, clone: 3A3-N2.1), CD45 (BV786, D058-1283) e CD3 (clone SP34-2, marcado com PE-Cy7) todos de BD Bioscience (San Jose, CA); CD4 (Pacific Blue, clone OKT4) de ThermoFisher Scientific (Waltham, MA). As diluições para anticorpos foram determinadas seguindo as recomendações do fabricante. Células mortas foram excluídas por utilização do kit de coloração de células mortas fixáveis Live-Dead obtido de Invitrogen (Carlsbad, CA). Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes com PBS contendo FBS 2% e 2 mM de EDTA e depois fixadas e permeabilizadas com o Kit FoxP3 Fix/Perm (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Os marcadores intracelulares FoxP3 e IL-21 foram corados em tampão de permeabilização. Tanto os controles de compensação (OneComp eBeads, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) quanto os controles de fluorescência Minus One (FMO) foram utilizados. Todas as amostras foram coletadas em um analisador LSR Fortessa X-20 (BD Biosciences, San Jose, CA) e foram analisadas usando o software FlowJo (FlowJo, LLC, Ashland, Oregon). Aproximadamente 2 x 105 a 1 x 106 eventos foram coletados por amostra.
DESAFIO RETAL COM SHIVS F162P3
[267]O vírus SHIVSF162P3 foi derivado de R157 colheita 3 (3.16.12). Esse estoque tinha um teor de P27 de 66 ng/ml, teor Log de RNA de aproximadamente 9,35, TCID50 em PBMC de Rhesus de origem indiana: 1.288/ml, e TCID50 em células TZM- bl: 4,1 x 104/ml. Um ml de uma diluição de 1:300 do estoque foi usado. Isso equivalia a 4,3 TCID50 em PBMCs de Rhesus e 137 TCID50 em células TZM-bl. Essa dose foi usada para desafio intra-retal (IR) semanalmente. Amostras de plasma foram analisadas para números de cópias de RNA viral de SHIV por Leidos Biomedical Research, Inc., Frederick National Laboratory. Animais com cópias de RNA acima 10 foram considerados como estando infectados e o número de desafios necessário para infectar aquele animal foi usado como eventos para análise de sobrevida de Kaplan-Meier. Uma vez infectado, o animal não era mais desafiado. As cargas virais no plasma foram monitoradas periodicamente pelo mesmo método até o final do estudo.
CARGA VIRAL DE SHIVS F162P3 EM TECIDOS
[268]Ao final do estudo, PBMCs e tecidos post-mortem foram coletados. PBMC e amostras do intestino foram analisadas para RNA viral de SHIVSF162P3 por qPCR. O software Prism 7 Graphical foi usado para todas as análises estatísticas.
SC-AD QUE EXPRESSA GP160 DE HIV-1
[269]Sequências de proteína do envelope Clado B (gp160 G4) foram identificadas antes e imediatamente antes de um pico na expansão da amplitude de neutralização de anticorpo (F8 gp160) do paciente com HIV VC10014. Essas sequências de gp160 foram inseridas em SC-Ad6 e SC-Ad657 sob o controle do promotor de citomegalovírus forte (Figura 24A). Ad57 é um Ad humano da espécie C que é quase idêntico ao Ad6, com variação em suas regiões hipervariáveis do héxon (HVRs) e em seus genes de evasão imune E3 (Figura 24B). A maioria dos anticorpos neutralizantes de Ad visa HVRs de héxon de Ad (Pichla-Gollon et al., 2007 J. Virol. 81: 1.680-1.689; e Sumida et al., 2005 J. Immunol. 174: 7.179-7.185). Considerando esse fato, HVRs de Ad6 foram substituídas com aquelas de Ad57 para gerar um vetor de Ad quimérico da espécie C denominado Ad657. Tanto SC-Ad6 quanto SC-Ad657 retêm todos os genes de Ad, incluindo E1, e não possuem genes pIIIA e E3 funcionais (Figura 24A). Ambos os SC-Ads, portanto, podem replicar seus genomas para amplificar a expressão de gp160, mas não geram vírus Ad na prole. Ambos os vírus foram resgatados e produzidos em células 293-IIIA e purificados em gradientes de CsCl. Quando usados para infectar células A549, ambos os vetores produziram gp160, como determinado por Western blotting.
[270]Vetores de Ad diferentes foram testados previamente em macacos Rhesus pela via sistêmica intramuscular (IM) e por diversas vias mucosas, incluindo gavagem oral, cápsulas orais com revestimento entérico, intranasal (IN) e intravaginal (IVAG). A testagem de SC-Ad-G4 pelas vias IM, IN e IVAG em pequenos animais revelou que a sensibilização pela via IVAG gerou respostas de anticorpo desprezíveis. Em contraste, a imunização IN tanto em camundongos quanto em hamsters gerou respostas de anticorpo fortes. Considerando esses dados e a dificuldade potencial na realização de imunizações IVAG em humanos, a via IN foi selecionada para a via mucosa de imunização em estudos em macacos subsequentes.
IMUNIZAÇÃO MUCOSA E SISTÊMICA ÚNICA EM MACACOS RHESUS
[271]Dois x 1010 vp de Env de SC-Ad6-G4 foram usadas para vacinar grupos de 8 fêmeas de macacos Rhesus por imunização IM ou IN única (Figura 14). Essa dose é relativamente baixa, sendo aproximadamente 7,5 vezes menor do que o uso recente de vacinas de RC-Ad de envelope de HIV liberadas por imunização IN e IM mista. Um grupo de vetor de controle negativo foi imunizado IN com SC-Ad6 que expressa glicoproteína de Ebola (gp). Quatro semanas mais tarde, amostras de plasma foram testadas para anticorpos de ligação ao Env contra gp140 F8 (Figura 14). Isso mostrou titulações de ligação médias significantemente maiores no grupo imunizado pela via IM após imunização única (p < 0,01 por ANOVA). As titulações de anticorpo neutralizante de SF162 (NAb) também estavam elevadas nesse ponto do tempo, mas não alcançaram significância por ANOVA para os grupos de vias individuais.
REFORÇO IM VS. IN COM SC-AD6 NA SEMANA 4
[272]Foi relatado que anticorpos neutralizantes anti- adenovírus que são produzidos por uma imunização IM contra Ad podem ser evitados por reforço por uma via diferente (Xiang et al., 2003 J. Virol. 77: 10.780-10.789). Para testar esse conceito de via para permitir a reutilização do mesmo sorotipo de Ad em macacos, cada grupo sensibilizado com SC- Ad6 foi dividido em 2 grupos de 4. Cada um desses foi reforçado com SC-Ad6 que expressa o Env F8 alternativo na semana 4 pela via IM ou pela via IN. Amostras de plasma coletadas 3 semanas após esse reforço mostraram elevações em titulações de ligação médias nos animais que foram sensibilizados-reforçados pelos grupos IM-IM, IM-IN e IN-IM. Nenhum anticorpo detectável foi observado no grupo IN-IN (Figura 14).
REFORÇO DE SC-AD657 NA SEMANA 13
[273]Os animais foram então reforçados por mudança de sorotipo com SC-Ad657 que expressa Env G4 na semana 13. Foi usada a mesma via do reforço prévio. Titulações da Semana 15 mostraram que animais sensibilizados pela via IM tinham titulações de ligação ao Env elevadas de quase 350, mas esses níveis não eram significantemente diferentes dos controles (Figura 14). Em contraste, os anticorpos no grupo IN-IM-IM foram significantemente maiores do que tanto no grupo de controle de vetor e quanto no grupo IN-IN-IN (p < 0,01). O grupo IN-IN-IN novamente não mostrou nenhum anticorpo contra Env, até mesmo após 3 imunizações.
REFORÇO DE PROTEÍNA ENV TRIMÉRICA RECOMBINANTE NA SEMANA 24
[274]A maioria dos estudos sobre vacina contra HIV aumenta as imunizações de Ad com reforços de proteína para amplificar as respostas de anticorpo. Por exemplo, em um estudo recente, vetores de RD-Ad26 foram usados duas vezes e reforçados três vezes com proteína gp140 com adjuvante (Barouch et al., 2015 Science 349 (6245): 320-4). Em um esforço para determinar se essa estratégia intensificaria as vacinas SC-Ad, todos os grupos de SC-Ad-Env foram reforçados com 50 μg de proteína gp140 trimérica F8 recombinante misturada com adjuvante ADJUPLEXTM pela via IM. A proteína trimérica F8 reforçou as titulações de ligação médias por duas ordens de magnitude em todos os grupos (Figura 14). Essa imunização com proteína também reforçou o grupo IN-ININ até níveis comparáveis com os outros grupos, embora anticorpos de ligação ao Env não fossem detectados após as imunizações de SC-Ad anteriores.
ANTICORPOS DE LIGAÇÃO E NEUTRALIZANTES NO PLASMA APÓS UM SEGUNDO REFORÇO DE PROTEÍNA
[275]Os animais foram reforçados com proteína uma segunda vez na semana 38. Isso aumentou as titulações plasmáticas de anticorpos de ligação a F8 até quase 105 por volta da semana 40 e todos os grupos ficaram significantemente diferentes dos controles (Figura 14). As titulações de anticorpos neutralizantes (NAb) contra o vírus SF162 Tier 1A estavam aumentadas de 100 para 10.000 na semana 40 (Figura 15). NAbs contra vírus SS1196 Tier 1B e vírus JRCSF Tier 2 aumentaram para 100 na maioria dos animais, com exceção de dois animais no grupo IN-IN-IN cujas titulações estavam em níveis basais (Figura 15).
ATIVIDADE DE ADCC APÓS O SEGUNDO REFORÇO DE PROTEÍNA
[276]A atividade de citotoxicidade celular anticorpo- dependente (ADCC) no plasma da semana 40 foi testada contra células SHIVSF162P3 infectadas. A atividade de ADCC foi geralmente maior em animais que tiveram pelo menos uma imunização mucosa IN com SC-Ad (Figura 16). Todos os animais que receberam uma imunização mucosa tinham significantemente % máximo de ADCC maior do que animais de controle de SC-Ad- Ebola (p < 0,05, 0,0001, 0,0001 para IM-IN-IN, IN-IM-IM e IN-IN-IN, respectivamente). Quando comparados por titulações de 50% de ADCC, somente os grupos sensibilizados IN com SCAd tiveram atividade de ADCC significantemente maior do que os controles (p < 0,05 e 0,001 por ANOVA para os grupos IN- IM-IM e IN-IN-IN).
RESPOSTAS DE ANTICORPO NA SALIVA E LAVADOS VAGINAIS APÓS UM SEGUNDO REFORÇO DE PROTEÍNA
[277]Os dados acima monitoraram respostas de anticorpo sistêmicas no plasma. Amostras de saliva e lavado vaginal também foram coletadas na semana 40 e medidas para anticorpos nesses locais mucosos. Quando saliva e lavados vaginais foram testadas quanto à ligação ao env F8 e SF162 por ELISA, essas respostas foram observadas na maioria dos grupos, com exceção do grupo de controle de SC-Ad-Ebola (Figura 25).
[278]Parecia haver um efeito regional nesses anticorpos mucosos. Em animais que foram imunizados com SC-Ad principalmente pela via IN (IM-IN-IN e IN-IN-IN), anticorpos de ligação estavam maiores na saliva perto desse local de imunização, mas menores no local vaginal mais distante (Figura 25). Quando a atividade de ADCC foi medida nessas amostras mucosas, essas respostas foram altamente variáveis (Figura 17). Apesar disso, foi observada atividade de ADCC mais elevada no grupo IN-IN-IN, quando comparado com animais de controle (p < 0,05 por ANOVA).
RESPOSTAS IMUNES CELULARES SISTÊMICAS APÓS UM REFORÇO DE PROTEÍNA
[279]PBMCs da Semana 38 foram testadas para células T contra Env e contra adenovírus por ELISPOT em amostras coletadas imediatamente antes de um segundo reforço de proteína Env F8. Todos os animais imunizados com Env tinham células secretoras de IFN-Y Env-específicas em seus PBMCs (Figura 18A). O nível de SFCs IFN-y Env-específicas estava geralmente aumentado em animais que receberam pelo menos uma imunização mucosa. No entanto, SFCs IFN-Y só estavam significantemente maiores no grupo de SC-Ad IN-IN-IN quando eram comparadas com animais de controle imunizados com SCAd Ebola (p < 0,05 por ANOVA). SFCs anti-Ad estavam relativamente baixas em todos os grupos, quando comparadas com SFCs anti-Env nesse ponto do tempo.
RESPOSTAS IMUNES CELULARES SISTÊMICAS APÓS UM SEGUNDO REFORÇO DE PROTEÍNA
[280]Na semana 40, PBMCs e células de linfonodo inguinal foram testadas para SFCs IFN-Y Env-específicas por ELISPOT (Figura 18B). Esse reforço de proteína aumentou as SFCs Env- específicas em PBMCs e em linfonodos para níveis similares em todos os animais imunizados com Env.
TRÁFEGO CELULAR MUCOSO
[281]Citometria de fluxo em amostras de biópsia retal na semana 40 mostrou números similares de células α4β7 CD4 e CD8 em locais retais (Figura 19A). Houve uma tendência para números crescentes nos grupos sensibilizados IN, mas esses não alcançaram significância. Os números de células CD69+ CD4+ ativadas em tecidos retais foram similares entre os grupos (Figura 19B). Similarmente, células FoxP3+ CD4+ nesse local mucoso não eram apreciavelmente diferentes (Figura 19B).
DISTRIBUIÇÕES DE CÉLULAS TFH ANTÍGENO-ESPECÍFICAS
[282]Células T helper foliculares (Tfh) CXCR5+ IL-21+ CD4+ foram medidas em PBMCs e amostras de linfonodo na semana 40 (Figura 20). Os animais que foram imunizados por Ad e proteína somente pela via IM tinham células Tfh periféricas (pTfh) significantemente maiores em PBMCs do que outros grupos (Figura 20). Nos linfonodos, as células Tfh eram as menores no grupo de controle e grupo somente IM. Em contraste, aproximadamente metade dos animais que receberam pelo menos uma imunização mucosa IN tinham Tfh detectável em seus linfonodos após o último reforço de proteína (Figura 20).
DESAFIO RETAL COM SHIVS F162P3
[283]Os macacos imunizados foram desafiados por via retal com isolado de HIV SHIVSF162P3. Quatro animais não imunizados de controle foram adicionados ao estudo e cada grupo foi desafiado semanalmente por inoculação retal com 1 ml de uma diluição de 1:300 de desafio com estoque de SHIVSF162P3 fornecido por NIH. Esse desafio equivalia a 4,3 TCID50 em PBMCs de Rhesus e 137 TCID50 em células TZM-bl. Após o primeiro desafio, 2 animais em um grupo de controle não imunizado e 2 animais no grupo IM-IM-IM ficaram infectados (Figura 21). Um animal em cada um dos grupos de via mista (IM-IN-IN e IN-IM-IM) ficou infectado após um desafio. Nenhum dos animais no grupo IN-IN-IN foi infectado após o primeiro desafio. As cargas virais no plasma indicaram que todos os animais, exceto o animal do grupo de Ebola, atingiram cargas virais elevadas após 3 desafios (Figura 22B). Os animais no grupo IN-IN-IN tiveram um retardo para alcançar essas cargas virais elevadas.
[284]À medida que os desafios continuavam, os animais em todos os grupos ficaram infectados, com exceção de um animal no grupo de Ebola que permaneceu não infectado após 7 desafios. Os alelos Trim-5α e MHC foram examinados retrospectivamente (Tabela 2). Essa análise não revelou genes abertamente protetores no animal resistente do grupo de Ebola. A maioria dos animais não pode ser classificada com alelos que possam mantê-los moderadamente protegidos, mas a maioria dos grupos teve pelo menos um animal com uma probabilidade maior de proteção em virtude desses alelos. Deve ser observado que 2/4 dos animais nos grupos IM-IM-IM e IN-IN-IN tinham alelos Trim-5α e MHC que podem prever uma probabilidade maior de proteção inata contra SIVsmm e talvez SHIVSF162P3 (Tabela 2). Tabela 2: Avaliação retrospectiva para alelos de genes protetores contra SIV
[285]Quando os animais foram agrupados com base em se foram sensibilizados pela via IM ou pela via IN com SC-Ad e a sobrevida de Kaplan-Meier foi analisada, a infecção dos oito animais sensibilizados pela via IM foi paralela com aquela de animais de controle (Figura 22A). Em contraste, a infecção foi um pouco retardada nos oito animais que foram sensibilizados com SC-Ad-Env pela via mucosa IN.
CARGAS VIRAIS POST-MORTEM EM TECIDOS
[286]O estudo de desafio foi terminado 9 semanas após o primeiro desafio. PBMCs e tecidos do intestino foram isolados, o RNA foi purificado e avaliado quanto aos genomas virais de SHIV (Figura 22B). PBMCs post-mortem tinham níveis variados de RNA viral de SHIV, com níveis um pouco menores no grupo IN-IN-IN do que no grupo IM-IM-IM. O RNA viral médio no cólon foi 15 vezes menor no grupo IN-IN-IN do que no grupo IM-IM-IM (Figura 23). Essa diferença não alcançou significância por ANOVA, mas teste-T bicaudado gerou um valor p de 0,0079.
[287]Esse exemplo demonstra que vetores de SC-Ad replicantes podem ser usados como uma plataforma robusta e segura para vacinação contra HIV-1 e outras doenças infecciosas. SC-Ad é capaz de amplificar genes de antígeno e citocina até 10.000 vezes em células humanas infectadas. A resposta imune é amplificada bem acima daquelas mediadas por vetores de RD-Ad que estão atualmente sendo testados como vacinas contra HIV-1 em humanos. Vacinas contra HIV podem fazer a transição para plataformas de vacina que amplificam genes de antígeno de HIV por utilização de vetores de SC-Ad, por exemplo, vetores de SC-Ad baseados em Ads recombinantes que possuem baixa soroprevalência.
EXEMPLO 8: ENSAIO DE LINFÓCITOS T CITOTÓXICOS (CTL) IN VIVO PARA RESPOSTAS IMUNES CONTRA ANTÍGENO DO VÍRUS DA HEPATITE C (HCV)
[288]Camundongos foram imunizados com Ad657 que expressa o cDNA da glicoproteína B (gB) CMV do citomegalovírus (CMV) ou antígeno de HCV 2.4. Células singênicas foram pulsadas com peptídeo de HCV e marcadas com succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) antes da injeção nos camundongos imunizados. A atividade de CTL cognata é observada contra HCV por perda de células marcadas no HCV, mas não em animais imunizados com CMV (Figura 26).
EXEMPLO 9: ADS CONDICIONALMENTE REPLICANTES (CRADS)
[289]Uma representação esquemática de mutações em Ad6, Ad657 e variantes destes que envolvem mutações na proteína E1 para converter o vírus em um Ad condicionalmente replicante (CRAd) é mostrada na Figura 39 e na Figura 43. Estes incluem dl1101 e/ou o dl1107 que bloqueiam a ligação a p300 e pRB, respectivamente.
[290]A Figura 56 mostra as sequências de aminoácidos do terminal-N de E1A em um Ad do tipo-selvagem, bem como variantes de Ad E1A dl1101, E1A dl1107 e E1A dl1101/1107.
[291]Também é mostrada a substituição do promotor de E1 de Ad com a sequência de DNA do promotor de probasina-E1 próstata-específico do ID. DE SEQ. N°: 44 para gerar o CRAd, Ad-PB (Figura 55). O promotor de probasina é androgênio- dependente e, portanto, funcionará em tumores androgênio- sensíveis como LNCaP, mas não em tumores androgênio- resistentes como DU145.
[292]Células A549 foram infectadas com as variantes de Ad6 ou Ad657 indicadas nas concentrações de vírus indicadas (vp/célula) e a viabilidade celular foi medida por coloração com violeta cristal após 5 dias (Figura 40).
[293]Morte de células não cancerosas por Ad com replicação defeituosa (RD-Ad), Ad6, CRAd6-dl1101/dl1107 ou CRAd6-PB. É demonstrada a modificação de Ad6 e Ad657 para serem Ads condicionalmente replicantes (CRAds) (Figura 44).
[294]Morte de células cancerosas por Ad5, Ad6, Ad657 replicação-competentes, e os CRAds indicados é mostrada na Figura 45. É demonstrada a modificação de Ad6 e Ad657 para serem Ads condicionalmente replicantes (CRAds).
[295]Os resultados mostrados na Figura 46 demonstram a modificação de Ad6 e Ad657 para serem Ads condicionalmente replicantes (CRAds) em células de câncer de mama.
[296]Os resultados mostrados na Figura 47 demonstram a modificação de Ad6 e Ad657 para serem Ads condicionalmente replicantes (CRAds) em células de câncer de próstata e células de câncer de pulmão.
[297]Efeitos in vivo de Ad6 replicação-competente ou dos CRAds indicados sobre o crescimento de tumores DU145 em camundongos. A Figura 48 demonstra a modificação de Ad6 e Ad657 para serem Ads condicionalmente replicantes (CRAds) in vivo após uma única injeção intravenosa em camundongos que abrigam tumores de próstata humanos.
[298]Efeitos in vivo de Ad6 replicação-competente ou dos CRAds indicados sobre a sobrevida de camundongos com tumores DU145. A Figura 49 demonstra a modificação de Ad6 e Ad657 para serem Ads condicionalmente replicantes (CRAds) in vivo após uma única injeção intravenosa em camundongos que abrigam tumores de próstata humanos.
[299]A Figura 51 demonstra que a modificação de Ad657 com a fibra mais curta de AdC68 de chimpanzé reduz a eficácia.
[300]Em uma modalidade, um vírus Ad 6/56/6 possui HVRs 1 e 7 de Ad6 e HVRs 2-6 de Ad657. A Figura 52 demonstra a morte pelo vírus Ad 6/56/6 de células de câncer de pulmão humano com e sem modificações de CRAd.
[301]Morte de célula tumoral por variantes de Ad que envolve mutações na proteína E3. Hamsters sírios imunocompetentes foram enxertados com tumores subcutâneos de câncer renal HaK. Quando esses alcançaram um volume de 200 μl, eles foram injetados uma única vez pela via intravenosa com os vírus Ad6 indicados construídos com e sem E3 (DE3) e com ou sem NHS-PEGuilação aleatória. Os tamanhos do tumor foram medidos ao longo do tempo. Os dados mostram que uma deleção de todos os genes E3 torna o vírus oncolítico menos eficaz (Ad6-delta-E3-Luc vs. Ad6-Luc) (Figura 58).
[302]A proteína da fibra do Ad é um complexo de três subunidades aparentemente idênticas que medeiam a etapa de adesão inicial. A proteína da fibra de Ad6 nativa compreende a sequência de aminoácido apresentada no ID. DE SEQ. N°: 60 e se liga ao CAR.
[303]Em um aspecto adicional da invenção, foram gerados Ads recombinantes com fibra modificada que possuem diferentes proteínas da fibra que não são nativas para o Ad parental. Ads recombinantes, incluindo CRAds, que compreendem proteínas do capsídeo de cepas de Ad diferentes foram gerados, por exemplo, Ads recombinantes que compreendem um polipeptídeo da fibra de Ad35 heterólogo ou polipeptídeo de fibra de Chimpanzé C68, +/- um peptídeo K7 (Figuras 62-69).
[304]Um Ad quimérico, quimera de fibra de AdF35, possui a sequência de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 61 e é mais curto do que proteínas da fibra de Ad5 e de Ad6 e redireciona o vírus para CD46.
[305]Um Ad recombinante com fibra modificada, que compreende Fibra K7 que possui a sequência do ID. DE SEQ. N°: 62, direciona o vírus para proteoglicanos de sulfato de heparina e cargas negativas nas células.
[306]Um Ad quimérico, recombinante, Fibra 6/FC68 que compreende a sequência do ID. DE SEQ. N°: 63, é um Ad quimérico que possui uma proteína da fibra de adenovírus de chimpanzé C68. A proteína da fibra é mais curta do que proteínas da fibra de Ad5 ou Ad6 e se liga ao CAR.
[307]Um Ad quimérico, recombinante, Fibra 6/FC68-K7 que compreende a sequência do ID. DE SEQ. N°: 64, é um Ad quimérico que possui uma proteína da fibra de adenovírus de chimpanzé C68. A proteína da fibra é mais curta do que proteínas da fibra de Ad5 ou Ad6. A Fibra 6/FC68-K7 se liga ao CAR e é redirecionada para sulfato de heparina e cargas negativas.
[308]Um Ad quimérico, recombinante, Fibra 6/FC68-HI-K7 que compreende a sequência do ID. DE SEQ. N°: 65, é um Ad quimérico que possui uma proteína da fibra de adenovírus de chimpanzé C68. A proteína da fibra é mais curta do que proteínas da fibra de Ad5 ou Ad6. A Fibra 6/FC68-HI-K7 se liga ao CAR e é redirecionada para sulfato de heparina e cargas negativas.
EXEMPLO 10: MUDANÇA DE SOROTIPO DE ADENOVÍRUS
[309]A Figura 41 é uma representação esquemática que mostra ciclos terapêuticos de Ad. Em uma modalidade, é exemplificada uma mudança de sorotipo com Ads diferentes ao longo do curso de um tratamento (Figura 41A).
DIRECIONAMENTO AO TUMOR DE PRÓSTATA APÓS MUDANÇA DE SOROTIPO DA ADENOVÍRUS ONCOLÍTICOS
[310]Camundongos que abrigam tumores de próstata DU145 em seus flancos foram tratados por uma única injeção intravenosa (IV) com Ad657 ou CRAd657. Esses camundongos foram tratados uma segunda vez com vírus Ad6 oncolítico alternativo ou Ad6-F35 que expressa GFP-Luciferase e a atividade de luciferase foi medida por imageamento. Ad6 possui héxon e fibra de Ad6 que visa CAR. Ad6-F35 possui héxon de Ad6 e a fibra de Ad35 que visa CD46. A Figura 42 demonstra a capacidade para oncolíticos com mudança de sorotipo com vírus que visam um tumor com infecção fora do alvo menor do fígado.
[311]Em outro exemplo de mudança de sorotipo, camundongos que abrigam tumores de próstata LNCaP em seus flancos foram tratados por uma única injeção intravenosa (IV) com 3e10 partículas virais (vp) de Ad657 ou CRAd657. Esses camundongos foram tratados uma segunda vez 5 meses mais tarde com 3e10 vp de vírus oncolítico Ad6/57/6 alternativo que expressa GFP-Luciferase e variantes de fibra K7 (com 7 lisinas adicionadas), F35 (com a fibra de Ad35), ou KKTK-C68 (fibra de chimpanzé C68 fundida após o domínio de flexibilidade de Ad6 KKTK. O vírus KKTK-C68 também possui um gene E4 34K códon-otimizado adicionado para aumentar a produtividade viral. A atividade de luciferase foi medida por imageamento 7 dias mais tarde. Todos os Ad6/57/6s possuem um héxon com HVR1 e 7 de Ad6 e HVRs 2-6 de Ad57. Ad6/57/6 e KKTK-C68 possuem fibras que visam CAR. Ad6/57/6-F35 possui a fibra de Ad35 que visa CD46. K7 aumenta a ligação às cargas negativas nas células, incluindo ligação a proteoglicanos de sulfato de heparina. A Figura 70 demonstra a capacidade para oncolíticos com mudança de sorotipo com vírus que visam um tumor com infecção fora do alvo menor do fígado.
MUDANÇA DE SOROTIPO DURANTE VACINAÇÃO DE PRIMATAS NÃO HUMANOS
[312]Nas Figuras 14 a 25, macacos Rhesus foram imunizados com Ad6 replicante de ciclo único que expressa envelope de HIV e depois reforçados por mudança de sorotipo com Ad657 de ciclo único que expressa envelope de HIV. Após essas imunizações, cada animal foi reforçado com proteína do envelope. Cada figura mostra a geração de respostas imunes adaptativas de anticorpo ou celulares e como os animais repeliram o desafio retal com vírus SHIVSF162P3. A Figura 14 documenta o valor da mudança de sorotipo, em que a alteração para Ad657 gerou aumentos acentuados nas respostas de anticorpo.
EXEMPLO 11: VACINAS ONCOLÍTICAS CONTRA O CÂNCER
[313]Camundongos BALB/c foram imunizados com 1010 partículas virais de CRAd-657-dl1101/1107-FolR com E3 intacta e que expressam o receptor de folato alfa humano ou com PBS pela via intramuscular. Os soros foram coletados 2 semanas após uma imunização e analisados para anticorpos anti-receptor alfa de Folato por ELISA usando anti-anticorpo IgM para detecção (todos os anticorpos são IgM nesse tipo de ponto do tempo inicial após imunização). Os dados mostram a geração de anticorpos contra o antígeno de câncer conhecido de receptor de folato alfa por esse CRAd. p - 0,07 por teste- T (Figura 53).
EXEMPLO 12: EFEITOS DE GENES DE EVASÃO IMUNE E3 SOBRE A ATIVIDADE ONCOLÍTICA
[314]A Figura 57 mostra uma representação esquemática de diferentes genes de evasão imune E3 em Ads. E3 19K protege células infectadas de células T e células NK. Proteínas RID protegem as células infectadas de ligantes de indução de morte (FAS, TRAIL, TNFR e EGFR). 14,7K inibe a ativação intrínseca de apoptose em células infectadas. Ads da espécie C também expressam o 11,6K conhecido como a proteína de morte dos adenovírus (ADP). A superexpressão de ADP acelera a morte celular, mas a morte global celular é igual. Espécie 49K se liga à CD46 em células T e células NK, levando à infra- regulação dessas células e morte celular menos eficiente de células deficientes em MHC classe I por células NK.
[315]A Figura 58 demonstra que a deleção parcial de E3 12,5K e a deleção completa de genes E3 6,7K, 19K, 11,6K (ADP), 10,4K (RIDα), 14,5K (RIDβ) e 14,7K reduzem a eficácia oncolítica em um modelo em hamster imunocompetente de câncer renal quando esses genes de evasão imune não estão presentes no adenovírus oncolítico.
OUTRAS MODALIDADES
[316]Deve ser subentendido que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a sua descrição detalhada, a descrição apresentada anteriormente visa ilustrar, e não limitar, o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações seguintes.

Claims (14)

1. Adenovírus humano recombinante (Ad) da cepa Ad6 caracterizado por compreender polipeptídeos de héxon tendo regiões hipervariáveis de héxon (HVRs) de uma cepa Ad57 humana, os referidos polipeptídeos de héxon tendo a sequência de SED ID NO: 49, o referido Ad recombinante compreendendo ainda ácidos nucleicos que codificam CD40L tendo a sequência de SEQ ID NO: 79, 4-1BBL tendo a sequência de SEQ ID NO: 80 ou uma combinação de 4-1BBL e CD40L.
2. Adenovírus humano recombinante (Ad) da cepa Ad6 caracterizado por compreender polipeptídeos de héxon tendo regiões hipervariáveis de héxon (HVRs) de uma cepa Ad57 humana, os referidos polipeptídeos de héxon tendo a sequência de SED ID NO: 49, em que o Ad recombinante é um Ad condicionalmente replicante (CRAd), o referido CRAd compreendendo ainda ácidos nucleicos que codificam CD40L tendo a sequência de SEQ ID NO: 79, 4-1BBL tendo a sequência de SEQ ID NO: 80 ou uma combinação de 4-1BBL e CD40L.
3. Adenovírus humano recombinante (Ad) da cepa Ad6 caracterizado por compreender polipeptídeos de héxon tendo regiões hipervariáveis de héxon (HVRs) de uma cepa Ad57 humana, os referidos polipeptídeos de héxon tendo a sequência de SED ID NO: 59, o referido Ad recombinante compreendendo ainda ácidos nucleicos que codificam CD40L tendo a sequência de SEQ ID NO: 79, 4-1BBL tendo a sequência de SEQ ID NO: 80 ou uma combinação de 4-1BBL e CD40L.
4. Adenovírus humano recombinante (Ad) da cepa Ad6 caracterizado por compreender polipeptídeos de héxon tendo regiões hipervariáveis de héxon (HVRs) de uma cepa Ad57 humana, os referidos polipeptídeos de héxon tendo a sequência de SED ID NO: 59, em que o Ad recombinante é um Ad condicionalmente replicante (CRAd), o referido CRAd compreendendo ainda ácidos nucleicos que codificam CD40L tendo a sequência de SEQ ID NO: 79, 4-1BBL tendo a sequência de SEQ ID NO: 80 ou uma combinação de 4-1BBL e CD40L.
5. Ad humano recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender ainda um polipeptídeo do capsídeo a partir de uma ou mais cepas de Ad diferentes, em que o polipeptídeo do capsídeo é um polipeptídeo de fibra compreendendo uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 60 a 65.
6. Ad humano recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda substituições de aminoácidos e/ou modificações de aminoácidos, em que a substituição de aminoácido é para uma cisteína em HVR dos polipeptídeos e a modificação de aminoácido é selecionada a partir de PEGuilação e BAPilação da cisteína na HVR do polipeptídeo.
7. Ad humano recombinante, de acordo com a reivindicação 2 ou 4, caracterizado por compreender um terminal-N do polipeptídeo E1A tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 45.
8. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um adenovírus humano recombinante (Ad), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e carreadores farmaceuticamente aceitáveis.
9. Uso do adenovírus humano recombinante (Ad), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento de câncer.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é câncer de próstata, câncer ovariano, câncer de pulmão, carcinoma hepatocelular, câncer pancreático, câncer renal, melanoma, câncer cerebral, câncer do cólon, linfoma, mieloma, leucemia linfocítica e leucemia mielógena.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para administração sistêmica.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a administração sistêmica compreende administração intramuscular, intranasal ou intravenosa.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para a administração que é administração local.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a referida administração local compreende injeção intratumoral.
BR112021009929-8A 2018-11-21 2019-11-21 Adenovírus recombinante, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e seus usos para tratamento de câncer BR112021009929B1 (pt)

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