KR20210093303A - 아데노바이러스 및 아데노바이러스의 사용 방법 - Google Patents

아데노바이러스 및 아데노바이러스의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 전달, 백신접종, 및/또는 암 치료를 위한 방법 및 물질에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 하나 이상의 재조합 아데노바이러스 (Ad)를 종양용해제로서 사용하는 핵산 전달, 백신접종, 및/또는 암 치료를 위한 방법 및 물질이 제공된다.

Description

아데노바이러스 및 아데노바이러스의 사용 방법
본 발명은 핵산 전달, 백신접종, 및/또는 암 치료를 위한 방법 및 물질에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 의학적 병태 예컨대 암을 치료하기 위한 아데노바이러스 (Ad) 및 아데노바이러스의 사용 방법을 포함한다. 본 발명의 한 측면에서, 본원에서 제공된 아데노바이러스는 종양용해제로서 사용될 수 있다.
방대한 노력에도 불구하고, 2017년에만 160만개를 초과하는 새로운 사례가 있으면서 암은 미국에서 여전히 주요 공중 보건 문제로 남아 있다 (National Cancer Institute, "Cancer Stat Facts: Cancer of Any Site", seer.cancer.gov/statfacts/html/all.html). 전통적인 요법, 예컨대 화학요법제, 방사선 요법 및 수술은 종종 실패하고, 특히 암이 진행된 경우에 그러하다. 이에 대한 이유 중 하나는 암 세포가 이러한 요법에 의해 표적화되는 성분을 제거하거나 또는 변형시켜, 사멸되는 것을 효과적으로 피할 수 있다는 것이다.
종양용해 바이러스요법은 선택적으로 복제되는 바이러스를 이용하여 종양을 파괴하는 것에 의해 암 치료에 대한 대안적인 접근법을 제공할 수 있고, 적응 면역 반응을 활성화시킬 수 있으며, 종양에 대한 평생 면역을 보장할 수 있다 (Russell et al., 2017 Molecular Therapy 25:1107-1116).
본 발명은 핵산 전달, 백신접종, 및/또는 암 치료를 위한 방법 및 물질에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 종양용해제로서 투여하는 것에 의해 암을 치료하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 한 실시양태에서, 재조합 Ad는 제1 Ad로부터 유래될 수 있고 (예를 들어, 재조합 Ad 백본으로도 지칭되는 제1 Ad, 예컨대 Ad6의 게놈을 포함할 수 있고), 제2 Ad 예컨대 Ad57로부터의 헥손 HVR을 포함할 수 있다. 재조합 Ad가 Ad6 게놈 및 Ad57 헥손 HVR을 포함하는 경우, 재조합 Ad는 Ad657로 지칭되는 키메라 Ad일 수 있다. (문헌 [Nguyen, et al. Oncolytic Virotherapy 7:43-51, 2018]을 참조한다).
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 사용하는 감염성 질환에 대한 백신접종 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 종양용해제로서 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, 하나 이상의 Ad657)를 사용하여, (예를 들어, 암 세포를 감염시키고 사멸시키는 것에 의해) 포유동물에서 암 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 사용하여, 포유동물에서 항암 면역 반응을 자극할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 사용하여, 포유동물에서 감염성 질환에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다.
본원에서 입증된 바와 같이, Ad657이 피하 인간 DU145 전립선암 종양이 있는 마우스에게 정맥내 주사에 의해 전달되는 경우, Ad657은 먼저 간을 감염시킨 후, 원위 종양에 도달한다. Ad6이 더 높은 효능을 매개하면서, Ad6 및 Ad657 양쪽 모두 종양 성장의 유의한 지연 및 생존 연장을 매개하였다.
본 발명은 핵산 전달, 백신접종, 및/또는 암 치료를 위한 방법 및 물질에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 종양용해제로서 투여하는 것에 의해 암을 치료하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 한 실시양태에서, 재조합 Ad는 제1 Ad로부터 유래될 수 있고 (예를 들어, 재조합 Ad 백본으로도 지칭되는 제1 Ad, 예컨대 Ad6의 게놈을 포함할 수 있고), 제2 Ad 예컨대 Ad57로부터의 헥손 HVR을 포함할 수 있다. 재조합 Ad가 Ad6 게놈 및 Ad57 헥손 HVR을 포함하는 경우, 재조합 Ad는 Ad657로 지칭되는 키메라 Ad일 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 사용하는 감염성 질환에 대한 백신접종 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 종양용해제로서 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, 하나 이상의 Ad657)를 사용하여, (예를 들어, 암 세포를 감염시키고 사멸시키는 것에 의해) 포유동물에서 암 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 사용하여, 포유동물에서 항암 면역 반응을 자극할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체 중 하나 이상)를 사용하여, 포유동물에서 감염성 질환에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다.
본원에서 입증된 바와 같이, Ad657이 피하 인간 DU145 전립선암 종양이 있는 마우스에게 정맥내 주사에 의해 전달되는 경우, Ad657은 먼저 간을 감염시킨 후, 원위 종양에 도달한다. Ad6이 더 높은 효능을 매개하면서, Ad6 및 Ad657 양쪽 모두 종양 성장의 유의한 지연 및 생존 연장을 매개하였다.
또한, 종양용해 바이러스가 정맥내 전신 요법으로 사용되는 경우에 간 격리는 실제로 임의의 종양용해 바이러스에 대한 상당한 문제이다. 바이러스가 간세포를 감염시키고 이를 사멸시키면, 이는 낮은 용량에서는 간 손상을, 더 높은 용량에서는 사망을 초래할 것이다. 명백하게, 본 발명의 Ad, 즉, Ad657 키메라 벡터 및 그의 변이체의 투여는 Ad5 또는 Ad6보다 예상밖의 더 낮은 간 손상을 매개하였다. 따라서, Ad6 플랫폼과 Ad657의 HVR 1-7의 독특한 조합이 생체분포에서의 변화 및 천연 바이러스에서 관찰되지 않은 요법을 매개하였다.
또한, 본원에서 입증된 바와 같이, 비강내 (IN) 및 근육내 (IM) 경로에 의해 클레이드 B HIV-1 gp160만 발현하는 복제성 단일-사이클 아데노바이러스 (SC-Ad657)로 리서스 마카크(리서스 마카크)를 면역화시키는 것이 백신접종의 점막 및 전신 경로에 비교되었다. SC-Ad 백신은 독자적으로 단 1회의 면역화 후에 Env에 대한 유의한 순환 항체 역가를 생성시켰다. IM 경로에 의해서만 면역화된 동물은 혈액에서 말초 T 여포 헬퍼 (pTfh) 세포가 높았지만, 림프절에서 Tfh가 낮았고, 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 항체 활성이 더 낮았다. IN 경로에 의해 면역화된 동물은 림프절에서 Tfh가 높았지만, 혈액에서 pTfh가 낮았고, ADCC 항체가 더 높았다. 면역화된 동물에 SHIVSF162P3을 직장으로 챌린지하였을 때, 이들 모두 감염되었지만, 점막-프라이밍 동물은 위장관 내의 바이러스 로드가 현저히 더 낮았다. 유사하게, C형 간염 항원에 대한 유전자를 보유하는 Ad657은 간염 및 사이토메갈로바이러스에 대해 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 생성시킬 수 있다. Ad657은 시토카인 예컨대 4-1BBL, 과립구 대식세포 자극 인자 (GMCSF), 및 IL-21을 포함하는 치료 유전자를 전달하고 발현시킬 수 있다. 본원에서 제공된 결과는 재조합 Ad가 암에 대한 핵산, 백신 및/또는 종양용해 바이러스요법을 위한 국소 또는 전신 전달 비히클로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
발명의 개요
일반적으로, 본 발명의 한 측면은 (a) 제1 Ad 균주로부터의 Ad 게놈 및 (b) 제2 Ad 균주로부터의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 헥손 폴리펩티드의 초가변 영역 (HVR) 중 하나 이상이 Ad 게놈에 의해 코딩되는 HVR과 상이한 것인 재조합 Ad를 특색으로 한다. 제1 Ad 균주는 제1 인간 Ad 균주일 수 있고, 제2 Ad 균주는 제1 인간 Ad 균주와 상이한 제2 인간 Ad 균주일 수 있다. 제1 Ad 균주 및 제2 Ad 균주는 혈청형이 별개의 것일 수 있다. 제1 Ad 균주는 인간 Ad6 균주일 수 있고, 제2 Ad 균주는 인간 Ad57 균주일 수 있다. 재조합 Ad는 하나 이상의 표적화 폴리펩티드, 항원성 폴리펩티드, 효소, 아미노산 치환, PEG화, 리간드, 태그 등을 또한 포함할 수 있다.
재조합 Ad는 유전자-기반 백신접종, 유전자 요법 용도/전달, 또는 종양용해 바이러스요법을 위한 벡터로서 사용될 수 있다.
추가 실시양태에서, 재조합 Ad는 (a) 제1 Ad 균주로부터의 Ad 게놈, 및 (b) 하나 이상의 Ad 균주로부터의 적어도 1개의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 하나 이상의 Ad 균주로부터의 헥손 폴리펩티드의 초가변 영역 (HVR)이 제1 Ad 게놈에 의해 코딩되는 HVR과 상이하다.
추가 실시양태에서, 재조합 Ad는 복제 적격성 또는 조건부-복제 Ad (예를 들어, CRAd)일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 제1 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 (b) 제2 헥손 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 헥손 폴리펩티드의 아미노산 서열이 제2 헥손 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이한 것인 재조합 및/또는 키메라 Ad를 특색으로 한다. 제1 헥손 폴리펩티드의 초가변 영역 (HVR)의 아미노산 서열이 제2 헥손 폴리펩티드의 초가변 영역의 아미노산 서열과 상이할 수 있다. 핵산은 제1 Ad 균주로부터의 것일 수 있고, 제2 헥손 폴리펩티드는 제2 Ad 균주로부터의 것일 수 있다. 제1 Ad 균주는 제1 인간 Ad 균주일 수 있고, 제2 Ad 균주는 제1 인간 Ad 균주와 상이한 제2 인간 Ad 균주일 수 있다. 제1 Ad 균주 및 제2 Ad 균주는 혈청형이 별개의 것일 수 있다. Ad 균주는 인간 Ad6 균주일 수 있고, 제2 Ad 균주는 인간 Ad57 균주일 수 있다. 재조합 Ad는 표적화 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩티드는 아미노산 서열 TARGEHKEEELI (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)을 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 재조합 Ad는 a) 제1 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 (b) 하나 이상의 Ad 균주로부터의 제2 헥손 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 헥손 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 Ad 균주로부터의 제2 헥손 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이하다.
추가 실시양태에서, 재조합 Ad는 복제 적격성 Ad 또는 조건부-복제 Ad (예를 들어, CRAd)일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암에 걸린 포유동물을 치료하기 위한 물질 및 방법을 제공한다. 방법은 (a) 제1 Ad 균주로부터의 Ad 게놈 및 (b) 하나 이상의 Ad 균주로부터의 적어도 1개의 헥손 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 헥손 폴리펩티드의 초가변 영역 (HVR) 중 하나 이상이 Ad 게놈에 의해 코딩되는 HVR과 상이한 것인 재조합 Ad, 및/또는 (a) 제1 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 (b) 제2 헥손 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 헥손 폴리펩티드의 아미노산 서열이 제2 헥손 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이한 것인 Ad를 암에 걸린 포유동물에게 투여하는 것을 포함하거나 또는 이렇게 투여하는 것으로 본질적으로 이루어질 수 있다. 포유동물은 인간일 수 있다. 암은 전립선암, 난소암, 폐암, 간세포 암종, 췌장암, 신장암, 흑색종, 뇌암, 결장암, 림프종, 골수종, 림프구성 백혈병, 및 골수성 백혈병일 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여 (예를 들어, 정맥내, 종양내, 근육내, 기관내, 림프절내 투여)를 포함할 수 있다.
Ad657 및 그의 변이체가 치료 폴리펩티드의 발현을 위해 치료 유전자를 세포에 전달할 수 있다는 것이 본원에서 입증된다. 따라서, 키메라 Ad를 포함하는 재조합 Ad가 암에 대한 핵산, 백신 및/또는 종양용해 바이러스요법을 위한 국소 또는 전신 전달 비히클로서 사용될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세사항이 실시예 및 첨부 도면, 뿐만 아니라 하기 설명에서 기재된다. 본 발명의 다른 특색, 목표, 및 장점이 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다. (a) 제1 Ad 균주로부터의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 Ad 게놈 및 (b) 하나 이상의 상이한 Ad 균주로부터의 적어도 1개의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 헥손 폴리펩티드의 적어도 1개의 초가변 영역 (HVR)이 제1 Ad 균주의 Ad 게놈에 의해 코딩되는 HVR과 상이한 것인 재조합 아데노바이러스 (Ad).
본 발명의 추가 측면은 제1 Ad 균주 및 하나 이상의 상이한 Ad 균주가 혈청형이 별개의 것인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 제1 Ad 균주가 인간 Ad6 균주이고, 제2 Ad 균주가 인간 Ad57 균주인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 표적화 폴리펩티드, 항원, 효소, 수용체, 리간드 또는 태그를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 표적화 폴리펩티드가 서열식별번호: 1-41 및 서열식별번호: 46-47로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 재조합 Ad가 복제 적격성 Ad인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 복제 적격성 Ad가 단일-사이클 Ad 또는 조건부-복제 Ad (CRAd)인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 (a) 제1 Ad 균주로부터의 Ad 캡시드 폴리펩티드 및 (b) 하나 이상의 상이한 Ad 균주로부터의 적어도 1개의 헥손 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 헥손 폴리펩티드의 초가변 영역 (HVR) 또는 캡시드 폴리펩티드가 제1 Ad 균주의 HVR 또는 캡시드 폴리펩티드와 상이한 것인 이러한 재조합 아데노바이러스 (Ad)에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 (a) 제1 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 (b) 제2 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 헥손 폴리펩티드의 아미노산 서열이 제2 헥손 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이한 것인 이러한 재조합 아데노바이러스 (Ad)에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 적어도 1개의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 상기 제2 헥손 폴리펩티드의 초가변 영역의 아미노산 서열과 상이한 것인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 핵산이 제1 Ad 균주로부터의 것이고, 상기 제2 헥손 폴리펩티드가 제2 Ad 균주로부터의 것인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 제1 Ad 균주가 제1 인간 Ad 균주이고, 상기 제2 Ad 균주가 상기 제1 인간 Ad 균주와 상이한 제2 인간 Ad 균주인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 제1 Ad 균주 및 상기 제2 Ad 균주가 혈청형이 별개의 것인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 제1 Ad 균주가 인간 Ad6 균주이고, 상기 제2 Ad 균주가 인간 Ad57 균주인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 표적화 폴리펩티드를 추가로 포함하는 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 표적화 폴리펩티드가 아미노산 서열 TARGEHKEEELI (서열식별번호: 1)를 포함하는 것인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 재조합 Ad가 복제 적격성 Ad인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 복제 적격성 Ad가 단일-사이클 Ad 또는 조건부-복제 Ad (CRAd)인 이러한 재조합 Ad에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 암에 걸린 포유동물에게 본원에 기술된 바와 같은 재조합 아데노바이러스 (Ad)를 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 암이 전립선암, 난소암, 폐암, 간세포 암종, 췌장암, 신장암, 흑색종, 뇌암, 결장암, 림프종, 골수종, 림프구성 백혈병, 및 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 이러한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 것인 이러한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 전신 투여가 근육내, 비강내 또는 정맥내 투여를 포함하는 것인 이러한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 투여가 국소 투여를 포함하는 것인 이러한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 상기 국소 투여가 종양내 주사를 포함하는 것인 이러한 방법에 관한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명을 실행하는 데 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질이 하기에서 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 추가적으로, 물질, 방법 및 예는 예시적일 뿐이고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세사항이 하기의 첨부 도면 및 설명에서 기재된다. 본 발명의 다른 특색, 목표, 및 장점이 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다
도 1은 파지에서 아데노바이러스로의 맥락-특이적 펩티드의 번역을 나타낸다. A) 무작위 12량체 펩티드 라이브러리를 구조적으로 구속하는 Ad5 섬유 HI β 시트를 함유하는 파지 디스플레이 라이브러리의 도식. Ad5 HVR5 헥손 내의 β7과 β8 시트 사이의 구조적으로 유사한 부위의 도시가 하기에 제시된다. B) HI 라이브러리 내의 12.51 및 12.52의 1차 아미노산 정렬, 및 헥손의 HVR5 내로 삽입되었을 때의 그의 위치. C) 이러한 펩티드로 변형된 Ad5 GFP-Luc 발현 바이러스를 나타냄.
도 2는 시험관 내 형질도입을 나타낸다. A) 감염 2일 후의 104 vp/세포의 지시된 벡터로 감염된 C2C12 세포의 형광 현미경에 의한 GFP 발현. B) 다양한 MOI의 지시된 Ad로의 감염 2일 후의 C2C12 세포로부터의 루시퍼라제 활성.
도 3은 마우스에서의 생체 내 형질도입을 나타낸다. A) 정맥내 (IV) 또는 근육내 (IM) 경로에 의한 주사 1일 후의 마우스의 루시퍼라제 영상화. IM 주사 마우스는 각각의 사두근 내로 109 vp가 제공되었다. IV 주사 마우스는 꼬리 정맥에 의해 1010 vp가 제공되었다. B) 주사 후 지시된 일의 영상화에 의한 루시퍼라제 활성의 정량. * 일원 ANOVA에 의해 p < 0.05. *** 일원 ANOVA에 의해 p < 0.001.
도 4는 햄스터에서의 생체 내 형질도입을 나타낸다. A) IM 경로에 의한 1010 vp 주사 1일 후의 햄스터의 근육에서의 루시퍼라제 활성. ** T 검정에 의해 p < 0.01.
도 5는 단일 IM 면역화 16주 후의 유전자-기반 면역 반응을 나타낸다. 도 3으로부터의 마우스에서 IM 주사 16주 후에 채혈하고, 혈청을 연속 희석에서 ELISA에 의해 분석하여, GFP 단백질에 대한 항체를 검출하였다. 일원 ANOVA에 의해 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. **** 일원 ANOVA에 의해 p < 0.0001. 모든 Ad-주사 마우스에서 1:10,000 내지 1:1000의 혈청 희석에서 PBS 군에 비교했을 때 유의한 항-GFP 항체가 생성되었다. Ad5-GL-HVR-12.51 및 12.52 대 Ad5-GL의 비교가 흑색 별표로 제시된다. Ad5-GL-HVR-12.51과 Ad5-GL-HVR-12.52 사이의 비교가 회색 별표로 제시된다. OD 0.06의 회색 단속선 및 점선은 PBS 군과 상이한 항체를 구별하는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 6은 인간 아데노바이러스 혈청형의 전체 게놈 서열의 계통수를 나타낸다.
도 7은 헥손 및 E3 영역에서의 변이를 나타내는 Ad5, 6, 및 57의 정렬을 나타낸다. (A) Ad6 및 Ad57의 게놈의 푸스텔(Pustell) DNA 정렬. 박스는 2개의 바이러스 사이에서 변이가 최고인 헥손 및 E3 영역을 지시한다. (B) Ad5, Ad6, 및 Ad57로부터의 헥손 단백질 내의 초가변 영역의 ClustalW 아미노산 정렬. 정렬은 맥벡터(MacVector) 상에서 수행되었다.
도 8은 Ad6 HVR을 Ad57 HVR로 교체하는 것에 의한 Ad657 구축의 삽화를 나타낸다. 약어: HVR, 초가변 영역.
도 9는 시험관 내 종양용해 활성을 나타낸다. LNCaP 및 DU145 세포를 지시된 바이러스로 지시된 vp/세포로 5일 동안 처리하였다. 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 세포 생존율을 OD595에 의해 측정하였다. 샘플의 OD를 동일한 96-웰 플레이트 상의 미처리 대조군 세포의 평균 OD로 나누고, 이러한 숫자에 100을 곱함으로써 세포 생존율 (%)을 계산하였다. (A) LNCaP 세포 사멸. (B) DU145 사멸. 약어: vp, 바이러스 입자.
도 10은 간 손상에 대한 종양용해 Ad의 효과를 나타낸다. C57BL/6 마우스 (n=6마리/군)에 1011 vp의 각각의 바이러스를 꼬리 정맥에 의해 주사하였다. (A) 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존. (B) 주사 3일 후 ALT 측정을 위해 혈액을 뽑았다 (**** ANOVA에 의해 p<0.001). 약어: ALT, 알라닌 아미노트랜스퍼라제; vp, 바이러스 입자.
도 11은 단일 i.v. 투여 후의 누드 마우스 내의 DU145 종양 이종이식편에서의 Ad6 및 Ad657의 항암 활성을 나타낸다. 확립된 DU145 종양을 보유하는 누드 마우스 (n=9마리/군)에 단일 용량의 3×1010 vp의 지시된 바이러스 또는 PBS를 i.v. 주사하였다. (A) 종양 성장에 대한 단일 i.v. 주사의 효과. 종양 치수를 캘리퍼스로 측정하고, 종양 부피를 폭2×길이×1/2로서 계산하였다. 데이터는 평균±SE로서 제시된다. 텍스트에 기술된 바와 같은 ANOVA 또는 T-검정에 의해 *p<0.05, ****p=0.0001. 위를 가리키는 흑색 화살표가 있는 흑색 별표는 텍스트에 기술된 선택된 날의 Ad6 군과 PBS 군 사이의 통계적 차이를 지시한다. 회색 별표 및 위를 가리키는 화살표는 지시된 날의 Ad657 군과 PBS 군 사이의 차이를 지시한다. 아래를 가리키는 회색 화살표가 있는 음영진 백색 별표는 지시된 날의 Ad6과 Ad657 군 사이의 통계적 차이를 지시한다. (B) 생존에 대한 단일 i.v. 주사의 효과. 종양 부피가 2000 ㎕에 도달하였거나 또는 다른 희생 기준 (예를 들어, 궤양화)이 충족되었을 때 동물을 안락사시키고, 카플란-마이어 생존 곡선을 플롯팅하였다 (로그-순위 분석에 의해 *p<0.05, **p<0.01). 약어: i.v., 정맥내.
도 12는 누드 마우스의 루시퍼라제 영상화를 나타낸다. 12.5K, 6.7K, 19K, 11.6K (ADP), 10.4K (RIDα), 14.5K (RIDβ), 및 14.7K의 부분의 결실 및 E4 34K의 부분적 결실이 있는 3×1010 vp의 Ad6 및 Ad657-GFP-Luc의 단일 i.v. 주사 4일 후. 약어: i.v., 정맥내; vp, 바이러스 입자.
도 13은 누드 마우스의 루시퍼라제 영상화를 나타낸다. 주: 3×1010 vp의 Ad657-GFP-Luc의 단일 i.v. 주사 14일 후. 약어: i.v., 정맥내; vp, 바이러스 입자.
도 14는 혈장 HIV Env 결합 역가를 나타낸다. 상이한 SC-Ad 및 gp140 단백질로의 면역화가 대형 화살표로 그래프 위에 제시된다. ELISA에 의한 중간점 F8 gp140 결합 역가가 각각의 동물에 대해 각각의 면역화 전 및 후에 제시된다. 단속선은 이러한 검정법에서의 항체에 대한 최소 검출 한계를 지시한다. 각각의 시점에 기호들이 x 방향으로 분산되어, 개별적인 측정이 관찰되도록 허용한다. SC-Ad6-Ebov는 음성 대조군 Ad 백신이다. 이러한 군의 동물은 gp140으로 부스팅되지 않았다. SC-Ad6-Ebov 군에 비교하여 일원 ANOVA에 의해 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p< 0.001, **** p < 0.0001.
도 15는 혈장 HIV 중화 역가를 나타낸다. TZM-bl 중화 검정법을 사용하여 지시된 바이러스의 중화를 수행하였다. 모든 값은 바이러스-단독 웰에 비교하여 계산되었다. 각각의 점은 각각의 동물에 대한 평균값을 나타낸다.
도 16은 혈장 ADCC 활성을 나타낸다. 혈장 샘플을 CD16-KHYG-1 이펙터 세포로 테스트하여, SHIVSF162P3으로 감염된 표적 세포인 CEM.NKR.CCR5.CD4+-Luc을 사멸시켰다. 각각의 점은 각각의 동물에 대한 평균값을 나타낸다. SC-Ad6-Ebov 군에 대비하여 일원 ANOVA에 의해 * p < 0.05, *** p< 0.001, **** p < 0.0001.
도 17은 점막 ADCC 활성을 나타낸다. 질 세정물 및 타액 샘플을 CD16-KHYG-1 이펙터 세포로 테스트하여, SHIVSF162P3로 감염된 표적 세포인 CEM.NKR.CCR5.CD4+-Luc를 사멸시켰다. 각각의 점은 각각의 동물에 대한 평균값을 나타낸다. SC-Ad6-Ebov 군에 대비하여 일원 ANOVA에 의해 * p < 0.05.
도 18은 PBMC 및 림프절로부터의 IFN-γ 분비 세포를 나타낸다. IFN-γ에 대해 염색하는 것에 의해 ELISPOT에 의해 PBMC 및 림프절 세포를 분석하였다. 항-Env는 보존된 HIV Env 펩티드 및 SC-Ad로 자극된 세포를 지시한다. 각각의 자극된 웰 내의 스팟 형성 세포 (SFC)의 총 개수를 카운팅하고, 배경으로서의 대조군 배지에 대해 조정하였다. 각각의 점은 각각의 동물에 대한 평균값을 나타낸다. * 일원 ANOVA에 의해 p < 0.05.
도 19는 점막 T 세포 추적 및 활성화를 나타낸다. 2차 단백질 부스트 후에 수집된 직장 생검물로부터 T 세포를 수확하고, 유동 세포측정법에 의해 CD4, CD8, α4β7 인테그린, CD69, 및 FoxP3에 대해 분석하였다. 각각의 점은 각각의 동물에 대한 평균값을 나타낸다.
도 20은 혈액 및 림프절에서의 Tfh 세포 반응을 나타낸다. 제40주에 수집된 PBMC 및 림프절 세포를 HIV-1 Env 단백질로 자극한 후, CD3+, CD4+, CXCR5+, 및 IL-21의 공동-발현에 대해 검사하였다. 각각의 점은 각각의 동물에 대한 평균값을 나타낸다. * 일원 ANOVA에 의해 p < 0.05.
도 21은 반복된 직장 SHIVSF162P3 챌린지에 대한 보호를 나타낸다. 지시된 군에 4.3 TCID50 (리서스 PBMC)의 SHIVSF162P3을 매주 기반으로 직장에 챌린지하였다. 혈장 샘플을 SHIV 바이러스 RNA 카피에 대해 분석하였다. 10개를 초과하는 RNA 카피가 있는 동물이 감염된 것으로 간주되었고, 이러한 동물을 감염시키는 데 필요한 챌린지의 수가 카플란-마이어 생존 분석을 위한 이벤트로서 사용되었다.
도 22는 SHIVSF162P3 획득 및 바이러스 로드를 나타낸다. A) 도 8로부터의 동물을 그의 초기 SC-Ad 프라이밍 경로 (IM 또는 IN)에 의해 군으로 분류하여 8마리의 군이 산출되었고, 카플란-마이어 분석을 수행하였다. B) 챌린지 연구 과정에 걸친 혈장 SHIVSF162P3 바이러스 RNA 수준.
도 23은 조직 내의 SHIV 바이러스 로드를 나타낸다. PBMC 및 사후 조직으로부터의 RNA를 수집하고, qPCR을 수행하여 SHIV 바이러스 RNA에 대해 검출하고, 분석하였다.
도 24는 실시예 7에서 사용된 단일-사이클 아데노바이러스 백신을 나타낸다. A) F8 및 G4 클레이드 B HIV 외피 유전자를 보유하는 SC-Ad 혈청형 6 및 657의 삽화. B) 백신 상에 디스플레이된 Ad6 및 57 헥손을 포함하는 클레이드 C Ad 헥손의 정렬.
도 25는 타액 및 질 HIV env 결합 적정을 나타낸다. F8에 대해 테스트되었을 때의 지시된 희석의 지시된 샘플에 대해 ELISA OD450 수준이 제시된다. 이러한 점막 샘플 내의 항체의 낮은 수준은 검정법의 포화에 도달하는 것을 방지한다. 이러한 이유로, 대부분의 동물에 대해 EC50 값이 신뢰할 수 있게 계산될 수 없다. IN-IM-IM 군의 리서스 마카크 Rh13-091이 EC50이 계산될 수 있는 유일한 동물이었다 (EC50 = 4580). 유사한 결과가 SF162 gp140을 사용하는 ELISA에서 관찰되었다.
도 26은 생체 내 세포독성 T 림프구 (CTL) 활성을 생성하는 사이토메갈로바이러스 (CMV) gB 및 C형 간염으로부터의 항원 유전자를 발현하는 Ad657을 나타낸다. CMV gB보다는 Ad657-HCV가 백신접종된 마우스에서 C형 간염 펩티드-로딩 표적 세포의 사멸이 제시된다.
도 27은 GMCSF-의존적 TF-1 인간 적혈모구의 증식을 유도하는 Ad657로부터의 인간 GMCSF의 발현을 나타낸다.
도 28은 Ad6 단일 IV 주사 대 A549 폐 종양을 나타내는 그래프이다.
도 29는 Ad6 단일 IV 또는 IT 주사 대 Panc1 췌장 종양을 나타내는 그래프이다.
도 30은 면역 적격성 햄스터에서의 Ad6 단일 IV 주사 대 신장암을 나타내는 그래프이다.
도 31은 헥손의 HVR5 내에 12.51 세포 결합 펩티드를 디스플레이하는 Ad에 의한 B16 흑색종 및 A549 폐 종양/암 세포에서의 루시퍼라제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 32는 헥손의 HVR5 내에 12.51 세포 결합 펩티드를 디스플레이하는 Ad에 의한 간세포 암종 및 신장암에서의 루시퍼라제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 33은 상이한 Ad 혈청형들로부터의 개별적인 HVR의 삽입과 표적화된 화학적 변형 및 차폐를 위한 헥손 내로의 세포 표적화/탈표적화 펩티드 또는 신규 아미노산 예컨대 시스테인의 삽입을 조합하는 삽화를 나타낸다. 세포 및 혈액 인자와의 천연 상호작용을 조정하기 위한 상이한 Ad 혈청형으로부터의 상이한 HVR이 조합된 키메라 HVR 구축물이 세포 진입 및 세포 회피를 변화시키기 위한 상이한 HVR 내의 세포 결합 및 세포 탈표적화 펩티드의 삽입과 조합되어 약리학을 개선한다는 것이 도시된다. 1개의 HVR이 100개의 Ad로부터 치환되면, 이는 100개의 상이한 헥손 키메라를 생성시킬 것이다. 7개의 HVR 각각 모두에 상이한 Ad HVR가 제공되면, 이러한 조합형 라이브러리는 7100개의 변이체일 것이다. 1개의 펩티드가 7개의 HVR 내로 도입되면, 이는 7×7100개의 변이체일 것이다. 10개의 상이한 펩티드가 7개의 HVR 내로 도입되면, 이는 10×7×7100개의 변이체일 것이다.
도 34는 대표적인 조합형 헥손 및 펩티드 조합에 대한 플라스미드 지도를 나타낸다. Ad6으로부터의 HVR1 및 Ad57로부터의 HVR 2-7, 뿐만 아니라 개별적인 HVR 내로의 세포 표적화 펩티드의 삽입이 있는 헥손이 제시된다.
도 35는 세포 및 혈액 인자와의 천연 상호작용을 조정하기 위한 상이한 Ad 혈청형으로부터의 상이한 HVR이 조합된 키메라 HVR 구축물이 세포 진입 및 세포 회피를 변화시키기 위한 상이한 HVR 내의 세포 결합 및 세포 탈표적화 펩티드의 삽입과 조합되어 약리학을 개선한다는 것을 나타낸다. 이러한 예에서, 단일 시스테인 아미노산이 Ad657의 HVR1 및 HVR5 내로 삽입되어, 약리학을 조정하고, 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 모이어티 예컨대 영상화제 예컨대 형광단의 표적화된 접합을 허용한다.
도 36은 Ad657-HVR1-C로의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 접합을 나타낸다. A) PEG화가 있거나 또는 없는 Ad 단백질의 SDS-PAGE. 화살표는 헥손으로의 PEG의 화학적 부착으로 인한 크기 증가를 나타낸다. B) 바이러스 감염에 대한 말레이미드-PEG에 의한 표적화된 PEG화 및 비-표적화 NHS-PEG의 효과.
도 37은 Ad657-HVR5-C로의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 접합을 나타낸다. A) PEG화가 있거나 또는 없는 Ad 단백질의 SDS-PAGE. B) PEG화가 있거나 또는 없고, 근적외선 형광 영상화 태그 IR800이 있거나 또는 없는 Ad 단백질의 SDS-PAGE의 근적외선 영상화. C) 루시퍼라제 영상화에 의한 말레이미드-PEG화 Ad657-HVR5-C의 복막내 주사 후의 생체 내 형질도입.
도 38은 누드 마우스의 루시퍼라제 영상화를 나타낸다. A) Ad6 처리의 단일 I.V. 주사 1, 4, 7, 14, 28, 및 42일 후 대 원위 DU145 전립선 종양. B) LNCaP 전립선 종양을 보유하는 마우스 내로의 복제성 Ad5-GFPLUC의 I.V. 주사 3, 7, 및 19일 후.
도 39는 E1A 유전자 내에 변형이 있는 암-특이적 조건부-복제 Ad (CRAd) dl1101+dl1107의 개략도를 나타낸다.
도 40은 Ad6 및 Ad657 양쪽 모두 표적화된 암 요법을 위한 CRAd로서 사용될 수 있다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 41은 Ad 치료 사이클을 나타내는 개략도이다. A) Ad로의 혈청형-전환의 개략도. B) Ad6 및 Ad657이 공유결합 중합체 접합과 조합된 혈청형-전환에 의해 다중 라운드의 치료에 사용될 수 있는 예시적인 치료 사이클의 개략도.
도 42는 E3A 유전자 (12.5K, 6.7K, 19K, 11.6K)에서의 결실이 있지만 E3B 유전자 (10.4K, 14.5K, 및 14.7K) 및 E4 34K가 유지된 Ad6 및 Ad6-F35의 단일 IV 주사 후의 DU145 전립선 종양에서의 혈청형-전환 및 표적-적중 루시퍼라제 활성을 입증한다. 양쪽 모두 무손상 E3 유전자가 있는 Ad657 및 CRAd657의 이전 단일 IV 주사에 종양이 저항한 마우스에 지시된 벡터를 단일 IV 주사에 의해 주사하였다.
도 43은 E1 발현이 천연 E1 프로모터에 의해 제어되는 복제 적격성 Ad (RC-Ad); E1 발현이 전립선-특이적 프로바신 프로모터에 의해 제어되는 변이체 CRAd-프로바신-E1A (Ad-PB); p300 경로 결합이 제거되고, 정상 세포에서 IFN 경로에 대해 감수성인 CRAd-dl1101; 제거된 pRB 결합이 바이러스가 RB 경로가 파괴된 암 세포를 사멸시키게 허용하지만, RB+ 정상 세포에서는 억제되는 CRAd-dl1107; p300 경로 결합이 제거되고, IFN 경로에 대해 감수성이며, 제거된 pRB 결합이 바이러스가 RB 경로가 파괴된 암 세포를 사멸시키게 허용하지만, RB+ 정상 세포에서는 억제되는 CRAd-dl1101/07의 개략도이다.
도 44 (A 및 B)는 비-암성 세포 상에서의 복제-적격성 Ad5, Ad6, Ad657로의 감염의 효과 및 Ad6 및 Ad657이 조건부-복제 Ad (CRAd)이도록 변형되는 것을 나타낸다.
도 45는 복제-적격성 Ad5, Ad6, Ad657, 및 지시된 CRAd에 의한 암성 세포의 사멸을 입증한다.
도 46은 Ad6 및 Ad657이 조건부-복제 Ad (CRAd)이도록 변형되는 것을 입증한다.
도 47은 Ad6 및 Ad657이 조건부-복제 Ad (CRAd)이도록 변형되는 것을 입증한다.
도 48은 마우스에서의 DU145 종양의 성장에 대한 복제-적격성 Ad6 또는 지시된 CRAd의 생체 내 효과를 입증한다.
도 49는 인간 전립선 종양을 보유하는 마우스에서의 단일 정맥내 주사 후의 생체 내에서의 양쪽 모두 무손상 E3 영역이 있는 복제-적격성 Ad657 및 조건부-복제 Ad657-dl1101/07의 생체 내 효과를 입증한다.
도 50은 PEG화가 생체 내에서 아데노바이러스를 간에 대해 탈표적화시킨다는 것을 입증한다.
도 51은 침팬지 AdC68로부터의 더 짧은 섬유로의 Ad657의 변형 및 코돈-워블 E4 34.K 유전자의 부가가 시험관 내 효능을 변화시킨다는 것을 입증한다.
도 52는 6/56/6 바이러스가 CRAd 변형의 존재 및 부재 하에 인간 전립선암 세포를 사멸시키는 것을 입증한다.
도 53은 무손상 E3 영역이 있는 CRAd657-dl1101/07-FOLR에 의한 BALB/c 마우스의 단일 근육내 면역화 후의 인간 암 항원 폴레이트 수용체 알파에 대한 항체 반응의 생산을 입증한다.
도 54는, 예를 들어, PEG화 또는 비오틴 어셉터 펩티드 (BAP)로의 "BAP화"에 의해 변형될 수 있는 Ad HVR 상의 부위를 도시한다.
도 55는 바이러스를 조건부-복제 Ad (CRAd)로 전환시키는 E1 단백질 내의 돌연변이를 갖는 Ad의 변이체의 개략도이다.
도 56은 야생형 E1A 폴리펩티드의 N-말단 부분, 및 CRAd 변이체 dl1101, dl1107 및 dl1101/1107의 E1A N-말단의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 57은 C종 Ad의 예인 Ad6 및 D종 Ad의 예인 Ad26에서의 상이한 E3 면역 회피 유전자의 개략도를 나타낸다. 양쪽 모두의 Ad가 E3 12.5K, 6.7K, 19K, 10.4K (RIDα), 14.5K (RIDβ), 및 14.7K 유전자의 크기 및 서열 변이체를 발현하고, 뿐만 아니라 이러한 E3 코딩 단백질의 기능을 도시한다.
도 58은 면역적격 햄스터에서의 Ad6-Luc 바이러스에 의한 종양용해 바이러스 항종양 활성에 대한 PEG화 및 E3 결실의 효과를 입증한다. Ad6-Luc 및 Ad6-Luc-20K PEG 양쪽 모두는 모든 E3 유전자 및 E4 34K가 무손상이다. Ad6-델타E3-Luc는 E3 12.5K 및 E4 34K의 부분적 결실 E3 6.7K, 19K, 11.6K (ADP), 10.4K (RIDα), 14.5K (RIDβ), 및 14.7K 유전자의 완전 결실을 갖는다. 이러한 면역 회피 유전자가 종양용해 아데노바이러스에 존재하지 않을 때 이러한 면역적격 동물 모델에서 종양용해 효능이 상실된다.
도 59는 E3 12.5K 및 E4 34K의 부분적 결실 및 E3 6.7K, 19K, 11.6K (ADP), 10.4K (RIDα), 14.5K (RIDβ), 및 14.7K 유전자의 완전 결실이 있는 Ad657의 플라스미드 지도이다.
도 60은 dl1101/1107 CRAd 변형이 있거나 또는 없고, 선택된 E3 면역 회피 유전자의 결실이 있거나 또는 없는 CRAd 657 구축물을 도시한다.
도 61은 E3 삽입 부위가 있는 CRAd657을 도시한다. 이들은 본원에 기술된 dl1101/1107 CRAd 변형이 있거나 또는 없고, E3 면역 회피 변형이 있거나 또는 없다.
도 62는 CRAd657 +/- Ad35 섬유 또는 침팬지 C68 섬유 +/- K7 펩티드를 도시한다. 이들은 이전 슬라이드에서 기술된 dl1101/1107 CRAd 변형이 있거나 또는 없고, E3 면역 회피 변형이 있거나 또는 없다. 일부 경우에, 코돈-워블 E4 34K 유전자가 E4 후 및 섬유 전에 포함되어, E3B 유전자가 결실되었을 때 E4 34K 부분적 결실을 보상한다.
도 63은 CRAd657 +/- Ad35 섬유 또는 침팬지 C68 섬유 +/- K7 펩티드를 도시한다. 이들은 이전 슬라이드에서 기술된 dl1101/1107 CRAd 변형이 있거나 또는 없고, E3 면역 회피 변형이 있거나 또는 없다.
도 64는 폴레이트 수용체 알파를 발현하는 CRAd657 +/- Ad35 섬유 또는 침팬지 C68 섬유 +/- K7 펩티드를 도시한다.
도 65는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF)를 발현하는 CRAd657 +/- Ad35 섬유 또는 침팬지 C68 섬유 +/- K7 펩티드를 도시한다.
도 66은 1개의 바이러스에서 4-1BBL 또는 GMCSF 또는 IL21 또는 CD40L 및 조합물을 발현하는 CRAd657 +/- Ad35 섬유 또는 침팬지 C68 섬유 +/- K7 펩티드를 도시한다.
도 67은 Ad6 HVR1 및 Ad57 HVR 2-7을 갖는 Ad6/57 +/- Ad35 섬유 또는 침팬지 C68 섬유 +/- K7 펩티드를 도시한다.
도 68은 Ad6 HVR1, Ad57 HVR 2-6, Ad6 HVR7을 갖는 Ad6/57/6 +/- Ad35 섬유 또는 침팬지 C68 섬유 +/- K7 펩티드를 도시한다.
도 69는 GFP루시퍼라제를 발현하는 Ad6 HVR1, Ad57 HVR 2-6, Ad6 HVR7을 갖는 Ad6/57/6 +/- Ad35 섬유 또는 침팬지 C68 섬유 +/- K7 펩티드를 도시한다.
도 70은 혈청형 전환 후의 루시퍼라제 영상화를 나타낸다. 옆구리에 LNCaP 전립선 종양을 보유하는 마우스를 Ad657 또는 CRAd657의 단일 IV 주사에 의해 처리하였다. 단일 IV 주사 5개월 후에 잔류 종양이 있는 마우스를 변이체 섬유 및 코돈-최적화 E4 34K 유전자가 있거나 또는 없는 GFP루시퍼라제를 발현하는 지시된 Ad6/57/6 변이체의 혈청형-전환에 의해 처리하였다. 지시된 Ad6/57/6 변이체는 섬유 상의 부가된 7개의 라이신 (K7), Ad6 섬유 상에 그의 KKTK 가요성 도메인 후에 그래프팅된 침팬지 C68 섬유, 및 Ad35 섬유를 포함하는 상이한 섬유 변형을 갖는 Ad6/57/6 바이러스를 포함한다. 7일 후에 루시퍼라제 활성에 대해 마우스를 영상화하였다.
도 71은 변이체 섬유 및 코돈-최적화 E4 34K 유전자가 있거나 또는 없는 지시된 바이러스 입자 (vp)/세포의 Ad6/57/6으로 처리된 A549 인간 폐암 세포를 나타낸다. 7일 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 플레이트 판독기에서 웰을 분석하였다. 높은 OD는 생존 세포의 존재를 지시한다. 낮은 OD는 부착성 세포의 사멸 및 상실을 지시한다.
본 발명은 핵산 전달, 백신접종, 및/또는 암 치료를 위한 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 하나 이상의 재조합 Ad (예를 들어, Ad657 및 그의 변이체)를 종양용해제로서 사용하는 단백질/폴리펩티드의 핵산 전달, 백신접종, 및/또는 암 치료를 위한 방법 및 물질을 제공한다.
아데노바이러스 20면체는 그의 헥손 단백질의 720개의 카피로 구성된다. 바이러스가 이러한 단백질을 수용체에 결합하는 데 사용하는 것이 아니라, 반복 단백질의 이러한 나노-격자는 단백질, 세포, 및 약물과의 상호작용 (예를 들어, 천연 상호작용 및 비천연 상호작용)을 위한 매트릭스를 제공한다. Ad를 중화할 수 있는 항체는 Ad 상의 헥손 폴리펩티드의 초가변 영역 (HVR)을 표적화할 수 있다.
일부 경우에, 본 발명은 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad를 제공한다. 예를 들어, 재조합 Ad는 제1 Ad로부터 유래될 수 있고, 하나 이상의 상이한 Ad로부터의 헥손 HVR을 포함할 수 있다. HVR은 임의의 C종 Ad, 예를 들어 Ad1, Ad2, Ad5, Ad6 및 Ad57로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 재조합 Ad는 제1 Ad로부터 유래될 수 있고, 적어도 1개의 다른 Ad로부터의 하나 이상의 헥손 HVR을 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 1개의 헥손 HVR은 제1 Ad의 HVR(들)과 상이하다. 제1 Ad 균주는 인간 Ad6 균주일 수 있고, 제2 Ad 균주는 인간 Ad57 균주일 수 있다. 헥손 셔틀 플라스미드 지도 (도 34)는 상이한 Ad 혈청형으로부터의 개별적인 HVR의 삽입과 표적화된 화학적 변형 및 차폐를 위한 헥손 내로의 세포 표적화/탈표적화 펩티드 또는 신규 아미노산 예컨대 시스테인의 삽입의 조합을 나타낸다. 한 실시양태에서, 재조합 Ad는 아미노산 치환, 예를 들어, 폴리펩티드 내로의 시스테인의 치환, 및 변형 예컨대 PEG화 및 BAP화를 포함한다. 중합체 및 기타 화학적 변형을 Ad657 헥손에 삽입된 시스테인으로 표적화하는 능력이 본원에서 입증된다.
인간 전립선암에 대한 종양용해제로서의 Ad657이 입증된다. Ad6 HVR이 Ad57로부터의 것으로 교체되어, Ad657로 칭해지는 키메라 C종 종양용해 바이러스가 생성되었다. Ad657 및 Ad6을 인간 암성 종양을 보유하는 누드 마우스에서 단일 i.v. 주사에 의해 전신 종양용해 요법으로서 테스트하였다. Ad657은 암에 대한 국소 또는 전신 종양용해 바이러스요법으로서 사용될 수 있다. 이러한 데이터는 종양용해 C종 Ad로의 혈청형-전환의 놀라운 효과를 또한 입증한다.
일부 경우에, 본 발명은 본원에서 제공된 하나 이상의 재조합 Ad를 사용하여 암, 감염성 질환 또는 유전 질환에 걸렸거나 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 재조합 Ad가 암에 걸렸거나 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물에게 투여되어, (예를 들어, 암 세포를 감염시키고 사멸시키는 것에 의해) 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 암 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 재조합 Ad가 암에 걸렸거나 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물에게 투여되어, 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 항암 면역 반응을 자극할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657 및 그의 변이체)는 포유동물의 면역계에 의해 파괴되지 않는다. 예를 들어, 재조합 Ad는 재조합 Ad가 투여된 포유동물에서 항원 제시 세포 (APC), 대식세포, 및/또는 기타 면역 세포에 의해 파괴되지 않는다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657 및 그의 변이체)는 다중 (예를 들어, 2회 이상) 라운드의 치료를 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 제1 재조합 Ad는 본원에 기술된 제2 재조합 Ad를 중화시킬 수 있는 항체를 방지할 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다. 암에 걸린 포유동물이 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad로 치료되는 경우에, 포유동물은 제1 치료 라운드에 제1 재조합 Ad가 투여될 수 있고, 후속적으로 제2 치료 라운드에 제2 재조합 Ad가 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657 및 그의 변이체)는 복제 적격성 Ad (RC-Ad)일 수 있다. 예를 들어, RC-Ad는 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 RC-Ad (예를 들어, E1+ RC-Ad)일 수 있다. 예를 들어, RC-Ad는 감염성 바이러스 자손의 생산과 연관된 하나 이상의 폴리펩티드 (예를 들어, pIIIa 및 E3)를 코딩하는 하나 이상의 핵산의 결실을 포함하는 단일-사이클 Ad (SC-Ad)일 수 있다. 예를 들어, RC-Ad는 조건부-복제 Ad (CRAd)일 수 있다. 단일-사이클 Ad의 예 및 그의 제조 및 사용 방법이 다른 곳에서 제공된다 (국제 특허 출원 공개 번호 WO2009/111738).
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657 및 그의 변이체)는 복제 결손성 Ad (RD-Ad)일 수 있다. 예를 들어, RD-Ad는 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 결실을 포함하는 RD-Ad (예를 들어, E1-결실 RD-Ad)일 수 있다.
본원에서의 실시예에서, CRAd 657 및 그의 변이체는 암성 세포에서 조건부-복제 Ad (CRAd)이고, CRAd 657 및 그의 변이체로의 세포 감염이 세포 생존율 및 종양 부피를 감소시킨다는 것이 입증된다. 따라서, CRAd 657 및 그의 변이체는 암에 걸린 대상체에서 국소 또는 전신 종양용해 바이러스요법으로서 사용될 수 있다.
더욱이, CRAd가 항원의 발현에 사용될 수 있고, 바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종 바이러스 (HPV) 및 C형 간염 바이러스 (HCV)에 대한 백신접종을 위한 백신으로서 사용될 수 있다는 것이 입증된다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657 및 그의 변이체)는 (예를 들어, 세포로의 바이러스 진입을 촉진하기 위해) 세포 표면 수용체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 재조합 Ad는 콕사키-아데노바이러스 수용체 (CAR) 및/또는 Fc 수용체 (예를 들어, FcμR 및 FcγR), 보체 수용체 (예를 들어, CR3 및/또는 C2qR)에 결합할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, CRAd는 Ad에 이종인 폴리펩티드, 예를 들어, 항원, 세포 표면 수용체, 세포 표적화 폴리펩티드 등을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, CRAd-657-dl1101/1107-FolR은 무손상 E3을 포함하고 인간 폴레이트 수용체 알파를 발현하는 재조합 Ad이다. CRAd가 공지된 암 항원, 예를 들어, 폴레이트 수용체 알파에 대한 항체를 생성시키는 데 사용될 수 있다는 것이 본원에서 입증된다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 (예를 들어, 세포로의 바이러스 진입을 촉진하기 위해) 스캐빈저 수용체에 대한 결합을 방지할 수 있다 (예를 들어, 결합하지 않는다). 예를 들어, 본원에 기술된 재조합 Ad는 SREC 수용체 및/또는 SR-A 수용체에 대한 결합을 방지한다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 포식작용을 방지할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 치료 중인 포유동물에 대해) 비-병원성이다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 분열 중인 세포를 감염시킬 수 있다 (예를 들어, 분열 중인 세포만 감염시킬 수 있다).
본원에 기술된 재조합 Ad는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 재조합 DNA 기술 및 방법에 의해 생성된 임의의 적합한 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad)일 수 있다. 재조합 Ad는 재조합 Ad가 유래되는 Ad 이외의 임의의 생물로부터의 물질 (예를 들어, 핵산 및/또는 폴리펩티드)을 재조합함으로써 생성된 임의의 Ad일 수 있다. 예를 들어, 재조합 Ad는 이러한 Ad에서 천연으로 발생하지 않는 (예를 들어, 재조합 전에 이러한 Ad에서 천연으로 발생하지 않는) 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에서 제공된 재조합 Ad는 키메라 Ad일 수 있다 (예를 들어, 2개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)의 상이한 Ad 게놈으로부터의 바이러스 요소를 포함할 수 있다).
이러한 실시양태들은 상이한 Ad로부터의 상이한 HVR을 조합하는 Ad (즉, HVR 셔플링)의 맥락에서 또한 적용될 수 있다. 예를 들어, Ad6의 HVR1과 Ad57의 HVR 2-7 또는 Ad6의 HVR1 및 7과 Ad57의 HVR 2-6, 또는 Ad6으로부터의 HVR 1 및 7 및 Ad657로부터의 HVR 2-6.
Ad에서 천연으로 발생하지 않는 핵산 및/또는 폴리펩티드는 임의의 적합한 공급원으로부터의 것일 수 있다. 일부 경우에, 그 Ad에서 천연으로 발생하지 않는 핵산 및/또는 폴리펩티드는 비-바이러스 생물로부터의 것일 수 있다. 일부 경우에, 그 Ad에서 천연으로 발생하지 않는 핵산 및/또는 폴리펩티드는 Ad 이외의 바이러스로부터의 것일 수 있다. 일부 경우에, 그 Ad에서 천연으로 발생하지 않는 핵산 및/또는 폴리펩티드는 상이한 종으로부터 수득된 Ad로부터의 것일 수 있다. 일부 경우에, 그 Ad에서 천연으로 발생하지 않는 핵산 및/또는 폴리펩티드는 상이한 Ad 균주 (예를 들어, 혈청형이 별개의 것인 균주)로부터의 것일 수 있다. 일부 경우에, 그 Ad에서 천연으로 발생하지 않는 핵산 및/또는 폴리펩티드는 합성 핵산 및/또는 합성 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 임의의 적합한 Ad로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 임의의 적합한 Ad로부터의 게놈 백본을 포함할 수 있다). 일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad는 낮은 혈청유병률을 갖는 Ad로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간)의 50% 이하 (예를 들어, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 이하)가 본원에 기술된 재조합 Ad가 유래되는 Ad에 노출되었을 수 있다. 혈청유병률과 관련하여, C종 아데노바이러스인 Ad6 및 Ad657은 원형 Ad5 바이러스보다 낮은 유병률을 갖는다. 일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad는 부작용 (예를 들어, 포식작용 및 간 손상)이 감소되거나 또는 제거된 Ad로부터 유래될 수 있다. 재조합 Ad는 임의의 적합한 동물 종으로부터 단리된 Ad로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, Ad는 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 원숭이 예컨대 구대륙 원숭이 종 예컨대 리서스 마카크), 어류, 개구리, 및 뱀으로부터 단리될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad는 인간 Ad (HAd 또는 HAdV)로부터 유래될 수 있다. 재조합 Ad는 임의의 Ad 종 (예를 들어, A, B, C, D, E, F, 또는 G)으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad는 Ad C종 (예를 들어, 인간 Ad C종 (HAd-C))으로부터 유래될 수 있다. 재조합 Ad는 임의의 적합한 Ad 혈청형 (예를 들어, 2, 5, 6, 또는 57)으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad는 Ad 혈청형 6 (Ad6; 예를 들어, 인간 Ad6)으로부터 유래될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657 및 그의 변이체)는 폴리펩티드 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 및/또는 Ad 게놈의 하나 이상의 바이러스 요소에 대한 하나 이상의 변형을 포함하는 Ad 게놈을 포함할 수 있다. 하나 이상의 변형은 임의의 적합한 변형일 수 있다. 일부 경우에, 변형은 변형된 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드 예컨대 p300 및/또는 pRB에 결합하는 능력을 억제하는 데 효과적일 수 있다. 일부 경우에, 변형은 하나 이상의 인터페론 경로를 중화하는 데 효과적일 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 바이러스 요소에 이루어질 수 있는 변형의 예는, 비제한적으로, 치환, 결실, 삽입 및 돌연변이를 포함한다.
Ad, 예를 들어 Ad657 및 그의 변이체는 모든 E1A 유전자가 변형되어 유지될 수 있거나, 또는 그의 코딩 단백질의 선택된 영역 및 기능이 결실되도록 변형될 수 있다.
도 57은 C종 Ad의 예인 Ad6 및 D종 Ad의 예인 Ad26에서의 상이한 E3 면역 회피 유전자의 개략도, 뿐만 아니라 이러한 E3 코딩 단백질의 기능의 도시를 나타낸다. 양쪽 모두의 Ad가 E3 12.5K, 6.7K, 19K, 10.4K (RIDα), 14.5K (RIDβ), 및 14.7K 유전자의 크기 및 서열 변이체를 발현한다. 19K는 세포 표면 상의 MHC I 및 MIC 단백질의 디스플레이를 감소시켜, 감염된 세포를 T 세포 및 NK 세포로부터 보호한다. RID 단백질은 감염된 세포를 사멸-유도 리간드 (FAS, TRAIL, TNFR, 및 EGFR)로부터 보호한다. 14.7K는 감염된 세포에서의 아팝토시스의 내재적 활성화를 억제한다. C종 Ad는 아데노바이러스 사멸 단백질 (ADP)로 공지된 11.6K를 또한 발현한다. ADP의 과발현은 세포 사멸을 가속화하지만, 전체적인 세포 사멸은 동일하다. D종 바이러스는 49K 및 31K로 칭해지는 2개의 신규 변이체를 또한 발현한다. 분비된 형태의 49K는 T 세포 및 NK 세포 상의 CD46에 결합하여, 이러한 세포의 하향-조절 및 NK 세포에 의한 클래스 I MHC가 결핍된 세포의 덜 효율적인 세포 사멸에 이른다. Ad657 플라스미드는 모든 천연 E3 면역 회피 유전자 (12.5K, 6.7K, 19K, 11.6K (ADP), 10.4K (RIDα), 14.5K (RIDβ), 및 14.7K) 및 E4 34K가 유지되도록 또는 선택된 영역이 결실되도록 변형되었다. Ad657 및 그의 변이체는 또한 49K 및 31K의 부가로 변형되어, 이러한 추가 기능을 이러한 C종 바이러스 플랫폼에 제공한다.
Ad, 예를 들어 Ad657 및 그의 변이체는 모든 E3 면역 회피 유전자를 유지하도록 또는 그의 코딩 단백질의 선택된 영역 및 기능이 결실되도록 변형될 수 있다. E3 돌연변이와 관련하여, 19k는 감염된 세포 상의 MHCI 및 MIC 단백질을 하향조절하고; ADP 과발현은 세포 사멸을 가속화하지만, 사멸되는 세포의 수는 증가시키지 않고; 10k 및 14k 단백질 (RIDα 및 RIDβ)는 외인성 아팝토시스 단백질 예컨대 FAS, TRAIL, TNF, TNFR, 및 EGFR에 의한 세포 사멸을 차단하도록 조합되고; 14.7k 단백질은 내인성 아팝토시스 신호전달을 억제한다.
이러한 E3 단백질을 유지하는 것은 종양용해제가 더 오래 지속되도록 허용할 수 있고, 이를 제거하는 것은 면역 자극을 증가시킬 수 있다.
종양용해 효능을 테스트하는 데이터는 무손상 E3이 더 양호한 효능을 매개한다는 것을 시사한다.
DE3 구축물은 12.5k부터 14.7k를 포함하는 부분이 결실되었고, DE3A 구축물은 E3 12.5k부터 19k를 포함하는 부분이 결실되었으며, DE3ADP 구축물은 E3 12.5k부터 ADP를 포함하는 부분이 결실되었다.
놀랍게도, 모든 E3 유전자를 결실시키는 것은 종양용해 바이러스를 종양 성장을 억제하는 것에서 덜 효과적이게 만든다.
한 실시양태에서, 본 발명은 단일-사이클 아데노바이러스, 예를 들어 SC-Ad657 및 그의 변이체를 포함한다. 폴리펩티드를 코딩하는 이종 핵산을 갖는 재조합 SC-Ad 바이러스를 백신으로서의 용도에 대해 평가하였다. SC-Ad657 백신은 단 1회의 면역화 후에 HIV 외피 단백질에 대한 유의한 순환 항체 역가를 독자적으로 생성시켰다.
유사하게, B형 및 C형 간염 항원에 대한 유전자를 보유하는 Ad657이 간염 및 사이토메갈로바이러스에 대한 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 생성시킬 수 있다.
Ad657이 인간 유두종 바이러스로부터의 합성 펩티드의 HVR5 내로의 삽입에 의해 변형되었다. 한 실시양태에서, 변이체 Ad657-HVR5-HPV 헥손의 아미노산 서열이 서열식별번호: 57에서 정의된다. 변형은 백신 목적을 위한 이러한 항원의 디스플레이, 뿐만 아니라 HPV 펩티드와 상호작용하는 단백질에 결합하는 것에 의한 재표적화를 허용한다.
추가 실시양태에서, Ad657에 의한 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF)의 발현이 본원에서 입증된다.
따라서, 본원에서의 실시예로부터, 재조합 Ad, 예를 들어 Ad657 및 그의 변이체가 이종 단백질, 예를 들어, 폴리펩티드 항원 및 세포 표적화 폴리펩티드의 발현을 위해 이용될 수 있다는 것이 입증된다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성이 있는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 하나 이상의 치환을 함유하는 Ad 게놈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 및/또는 Ad 게놈에 의해 코딩되는 하나 이상의 바이러스 요소가 치환될 수 있다. 치환은 임의의 적합한 치환일 수 있다. 일부 경우에, 제1 Ad의 게놈의 캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 제2 Ad의 캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산으로 치환되어, 키메라 Ad가 생성될 수 있다. 예를 들어, 재조합 Ad가 게놈 내의 캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 제2 Ad (예를 들어, Ad 백본과 상이한 Ad)로부터의 캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 치환된 제1 Ad로부터의 게놈을 포함하는 경우, 제2 Ad로부터의 캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 하나 이상의 캡시드 폴리펩티드를 발현할 수 있고, 발현된 캡시드 폴리펩티드(들)가 재조합 Ad의 캡시드 내로 혼입될 수 있다. 캡시드 폴리펩티드의 예는, 비제한적으로, 헥손 폴리펩티드, 섬유 폴리펩티드, 펜톤 염기 폴리펩티드, IIIa 폴리펩티드, IX 폴리펩티드, 및 pVI 폴리펩티드를 포함한다.
Ad 섬유 단백질은 초기 세포 부착 단계를 매개하는 3개의 외관상 동일한 서브유닛의 복합체이다. 천연 Ad6 섬유 단백질은 서열식별번호: 60에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, CAR에 결합한다.
본 발명의 한 측면에서, 모체 또는 "백본" Ad에 천연이 아닌 섬유 단백질을 갖는 섬유-변형 재조합 및 키메라 Ad가 생성되었다.
키메라 Ad인 AdF35 섬유 키메라는 서열식별번호: 61의 아미노산 서열을 갖고, Ad5 및 Ad6 섬유 단백질보다 더 짧으며, 바이러스를 CD46으로 재표적화한다.
서열식별번호: 62의 서열을 갖는 K7 섬유를 포함하는 섬유-변형 재조합 Ad는 바이러스를 세포 상의 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 및 음전하에 표적화한다.
서열식별번호: 63의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 더 짧고, CAR에 결합한다.
서열식별번호: 64의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68-K7 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 짧다. 6/FC68-K7 섬유는 CAR에 결합하고, 헤파린 술페이트 및 음전하에 재표적화된다.
서열식별번호: 65의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68-HI-K7 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 짧다. 6/FC68-HI-K7 섬유는 CAR에 결합하고, 헤파린 술페이트 및 음전하에 재표적화된다.
일부 경우에, 재조합 Ad는 게놈 내의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 HVR)이 제2 Ad로부터의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 HVR)으로 치환된 제1 Ad로부터의 게놈을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad는 제2 Ad로부터의 하나 이상의 HVR로 치환된 하나 이상의 HVR을 갖는 제1 Ad로부터의 게놈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 Ad는 키메라, 특히 Ad657일 수 있다 (예를 들어, 헥손 HVR이 Ad57 헥손 HVR로 치환된 Ad6 게놈을 포함할 수 있다). 재조합 Ad가 게놈 내의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 제2 Ad로부터의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 치환된 제1 Ad로부터의 게놈을 포함하는 경우, 재조합 Ad는 제2 Ad로부터의 약 1개 내지 약 720개의 헥손 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 Ad가 Ad657인 경우, Ad657은 Ad6 게놈, 및 Ad57 헥손 HVR을 포함하는 720개의 헥손 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 하나 이상의 핵산 결실을 함유하는 Ad 게놈을 포함할 수 있다. 핵산 결실은 임의의 적합한 핵산 결실일 수 있다. 핵산 결실은 완전 결실 (예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 결실) 또는 부분적 결실 (예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실)일 수 있다. 핵산 결실은 결실된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 전사 및 번역을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 임의의 적합한 핵산이 결실될 수 있다. 일부 경우에, 감염성 자손의 생산과 연관된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 결실될 수 있다. 본원에 기술된 재조합 Ad에서 결실 및/또는 변형될 수 있는 핵산의 예는 E1 (예를 들어, E1A 및 E1B), E2, E3, E4, pIIIA, 섬유, E1B를 코딩할 수 있고, 바이러스 인핸서 및 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 함유하는 Ad 게놈을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad는 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 재조합 Ad는 서열식별번호: 48의 핵산을 예를 들어 포함하는 프로바신 프로모터를 포함하도록 변형되고; 본원에 기술된 재조합 Ad는 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내에 dl1101 결실을 포함하도록 변형되고; 본원에 기술된 재조합 Ad는 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내에 dl1107 결실을 포함하도록 변형되고; 본원에 기술된 재조합 Ad는 dl1101 결실 및 dl1107 결실을 포함하도록 변형된다. E1A 폴리펩티드, 예를 들어, 야생형 Ad E1A, 및 CRAd-657-dl1101, CRAd-657-dl1107 및 CRAd-657-dl1101/1107 변이체의 N-말단 아미노산 서열에 대해 본원에서의 실시예 및 도 56을 참조한다.
한 실시양태에서, 변이체 CRAd-657-dl1101/1107-FolR은 무손상 E3을 포함하고, 암 세포 상에서 발견되는 인간 폴레이트 수용체 알파를 발현한다.
일반적으로, Ad는 본원에 기술된 CRAd 변형을 포함하도록 변형될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 하나 이상의 핵산 삽입을 함유하는 Ad 게놈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 삽입은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 본원에 기술된 재조합 Ad의 게놈 내의 임의의 적합한 위치 내로 삽입될 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 본원에 기술된 재조합 Ad의 게놈의 HVR (예를 들어, HVR 5 루프) 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 본원에 기술된 재조합 Ad의 게놈의 HVR 내로 삽입될 때, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 하나 이상의 폴리펩티드를 발현할 수 있고, 발현된 폴리펩티드(들)가 재조합 Ad의 캡시드 내로 혼입될 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 본원에 기술된 재조합 Ad의 게놈의 HVR 내로 삽입되는 경우, 재조합 Ad는 삽입된 핵산에 의해 코딩되는 약 1개 내지 약 720개의 폴리펩티드를 자신의 표면 상에 제시할 수 있다. 핵산 삽입은 임의의 적합한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산일 수 있다. 일부 경우에, 핵산 삽입은 폴리펩티드 항원을 코딩할 수 있다.
일부 경우에, 핵산 삽입은 표적화 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 본원에 기술된 재조합 Ad에 포함될 수 있는 표적화 폴리펩티드의 예는, 비제한적으로, 펩티드 12.51 (TARGEHKEEELI; 서열식별번호: 1), 펩티드 12.52 (LRQTGAASAVWG; 서열식별번호: 2), 12.53 (ARRADTQWRGLE; 서열식별번호: 3), VSV (GTWLNPGFPPQSCGYATVT; 서열식별번호: 4), RGD (CDCRGDCFC; 서열식별번호: 5), 알파4 인테그린 결합 펩티드 (NMSLDVNRKA; 서열식별번호: 6), Met 3-4 (ISLSSHRATWVV; 서열식별번호: 7), L10.1F (WTMGLDQLRDSSWAHGGFSA; 서열식별번호: 8), L10.1RGDF (WTMGLDQLRGDSSWAHGGFS; 서열식별번호: 9), L10.2F (RSVSGTEWVPMNEQHRGAIW; 서열식별번호: 10), L10.5F (TELRTHTSKELTIRTAASSD; 서열식별번호: 11), S5.1 (DRAIGWQDKLYKLPLGSIHN; 서열식별번호: 12), DU9C.1 (MGSWEKAALWNRVSASSGGA; 서열식별번호: 13), DU9C.2 (MAMGGKPERPADSDNVQVRG; 서열식별번호: 14), DU9A.7 (MASRGDAGEGSTQSNTNVPS; 서열식별번호: 15), XS.1 (GPEDTSRAPENQQKTFHRRW; 서열식별번호: 16), REDVmyc (MGREDVGEQKLISEEDLGGS; 서열식별번호: 17), RGD-4C (ACDCRGDCFCG; 서열식별번호: 18), REDV-4C (ACDCREDVCFCG; 서열식별번호: 19), SKBR5C1 (GQIPITEPELCCVPWTEAFY; 서열식별번호: 20), 231R10.1 (PQPPNSTAHPNPHKAPPNTT; 서열식별번호: 21), HepaCD8 (VRWFPGGEWGVTHPESLPPP; 서열식별번호: 22), K20 (KKKKKKKKKKKKKKKKKKK; 서열식별번호: 23), BAP (GLNDIFEAQKIEWH; 서열식별번호: 24), CALM BP (CAAARWKKAFIAVSAANRFKKIS; 서열식별번호: 25), EBV (EDPGFFNVEIPEFP; 서열식별번호: 26), #1-5 (GGHGRVLWPDGWFSLVGISP; 서열식별번호: 27), ##4*-5 (MARTVTANVPGMGEGMVVVPC; 서열식별번호: 28), 1-1 (GVSKRGLQCHDFISCSGVPW; 서열식별번호: 29), 1-2 (NQSIPKVAGDSKVFCWWCAL; 서열식별번호: 30), 1-3 (QSTPPTKHLTIPRHLRNTLI; 서열식별번호: 31), 1-4 (DMSFQLVTPFLKALPTGWRG; 서열식별번호: 32), 1-5 (GGHGRVLWPDGWFSLVGISP; 서열식별번호: 33), 1-5con (FSLVGISP; 서열식별번호: 34), 1-6 (QIMMGPSLGYYMPSESIFAY; 서열식별번호: 35), 2-11 (ISWDIWRWWYTSEDRDAGSA; 서열식별번호: 36), 2-14 (VWGMTTSDHQRKTERLDSPE; 서열식별번호: 37), 2-20 (MTSAQTSEKLKAETDRHTAE; 서열식별번호: 38), 2-9 (MGSRSAVGDFESAEGSRRP; 서열식별번호: 39), 3b-6 (MGRTVQSGDGTPAQTQPSVN; 서열식별번호: 40), 4*-5 (MARTVTANVPGMGEGMVVVP; 서열식별번호: 41), CLL 펩티드, PD-1, GLA 폴리펩티드 (예를 들어, 인자 X), 항원 유전자, 융합 단백질, 융합원성 당단백질, 단일쇄 항체, 및 다른 바이러스로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 표적화 폴리펩티드는 임의의 적합한 세포 유형을 표적화할 수 있다. 본원에 기술된 재조합 Ad에 포함된 표적화 폴리펩티드에 의해 표적화될 수 있는 세포 유형의 예는, 비제한적으로, 근육 세포 (예를 들어, 골격근 세포), 종양, 암 세포, 신장 세포, 간 세포, 점막 세포, 탄수화물, 및 세포막을 포함한다.
이러한 예는 파지 라이브러리 상에서 상용성인 구조적 맥락에서 선택된 펩티드가 Ad 헥손 단백질 내로 번역될 수 있다는 것을 입증한다. 예를 들어, 12.51 펩티드의 경우, 이러한 삽입 부위는 근육 형질도입을 증가시키는 한편, 간에서의 표적을 벗어나는 감염을 감소시킨다. 따라서, 근육 조직을 표적화하는 이러한 재조합 Ad가 유전자-기반 근육 백신접종 또는 근육으로의 유전자 요법 적용/전달을 위한 벡터로서 사용될 수 있다.
일부 경우에, 핵산 삽입은 (예를 들어, 소정의 HVR에서 발생하는 세포 및 단백질 상호작용을 파괴하는 것에 의해) 바이러스를 탈표적화시킬 수 있다. 일부 경우에, 핵산 삽입은 검출가능한 표지를 코딩할 수 있다. 검출가능한 표지의 예는, 비제한적으로, 형광단 (예를 들어, 녹색 형광 (GFP), mCherry, 및 mBFP), 및 효소 (예를 들어, 루시퍼라제, DNAse, 프로테아제, 수송체, 및 중합효소)를 포함한다.
본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657 및 그의 변이체)를 함유하는 발현 벡터가 본원에서 또한 제공된다. 발현 벡터는 본원에 기술된 재조합 Ad를 이것이 복제 및/또는 발현될 수 있는 또 다른 세포 (예를 들어, 암 세포) 내로 운반할 수 있다. 발현 구축물로도 통상적으로 지칭되는 발현 벡터는, 전형적으로, 특정 핵산의 발현을 제어하는 인핸서/프로모터 영역을 갖는 플라스미드 또는 벡터이다. 세포 내로 도입되었을 때, 발현 벡터는 세포성 단백질 합성 기구를 이용하여 세포 내에서 바이러스를 생산할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad를 함유하는 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 재조합 Ad를 함유하는 발현 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 재조합 Ad를 함유하는 발현 벡터는 (예를 들어, 다중-클로닝 부위에서) 하나 이상의 트랜스진의 삽입을 허용하도록 디자인될 수도 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 재조합 Ad를 포함하는 발현 벡터는 검출가능한 표지를 코딩하는 핵산을 또한 포함할 수 있다. 검출가능한 표지의 예는, 비제한적으로, 형광단 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), mCherry, 및 mBFP), 및 효소 (예를 들어, 루시퍼라제, 리컴비나제, 뉴클레아제, 및 전사 인자)를 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)를 사용하기 위한 방법 및 물질을 또한 제공한다. 일부 경우에, 본원에서 제공된 재조합 Ad는 암에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 암에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물을 치료하는 방법은 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad를 포유동물에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물을 치료하는 방법은 본원에 기술된 재조합 Ad 또는 본원에 기술된 재조합 Ad를 코딩하는 핵산을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad가 포유동물에게 투여되어, 포유동물 내의 암 세포의 수를 감소시키고/거나 (예를 들어, 종양 성장을 억제하고/거나 지연시킴), 포유동물의 생존을 증가시킬 수 있다.
종양용해 아데노바이러스의 혈청형-전환에 의한 암성 종양의 표적화가 입증된다. 옆구리에 DU145 또는 LNCaP 전립선 종양을 보유하는 마우스를 Ad657의 정맥내 (IV) 주사에 의해 1회 처리하였다. 이러한 마우스를 섬유 변형이 있고 GFP루시퍼라제를 발현하는 대안적인 Ad6 또는 Ad6/57/6 종양용해 바이러스 변이체로 2차로 처리하고, 루시퍼라제 활성을 영상화에 의해 측정하였다. Ad6은 Ad6 헥손, 및 CAR을 표적화하는 섬유를 갖는다. Ad6-F35는 Ad6 헥손, 및 CD46을 표적화하는 Ad35 섬유를 갖는다. Ad6/57/6은 Ad6으로부터의 HVR1 및 7 및 Ad57로부터의 HVR 2-6을 갖는다. Ad6/57/6 바이러스는 Ad6 섬유, AdC68 섬유, 또는 Ad35 섬유를 갖는다. 도 9의 이러한 데이터는 더 낮은 표적을 벗어나는 간 감염으로 종양을 표적화하는 바이러스로 종양용해제를 혈청형-전환시키는 놀라운 능력을 나타낸다.
혈청형-전환의 또 다른 예에서, 옆구리에 LNCaP 전립선 종양을 보유하는 마우스를 Ad657 또는 CRAd657의 단일 정맥내 (IV) 주사에 의해 처리하였다. 이러한 마우스를 5개월 후에 GFP루시퍼라제를 발현하는 대안적인 Ad6/57/6 종양용해 바이러스 및 섬유 변이체 K7 (7개의 라이신이 부가됨), F35 (Ad35 섬유가 있음), 또는 KKTK-C68 (Ad6 KKTK 가요성 도메인 후에 융합된 침팬지 C68 섬유)로 2차로 처리하였다. KKTK-C68 바이러스는 바이러스 생산성을 강화하기 위한 부가된 코돈-최적화 E4 34K 유전자를 또한 갖는다. 루시퍼라제 활성을 영상화에 의해 측정하였다. 모든 Ad6/57/6은 Ad6으로부터의 HVR1 및 7 및 Ad57로부터의 HVR 2-6을 갖는 헥손을 갖는다. Ad6/57/6 및 KKTK-C68은 CAR을 표적화하는 섬유를 갖는다. Ad6/57/6-F35는 CD46을 표적화하는 Ad35 섬유를 갖는다. K7은 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 결합하는 것을 포함하여 세포 상의 음전하에 결합하는 것을 증가시킨다. 도 70은 더 낮은 표적을 벗어나는 간 감염으로 종양을 표적화하는 바이러스로 종양용해제를 혈청형-전환시키는 능력을 입증한다.
암, 감염성 질환 및/또는 유전 질환에 걸렸거나 또는 걸릴 위험이 있는 임의의 적합한 포유동물이 본원에 기술된 바와 같이 치료될 수 있다. 예를 들어, 암, 감염성 질환 및/또는 유전 질환에 걸린 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 원숭이), 말, 소 종, 돼지 종, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 급식 동물이 본원에 기술된 바와 같이 암에 대해 치료될 수 있다. 일부 경우에, 암에 걸린 인간이 치료될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같이 치료된 포유동물 (예를 들어, 인간)은 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)를 생성시키는 데 사용된 Ad의 천연 숙주가 아니다. 예를 들어, 본원에 기술된 재조합 Ad657로 치료 중인 인간은 Ad6에 대한 임의의 선재성 적응 면역이 결여될 수 있다.
임의 유형의 암에 걸린 포유동물이 본원에 기술된 바와 같이 치료될 수 있다. 일부 경우에, 암은 하나 이상의 고형 종양을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암은 혈액암일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 치료될 수 있는 암의 예는, 비제한적으로, 전립선암, 난소암, 폐암, 간세포 암종, 췌장암, 신장암, 흑색종, 뇌암, 결장암, 림프종, 골수종, 및 백혈병 (예를 들어, 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병)을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기술된 방법은 암에 걸린 포유동물을 확인하는 것을 또한 포함할 수 있다. 암에 걸린 포유동물을 확인하는 방법의 예는, 비제한적으로, 신체 검사, 실험실 테스트 (예를 들어, 혈액 및/또는 소변), 생검, 영상화 테스트 (예를 들어, X-레이, PET/CT, MRI, 및/또는 초음파), 핵의학 스캔 (예를 들어, 골 스캔), 내시경검사, 및/또는 유전자 검사를 포함한다. 암, 감염성 질환 및/또는 유전 질환에 걸린 것으로 확인되면, 포유동물에게 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657) 또는 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 발현 벡터)을 투여하거나 또는 자가-투여하도록 지시할 수 있다.
하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 경우에, 투여는 국소 투여일 수 있다. 일부 경우에, 투여는 전신 투여일 수 있다. 투여 경로의 예는, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 피하, 경구, 비강내, 흡입, 경피, 비경구, 종양내, 요관-후방, 피막하, 질 및 직장 투여를 포함한다. 다중 라운드의 치료가 투여되는 경우, 제1 치료 라운드는 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad를 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 제1 경로에 의해 (예를 들어, 정맥 내로) 투여하는 것을 포함할 수 있고, 제2 치료 라운드는 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad를 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 제2 경로에 의해 (예를 들어, 근육 내로) 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제약 조성물"은 하나 이상의 본 발명의 재조합 및/또는 키메라 Ad와 조성물을 치료 용도에 특히 적절하게 만드는 불활성 또는 활성 담체의 조합물을 지칭한다. 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)가 포유동물 (예를 들어, 암에 걸렸거나 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물)에게 투여하기 위해 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)로 제형될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 재조합 Ad가 암에 걸렸거나 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물에게 투여하기 위한 제약상 허용되는 조성물로 제형될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 재조합 Ad가 하나 이상의 제약상 허용되는 담체 (첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제형될 수 있다. 제약 조성물은 멸균 용액, 현탁액, 서방성 제형, 정제, 캡슐, 알약, 분말, 웨이퍼, 및 과립을 비제한적으로 포함하는 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 제형될 수 있다. 본원에 기술된 제약 조성물에서 사용될 수 있는 제약상 허용되는 담체, 충전제 및 비히클은, 비제한적으로, 염수 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수, 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이드, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 소듐 카브록시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블럭 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 및 양모 지방을 포함한다. 적절한 제약 담체가 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin, 18th Edition]에 기술되어 있다. 적절한 부형제의 선택 및 사용이 문헌 [Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)]에서 교시된다.
하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657)를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)은 백신으로서 포유동물 (예를 들어, 암에 걸렸거나 또는 걸릴 위험이 있는 포유동물)에게 투여될 수 있다. 백신은 예방적 또는 치료적일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 방법은 포유동물 (예를 들어, 암에 걸린 포유동물)에게 암 치료에 사용되는 하나 이상의 추가적인 작용제를 투여하는 것을 또한 포함할 수 있다. 암 치료에 사용되는 하나 이상의 추가적인 작용제는 임의의 적합한 암 치료를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암 치료는 수술을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암 치료는 방사선 요법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암 치료는 약물요법 예컨대 화학요법, 호르몬 요법, 표적화된 요법, 및/또는 세포독성 요법의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 암에 걸린 포유동물에게 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해 항암 활성을 갖는 재조합 Ad 예컨대 재조합 Ad657 및 그의 변이체)를 투여할 수 있고, 암 치료에 사용되는 하나 이상의 추가적인 작용제를 투여할 수 있다. 암에 걸린 포유동물이 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad로 치료되고, 암, 감염성 질환 및/또는 유전 질환의 치료에 사용되는 하나 이상의 추가적인 작용제로 치료되는 경우, 암, 감염성 질환 및/또는 유전 질환의 치료에 사용되는 추가적인 작용제는 동시에 또는 독립적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad 및 암, 감염성 질환 및/또는 유전 질환의 치료에 사용되는 하나 이상의 추가적인 작용제가 단일 조성물을 형성하도록 함께 제형될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 본원에 기술된 재조합 Ad가 먼저 투여될 수 있고, 암, 감염성 질환 및/또는 유전 질환의 치료에 사용되는 하나 이상의 추가적인 작용제가 2차로 투여될 수 있거나, 또는 그 반대도 가능하다.
실시예
실시예 1. 아데노바이러스.
50년 동안, Ad1, Ad2, Ad5, 및 Ad6을 포함하는 4개의 C종 인간 종 Ad만이 공지되어 있었다 (예를 들어, 문헌 [Weaver et al., 2011 Virology. 412:19-27]을 참조한다). 2001년에, 다섯번째 C종 아데노바이러스가 야생 분리주 균주 #16700으로서 확인되었고, Ad1, 2, 5, 및 6에 대한 항혈청으로의 바이러스 중화 테스트는 각각의 항혈청이 그의 동족 바이러스에 대해 사용되었을 때 높은 수준의 중화 (500-16,000의 역수 역가)를 입증하였다 (Lukashev et al., 2008 J Gen Virol. 89:380-388). 대조적으로, 항-Ad1, 2, 및 5 항체는 #16700에 대한 교차-반응성이 낮다 (32-64의 역수 역가). 항-Ad6 혈청은 #16700에 대해 더 높은 교차-반응성을 입증하였지만, Ad6 자체에 비교했을 때 #16700을 중화시키기 위해 10배 더 높은 농도의 혈청이 중화에 요구되었다. 후속 서열 비교에서 #16700이 신규 C종 아데노바이러스로 확인되었고, 이는 Ad57로 명칭이 변경되었다 (예를 들어, 문헌 [Walsh et al., 2011 J. Clin Microbiol. 49:3482-3490]을 참조한다).
15개의 인간 Ad를 유방, 난소, 간, 전립선, 신장, 및 B 세포 악성종양에 대한 종양용해 활성에 대해 평가하였다. DU145 인간 전립선 종양에 대한 테스트에서, C종 Ad6이 C종 Ad5 또는 B종 바이러스 Ad11 및 Ad35보다 단일 종양내 또는 정맥내 (i.v.) 주사 후에 더욱 강력하였다. Ad6은 또한 면역적격성 시리아 햄스터에서 Ad5 및 Ad11보다 더욱 효과적이었다.
재조합 아데노바이러스의 구축.
관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 방법을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 재조합 아데노바이러스를 구축하였다. 재조합 Ad는 제1 Ad로부터 유래되고 (예를 들어, 제1 Ad, 예컨대 Ad6의 게놈을 포함할 수 있고), 제2 Ad 예컨대 Ad57로부터의 헥손 HVR을 포함할 수 있다. 재조합 Ad가 Ad6 게놈 및 Ad57 헥손 HVR을 포함하는 경우, 재조합 Ad는 Ad657로 지칭되는 키메라 Ad일 수 있다.
Ad657을 수득하기 위해, Ad57 HVR 서열을 합성하고, pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, Ad657 및 그의 변이체가 생성되었다. Ad657 헥손의 아미노산 서열이 서열식별번호: 49에 기재된다. Ad657 변이체의 플라스미드 지도에 대해 도 34 및 59-65를 참조한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, 시스테인, 가요성 아미노산, 및 다른 펩티드의 삽입을 허용하기 위한 제한 부위로 변형된 HVR1로 Ad57 HVR 서열을 합성하였다. 이를 pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR1 내에 시스테인이 있는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR1-XXA로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, 시스테인, 가요성 아미노산, 및 다른 펩티드의 삽입을 허용하기 위한 제한 부위로 변형된 HVR5로 Ad57 HVR 서열을 합성하였다. 이를 pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR5 내에 시스테인이 있는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR5-XXA로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, 시스테인, 가요성 아미노산, 및 다른 펩티드의 삽입을 허용하기 위한 제한 부위로 변형된 HVR1로 Ad57 HVR 서열을 합성하였다. 이를 pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR1 내에 시스테인이 없지만 HVR1 내로의 펩티드 삽입을 허용하는 제한 부위를 갖는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR1-XA로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, 시스테인, 가요성 아미노산, 및 다른 펩티드의 삽입을 허용하기 위한 제한 부위로 변형된 HVR5로 Ad57 HVR 서열을 합성하였다. 이를 pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR5 내에 시스테인이 없지만 HVR5 내로의 펩티드 삽입을 허용하는 제한 부위를 갖는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR5-XA로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, Ad657 HVR1-XA 서열을 HVR1 내로의 비오틴 어셉터 펩티드의 삽입에 의해 변형시켰다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR1 내에 BAP를 갖는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR1-PSTCD로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
비오틴 어셉터 펩티드의 삽입은 바이러스 변이체를 간으로부터 탈표적화시키고, 바이러스를 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 비오틴화 리간드로 재표적화되도록 허용하고, 바이러스가 단량체성 아비딘 또는 스트렙타비딘 칼럼 상에서 정제되도록 허용한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, Ad657 HVR1-XA 서열을 HVR1 내로의 비오틴 어셉터 펩티드의 삽입에 의해 변형시켰다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR1 내에 BAP를 갖는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR5-PSTCD로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, Ad657 HVR5-XA 서열을 HIV 외피로부터의 합성 V1/V2 루프의 HVR5 내로의 삽입에 의해 변형시켰고, Ad657-HVR5-V1/V2로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호: 56의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
HIV 외피로부터의 합성 V1/V2 루프의 삽입은 이러한 항원을 백신으로서의 역할을 하도록 디스플레이하는 것을 허용할 뿐만 아니라, HIV 외피와 상호작용하는 단백질에 결합하는 것에 의한 재표적화를 허용한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, Ad657 HVR5-XA 서열을 인간 유두종 바이러스로부터의 합성 펩티드의 HVR5 내로의 삽입에 의해 변형시켰고, Ad657-HVR5-HPV로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호: 57의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
인간 유두종 바이러스로부터의 합성 펩티드의 삽입은 HPV 펩티드를 백신 목적을 위한 항원으로서 디스플레이하는 것을 허용할 뿐만 아니라, HPV 펩티드와 상호작용하는 단백질에 결합하는 것에 의한 재표적화를 허용한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, Ad6 HVR1 및 Ad57 HVR 2-7을 갖는 키메라 Ad가 생성되었고, Ad6/57 HVR 키메라로 지칭되는 이러한 키메라는 서열식별번호: 58의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, Ad6 HVR1 및 7 및 Ad57 HVR 2-6을 갖는 키메라 Ad가 생성되었고, Ad6/57/6 HVR 키메라로 지칭되는 이러한 키메라는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
실시예 2. 유전자 전달을 위한 재표적화 및 탈표적화된 재조합 아데노바이러스.
아데노바이러스는 유전자 전달 및 유전자-기반 면역화를 위한 강건한 벡터이다. 대다수의 이러한 용도를 위해 사용된 원형 아데노바이러스는 인간 C종 아데노바이러스 혈청형 5 (HAdV-C5 또는 Ad5)였다. 시험관 내에서, Ad5는 그의 섬유 및 펜톤 염기 단백질과 세포 표면 수용체의 조합된 상호작용을 통해 세포에 결합하고 진입한다. 삼량체성 섬유가 콕사키-아데노바이러스 수용체 (CAR)에 결합하고, CAR이 결여된 세포는 펜톤 염기 상의 RGD 모티프에 의해 결합될 수 있는 αv 인테그린을 또한 발현하지 않는 한 감염에 대해 상대적으로 저항성이다.
생체 내에서, 이러한 상호작용이 여전히 이용되지만, 그의 중요성은 주사 경로에 따라 다르다. 고형 조직 또는 종양 내로 직접 주입되면, CAR 및 인테그린 상호작용이 우세하다. 정맥 내로 (IV) 주사되면, 이러한 상호작용은 Ad5가 비타민-K-의존적 혈액 응고 인자에 결합하는 것의 효과로 인해 2차적이게 된다. 혈액 인자 X (FX)는 Ad5의 헥손에 나노몰 미만의 친화력으로 결합하고, 결과적으로, IV 주사 후에 Ad5가 간세포에 효율적으로 형질도입될 수 있게 한다. FX의 부재 하에, 간 형질도입이 급격하게 감소된다.
4.5 kb일 뿐인 DNA 서열을 갖는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터와 같은 다른 벡터에 비교했을 때, 아데노바이러스 벡터는 최대 36 킬로베이스 쌍 (kbp)의 매우 큰 cDNA 서열을 보유하는 능력 면에서 다소 독특하다. 이러한 페이로드 용량은 14 kbp 디스트로핀 cDNA와 같은 매우 큰 트랜스진을 전달할 때 근육 유전자 요법을 위해 초기에 Ad 벡터를 연구하는 것을 정당화하였다. 신생 마우스에서의 IV 투여는 근육 유전자 전달을 매개할 수 있지만, 성체 마우스에서는 이러한 능력이 상실된다. 나이에 따른 형질감염 감소는 Ad 비리온의 매우 큰 크기 (즉, 100 nm), 뿐만 아니라 노화에 따른 근육 세포 상의 CAR 수용체의 상실에 부분적으로 기인한다. 근육내 (IM) 경로는 CAR이 골격근 세포 상에 부재한다는 사실에도 불구하고 Ad5 및 다른 혈청형을 사용할 때 유전자-기반 백신에 대한 단연 가장 대중적인 경로이다.
따라서, 근육의 Ad5 및 다른 Ad 혈청형 형질도입이 유전자 요법 또는 유전자-기반 백신접종에 적합할 수 있다. 그러나, 근육 내의 바이러스의 1차 수용체의 부재는 바이러스의 효능을 감소시키고, 원하는 효과를 달성하기 위해 더 많은 벡터가 전달될 것을 요구한다.
아데노바이러스 내의 펩티드-변형 헥손의 구축.
C2C12 마우스 근육 세포 상의 아미노산 12개 (12량체)의 펩티드를 Ad5의 놉(knob) 영역으로부터의 H와 I β 시트 사이에 디스플레이된 무작위 펩티드 라이브러리로부터 선택하였다 (도 1A). 펩티드 12.51 (TARGEHKEEELI; 서열식별번호: 1) 및 12.52 (LRQTGAASAVWG; 서열식별번호: 2)를 비-표적 세포에 대한 사전-정리로 근모세포에 대해 선택하여, 근육 세포에 결합하는 것에 대해 특이적일 펩티드를 수득하였다. 대부분의 경우에, 소형 펩티드는 비교적 친화력이 낮다. 따라서, 이러한 근육-선택 펩티드를 Ad5 헥손의 720개의 카피 상에 디스플레이하는 것이 더 양호한 근육 유전자 전달을 가능하게 할 수 있을 것으로 추론되었다. 이러한 삽입 부위는 임의의 벡터가 IM 주사 후에 혈액 내로 누출된 경우에 헥손에 대한 FX 결합을 불활성화시켜 벡터를 간으로부터 "탈표적화"시키는 장점을 가질 수도 있다.
이러한 근육-선택 펩티드를 바이러스 상의 초가변 루프를 또한 구속하는 2개의 다른 β 시트 사이에 삽입하여, 변형된 Ad가 향성을 조정하는 능력을 평가하였다. 펩티드 12.51 및 12.52를 Ad5 헥손 내의 β7 및 β8 시트에 의해 구속된 초가변 영역 (HVR) 5 루프 내로 도입하였다. 마우스 및 햄스터에서 정맥내 및 근육내 주사 후 조직에 형질도입되는 이러한 바이러스의 생체 내 능력을 평가하였다.
아데노바이러스
E1-결실 Ad5-GL (RD-Ad5-GL)은 다른 곳에 기술된 바와 같이 녹색 형광 단백질-루시퍼라제 (GFP-루시퍼라제, GL) 융합 단백질을 발현한다 (예를 들어, 문헌 [Crosby et al., 2002J. Virol., 76:6893-6899]; [Khare et al., 2011 Mol. Ther., 19:1254-1262]; 및 [Khare et al., 2012 J. Virol., 86:2293-2301]을 참조한다). 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 근육-선택 펩티드 12.51 및 12.52를 Ad5 헥손 상의 HVR5 대신에 Ad5의 놉 영역으로부터의 H 및 I β 시트와 구조적으로 유사한 그의 β7과 β8 시트 사이에서 삽입하였다 (도 1A). 가요성 리더가 있는 펩티드가 Ad5에서 전체 HVR5 루프를 교체하였다 (도 1B). 이러한 변형된 헥손 서열을 박테리아에서의 레드 재조합에 의해 녹색 형광 단백질-루시퍼라제 (RD-Ad5-GL) 융합 단백질을 발현하는 복제-결손성 Ad5 내로 도입하였다 (예를 들어, 문헌 [Campos et al., 2004 Hum. Gene Ther., 15:1125-1130]을 참조한다). 펩티드-변형 Ad를 펩티드 12.51 및 12.52를 코딩하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드 (도 1B)를 플라스미드 pHVR5 디스플레이 (도 1A 하단) 내로 삽입하는 것에 의해 구축하여, 재조합 Ad인 Ad5-HVR5-12.51 및 Ad5-HVR5-12.52가 산출되었다.
생성된 플라스미드를 소화시키고, pAd5-GL 내로의 레드 재조합에 사용하였다. 이러한 벡터를 293 세포에서 구조하고, 2회의 연속적인 CsCl 구배에서 정제하고, 에코노팩(Econopac) 10-DG 크로마토그래피 칼럼 (바이오-래드(Bio-Rad)) 상에서 50 mM 트리스 pH 8 + 0.5 M 수크로스 내로 탈염시키고, -80℃에서 보관하였다.
시험관 내 바이러스 테스트
C2C12 마우스 근모세포를 아메리칸 타입 티슈 컬처(American Type Tissue Culture) (버지니아주 머내서스)로부터 구입하였다. 293 세포를 마이크로빅스(Microbix) (캐나다 온타리오주 토론토)로부터 수득하였다. 세포를 DMEM + 10% FBS (인비트로젠(Invitrogen))에서 유지시켰다.
C2C12 근육 세포를 감염 전날 6웰 플레이트 (코닝(Corning))에 플레이팅하였다. 바이러스를 사용하여 DMEM + 5% FBS 내의 세포를 감염시켰다. 세포를 2일 동안 인큐베이션한 후, 녹색 형광 하에 관찰하였다.
동물 실험은 동물 복지법의 규정, PHS 동물 복지 정책, 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침의 원칙에 따라 메이요 클리닉의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인 하에 수행되었다. 암컷 CD-1 마우스 (찰스 리버(Charles River))를 마취시키고, 1010 vp의 지시된 바이러스를 지시된 시간에 근육 내로 (IM) 또는 정맥 내로 (IV) 주사하였다. 동물을 마취시키고, 3 mg의 d-루시페린 (몰레큘러 이미징 프로덕츠(Molecular Imaging Products))을 주사하고, 제노젠(Xenogen) 영상화 시스템 상에서 영상화하였다. 나중에, 동물을 마취시키고, ELISA를 위해 혈청 분리기에서 혈액을 수집하였다.
ELISA를 하기와 같이 수행하였다. 이뮬론(Immulon) 4 HBX 플레이트 (써모(Thermo))를 100 ng/웰의 1× 포스페이트-완충 염수 (PBS) 내의 GFP 단백질과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 세정하고, TRIS-완충 염수 + 0.1% 트윈 20 (TBST) 내의 5% 밀크로 실온에서 2시간 동안 차단하였다. 각각의 혈청 샘플의 1:100,000 내지 1:1,1000 희석물을 차단 완충제에서 제조하였다. 웰을 세정하고, 각각 100 ㎕를 GFP-코팅 플레이트에 삼중으로 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 웰을 세정하고, 염소 항-마우스-HRP 2차 항체 (피어스 케미컬(Pierce Chemical))의 1/10,000 희석물을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 세정하고, 50 ㎕의 1 스텝 울트라 TMB ELISA (써모 피셔 사이언티픽 인크(Thermo Fisher Scientific Inc.))를 HRP 검출을 위해 첨가한 후, 50 ㎕의 2 M H2SO4를 첨가하였다. 벡맨 쿨터(Beckman Coulter) DTX 880으로 450 nm에서의 흡광도를 결정하였다.
프리즘(Prism) (그래프패드(Graphpad))으로 통계 분석을 수행하였다. 일원 ANOVA에 이어진 투키 HSD에 의해 통계적 유의성을 계산하였다.
마우스 C2C12 근육 세포에서의 시험관 내 형질도입
RD-Ad5-GL, RD-Ad5-GL-HVR5-12.51, 및 RD-Ad5-HVR5-12.52를 사용하여, 바이러스 입자 (vp)/세포로 환산된 다양한 감염 다중도 (MOI)로 마우스 C2C12 근모세포 세포를 감염시켰다. GFP 융합 단백질로부터의 녹색 형광을 형광 현미경에 의해 관찰했을 때, 펩티드-변형 벡터 양쪽 모두가 RD-Ad5-GL보다 유의하게 더 양호한 형질도입을 매개하였다 (도 2A). 루시퍼라제 활성을 측정했을 때, 유의한 증가가 RD-Ad5-GL-12.51 및 12.52 감염된 세포에서 관찰되었다 (도 2B). 펩티드 중 하나인 12.51이 Ad5의 놉 영역 내로 다시 삽입되었을 때, 펩티드는 C2C12 근모세포 상에서 시험관 내 형질도입을 14배 증가시켰다.
마우스에서의 근육내 주사 후의 생체 내 형질도입
109 vp의 Ad5-GL, Ad5-GL-HVR5-12.51, 및 Ad5-GL-HVR5-12.52를 IM 경로에 의해 마우스의 양쪽 사두근 내로 주사하고, 루시퍼라제 영상화를 다양한 시간에 수행하였다 (도 3A 상단). Ad5-GL-HVR5-12.51은 모든 시점에 Ad5-GL보다 2 내지 3배 더 높은 루시퍼라제 활성을 생산하였다 (일원 ANOVA에 의해 제1일에 p < 0.05) (도 3B 왼쪽). 근육에서의 Ad5-GL-HVR5-12.52 활성은 시험관 내에서의 그의 더 강한 활성에 대조적으로 Ad5-GL 및 HVR5-12.51 양쪽 모두보다 더 낮았다.
마우스에서의 정맥내 주사 후의 생체 내 형질도입
3 × 1010 vp의 Ad5-GL, Ad5-GL-HVR5-12.51, 및 Ad5-GL-HVR5-12.52를 마우스에서 IV 경로에 의해 주사하고, 루시퍼라제 영상화를 수행하였다 (도 3A 하단). 근육에서의 결과에 대조적으로, 미변형 Ad5-GL만 강한 간 형질도입을 매개하였다. Ad5-GL에 의한 간 형질도입이 Ad5-GL-HVR5-12.51 및 Ad5-GL-HVR5-12.52 양쪽 모두보다 60배 더 높았고 (일원 ANOVA에 의해 제1일에 p < 0.001) (도 3B 오른쪽), 이는 재조합 Ad가 근육 조직을 표적화하는 한편 간에서의 표적을 벗어나는 감염을 감소시킨다는 것을 입증한다.
햄스터에서의 근육내 주사 후의 생체 내 형질도입
12.51 변형 벡터가 마우스 이외의 종에서 작동하는지를 테스트하기 위해, 1010 vp의 Ad5-GL 및 Ad5-GL-HVR5-12.51을 더 큰 시리안 햄스터의 양쪽 사두근 내로 IM 주사하고, 24시간 후에 루시퍼라제 영상화를 수행하였다 (도 4). 이러한 경우에, Ad5-GL-HVR5-12.51이 Ad5-GL보다 7배 더 높은 루시퍼라제 활성을 매개하였다 (일원 ANOVA에 의해 제1일에 p < 0.01).
마우스에서의 근육내 주사 후의 유전자-기반 면역화
IM 주사 16주 후, 상기 기술된 바와 같이, 그리고 도 3에 제시된 바와 같이 처리된 마우스에서 혈청을 수집하고, 트랜스진-코딩 GFP에 대한 항체에 대해 ELISA에 의해 연속 희석에서 분석하였다 (도 5). 1:10,000 내지 1:1000의 혈청 희석에서 PBS 군에 비교했을 때 모든 Ad-주사 마우스에서 유의한 항-GFP 항체가 생성되었다 (일원 ANOVA에 의해 p < 0.0001). 그러나, Ad5-GL-HVR-12.51이 Ad5 또는 Ad5-HVR5-12.52보다 더 높은 항체를 생산하였다. 혈청의 1:1000 내지 1:10,000 희석에서, Ad5-GL-HVR-12.51이 Ad5-GL보다 유의하게 더 높았다 (일원 ANOVA에 의해 p < 0.01 내지 0.0001). 혈청의 1:1000 희석에서, 12.51이 12.52보다 유의하게 더 높았다 (p < 0.05). Ad5-GL-12.52가 혈청의 1:1000 및 1:10,000 희석에서 Ad5-GL보다 유의하게 더 높았다 (p < 0.05 내지 0.001).
이러한 실시예는 파지 라이브러리 상에서 상용성인 구조적 맥락에서 선택된 펩티드가 Ad 헥손 단백질 내로 번역될 수 있다는 것을 입증한다. 예를 들어, 12.51 펩티드의 경우, 이러한 삽입 부위는 근육 형질도입을 증가시키는 한편, 간에서의 표적을 벗어나는 감염을 감소시킨다. 따라서, 근육 조직을 표적화하는 이러한 재조합 Ad가 유전자-기반 근육 백신접종 또는 근육으로의 유전자 요법 적용/전달을 위한 벡터로서 사용될 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 Ad657 HVR 및 Ad6 및 C68 HI 루프 내로 삽입된 다른 세포 표적화 펩티드를 포함하는 재조합 및/또는 키메라 Ad에 관한 것이고, 이는 표 1에서 기술된다.
표 1.
Ad657 HVR 및 Ad6 및 C68 HI 루프 내로 삽입된 다른 세포 표적화 펩티드
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Ad 플라스미드, 예를 들어, XA 헥손 플라스미드 또는 pAd6-NdePfl 섬유 셔틀 플라스미드 내로의 라이게이션을 위한 점착성 단부가 플랭킹된, 지시된 펩티드를 코딩하는 DNA 및 그의 상보적인 DNA를 합성하였다. 이러한 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 Ad의 HVR 또는 HI 루프 내로 라이게이션시켰다. 이러한 플라스미드를 다양한 Ad 백본 플라스미드 내로 재조합시키는 데 사용하였다.
일부 펩티드는 세포 상의 신규 수용체를 표적화하는 역할을 한다. 소형 BAP와 같은 다른 것은 바이러스가 박테리아 비오틴 리가제 BirA를 발현하는 세포에서 성장되는 경우 아비딘 표적화 및 정제에 사용될 수 있다. 칼모듈린 펩티드는 재표적화 또는 바이러스 정제를 위해 바이러스가 칼모듈린 또는 칼모듈린-융합 단백질에 결합하도록 허용한다.
따라서, 특이적인 조직/세포 수용체를 표적화하는 이러한 재조합 Ad가 유전자-기반 백신접종 또는 표적화된 세포 및/또는 조직에서의 유전자 요법 용도를 위한 벡터로서 사용될 수 있다.
실시예 3. 세포 표적화/탈표적화 펩티드 또는 신규 아미노산의 삽입과 함께 상이한 Ad 혈청형으로부터의 개별적인 HVR을 삽입함.
헥손 셔틀 플라스미드 지도 (도 34)는 상이한 Ad 혈청형으로부터의 개별적인 HVR의 삽입과 표적화된 화학적 변형 및 차폐를 위한 헥손 내로의 세포 표적화/탈표적화 펩티드 또는 신규 아미노산 예컨대 시스테인의 삽입의 조합을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 세포 결합 펩티드 12.51, VSV, RGD (표 1 참조)가 HVR 1 또는 HVR 5 내로 삽입되고, 이러한 실시양태는 이러한 펩티드 및 다른 펩티드를 Ad의 HVR 중 임의의 것에 삽입하는 예로서의 역할을 한다 (도 34). 또 다른 예는 비오틴 어셉터 펩티드 (BAP)의 삽입이 이러한 HVR 내로 삽입되어 아비딘 또는 스트렙타비딘 및 비오틴화 리간드로 또는 아비딘- 또는 스트렙타비딘 융합 단백질로의 벡터 재표적화를 허용하는 것을 나타낸다. BAP 삽입은 또한 바이러스가 벡터 생산을 위한 단량체성 아비딘 또는 스트렙타비딘 칼럼 상에서 정제되도록 허용한다. 마찬가지로, Ad57-HVR1-XXA 및 XA는 시스테인을 이러한 부위 내로 삽입하여 말레이미드 또는 다른 시스테인-반응성 작용제로의 표적화된 화학적 변형을 허용하는 예를 나타낸다 (도 34).
이러한 실시양태들은 상이한 Ad로부터의 상이한 HVR을 조합하는 Ad (즉, HVR 셔플링)의 맥락에서 또한 적용될 수 있다. 예를 들어, Ad6의 HVR1과 Ad57의 HVR 2-7 또는 Ad6의 HVR1 및 7과 Ad57의 HVR 2-6. 추가 실시양태에서, 6/56/6 바이러스는 Ad6으로부터의 HVR 1 및 7 및 Ad657로부터의 HVR 2-6을 갖는다.
실시예 4. 시스테인-변형 헥손-변형 Ad657-HVR5C의 표적화된 화학적 접합
도 35는 상이한 Ad 혈청형으로부터의 개별적인 HVR의 삽입과 표적화된 화학적 변형 및 차폐를 위한 헥손 내로의 신규 아미노산 예컨대 시스테인의 삽입의 조합을 나타내는 Ad 변이체를 도시한다.
시스테인-변형 헥손-변형 Ad657-HVR1C의 차폐 및 기능에 대한 표적화되지 않은 화학적 접합 대 표적화된 화학적 접합의 효과의 비교 (도 36). 이러한 실시예는 중합체 및 기타 화학적 변형을 Ad 헥손 내로 삽입된 시스테인에 표적화하는 능력을 입증한다. 표적화되지 않은 PEG는 바이러스 감염을 불활성화시키는 반면, 시스테인-표적화 PEG화는 바이러스 기능을 유지한다.
본 발명의 한 측면에서, 항체, 단백질, 세포로부터 탈표적화시키고, 재표적화시키고, 차폐하기 위해 중합체 또는 삽입된 펩티드/단백질을 사용하는 것이 구상된다. 도 54는, 예를 들어, PEG화 또는 "BAP화"에 의해 변형될 수 있는 Ad HVR의 부위를 도시한다.
한 실시양태에서, 상이한 Ad 혈청형 및/또는 변이체는 Ad6 및 Ad657 변이체의 다중 투약을 허용하도록 중합체 차폐를 포함한다. 공유결합 중합체 접합과 조합된 혈청형-전환에 의해 Ad6 및 Ad657이 다중 라운드의 치료에 사용될 수 있는 예시적인 치료 사이클이 제시된다 (도 41B).
GFP루시퍼라제를 발현하는 Ad657-HVR1C를 세포로부터 생산하고, CsCl 구배 상에서 정제하였다. 바이러스를 5 kDa 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 공유결합으로 변형시켰다. 바이러스를 바이러스 단백질 상의 아민/라이신과 무작위로 반응하는 NHS-PEG, 또는 XXA 셔틀 플라스미드를 사용하여 HVR1 내로 삽입된 시스테인과 특이적으로 반응하는 말레이미드 PEG로 처리하였다. 그 후, 이러한 미변형 또는 변형 바이러스를 최종 CsCl 스핀에 의해 정제하고, 이어서 탈염시켰다. 지시된 바이러스를 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 사이프로루비(SyproRuby)로 염색하고, 영상화에 의해 가시화하였다 (도 36A). 이는 NHS-PEG화가 단백질의 겉보기 질량의 증가 (화살표로 지시됨)에 의해 입증된 바와 같이 다수의 바이러스 단백질을 무작위로 변형시킨다는 것을 나타낸다. 대조적으로, HVR1 내의 시스테인으로의 표적화된 말레이미드 PEG 반응은 헥손만 변형시키고, 다른 바이러스 캡소머 단백질을 손상시키지 않는다. 바이러스 기능에 대한 PEG화의 효과를 평가하였다.
지시된 바이러스를 A549 세포와 함께 인큐베이션하고, 세포를 감염시키는 능력을 루시퍼라제 검정법에 의해 측정하였다. 이는 무작위 NHS-PEG화가 바이러스 활성을 90% 초과로 감소시키는 반면, 말레이미드-PEG는 그렇지 않다는 것을 나타낸다 (도 36B).
면역 적격 시리아 햄스터에 피하 HaK 신장암 종양을 생착시켰다. 종양이 200 ㎕ 부피에 도달했을 때, 마우스에 E3이 있거나 또는 없이 (DE3), 그리고 무작위 NHS-PEG화가 있거나 또는 없이 구축된 지시된 Ad6 바이러스를 정맥내 경로에 의해 1회 주사하였다. 종양 크기를 경시적으로 측정하였다. 데이터는 종양용해 바이러스 Ad6-델타E3-Luc에서 모든 E3 유전자를 결실시키는 것이 바이러스를 종양 부피를 감소시키는 것에서 종양용해 모체 바이러스 Ad6-Luc보다 덜 효과적이게 만든다는 것을 나타낸다. 데이터는 Ad6이 PEG화될 수 있고, 효능을 유지할 수 있다는 것을 또한 나타낸다 (Ad6-Luc 대 Ad6-Luc-20 kDa PEG을 참조한다) (도 58).
시스테인-변형 헥손-변형 Ad, 예를 들어 Ad657-HVR5C의 표적화된 화학적 접합. GFP루시퍼라제를 발현하는 Ad657-HVR5C를 세포로부터 생산하고, CsCl 구배 상에서 정제하였다. 바이러스를 말레이미드-IR800 근적외선 형광단, 말레이미드-비오틴, 또는 5 kDa 말레이미드-PEG (XXA 셔틀 플라스미드를 사용하여 HVR5 내로 삽입된 시스테인과 특이적으로 반응함)로 공유결합으로 변형시켰다. 지시된 Ad 및 변형된 Ad를 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 사이프로루비로 염색하고, 영상화에 의해 가시화하였다 (도 37A). 바이러스의 단백질의 SDS-PAGE에 이어진 근적외선 영상화는 HVR-C에 영상화제가 태그로 부착될 수 있다는 것을 입증한다 (도 37B). PEG화 Ad 바이러스를 복막 내로 주사하는 것에 의해 생체 내 Ad 바이러스 기능에 대한 PEG화의 효과가 입증되었다. 종양 보유 마우스에서 세포를 감염시키는 능력이 검출가능한 루시퍼라제 활성에 의해 영상화에 의해 입증된다. 도 37C는 중합체 및 기타 화학적 변형을 Ad657 헥손 영역 내로 삽입된 시스테인에 표적화하는 능력을 입증한다. 더욱이, PEG화가 생체 내에서 아데노바이러스를 간에 대해 탈표적화시킨다는 것이 입증된다 (도 50).
실시예 5. Ad657에 의한 인간 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF)의 발현.
인간 GMCSF에 대한 cDNA를 보유하는 Ad657을 사용하여 A549 세포를 감염시키고, 다양한 양의 상청액을 GMCSF 성장-의존적 TF-1 세포에 첨가하였다. 세포수 증가는 기능성 인간 시토카인의 발현을 지시한다 (도 27). 데이터는 재조합 Ad가 이종 단백질의 발현에 이용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 6. 암 세포에 대한 전신 바이러스요법을 위한 종양용해 아데노바이러스 Ad657.
선택된 전체 Ad 게놈의 정렬로 Ad57을 다른 C종 바이러스와 클러스터링시키는 계통수가 생성되고, 이때 대부분의 상동성이 Ad6과의 것이고, 이러한 계통수가 도 6에서 제시된다.
Ad57은 헥손 초가변 영역 (HVR) 및 E3 면역 회피 유전자에서의 서열 분기가 있으면서 Ad6과 거의 동일한 것으로 보인다 (도 7). 섬유, 펜톤 염기, IIIa, 및 IX를 포함하는 다른 노출된 바이러스 캡시드 단백질은 Ad6과 Ad57 사이에서 사실상 동일하다. 중화 데이터는 대부분의 아데노바이러스-중화 항체가 Ad 상의 HVR을 표적화한다는 사실과 일치한다. Ad6 항혈청과 Ad57 사이의 낮은 교차-반응성은 이들의 공통 섬유 단백질을 표적화할 수 있는 항체에 기인하는 것으로 생각된다 (Lukashev et al., 2008J Gen Virol. 89:380-388).
이러한 실시예에서, 인간 전립선암에 대한 종양용해제로서의 Ad657의 유용성이 입증된다. Ad6 HVR을 Ad57로부터의 것으로 교체하여, Ad657로 칭해지는 키메라 C종 종양용해 바이러스를 생성시켰다. Ad657 및 Ad6을 인간 전립선암 종양을 보유하는 누드 마우스에서 단일 i.v. 주사에 의해 전신 종양용해 요법으로서 테스트하였다. 이러한 바이러스의 간 및 종양 향성을 하기와 같이 전립선암의 마우스 모델에서 평가하였다.
DU145 인간 전립선 암종 세포를 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC; 미국 버지니아주 머내서스)으로부터 구입하고, RADIL의 IMPACT 테스트에 의해 특정 병원체가 없음을 확인하였다. 293 세포를 마이크로빅스 (캐나다 온타리오주 토론토)로부터 수득하였다. 세포를 DMEM + 10% FBS (인비트로젠, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)에서 유지시켰다.
Ad6, 톤실(Tonsil) 99 균주 (ATCC VR-1083)의 게놈을 다른 곳에 기술된 바와 같이 클로닝하였다 (예를 들어, 문헌 [Weaver et al., 2013 PLoS One. 8:e73313]을 참조한다). 천연 ApaI와 SacI 부위 사이의 Ad57 헥손에 상응하는 카세트가 진스크립트(Genscript)에 의해 합성되었다. 이러한 단편을 다른 곳에 기술된 바와 같이 박테리아에서의 상동 재조합을 위한 FRT-제오신® 저항성 유전자-FRT 카세트가 사이에 있는 Ad6 pVI 및 헥손 유전자를 함유하는 셔틀 플라스미드 pUC57-Ad6 헥손-FZF 내로 클로닝하였다 (예를 들어, 문헌 [Campos et al., 2004 Hum Gene Ther. 15:1125-1130]; 및 [Khare et al., 2012 J Virol. 86:2293-2301]을 참조한다). Ad6 ApaI-SacI 단편이 Ad57 단편으로 교체되어 플라스미드 pUC57-Ad6/57 헥손-FZF가 생성되었다. 이를 레드 재조합에 의해 Ad6 게놈 내로 재조합시켰다 (Campos et al., 2004 Hum Gene Ther. 15:1125-1130). 도 59는 E3 결실이 있는 Ad657의 플라스미드 지도를 나타낸다. 293 세포 내로의 형질감염에 의해 바이러스를 구조하고, 10-플레이트 셀스택(CellStack) (코닝 라이프 사이언시즈(Corning Life Sciences), 미국 매사추세츠주 로웰)로부터 생산하였다. 녹색 형광 단백질-루시퍼라제 (GFP-Luc) 융합 단백질을 발현하는 바이러스는 Ad 섬유와 E4 사이에 삽입된 CMV-GFP-Luc 발현 카세트, 및 이러한 삽입을 위한 공간을 만드는 E3 결실을 갖는다. 바이러스를 2회의 CsCl 구배에서 정제하고, 바이러스 입자 (vp) 수를 OD260에 의해 계산하였다.
시험관 내 종양용해 활성을 검사하기 위해, 세포를 DMEM + 5% FBS 및 항생제-항진균제 (인비트로젠, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 내의 vp/세포로 환산된 지시된 감염 다중도 (MOI)로 처리하였다. 5일 후, 배지를 제거하고, 세포를 크리스탈 바이올렛 (포스페이트-완충 염수 내의 0.05% 크리스탈 바이올렛, 3.7% 포름알데히드; 인비트로젠, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)으로 10분 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 2회 세정한 후, PBS 내의 0.1% 소듐 도데실 술페이트에서 밤새 37℃에서 인큐베이션하여, 크리스탈 바이올렛을 가용화시켰다. 크리스탈 바이올렛 흡광도를 벡맨 쿨터 DTX 880 플레이트 판독기에서 OD595에서 측정하였다. 샘플의 OD를 동일한 96-웰 플레이트 상의 미처리 대조군 세포의 평균 OD로 나누고, 이러한 숫자에 100을 곱함으로써 세포 생존율 (%)을 계산하였다.
동물을 메이요 클리닉 동물 시설(Mayo Clinic Animal Facility)에서 실험 동물 관리 평가 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)의 지침 하에 거주시켰다. 연구는 동물 복지법의 규정, PHS 동물 복지 정책에 따라 메이요 클리닉 동물 사용 및 관리 위원회에 의해 승인되었다. 100 ㎕의 DMEM/50% 매트리겔(Matrigel) (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산호세) 내의 1×107개의 DU145 세포를 피하 (s.c.) 주사함으로써 4주령 누드 마우스 (할란 스프라그 돌리(Harlan Sprague Dawley), 미국 인디애나주 인디애나폴리스)에서 피하 종양이 시작되었다. 폭2×길이×1/2의 공식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다. 종양 부피가 ~200 ㎕에 도달했을 때, 마우스를 여러 군으로 분배하고, 꼬리 정맥으로의 단일 i.v. 주사에 의해 처리하였다. 종양 부피가 2000 ㎕에 도달하거나 또는 동물이 빈사 상태였거나, 고통을 당하거나, 또는 종양 위로 피부가 파열되었으면, 동물을 안락사시켰다.
혈액 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 측정을 위해, 6마리의 C57BL/6 마우스의 군에 1011 vp의 Ad5, Ad6, 또는 Ad657을 꼬리 정맥에 의해 i.v. 주사하고, ALT 활성 검정법 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 ALT를 측정하기 위해 3일 후에 혈액을 수집하였다.
반복 측정 ANOVA 또는 일원 ANOVA에 이어지는 투키 HSD 검정에 의해 프리즘 (그래프패드)으로 통계 분석을 수행하였다. 카플란-마이어 생존 곡선을 플롯팅하였고, 로그 순위 검정에 의해 비교하였다.
Ad57의 캡소머 유전자는 그의 헥손 HVR을 제외하고는 Ad6과 거의 동일하다 (도 6 및 7). Ad57 및 Ad6의 키메라 바이러스를 생성시키기 위해, Ad57 헥손 HVR에 상응하는 카세트를 야생형 Ad6 게놈 내로 재조합시켰다 (도 8). 이러한 바이러스를 293 세포에서 구조하여 생산하였고, CsCl 구배 상에서 정제하였다. 기재 바이러스 게놈이 Ad6임을 감안하여, 이러한 헥손 키메라 바이러스는 Ad657로 지칭된다 (도 59).
LNCap 및 DU145 세포를 10, 100 또는 1000 vp/세포로 감염시킴으로써 시험관 내 종양용해 활성을 평가하였다. Ad5, Ad6, 및 Ad657에 의한 간 손상을 비교하기 위해, 고용량의 1011 vp의 각각의 바이러스를 꼬리 정맥에 의해 면역적격 C57BL/6 마우스 내로 주사하였다. Ad5-주사 동물이 2일 이내에 빈사 상태가 되었고, 안락사시켜야 했다 (도 10A). Ad5 및 Ad6에 대한 생존이 PBS에 비교했을 때 유의하게 더 낮았다 (로그-순위 분석에 의해 각각 p=0.0001 및 0.0009). Ad657에 대한 생존 또한 PBS에 비교했을 때 감소되었다 (p=0.0578). Ad6 또는 Ad657에 대한 노출 후의 생존이 Ad5-처리 마우스보다 유의하게 더 양호하였다 (각각 p=0.0001 및 0.0001). Ad6 및 Ad657 생존이 통계적으로 상이하지 않았다 (p=0.248).
생존 Ad6 및 Ad657 동물에서 주사 3일 후에 혈액에서 ALT를 측정하였다. Ad5-처리 동물은 테스트하지 않았는데, 대부분의 군이 희생될 필요가 있었기 때문이었다. 이러한 검정법은 Ad6이 혈액 내의 간 ALT 효소 방출의 관점에서 비교적 낮은 수준의 간 손상을 유발하였음을 나타낸다 (도 10B). Ad6 및 Ad657 군 양쪽 모두 PBS-처리 마우스에 비교했을 때 ALT 수준이 낮지만 유의하였다 (양쪽 바이러스에 대해 일원 ANOVA + 투키 다중 비교 검정에 의해 p<0.001). Ad657은 Ad6보다 ALT 수준이 더 낮았다 (ANOVA에 의해 p<0.001). 이는 루시퍼라제 발현 바이러스의 i.v. 주사 후의 Ad657보다 더 높은 수준의 간에서의 Ad6 감염과 일관된다 (도 12). 1마리의 Ad657 동물이 제3일의 채혈 후 분실되었다. 6일에, 대부분의 Ad6 동물이 빈사 상태가 되었다 (도 10A). 대조적으로, 50%의 Ad657 동물이 치료 후 2주 이상 생존하였다.
인간 DU145 전립선 종양에 대한 Ad6 및 Ad657의 종양용해 활성을 비교하기 위해, 누드 마우스에 DU145 세포를 s.c. 생착시켰다. 동물을 평균 200 ㎕의 유사한 종양 크기를 갖는 군으로 분배하고, 9마리의 마우스의 군을 3×1010 vp의 Ad6 또는 Ad657의 용량으로 i.v. 경로에 의해 1회 처리하였다 (도 11).
Ad6 및 Ad657의 이러한 단일 i.v. 주사가 PBS-주사 대조군 동물에 비교했을 때 종양 크기를 감소시켰다. PBS 군에 비교했을 때 7일 이내에 Ad6 군에서 종양이 유의하게 더 작았다 (2원 ANOVA + 투키 다중 비교 검정에 의해 p<0.05). Ad657 군에서의 종양이 제14일에 PBS 군에서의 것과 유의하게 상이하였다 (ANOVA에 의해 p<0.01). Ad6 및 Ad657 양쪽 모두 제38일까지 PBS와의 유의한 차이를 유지하였다 (2원 ANOVA에 의해 p<0.0001). PBS 군의 첫번째 동물이 희생되어야 했을 때인 제38일에 이러한 비교가 종료되었는데, 이후의 비교는 동물 수에서의 변화로 인해 왜곡될 것이기 때문이다. 제38일까지 Ad6 및 Ad657 군에서의 종양 크기가 유의하게 상이하지 않았고, 이 때 Ad657이 2원 ANOVA에 의한 유의하게 더 높은 종양 부피 (p<0.05)를 가졌다 (도 11A). Ad6과 Ad657 종양 크기 사이의 이러한 차이는 제52일까지 지속되었고 (T-검정에 의해 p=0.04), 그 후 이러한 시간 이후에는 종양이 유의하게 상이하지 않았다.
모든 원인으로 인한 생존을 평가했을 때, Ad6 및 Ad657 양쪽 모두 PBS-처리 동물에 비교했을 때 생존을 유의하게 연장시켰다 (도 11B, 로그-순위 분석에 의해 각각 p<0.01 및 0.05). 모든 원인으로 인한 Ad6 생존이 Ad657보다 유의하게 더 양호하였다 (p<0.05). 그러나, 이는 Ad657 동물 중 3마리가 과도한 종양 크기로 인해서라기보다는 종양 위의 피부에서의 궤양 형성으로 인해 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 희생되었어야 하기 때문에 모두에 기인하는 생존의 오차이다. 일부 경우에, 궤양화는 실제로는 효과적인 종양 제어와 연관된다. Ad6과 유사하게, GFP-루시퍼라제를 발현하는 Ad657이 단일 i.v. 주사 후에 원위 DU145 피하 종양에서 유의한 루시퍼라제 활성을 생산하였다 (도 12 및 도 13). 이는 Ad6 및 Ad657 양쪽 모두 단일 전신 처리 후에 전립선 종양에서 종양용해 효과를 매개할 수 있다는 것을 시사한다.
이러한 실시예는 Ad657이 전립선암에 대한 국소 또는 전신 종양용해 바이러스요법으로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 이러한 데이터는 종양용해 C종 Ad로의 혈청형-전환의 놀라운 효과를 또한 입증한다.
Ad의 종양용해 활성을 종양 세포 및/또는 암성 종양에서 평가하였다. Ad6 단일 IV 주사 대 A549 폐 종양 세포를 평가하였고 (도 28); Ad6 단일 IV 또는 종양내 (IT) 주사 대 Panc1 췌장 종양을 평가하였고 (도 29), 면역 적격 햄스터에서의 Ad6 단일 IV 주사 대 신장암을 평가하였다 (도 30).
도 38은 누드 마우스의 루시퍼라제 영상화를 나타낸다. A) Ad6 처리의 단일 I.V. 주사 1, 4, 7, 14, 28, 및 42일 후 대 원위 DU145 전립선 종양. B) LNCaP 전립선 종양을 보유하는 마우스 내로의 복제성 Ad5-GFPLUC의 I.V. 주사 3, 7, 및 19일 후.
Ad6이 IV 주사 후 원위 표적 세포에 도달한다는 결론을 내릴 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 펩티드 라이브러리에서 생성된 펩티드 12.51 및 12.52가 헥손의 HVR5 내로 삽입된 또는 삽입되지 않은, 루시퍼라제를 발현하는 Ad를 지시된 개수의 바이러스 입자 (vp)로 지시된 세포주인 B16 흑색종 및 A549 폐 암종 세포에서 인큐베이션하고, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 펩티드-변형 헥손을 보유하는 Ad에 의한 암 세포의 개선된 감염이 입증된다 (도 31).
펩티드-변형 헥손을 보유하는 Ad에 의한 암 세포의 개선된 감염.
펩티드 라이브러리에서 생성된 펩티드 12.51 및 12.52가 헥손의 HVR5 내로 삽입된 또는 삽입되지 않은, 루시퍼라제를 발현하는 Ad를 104 vp의 각각의 바이러스로 지시된 간세포 암종 세포주에서 인큐베이션하고, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 펩티드-변형 헥손을 보유하는 Ad에 의한 암 세포의 개선된 감염이 입증된다 (도 32).
실시예 7. 리서스 마카크에서 복제성 단일-사이클 아데노바이러스의 전신 및 점막 면역화에 의해 생성된, 분기성 HIV-1에 대해 지시된 면역 반응.
대부분의 유전자-기반 아데노바이러스 백신은 복제 및 Ad 감염 야기를 방지하기 위해 그의 E1 유전자가 결실된 복제-결손성 Ad (RD-Ad) 벡터이다. 헬퍼-의존적 아데노바이러스 (HD-Ad)는 모든 Ad 유전자가 결실되고, 또한 복제-결손성이다. E1-결실 Ad 백신은 세포를 감염시킬 수 있고, 자신의 1개의 카피의 항원 유전자를 전달할 수 있으며, 단일 카피 (예를 들어, "1×")의 이러한 항원을 발현할 수 있다. 이는 안전하지만, 트랜스진 또는 그의 발현을 복제하지 않는다.
대조적으로, E1+ 복제-적격성 Ad (RC-Ad) 백신은 동일한 세포를 감염시킬 수 있고, 항원 유전자 DNA를 10,000배 복제할 수 있으며, 실질적으로 더 많은 항원을 생산할 수 있고, E1-결실 벡터보다 더 강한 면역 반응을 유발한다. RC-Ad가 RD-Ad보다 더 강력하지만, 복제-적격성 Ad는 인간에서 노골적인 아데노바이러스 감염을 야기할 실제 위험이 있을 수 있다.
트랜스진 DNA 복제의 장점을 취하지만, 아데노바이러스 감염의 위험을 방지하기 위해, 핵심적인 바이러스 후기 단백질인 pIIIa에 대한 유전자가 결실된 단일-사이클 Ad (SC-Ad) 벡터가 개발되었다 (문헌 [Crosby et al., 2014. Virology 462-463:158-165]; [Crosby et al., 2015 J Virol 89:669-675]; [Anguiano-Zarate et al., 2018 J Infectious Dis 218:1883-1889]; 및 [Crosby et al., 2017 Genes (Basel) 8:E79]). SC-Ad는 그의 E1 유전자를 유지하여, 그의 게놈을 복제하도록 허용하지만, pIIIa의 부재가 감염성 자손 바이러스의 생산을 차단한다. SC-Ad는 RC-Ad만큼 그의 게놈 및 트랜스진을 잘 복제한다 (최대 10,000배; 문헌 [Crosby et al., 2014. Virology 462-463:158-165]). RC- 및 SC-Ad는 RD-Ad 벡터보다 더 많은 트랜스진 단백질을 생산한다 (Crosby et al., 2014. Virology 462-463:158-165). SC-Ad는 RD-Ad 또는 RC-Ad보다 더 강건하고 더 지속적인 면역 반응을 생성시킨다 (Crosby et al., 2015 J Virol 89:669-675). 정면 비교에서, SC-Ad는 인플루엔자 바이러스에 대해 유의하게 더 높은 항체 및 더 양호한 보호를 생산한다 (Crosby et al., 2017 J Virol 91:e00720-16).
이러한 연구에서, 리서스 마카크를 항체 반응이 확장 중화 폭을 겪기 전 및 후에 HIV-1 환자로부터 수득된 클레이드 B 외피 서열을 발현하는 SC-Ad로 면역화시켰다. 마카크를 단일 전신 IM 면역화에 의해 또는 단일 점막 비강내 (IN) 면역화에 의해 면역화시켰다. 그 후, 동물을 동일하거나 또는 대안적인 경로에 의해 SC-6 Ad에 이어지는 단백질 부스트로 부스팅하였다. 이러한 예는 이러한 다양한 SC-Ad 면역화 전략이 HIV 결합, 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 및 중화 항체의 생성에 어떻게 영향을 미쳤는지, 뿐만 아니라 혈액 및 림프절 내의 T 여포 헬퍼 (pTfh) 세포를 포함하는 세포성 면역 반응에 대한 그의 효과를 기술한다.
HIV-1 외피 단백질 gp140을 발현하는 단일-사이클 아데노바이러스.
HIV 환자 VC10014로부터의 항체 중화 폭의 확장의 이전 (G4) 및 피크 직전 (F8)에 생성된 클레이드 B gp160 외피 서열 (Malherbe et al., 2014J Virol 88:12949-12967)을 면역원으로서 사용하였다. 모티프-최적화 G4 및 F8 gp160 서열을 인간 Ad 혈청형 6 및 57 을 기초로 하는 SC-Ad 내로 재조합시켰다 (예를 들어, 문헌 [Crosby et al., 2014. Virology 462-463:158-165]; [Crosby et al., 2015 J Virol 89:669-675]; [Anguiano-Zarate et al., 2018 J Infectious Dis 218:1883-1889]; 및 [Nguyen et al., 2018 Oncolytic Virotherapy 7:43-51]을 참조한다). 에볼라 당단백질을 발현하는 대조군 SC-Ad 또한 사용되었다. 다른 곳에 기술된 바와 같이 바이러스를 구조하고 정제하였다 (예를 들어, 문헌 [Crosby et al., 2014. Virology 462-463:158-165]; [Crosby et al., 2015 J Virol 89:669-675]; 및 [Anguiano-Zarate et al., 2018 J Infectious Dis 218:1883-1889]을 참조한다).
SC-Ad 벡터에서 사용된 HIV 클레이드 B-감염 대상체로부터 클로닝된 외피 유전자 F8이 모티프-최적화되었고, 절단되지 않은 삼량체성 gp140을 발현하도록 부위-지정 돌연변이유발에 의해 변형되었다. 발현, 정제 및 항원 특성화에 대한 세부사항이 다른 곳에서 기술되었다 (예를 들어, 문헌 [Malherbe et al., 2014J Virol 88:12949-12967]을 참조한다).
인도 기원의 암컷 성체 리서스 마카크 (마카카 물라타(Macaca mulatta))를 유니버시티 오브 텍사스 MD 앤더슨 암 센터(University of Texas MD Anderson Cancer Center) (텍사스주 배스트롭)의 비교 의학 및 연구를 위한 마이클 킬링 센터(Michael Keeling Center for Comparative Medicine and Research)에서 특정 병원체가 없는 사육 콜로니에서 유지시켰다. 모든 동물의 취급은 메이요 클리닉 및 유니버시티 오브 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 정책 및 절차, 동물 복지법의 규정, PHS 동물 복지 정책, 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침의 원칙에 따라 수행되었다.
마카크를 케타민으로 마취시키고, 비강내 (IN) 또는 근육내 (IM) 경로에 의해 2×1010개의 바이러스 입자 (vp)의 지시된 SC-Ad 백신으로 면역화시켰다. 다른 곳에 기술된 바와 같이 IM 경로에 의해 아주플렉스(Adjuplex)™ 아주반트와 조합된 50 ㎍의 정제된 삼량체성 재조합 F8 gp140으로 동물을 부스팅시켰다 (예를 들어, 문헌 [Malherbe et al., 2014J Virol 88:12949-12967]; 및 [Hessell et al., 2016J Immunol 196:3064-3078]을 참조한다).
말초 정맥혈 샘플을 EDTA에서 수집하였다. 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 단리 전에, 혈장을 분리하고, 즉각적으로 -80℃에서 보관하였다. 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도-구배 상에서 혈액으로부터 PBMC를 제조하였다. 다른 곳에 기술된 바와 같이, 타액 및 질 도말물을 프로테아제 억제제를 함유하는 1 ml의 PBS 내에 웩-셀 스피어(Wek-Cel Spear)로 수집하고, 와동시키고, 2,000 r.p.m. 원심분리 후 상청액을 수집하였다 (예를 들어, 문헌 [Kozlowski et al., 1997 Infect Immun 65:1387-1394]을 참조한다). 샘플을 추후에 사용할 때까지 -80℃에서 냉동으로 유지시켰다.
항원-특이적 IFN-γ 생산 세포를 검출하기 위한 ELISPOT 검정법
신선하게 단리된 PBMC를 다른 곳에 기술된 방법을 사용하여 효소 결합 이뮤노 스팟(Enzyme Linked Immuno Spot) (ELISPOT) 검정법에 의해 IFN-γ-생산 세포의 수를 결정하기 위해 F8 gp140 단백질 (1 ㎍/mL) 또는 열 불활성화 Ad6 (7.0×108 vp/웰)로 자극하였다 (예를 들어, 문헌 [Nehete et al., 2017 Comp Med 67:67-78]; [Nehete et al., 2013 PLoS One 8:e79836]; 및 [Nehete et al., 2017 J Am Assoc Lab Anim Sci 56:509-519]을 참조한다). 간략하게, 분취량의 PBMC (105/웰)를 1차 IFN-γ 항체로 예비-코팅된 96-웰 플레이트 (폴리비닐리덴 디플루오라이드 후면 플레이트, MAIP S 45, 밀리포어(Millipore) (매사추세츠주 베드포드))의 이중 웰에 시딩하고, 림프구를 Con A, F8 gp140 단백질, 또는 열 불활성화 Ad6으로 자극하였다. 30-36시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 세포를 제거하고, 웰을 PBS로 철저히 세정하고, 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 발색시켰다. 결과는 배지만 있는 이중 웰 (음성 대조군)의 차감 후에 105 PBMC 당 IFN-γ 스팟-형성 세포 (SFC)로서 표현되고, 배경의 2배를 초과하고 5 SFC/105 PBMC를 초과하면 양성으로 간주된다.
항체 ELISA
다른 곳에 기술된 바와 같이 F8 gp140 또는 SF162 gp140에 대해 규칙적인 간격으로 수집된 혈장 샘플에서 HIV-1 외피 결합 항체 역가를 측정하였다 (문헌 [Malherbe et al., 2014 J Virol 88:12949-12967]; 및 [Hessell et al., 2016J Immunol 196:3064-3078]).
중화 검정법
다른 곳에 기술된 바와 같이 TZM-bl 중화 검정법을 사용하여 HIV 중화를 수행하였다 (문헌 [Malherbe et al., 2014 J Virol 88:12949-12967]; 및 [Hessell et al., 2016J Immunol 196:3064-3078]). 모든 값은 바이러스-단독 웰에 비교하여 계산되었다.
항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)
다른 곳에 기술된 바와 같이 표적 세포인 CEM.NKR.CCR5.CD4+-Luc를 50 ng SHIVSF162P3으로 감염시키고, 4일 동안 배양하였다 (예를 들어, 문헌 [Alpert et al., 2012 PLoS Pathog 8:e1002890]을 참조한다). 감염된 표적에 각각의 샘플의 2배 연속 희석물을 실온에서 20분 동안 첨가하였다. CD16-KHYG-1 이펙터 세포를 10:1 이펙터 대 표적 비로 첨가하고, 추가로 8시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 활성을 바이오-텍(Bio-Tek) 플레이트 판독기에서 측정하였다.
유동 세포측정법
직장 및 림프절 생검으로부터 수집된 세포를 마지막 4시간 동안 골지플러그(GolgiPlug)™ (BD 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산호세)의 존재 하에 0.2 ㎍ gp140 또는 배지 단독과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 배양 후, 세포를 수확하고, 리서스 마카크 샘플과 교차-반응하는 인간 항체의 패널과 함께 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 패널은 하기의 형광색소 표지 항체를 포함하였다: CD8 (Qdot655), α4β7 (PE) 및 CXCR5(PE) (모두 비-인간 영장류 시약 리소스(Nonhuman Primate Reagent Resource)로부터 수득됨); CD69 (BV737, 클론 FN50) 및 FoxP3 (PECy5, 클론: PCH101) (이바이오사이언스(eBioscience)로부터 수득됨), IL-21 (BV421, 클론: 3A3-N2.1), CD45 (BV786, D058-1283) 및 CD3 (클론 SP34-2, PE-Cy7-표지) (모두 BD 바이오사이언시즈 (캘리포니아주 산호세)); CD4 (퍼시픽 블루(Pacific Blue), 클론 OKT4) (써모 피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) (매사추세츠주 월섬)). 제조사의 권장사항에 따라 항체에 대한 희석을 결정하였다. 인비트로젠 (캘리포니아주 칼스배드)으로부터 수득된 라이브-데드(live-dead) 고정형 사세포 염색 키트를 사용하여 사세포를 배제하였다. 이어서, 세포를 2% FBS 및 2 mM EDTA를 함유하는 PBS로 2회 세정한 후, FoxP3 픽스/펌(Fix/Perm) 키트 (써모피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)로 고정하고 투과화시켰다. 세포내 마커 FoxP3 및 IL-21이 투과화 완충제에서 염색되었다. 보상 대조군 (원컴프 이비드(OneComp eBeads), 써모피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 및 형광 마이너스 원(fluorescence minus one) (FMO) 대조군 양쪽 모두를 이용하였다. 모든 샘플을 LSR 포르테사(Fortessa) X-20 분석기 (BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주 산호세) 상에서 수집하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (플로우조 엘엘씨(FlowJo, LLC), 오리건주 애슐랜드)를 사용하여 분석하였다. 샘플 당 약 2×105 내지 1×106개의 이벤트가 수집되었다.
SHIVSF162P3 직장 챌린지
SHIVSF162P3 바이러스는 R157 수확물 3 (3.16.12)으로부터 유래되었다. 이러한 모액은 P27 함량이 66 ng/ml이고, RNA 함량이 Log ~9.35이며, 인도 기원 리서스 PBMC에서의 TCID50이 1288/ml이고, TZM-bl 세포에서의 TCID50이 4.1×104/ml이었다. 이러한 모액의 1:300 희석물 1 ml를 사용하였다. 이는 리서스 PBMC에서의 4.3 TCID50 및 TZM-bl 세포에서의 137 TCID50과 같았다. 이러한 용량을 매주 직장내 (IR) 챌린지에 사용하였다. 혈장 샘플을 레이도스 바이오메디컬 리서치 인크(Leidos Biomedical Research, Inc.), 프레드릭 내셔널 래버러토리(Frederick National Laboratory)에 의해 SHIV 바이러스 RNA 카피수에 대해 분석하였다. 10개를 초과하는 RNA 카피가 있는 동물이 감염된 것으로 간주되었고, 이러한 동물을 감염시키는 데 필요한 챌린지의 수가 카플란-마이어 생존 분석을 위한 이벤트로서 사용되었다. 감염되었으면, 동물에 더 이상 챌린지하지 않았다. 연구가 끝날 때가지 동일한 방법에 의해 혈장 바이러스 로드를 주기적으로 모니터링하였다.
조직 내의 SHIVSF162P3 바이러스 로드
연구가 끝날 때, PBMC 및 사후 조직을 수집하였다. PBMC 및 장 샘플을 SHIVSF162P3 바이러스 RNA에 대해 qPCR에 의해 분석하였다. 모든 통계 분석에 프리즘 7 그래픽 소프트웨어를 사용하였다.
HIV-1 gp160을 발현하는 SC-Ad
클레이드 B 외피 단백질 서열 (G4 gp160)이 HIV 환자 VC10014로부터의 항체 중화 폭의 확장의 이전 및 피크 직전 (F8 gp160)에 확인되었다. 이러한 gp160 서열을 강력한 사이토메갈로바이러스 프로모터의 제어 하에 SC-Ad6 및 SC-Ad657 내로 삽입하였다 (도 24A). Ad57은 그의 헥손 초가변 영역 (HVR) 및 그의 E3 면역 회피 유전자에 변이가 있는, Ad6과 거의 동일한 C종 인간 Ad이다 (도 24B). 대부분의 Ad 중화 항체는 Ad의 헥손 HVR을 표적화한다 (문헌 [Pichla-Gollon et al., 2007 J Virol 81:1680-1689]; 및 [Sumida et al., 2005 J Immunol 174:7179-7185]). 이를 감안하여, Ad6의 HVR이 Ad57로부터의 것으로 교체되어, Ad657로 칭해지는 키메라 C종 Ad 벡터가 생성되었다. SC-Ad6 및 SC-Ad657 양쪽 모두 E1을 포함하는 모든 Ad 유전자를 유지하고, 기능성 pIIIA 및 E3 유전자가 결여된다 (도 24A). 따라서, 양족 모두의 SC-Ad가 자신의 게놈을 복제하여 gp160 발현을 증폭시킬 수 있지만, 자손 Ad 바이러스는 생성시키지 않는다. 양쪽 모두의 바이러스를 293-IIIA 세포에서 구조하여 생산하였고, CsCl 구배 상에서 정제하였다. A549 세포를 감염시키는 데 사용되었을 때, 양쪽 모두의 벡터가 웨스턴 블롯팅에 의해 결정된 바와 같이 gp160을 생산하였다.
상이한 Ad 벡터들이 기존에 리서스 마카크에서 전신 근육내 (IM) 경로, 및 경구 위관영양, 경구 장용 코팅 캡슐, 비강내 (IN), 및 질내 (IVAG)를 포함하는 다양한 점막 경로에 의해 테스트되었다. 소형 동물에서의 IM, IN, 및 IVAG 경로에 의한 SC-Ad-G4의 테스트에서, IVAG 경로에 의한 프라이밍이 무시할 수 있는 항체 반응을 생성시켰음이 밝혀졌다. 대조적으로, 마우스 및 햄스터 양쪽 모두에서의 IN 면역화는 강한 항체 반응을 생성시켰다. 이러한 데이터 및 인간에서 IVAG 면역화를 수행하는 것의 잠재적인 어려움을 감안하여, 후속 마카크 연구에서 IN 경로가 점막 면역화 경로에 대해 선택되었다.
리서스 마카크의 단일 점막 및 전신 면역화
2×1010 vp의 SC-Ad6-G4 Env를 단일 IM 또는 IN 면역화에 의해 8마리의 암컷 리서스 마카크의 군에 백신접종하는 데 사용하였다 (도 14). 이러한 용량은 비교적 낮고, 혼합된 IN 및 IM 면역화에 의해 전달된 최근에 사용된 RC-Ad HIV 외피 백신보다 약 7.5배 더 낮다. 음성 대조군 벡터 군은 에볼라 당단백질 (gp)을 발현하는 SC-Ad6으로 IN 면역화되었다. 4주 후, 혈장 샘플을 F8 gp140에 대한 Env 결합 항체에 대해 검정하였다 (도 14). 이는 단일 면역화 후 IM 면역화 경로 군에서 유의하게 더 높은 중간점 결합 역가를 나타냈다 (ANOVA에 의해 p<0.01). 이러한 시점에 SF162 중화 항체 (NAb) 역가가 또한 상승되었지만, 개별적인 경로 군에 대해서 ANOVA에 의한 유의성에 도달하지 않았다.
제4주의 SC-Ad6으로의 IM 대 IN 부스트
1회의 Ad IM 면역화에 의해 생산된 항-아데노바이러스 중화 항체가 상이한 경로에 의한 부스팅에 의해 방지될 수 있다는 것이 보고되었다 (Xiang et al., 2003J Virol 77:10780-10789). 동일한 Ad 혈청형을 마카크에서 다시 사용할 수 있게 하도록 이러한 경로 개념을 테스트하기 위해, 각각의 SC-Ad6-프라이밍 군을 4마리의 군 2개로 나눴다. 이들을 제4주에 IM 또는 IN 경로에 의해 대안적인 F8 Env을 발현하는 SC-Ad6으로 각각 부스팅시켰다. 이러한 부스팅 3주 후에 수집된 혈장 샘플은 IM-IM, IM-IN, 및 IN-IM 군에 의해 프라이밍-부스팅된 동물에서 중간점 결합 역가의 상승을 나타냈다. IN-IN 군에서는 검출가능한 항체가 관찰되지 않았다 (도 14).
제13주의 SC-Ad657 부스트
그 후, 동물을 제13주에 G4 Env를 발현하는 SC-Ad657로 혈청형-전환에 의해 부스팅시켰다. 이전 부스트에서와 동일한 경로를 사용하였다. 제15주 역가는 IM 프라이밍 동물이 350에 가깝게 Env 결합 역가가 상승되었음을 나타냈지만, 이러한 수준은 대조군과 유의하게 상이하지 않았다 (도 14). 대조적으로, IN-IM-IM 군의 항체는 벡터 대조군 및 IN-IN-IN 군 양쪽 모두보다 유의하게 더 높았다 (p < 0.01). IN-IN-IN 군은 또 다시 3회의 면역화 후에도 Env 항체를 나타내지 않았다.
제24주의 재조합 삼량체성 Env 단백질 부스트
대부분의 HIV 백신 연구는 항체 반응을 증폭시키도록 단백질 부스트로 Ad 면역화를 증대시킨다. 예를 들어, 최근 연구에서, RD-Ad26 벡터가 2회 사용되었고, 아주반트화 gp140 단백질로 3회 부스팅되었다 (Barouch et al., 2015 Science 349(6245):320-4). 이러한 전략이 SC-Ad 백신을 강화할 것인지 여부를 결정하기 위한 노력으로, 모든 SC-Ad-Env 군을 IM 경로에 의해 아주플렉스™ 아주반트와 혼합된 50 ㎍의 재조합 F8 삼량체성 gp140 단백질로 부스팅시켰다. F8 삼량체성 단백질은 모든 군에서 중간점 결합 역가를 두자릿수만큼 부스팅시켰다 (도 14). 또한 이러한 단백질 면역화는 Env 결합 항체가 초기 SC-Ad 면역화 후에 검출되지 않았음에도 불구하고 IN-IN-IN을 다른 군에 필적하는 수준으로 부스팅시켰다.
2차 단백질 부스트 후의 혈장 내의 결합 및 중화 항체
동물을 제38주에 단백질로 2차로 부스팅시켰다. 이는 제40주에 F8 결합 혈장 항체 역가를 거의 105로 증가시켰고, 모든 군이 대조군과 유의하게 상이하였다 (도 14). Tier 1A SF162 바이러스에 대한 중화 항체 (NAb) 역가가 제40주에 100 내지 10,000으로 증가되었다 (도 15). 역가가 배경 수준인 IN-IN-IN 군의 2마리의 동물을 제외하고는 Tier 1B 바이러스 SS1196 및 Tier 2 JRCSF 바이러스에 대한 NAb가 대부분의 동물에서 100으로 증가되었다 (도 15).
2차 단백질 부스트 후의 ADCC 활성
제40주 혈장에서의 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 SHIVSF162P3 감염된 세포에 대해 테스트하였다. ADCC 활성이 적어도 1회의 IN 점막 SC-Ad 면역화를 받은 동물에서 일반적으로 더 높았다 (도 16). 점막 면역화를 받은 모든 동물이 SC-Ad-에볼라 대조군 동물보다 최대 % ADCC가 유의하게 더 높았다 (IM-IN-IN, IN-IM-IM, 및 IN-IN-IN에 대해 각각 p < 0.05, 0.0001, 0.0001). 50% ADCC 역가에 의해 비교했을 때, IN SC-Ad 프라이밍 군만 대조군보다 ADCC 활성이 유의하게 더 높았다 (IN-IM-IM 및 IN-IN-IN 군)에 대해 ANOVA에 의해 p < 0.05 및 0.001).
2차 단백질 부스트 후의 타액 및 질 세정물에서의 항체 반응
상기 데이터는 혈장에서의 전신 항체 반응을 모니터링한다. 타액 및 질 세정물 샘플을 제40주에 또한 수집하고, 이러한 점막 부위에서의 항체에 대해 측정하였다. 타액 및 질 세정물을 ELISA에 의해 F8 및 SF162 env 결합에 대해 검정했을 때, 이러한 반응이 SC-Ad-에볼라 대조군 군을 제외한 대부분의 군에서 관찰되었다 (도 25).
이러한 점막 항체에 대한 국소적인 효과가 있는 것으로 나타났다. 대부분 IN 경로 (IM-IN-IN 및 IN-IN-IN)에 의해 SC-Ad로 면역화된 동물에서, 결합 항체가 이러한 면역화 부위 근처의 타액에서 더 높았지만, 더 원위인 질 부위에서는 더 낮았다 (도 25). ADCC 활성을 이러한 점막 샘플에서 측정했을 때, 이러한 반응이 고도로 가변적이었다 (도 17). 그럼에도 불구하고, 더 높은 ADCC 활성이 대조군 동물에 비교했을 때 IN-IN-IN 군에서 관찰되었다 (ANOVA에 의해 p < 0.05).
1회의 단백질 부스트 후의 전신의 세포성 면역 반응
2차 F8 Env 단백질 부스트 직전에 수집된 샘플에서 ELISPOT에 의해 Env 및 아데노바이러스에 대한 T 세포에 대해 제38주 PBMC를 검정하였다. 모든 Env-면역화 동물이 그의 PBMC 내에 Env-특이적 IFN-γ 분비 세포를 가졌다 (도 18A). 적어도 1회의 점막 면역화를 받은 동물에서 Env-특이적 IFN-γ SFC의 수준이 일반적으로 증가되었다. 그러나, IFN-γ SFC는 SC-Ad 에볼라 면역화 대조군 동물에 비교했을 때 IN-IN-IN SC-Ad 군에서만 유의하게 더 높았다 (ANOVA에 의해 p<0.05). 이러한 시점에 항-Env SFC에 비교했을 때 모든 군에서 항-Ad SFC가 비교적 낮았다.
2차 단백질 부스트 후의 전신의 세포성 면역 반응
제40주에, PBMC 및 서혜부 림프절 세포를 ELISPOT에 의해 Env-특이적 IFN-γ SFC에 대해 검정하였다 (도 18B). 이러한 단백질 부스트는 모든 Env-면역화 동물에서 유사한 수준으로 PBMC 및 림프절 내의 Env-특이적 SFC를 증가시켰다.
점막 세포 추적
제40주의 직장 생검 샘플에서의 유동 세포측정법은 직장 부위 내의 유사한 개수의 α4β7 CD4 및 CD8 세포를 나타냈다 (도 19A). IN 프라이밍 군에서 개수가 증가하는 경향이 있었지만, 이는 유의성에 도달하지 않았다. 직장 조직 내의 활성화된 CD69+ CD4+ 세포의 개수가 군들 사이에서 유사하였다 (도 19B). 유사하게, 이러한 점막 부위 내의 FoxP3+ CD4+ 세포가 두드러지게 상이하지 않았다 (도 19B).
항원-특이적 Tfh 세포 분포
CXCR5+ IL-21+ CD4+ T 여포 헬퍼 (Tfh) 세포를 제40주의 PBMC 및 림프절 샘플에서 측정하였다 (도 20). IM 경로에 의해서만 Ad 및 단백질에 의해 면역화된 동물은 다른 군보다 PBMC 내의 말초 Tfh (pTfh) 세포가 유의하게 더 높았다 (도 20). 림프절에서는, Tfh 세포가 대조군 및 IM 단독 군에서 가장 낮았다. 대조적으로, 적어도 1회의 IN 점막 면역화를 받은 동물의 약 1/2은 마지막 단백질 부스트 후에 림프절에 검출가능한 Tfh가 있었다 (도 20).
SHIVSF162P3으로의 직장 챌린지
면역화된 마카크에 HIV 분리주 SHIVSF162P3을 직장으로 챌린지하였다. 4마리의 면역화되지 않은 대조군 동물이 연구에 추가되었고, 각각의 군에 NIH가 제공한 SHIVSF162P3 챌린지 모액의 1:300 희석물 1 ml를 직장 접종에 의해 매주 챌린지하였다. 이러한 챌린지는 리서스 PBMC에서의 4.3 TCID50 및 TZM-bl 세포에서의 137 TCID50과 같았다. 1차 챌린지 후, 면역화되지 않은 대조군 군의 동물 2마리 및 IM-IM-IM 군의 동물 2마리가 감염되었다 (도 21). 각각의 혼합 경로 군 (IM-IN-IN 및 IN-IM-IM)의 동물 1마리가 1회의 챌린지 후 감염되었다. IN-IN-IN 군의 동물은 1차 챌린지 후 감염되지 않았다. 혈장의 바이러스 로드는 에볼라 군을 제외한 모든 동물이 3회의 챌린지 후에 높은 바이러스 로드에 도달하였음을 지시하였다 (도 22B). IN-IN-IN 군의 동물은 이러한 높은 바이러스 로드에 도달하는 것이 지연되었다.
챌린지가 계속됨에 따라, 7회의 챌린지 후에 여전히 감염되지 않은 에볼라 군의 동물 1마리를 제외한 모든 군의 동물이 감염되었다. Trim5α 및 MHC 대립유전자를 후향적으로 검사하였다 (표 2). 이러한 분석은 저항성 에볼라 군 동물에서 보호 유전자를 명백하게 드러내지 않았다. 대부분의 동물이 그들을 중등도로 보호되도록 유지시킬 수 있는 대립유전자로 분류될 수 없었지만, 대부분의 군에 이러한 대립유전자에 의해 보호될 가능성이 더 높은 적어도 1마리의 동물이 있었다. IM-IM-IM 및 IN-IN-IN 군의 2/4마리의 동물이 SIVsmm 및 아마도 SHIVSF162P3에 대한 선천적 보호의 더 높은 가능성을 예측할 수 있는 Trim5a 및 MHC 대립유전자를 가졌음을 주지하여야 한다 (표 2).
표 2. SIV 보호 유전자 대립유전자에 대한 후향적 스크리닝.
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동물을 IM 또는 IN 경로에 의해 SC-Ad로 프라이밍되었는지 여부를 기초로 군으로 나누고, 카플란-마이어 생존을 분석했을 때, 8마리의 IM 프라이밍 동물의 감염이 대조군 동물의 것과 유사하였다 (도 22A). 대조적으로, 점막 IN 경로에 의해 SC-Ad-Env로 프라이밍된 8마리의 동물에서는 감염이 다소 지연되었다.
조직 내의 사후 바이러스 로드
챌린지 연구가 1차 챌린지 9주 후에 종료되었다. PBMC 및 장 조직을 단리하고, RNA를 정제하고, SHIV 바이러스 게놈에 대해 평가하였다 (도 22B). IM-IM-IM 군에서보다 IN-IN-IN 군에서 수준이 다소 더 낮으면서, 사후 PBMC는 SHIV 바이러스 RNA의 수준이 다양하였다. 결장의 평균 바이러스 RNA는 IM-IM-IM 군에서보다 IN-IN-IN 군에서 15배 더 낮았다 (도 23). 이러한 차이는 ANOVA에 의한 유의성에 도달하지 않았지만, 양측 T 검정은 0.0079의 p 값을 제공하였다.
이러한 실시예는 복제성 SC-Ad 벡터가 HIV-1 및 다른 감염성 질환에 대한 백신접종을 위한 강건하고 안전한 플랫폼으로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다. SC-Ad는 감염된 인간 세포에서 항원 및 시토카인 유전자를 최대 10,000배까지 증폭시킬 수 있다. 면역 반응이 현재 인간에서 HIV-1 백신으로 테스트 중인 RD-Ad 벡터에 의해 매개되는 것보다 훨씬 높게 증폭된다. HIV 백신은 SC-Ad 벡터, 예를 들어, 낮은 혈청유병률을 갖는 재조합 Ad를 기초로 하는 SC-Ad 벡터를 이용하는 것에 의해 HIV 항원 유전자를 증폭시키는 백신 플랫폼으로 변환될 수 있다.
실시예 8. C형 간염 바이러스 (HCV) 항원에 대한 면역 반응에 대한 생체 내 세포독성 T 림프구 (CTL) 검정법.
마우스를 CMV 사이토메갈로바이러스 (CMV) 당단백질 B (gB) cDNA 또는 HCV 항원 2.4를 발현하는 Ad657로 면역화시켰다. 동계 세포에 HCV 펩티드를 펄싱하고, 카르복시플루오로세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 표지한 후, 면역화된 마우스 내로 주사하였다. CMV는 아니지만 HCV 면역화 동물 내의 표지된 세포의 상실에 의해 HCV에 대해 동족 CTL 활성이 관찰된다 (도 26).
실시예 9. 조건부 복제 Ad (CRAd).
바이러스를 조건부-복제 Ad (CRAd)로 변환시키기 위한 E1 단백질 내의 돌연변이를 수반하는 Ad6, Ad657 및 그의 변이체에서의 돌연변이의 개략도가 도 39 및 도 43에서 제시된다. 이는 각각 p300 및 pRB에 결합하는 것을 차단하는 dl1101 및/또는 dl1107을 포함한다.
도 56은 야생형 Ad의 E1A, 뿐만 아니라 Ad 변이체 E1A dl1101, E1A dl1107 및 E1A dl1101/1107의 N-말단 아미노산 서열을 나타낸다.
CRAd인 Ad-PB가 생성되도록 Ad E1 프로모터를 서열식별번호: 44의 전립선-특이적 프로모터 프로바신-E1 DNA 서열로 교체하는 것이 또한 제시된다 (도 55). 프로바신 프로모터는 안드로겐 의존적이고, 따라서 LNCaP와 같은 안드로겐-민감성 종양에서는 작동하지만, DU145와 같은 안드로겐-저항성 종양에서는 그렇지 않을 것이다.
A549 세포를 지시된 바이러스 농도 (vp/세포)의 지시된 Ad6 또는 Ad657 변이체로 감염시키고, 5일 후 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 세포 생존율을 측정하였다 (도 40).
복제-결손성 Ad (RD-Ad)인 Ad6, CRAd6-dl1101/dl1107 또는 CRAd6-PB에 의한 비-암성 세포의 사멸. 조건부-복제 Ad (CRAd)이도록 Ad6 및 Ad657이 변형되는 것이 입증된다 (도 44).
복제-적격성 Ad5, Ad6, Ad657, 및 지시된 CRAd에 의한 암성 세포의 사멸이 도 45에서 제시된다. 조건부-복제 Ad (CRAd)이도록 Ad6 및 Ad657이 변형되는 것이 입증된다.
도 46에 제시된 결과는 유방암 세포에서 조건부-복제 Ad (CRAd)이도록 Ad6 및 Ad657이 변형되는 것을 입증한다.
도 47에 제시된 결과는 전립선암 세포 및 폐암 세포에서 조건부-복제 Ad (CRAd)이도록 Ad6 및 Ad657이 변형되는 것을 입증한다.
마우스에서의 DU145 종양의 성장에 대한 복제-적격성 Ad6 또는 지시된 CRAd의 생체 내 효과. 도 48은 인간 전립선 종양을 보유하는 마우스에서 단일 정맥내 주사 후에 생체 내에서 조건부-복제 Ad (CRAd)이도록 Ad6 및 Ad657이 변형되는 것을 입증한다.
DU145 종양이 있는 마우스의 생존에 대한 복제-적격성 Ad6 또는 지시된 CRAd의 생체 내 효과. 도 49는 인간 전립선 종양을 보유하는 마우스에서 단일 정맥내 주사 후에 생체 내에서 조건부-복제 Ad (CRAd)이도록 Ad6 및 Ad657이 변형되는 것을 입증한다.
도 51은 침팬지 AdC68로부터의 더 짧은 섬유로의 Ad657의 변형이 효능을 감소시킨다는 것을 입증한다.
한 실시양태에서, Ad 6/56/6 바이러스는 Ad6으로부터의 HVR 1 및 7 및 Ad657로부터의 HVR 2-6을 갖는다. 도 52는 Ad 6/56/6 바이러스가 CRAd 변형의 존재 및 부재 하에 인간 폐암 세포를 사멸시키는 것을 입증한다.
E3 단백질 내의 돌연변이를 수반하는 Ad 변이체에 의한 종양 세포 사멸. 면역 적격 시리아 햄스터에 피하 HaK 신장암 종양을 생착시켰다. 종양이 200 ㎕ 부피에 도달했을 때, 마우스에 E3이 있거나 또는 없이 (DE3), 그리고 무작위 NHS-PEG화가 있거나 또는 없이 구축된 지시된 Ad6 바이러스를 정맥내 경로에 의해 1회 주사하였다. 종양 크기를 경시적으로 측정하였다. 데이터는 모든 E3 유전자를 결실시키는 것이 종양용해 바이러스를 덜 효과적이게 만든다는 것을 나타낸다 (Ad6-델타E3-Luc 대 Ad6-Luc) (도 58).
Ad 섬유 단백질은 초기 부착 단계를 매개하는 3개의 외관상 동일한 서브유닛의 복합체이다. 천연 Ad6 섬유 단백질은 서열식별번호: 60에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, CAR에 결합한다.
본 발명의 추가 측면에서, 모체 Ad에 천연이 아닌 상이한 섬유 단백질을 갖는 섬유-변형 재조합 Ad가 생성되었다. 상이한 Ad 균주로부터의 캡시드 단백질을 포함하는, CRAd를 포함하는 재조합 Ad, 예를 들어, 이종 Ad35 섬유 폴리펩티드 또는 침팬지 C68 섬유 폴리펩티드, +/- K7 펩티드를 포함하는 재조합 Ad가 생성되었다 (도 62-69).
키메라 Ad인 AdF35 섬유 키메라는 서열식별번호: 61의 아미노산 서열을 갖고, Ad5 및 Ad6 섬유 단백질보다 더 짧으며, 바이러스를 CD46으로 재표적화한다.
서열식별번호: 62의 서열을 갖는 K7 섬유를 포함하는 섬유-변형 재조합 Ad는 바이러스를 세포 상의 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 및 음전하에 표적화한다.
서열식별번호: 63의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 더 짧고, CAR에 결합한다.
서열식별번호: 64의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68-K7 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 짧다. 6/FC68-K7 섬유는 CAR에 결합하고, 헤파린 술페이트 및 음전하에 재표적화된다.
서열식별번호: 65의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68-HI-K7 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 짧다. 6/FC68-HI-K7 섬유는 CAR에 결합하고, 헤파린 술페이트 및 음전하에 재표적화된다.
실시예 10. 아데노바이러스의 혈청형-전환.
도 41은 Ad 치료 사이클을 나타내는 개략도이다. 한 실시양태에서, 치료 과정에 걸친 상이한 Ad로의 혈청형-전환이 예시된다 (도 41A).
종양용해 아데노바이러스의 혈청형-전환 후의 전립선 종양 표적화.
옆구리에 DU145 전립선 종양을 보유하는 마우스를 Ad657 또는 CRAd657의 단일 정맥내 (IV) 주사에 의해 처리하였다. 이러한 마우스를 GFP루시퍼라제를 발현하는 대안적인 Ad6 종양용해 바이러스 또는 Ad6-F35로 2차로 처리하고, 루시퍼라제 활성을 영상화에 의해 측정하였다. Ad6은 Ad6 헥손, 및 CAR을 표적화하는 섬유를 갖는다. Ad6-F35는 Ad6 헥손, 및 CD46을 표적화하는 Ad35 섬유를 갖는다. 도 42는 더 낮은 표적을 벗어나는 간 감염으로 종양을 표적화하는 바이러스로 종양용해제를 혈청형-전환시키는 능력을 입증한다.
혈청형-전환의 또 다른 예에서, 옆구리에 LNCaP 전립선 종양을 보유하는 마우스를 3e10개의 바이러스 입자 (vp)의 Ad657 또는 CRAd657로 단일 정맥내 (IV) 주사에 의해 처리하였다. 이러한 마우스를 5개월 후에 3e10 vp의 GFP루시퍼라제를 발현하는 대안적인 Ad6/57/6 종양용해 바이러스 및 섬유 변이체 K7 (7개의 라이신이 부가됨), F35 (Ad35 섬유가 있음), 또는 KKTK-C68 (Ad6 KKTK 가요성 도메인 후에 융합된 침팬지 C68 섬유)로 2차로 처리하였다. KKTK-C68 바이러스는 바이러스 생산성을 강화하기 위한 부가된 코돈-최적화 E4 34K 유전자를 또한 갖는다. 루시퍼라제 활성을 7일 후에 영상화에 의해 측정하였다. 모든 Ad6/57/6은 Ad6으로부터의 HVR1 및 7 및 Ad57로부터의 HVR 2-6이 있는 헥손을 갖는다. Ad6/57/6 및 KKTK-C68은 CAR을 표적화하는 섬유를 갖는다. Ad6/57/6-F35는 CD46을 표적화하는 Ad35 섬유를 갖는다. K7은 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 결합하는 것을 포함하여 세포 상의 음전하에 결합하는 것을 증가시킨다. 도 70은 더 낮은 표적을 벗어나는 간 감염으로 종양을 표적화하는 바이러스로 종양용해제를 혈청형-전환시키는 능력을 입증한다.
비-인간 영장류의 백신접종 동안의 혈청형-전환.
도 14 내지 25에서, 리서스 마카크를 HIV 외피를 발현하는 복제성 단일-사이클 Ad6으로 면역화한 후, HIV 외피를 발현하는 단일-사이클 Ad657로의 혈청형-전환에 의해 부스팅시켰다. 이러한 면역화 후, 각각의 동물을 외피 단백질로 부스팅시켰다. 각각의 도면은 적응 항체 및 세포성 면역 반응의 생성, 및 어떻게 동물이 SHIVSF162P3 바이러스로의 직장 챌린지를 격퇴하였는지를 나타낸다. 도 14는 Ad657로 변화시키는 것이 항체 반응의 현저한 상승을 생성시킨 혈청형-전환의 값을 문서화한다.
실시예 11. 종양용해 암 백신.
BALB/c 마우스를 무손상 E3이 있고 인간 폴레이트 수용체 알파를 발현하는 1010개의 바이러스 입자의 CRAd-657-dl1101/1107-FolR, 또는 PBS로 근육내 경로에 의해 면역화시켰다. 1회의 면역화 2주 후에 혈청을 수집하고, 항-IgM 항체를 검출에 사용하여 ELISA에 의해 항-폴레이트 수용체 알파 항체에 대해 분석하였다 (모든 항체가 면역화 후의 이러한 유형의 초기 시점에 IgM이다). 데이터는 이러한 CRAd에 의한 공지된 암 항원인 폴레이트 수용체 알파에 대한 항체의 생성을 나타낸다. T 검정에 의해 p - 0.07 (도 53).
실시예 12. 종양용해 활성에 대한 E3 면역 회피 유전자의 효과.
도 57은 Ad 내의 상이한 E3 면역 회피 유전자들의 개략도를 나타낸다. E3 19K는 감염된 세포를 T 세포 및 NK 세포로부터 보호한다. RID 단백질은 감염된 세포를 사멸-유도 리간드 (FAS, TRAIL, TNFR, 및 EGFR)로부터 보호한다. 14.7K는 감염된 세포에서의 아팝토시스의 내재적 활성화를 억제한다. C종 Ad는 아데노바이러스 사멸 단백질 (ADP)로 공지된 11.6K를 또한 발현한다. ADP의 과발현은 세포 사멸을 가속화하지만, 전체적인 세포 사멸은 동일하다. 49K 종은 T 세포 및 NK 세포 상의 CD46에 결합하여, 이러한 세포의 하향-조절 및 NK 세포에 의한 클래스 I MHC가 결핍된 세포의 덜 효율적인 세포 사멸에 이른다.
도 58은 E3 12.5K의 부분적 결실 및 E3 6.7K, 19K, 11.6K (ADP), 10.4K (RIDα), 14.5K (RIDβ), 및 14.7K 유전자의 완전 결실이 이러한 면역 회피 유전자가 종양용해 아데노바이러스에 존재하지 않을 때 신장암의 면역적격 햄스터 모델에서 종양용해 효능을 감소시킨다는 것을 입증한다.
기타 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하도록, 그리고 이를 제한하지 않도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 다른 측면, 장점 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH <120> ADENOVIRUSES AND METHODS FOR USING ADENOVIRUSES <130> ADZE 1 US SEQ <150> 62/770,631 <151> 2018-11-21 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> targeting polypeptide <400> 1 Thr Ala Arg Gly Glu His Lys Glu Glu Glu Leu Ile 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> targeting polypeptide <400> 2 Leu Arg Gln Thr Gly Ala Ala Ser Ala Val Trp Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> targeting polypeptide <400> 3 Ala Arg Arg Ala Asp Thr Gln Trp Arg Gly Leu Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> targeting polypeptide <400> 4 Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln Ser Cys Gly Tyr Ala 1 5 10 15 Thr Val Thr <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> targeting polypeptide <400> 5 Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys 1 5 <210> 6 <211> 10 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300 Asn Ile Ala Thr Leu Thr Thr Ser Pro Phe Phe Phe Ser Tyr Ile Thr 305 310 315 320 Glu Asp Asp Asn <210> 62 <211> 534 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fiber Polypeptide <400> 62 Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro 1 5 10 15 Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro 20 25 30 Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser 35 40 45 Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Ser His Gly Met Leu Ala Leu 50 55 60 Lys Met Gly Ser Gly Leu Ser Leu Asp Gln Ala Gly Asn Leu Thr Ser 65 70 75 80 Asn Thr Ile Thr Val Ser Gln Pro Leu Lys Lys Thr Lys Ser Asn Ile 85 90 95 Thr Leu Glu Thr Ser Ala Pro Leu Thr Val Ser Ser Gly Ala Leu Thr 100 105 110 Met Ala Thr Thr Ser Pro Leu Val Val Ser Asp Asn Thr Leu Thr Met 115 120 125 Gln Ser Gln Ala Pro Leu Thr Val Gln Asp Ser Lys Leu Ser Ile Ala 130 135 140 Thr Lys Glu Pro Leu Thr Val Leu Asp Gly Lys Leu Ala Leu Gln Thr 145 150 155 160 Ser Ala Pro Leu Ser Ala Thr Asp Asn Asn Ala Leu Thr Ile Thr Ala 165 170 175 Ser Pro Pro Leu Thr Thr Ala Asn Gly Ser Leu Ala Val Thr Met Glu 180 185 190 Asn Pro Leu Tyr Asn Asn Asn Gly Lys Leu Gly Leu Lys Ile Gly Gly 195 200 205 Pro Leu Gln Val Ala Thr Asp Ser His Ala Leu Thr Leu Gly Thr Gly 210 215 220 Gln Gly Val Ala Val His Asn Asn Leu Leu His Thr Lys Val Thr Gly 225 230 235 240 Ala Ile Gly Phe Asp Thr Ser Gly Asn Met Glu Leu Lys Thr Gly Asp 245 250 255 Gly Leu Tyr Val Asp Ser Ala Gly Pro Asn Gln Lys Leu His Ile Asn 260 265 270 Leu Asn Thr Thr Lys Gly Leu Ala Phe Asp Asn Thr Ala Ile Thr Ile 275 280 285 Asn Ala Gly Lys Gly Leu Glu Phe Glu Thr Asp Ser Ser Asn Gly Asn 290 295 300 Pro Ile Lys Thr Lys Ile Gly Ser Gly Ile Gln Tyr Asn Thr Asn Gly 305 310 315 320 Ala Met Val Ala Lys Leu Gly Thr Gly Leu Ser Phe Asp Ser Ser Gly 325 330 335 Ala Ile Thr Met Gly Ser Ile Asn Asn Asp Arg Leu Thr Leu Trp Thr 340 345 350 Thr Pro Asp Pro Ser Pro Asn Cys Arg Ile Ala Ser Asp Lys Asp Cys 355 360 365 Lys Leu Thr Leu Ala Leu Thr Lys Cys Gly Ser Gln Ile Leu Gly Thr 370 375 380 Val Ser Ala Leu Ala Val Ser Gly Asn Met Ala Ser Ile Asn Gly Thr 385 390 395 400 Leu Ser Ser Val Asn Leu Val Leu Arg Phe Asp Asp Asn Gly Val Leu 405 410 415 Met Ser Asn Ser Ser Leu Asp Lys Gln Tyr Trp Asn Phe Arg Asn Gly 420 425 430 Asp Ser Thr Asn Gly Gln Pro Tyr Thr Tyr Ala Val Gly Phe Met Pro 435 440 445 Asn Leu Lys Ala Tyr Pro Lys Thr Gln Ser Lys Thr Ala Lys Ser Asn 450 455 460 Ile Val Ser Gln Val Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Ser Lys Pro Leu His 465 470 475 480 Phe Thr Ile Thr Leu Asn Gly Thr Asp Glu Thr Asn Gln Val Ser Lys 485 490 495 Tyr Ser Ile Ser Phe Ser Trp Ser Trp Asn Ser Gly Gln Tyr Thr Asn 500 505 510 Asp Lys Phe Ala Thr Asn Ser Tyr Thr Phe Ser Tyr Ile Ala Gln Glu 515 520 525 Lys Lys Lys Lys Lys Lys 530 <210> 63 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fiber Polypeptide <400> 63 Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro Val Tyr Pro 1 5 10 15 Tyr Asp Thr Glu Thr Gly Pro Pro Thr Val Pro Phe Leu Thr Pro Pro 20 25 30 Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser 35 40 45 Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Lys Asn Gly Glu Ile Thr Leu 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Gly Val Asp Leu Asp Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ser 65 70 75 80 Asn Thr Ala Thr Lys Ala Ala Ala Pro Leu Ser Phe Ser Asn Asn Thr 85 90 95 Ile Ser Leu Asn Met Asp His Pro Phe Tyr Thr Lys Asp Gly Lys Leu 100 105 110 Ser Leu Gln Val Ser Pro Pro Leu Asn Ile Leu Arg Thr Ser Ile Leu 115 120 125 Asn Thr Leu Ala Leu Gly Phe Gly Ser Gly Leu Gly Leu Arg Gly Ser 130 135 140 Ala Leu Ala Val Gln Leu Val Ser Pro Leu Thr Phe Asp Thr Asp Gly 145 150 155 160 Asn Ile Lys Leu Thr Leu Asp Arg Gly Leu His Val Thr Thr Gly Asp 165 170 175 Ala Ile Glu Ser Asn Ile Ser Trp Ala Lys Gly Leu Lys Phe Glu Asp 180 185 190 Gly Ala Ile Ala Thr Asn Ile Gly Asn Gly Leu Glu Phe Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Thr Glu Thr Gly Val Asp Asp Ala Tyr Pro Ile Gln Val Lys Leu 210 215 220 Gly Ser Gly Leu Ser Phe Asp Ser Thr Gly Ala Ile Met Ala Gly Asn 225 230 235 240 Lys Glu Asp Asp Lys Leu Thr Leu Trp Thr Thr Pro Asp Pro Ser Pro 245 250 255 Asn Cys Gln Ile Leu Ala Glu Asn Asp Ala Lys Leu Thr Leu Cys Leu 260 265 270 Thr Lys Cys Gly Ser Gln Ile Leu Ala Thr Val Ser Val Leu Val Val 275 280 285 Gly Ser Gly Asn Leu Asn Pro Ile Thr Gly Thr Val Ser Ser Ala Gln 290 295 300 Val Phe Leu Arg Phe Asp Ala Asn Gly Val Leu Leu Thr Glu His Ser 305 310 315 320 Thr Leu Lys Lys Tyr Trp Gly Tyr Arg Gln Gly Asp Ser Ile Asp Gly 325 330 335 Thr Pro Tyr Thr Asn Ala Val Gly Phe Met Pro Asn Leu Lys Ala Tyr 340 345 350 Pro Lys Ser Gln Ser Ser Thr Thr Lys Asn Asn Ile Val Gly Gln Val 355 360 365 Tyr Met Asn Gly Asp Val Ser Lys Pro Met Leu Leu Thr Ile Thr Leu 370 375 380 Asn Gly Thr Asp Asp Ser Asn Ser Thr Tyr Ser Met Ser Phe Ser Tyr 385 390 395 400 Thr Trp Thr Asn Gly Ser Tyr Val Gly Ala Thr Phe Gly Ala Asn Ser 405 410 415 Tyr Thr Phe Ser Tyr Ile Ala Gln Glu 420 425 <210> 64 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fiber Polypeptide <400> 64 Met Lys Arg Ala Arg Pro Ser Glu Asp Thr Phe Asn Pro 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220 Gly Ser Gly Leu Ser Phe Asp Ser Thr Gly Ala Ile Met Ala Gly Asn 225 230 235 240 Lys Glu Asp Asp Lys Leu Thr Leu Trp Thr Thr Pro Asp Pro Ser Pro 245 250 255 Asn Cys Gln Ile Leu Ala Glu Asn Asp Ala Lys Leu Thr Leu Cys Leu 260 265 270 Thr Lys Cys Gly Ser Gln Ile Leu Ala Thr Val Ser Val Leu Val Val 275 280 285 Gly Ser Gly Asn Leu Asn Pro Ile Thr Gly Thr Val Ser Ser Ala Gln 290 295 300 Val Phe Leu Arg Phe Asp Ala Asn Gly Val Leu Leu Thr Glu His Ser 305 310 315 320 Thr Leu Lys Lys Tyr Trp Gly Tyr Arg Gln Gly Asp Ser Ile Asp Gly 325 330 335 Thr Pro Tyr Thr Asn Ala Val Gly Phe Met Pro Asn Leu Lys Ala Tyr 340 345 350 Pro Lys Ser Gln Ser Ser Thr Thr Lys Asn Asn Ile Val Gly Gln Val 355 360 365 Tyr Met Asn Gly Asp Val Ser Lys Pro Met Leu Leu Thr Ile Thr Leu 370 375 380 Asn Gly Thr Asp Asp Ser Asn Ser Thr Tyr Ser Met Ser Phe Ser Tyr 385 390 395 400 Thr Trp Thr Asn Gly Ser Tyr Val Gly Ala Thr Phe Gly Ala Asn Ser 405 410 415 Tyr Thr Phe Ser Tyr Ile Ala Gln Glu Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 420 425 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Gly Ala Ile Ala Thr Asn Ile Gly Asn Gly Leu Glu Phe Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Thr Glu Thr Gly Val Asp Asp Ala Tyr Pro Ile Gln Val Lys Leu 210 215 220 Gly Ser Gly Leu Ser Phe Asp Ser Thr Gly Ala Ile Met Ala Gly Asn 225 230 235 240 Lys Glu Asp Asp Lys Leu Thr Leu Trp Thr Thr Pro Asp Pro Ser Pro 245 250 255 Asn Cys Gln Ile Leu Ala Glu Asn Asp Ala Lys Leu Thr Leu Cys Leu 260 265 270 Thr Lys Cys Gly Ser Gln Ile Leu Ala Thr Val Ser Val Leu Val Val 275 280 285 Gly Ser Gly Asn Leu Asn Pro Ile Thr Gly Thr Val Ser Ser Ala Gln 290 295 300 Val Phe Leu Arg Phe Asp Ala Asn Gly Val Leu Leu Thr Glu His Ser 305 310 315 320 Thr Leu Lys Lys Tyr Trp Gly Tyr Arg Gln Gly Asp Ser Ile Asp Gly 325 330 335 Thr Pro Tyr Thr Asn Ala Val Gly Phe Met Pro Asn Leu Lys Ala Tyr 340 345 350 Pro Lys Ser Gln Ser Ser Thr Thr Lys Asn Asn Ile Val Gly Gln Val 355 360 365 Tyr Met Asn Gly Asp Val Ser Lys Pro Met Leu Leu Thr Ile Thr Leu 370 375 380 Asn Gly Thr Asp Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Lys Lys Lys Lys Lys 385 390 395 400 Lys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Ser Met Ser Phe Ser Tyr 405 410 415 Thr Trp Thr Asn Gly Ser Tyr Val Gly Ala Thr Phe Gly Ala Asn Ser 420 425 430 Tyr Thr Phe Ser Tyr Ile Ala Gln Glu 435 440

Claims (26)

  1. (a) 제1 아데노바이러스 (Ad) 균주로부터의 Ad 캡시드 폴리펩티드 및 (b) 하나 이상의 상이한 Ad 균주로부터의 적어도 1개의 헥손 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 헥손 폴리펩티드의 적어도 1개의 초가변 영역 (HVR)이 제1 Ad 균주의 HVR과 상이한 것인 재조합 Ad.
  2. 제1항에 있어서, 제1 Ad 균주 및 하나 이상의 상이한 Ad 균주가 혈청형이 별개의 것인 재조합 Ad.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 Ad 균주가 인간 Ad6 균주이고, 제2 Ad 균주가 인간 Ad57 균주인 재조합 Ad.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상이한 Ad 균주로부터의 캡시드 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기서 캡시드 폴리펩티드가 제1 Ad 균주의 캡시드 폴리펩티드와 상이한 것인 재조합 Ad.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적화 폴리펩티드, 항원성 폴리펩티드, 효소, 수용체 또는 리간드를 추가로 포함하는 재조합 Ad.
  6. 제5항에 있어서, 표적화 폴리펩티드가 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-41 및 서열식별번호: 46-47로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 Ad.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환 및/또는 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 여기서 아미노산 치환이 시스테인에 대한 것이고, 아미노산 변형이 PEG화 및 BAP화로부터 선택되는 것인 재조합 Ad.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조건부-복제 Ad (CRAd)인 재조합 Ad.
  9. 제8항에 있어서, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 Ad.
  10. (a) 제1 아데노바이러스 (Ad) 균주로부터의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 Ad 게놈 및 (b) 하나 이상의 상이한 Ad 균주로부터의 적어도 1개의 헥손 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 헥손 폴리펩티드의 적어도 1개의 초가변 영역 (HVR)이 제1 Ad 균주의 Ad 게놈에 의해 코딩되는 HVR과 상이한 것인 재조합 Ad.
  11. 제10항에 있어서, 제1 Ad 균주 및 하나 이상의 상이한 Ad 균주가 혈청형이 별개의 것인 재조합 Ad.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 제1 Ad 균주가 인간 Ad6 균주이고, 제2 Ad 균주가 인간 Ad57 균주인 재조합 Ad.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상이한 Ad 균주로부터의 캡시드 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 여기서 캡시드 폴리펩티드가 제1 Ad 균주의 캡시드 폴리펩티드와 상이한 것인 재조합 Ad.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 폴리펩티드, 항원성 폴리펩티드, 효소, 수용체 또는 리간드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함하는 재조합 Ad.
  15. 제14항에 있어서, 핵산이 서열식별번호: 1-41 및 서열식별번호: 46-47로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 표적화 폴리펩티드를 코딩하는 것인 재조합 Ad.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환 및/또는 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 여기서 아미노산 치환이 시스테인에 대한 것이고, 아미노산 변형이 PEG화 및 BAP화로부터 선택되는 것인 재조합 Ad.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 Ad가 조건부-복제 Ad (CRAd)인 추가 변형을 포함하는 재조합 Ad.
  18. 제17항에 있어서, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 Ad.
  19. 암에 걸린 포유동물에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스 (Ad)를 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 포유동물을 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 암이 전립선암, 난소암, 폐암, 간세포 암종, 췌장암, 신장암, 흑색종, 뇌암, 결장암, 림프종, 골수종, 림프구성 백혈병, 및 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 투여가 전신 투여를 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 전신 투여가 근육내, 비강내 또는 정맥내 투여를 포함하는 것인 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 국소 투여를 포함하는 것인 방법.
  24. 제24항에 있어서, 상기 국소 투여가 종양내 주사를 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 재조합 Ad의 암 치료를 위한 용도.
  26. (a) 제1 아데노바이러스 (Ad) 균주로부터의 Ad 캡시드 폴리펩티드 및 (b) 하나 이상의 상이한 Ad 균주로부터의 적어도 1개의 헥손 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 헥손 폴리펩티드의 적어도 1개의 초가변 영역 (HVR)이 제1 Ad 균주의 HVR과 상이한 것인 재조합 Ad의 암 치료를 위한 약제로서의 용도.
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