CN113227361A - 腺病毒和使用腺病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于核酸递送、接种疫苗和/或治疗癌症的方法和材料。更具体地，提供了使用一种或多种重组腺病毒(Ad)作为溶瘤剂进行核酸递送、接种疫苗和/或治疗癌症的方法和材料。

Description

腺病毒和使用腺病毒的方法
发明背景
发明的技术领域
本发明涉及用于核酸递送、接种疫苗和/或治疗癌症的方法和材料。例如，本发明包括腺病毒(Ad)和利用腺病毒治疗医学状况如癌症的方法。在本发明的一方面中，本文提供的腺病毒可用作溶瘤剂。
尽管付出了巨大努力，癌症仍然是美国主要的公共卫生问题，仅在2017年，新病例就超过160万例(美国国家癌症研究所，“Cancer Stat Facts:Cancer of Any Site”，seer.cancer.gov/statfacts/html/all.html)。诸如化学疗法、放射疗法和外科手术的传统疗法经常失败，尤其是在癌症晚期时。原因之一是癌细胞可消除或修饰这些疗法靶向的成分并有效避免被杀死。
溶瘤病毒疗法可通过利用选择性复制的病毒来破坏肿瘤、激活获得性免疫应答并确保针对肿瘤的终生免疫而提供癌症疗法的替代方法(Russell等人，2017MolecularTherapy 25:1107-1116)。
本发明提供了用于核酸递送、接种疫苗和/或治疗癌症的方法和材料。例如，本发明提供了通过施用一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)作为溶瘤剂来治疗癌症的方法和材料。在一个实施方案中，重组Ad可源自第一Ad(如，可包括第一Ad如Ad6的基因组，又称为重组Ad骨架)，并且可包括来自第二Ad如Ad57的六邻体HVR。在重组Ad包括Ad6基因组和Ad57六邻体HVR的情况下，重组Ad可以是被称为Ad657的嵌合Ad(参见Nguyen,等人Oncolytic Virotherapy 7:43-51,2018)。
在一方面，本发明提供了使用一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)来针对传染病进行接种疫苗的方法。在一方面，本发明提供了使用一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)作为溶瘤剂来治疗癌症的方法。在一些情况下，可将一种或多种重组Ad(如，一个或多个Ad657)用于减少哺乳动物中癌细胞的数目(如，通过感染和杀死癌细胞)。在一些情况下，可将一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)用于刺激哺乳动物中的抗癌免疫应答。在一些情况下，可将一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)用于在哺乳动物中刺激针对传染病的免疫应答。
如本文所证明，当通过静脉内注射将Ad657递送至具有皮下人DU145前列腺癌肿瘤的小鼠时，Ad657首先感染肝脏，然后到达远处的肿瘤。Ad6和Ad657两者均介导肿瘤生长的显著延迟并延长存活，其中Ad6介导的功效更高。
本发明提供了用于核酸递送、接种疫苗和/或治疗癌症的方法和材料。例如，本发明提供了通过施用一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)作为溶瘤剂来治疗癌症的方法和材料。在一个实施方案中，重组Ad可源自第一Ad(如，可包括第一Ad如Ad6的基因组，又被称为重组Ad骨架)，并且可包括来自第二Ad如Ad57的六邻体HVR。在重组Ad包括Ad6基因组和Ad57六邻体HVR的情况下，重组Ad可以是被称为Ad657的嵌合Ad。在一方面，本发明提供了利用一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)来针对传染病进行接种疫苗的方法。在一方面，本发明提供了利用一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)作为溶瘤剂来治疗癌症的方法。在一些情况下，可利用一种或多种重组Ad(如，一种或多种Ad657)来减少哺乳动物中癌细胞的数目(如，通过感染和杀死癌细胞)。在一些情况下，可利用一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)来刺激哺乳动物中的抗癌免疫应答。在一些情况下，可利用一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体中的一种或多种)来刺激哺乳动物中针对传染病的免疫应答。
如本文所证明，当通过静脉内注射将Ad657递送至具有皮下人DU145前列腺癌肿瘤的小鼠时，Ad657首先感染肝脏，然后到达远处的肿瘤。Ad6和Ad657两者均介导了肿瘤生长的显著延迟并延长存活，其中Ad6介导的功效更高。
此外，对于几乎任何溶瘤病毒而言，如果将其用作静脉内全身疗法，则肝脏扣留是一个相当大的问题。如果病毒感染并杀死肝细胞，这在低剂量时会导致肝损伤，高剂量时会导致死亡。值得注意的是，相比Ad5或Ad6，施用本发明的Ad(即，Ad657嵌合载体及其变体)介导了出乎意料的更低的肝损伤。因此，Ad6平台与Ad657的HVR 1-7的独特组合介导了天然病毒中未观测到的生物分布和疗法的变化。
同样，如本文所证明，通过鼻内(IN)和肌内(IM)途径用仅表达进化枝BHIV-1gp160的复制型单周期腺病毒(SC-Ad657)疫苗免疫恒河猴(rhesus macaques)，并与接种疫苗的粘膜和全身途径进行了比较。仅一次免疫后，SC-Ad疫苗本身就产生了针对Env的显著的循环抗体滴度。仅通过IM途径免疫的动物血液中的外周T滤泡辅助(pTfh)细胞高，而淋巴结中的Tfh低，并且具有较低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)抗体活性。通过IN途径免疫的动物淋巴结中的Tfh高，而血液中的pTfh低，并且具有较高的ADCC抗体。当用SHIVSF162P3直肠攻击免疫动物后，它们全部被感染，但粘膜初免(prime)动物的胃肠道病毒载量明显更低。类似地，携带丙型肝炎抗原基因的Ad657能够产生针对肝炎和巨细胞病毒的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。Ad657能够递送和表达治疗基因，包括细胞因子如4-1BBL、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GMCSF)和IL-21。本文提供的结果证明可将重组Ad用作用于癌症的核酸、疫苗和/或溶瘤病毒疗法的局部或全身递送媒介物。
发明内容
总体上，本发明一方面的特征在于重组Ad，其包含(a)来自第一Ad株的Ad基因组，和(b)来自第二Ad株的编码六邻体多肽的核酸，其中六邻体多肽的高变区(HVR)中的一个或多个高变区不同于Ad基因组编码的HVR。第一Ad株可以是第一人类Ad株，第二Ad株可以是与第一人类Ad株不同的第二人类Ad株。第一Ad株和第二Ad株在血清型上可以是不同的。第一Ad株可以是人Ad6株，而第二Ad株可以是人Ad57株。重组Ad还可包括一种或多种靶向多肽，抗原多肽，酶，氨基酸取代，PEG化，配体，标签等。
可将重组Ad用作载体用于基于基因的接种疫苗，用于基因治疗应用/递送，或用于溶瘤病毒疗法。
在另一实施方案中，重组Ad包含(a)来自第一Ad株的Ad基因组，和(b)编码来自一种或多种Ad株的至少一个六邻体多肽的核酸，其中来自一种或多种Ad株的六邻体多肽的高变区(HVR)不同于第一Ad基因组编码的HVR。
在另一实施方案中，重组Ad可以是可复制型Ad或条件复制型Ad(如，CRAd)。
另一方面，本发明的特征在于重组和/或嵌合Ad，其包含(a)编码第一六邻体多肽的核酸，和(b)第二六邻体多肽，其中第一六邻体多肽的氨基酸序列不同于第二六邻体多肽的氨基酸序列。第一六邻体多肽的高变区(HVR)的氨基酸序列可不同于第二六邻体多肽的高变区的氨基酸序列。核酸可来自第一Ad株，第二六邻体多肽可来自第二Ad株。第一Ad株可以是第一人类Ad株，第二Ad株可以是与第一人类Ad株不同的第二人类Ad株。第一Ad株和第二Ad株在血清型上可以是不同的。Ad株可以是人Ad6株，第二Ad株可以是人Ad57株。重组Ad还可包含靶向多肽。靶向多肽可包括氨基酸序列TARGEHKEEELI(SEQ ID NO:1)。
在另一实施方案中，重组Ad包含(a)编码第一六邻体多肽的核酸，和(b)来自一种或多种Ad株的第二六邻体多肽，其中第一六邻体多肽的氨基酸序列不同于来自一种或多种Ad株的第二六邻体多肽的氨基酸序列。
在另一实施方案中，重组Ad可以是可复制型Ad或条件复制型Ad(如，CRAd)。
另一方面，本发明提供了用于治疗患有癌症的哺乳动物的材料和方法。所述方法可包括以下或基本上由以下组成：向患有癌症的哺乳动物施用重组Ad，所述重组Ad包含(a)来自第一Ad株的Ad基因组和(b)来自一种或多种Ad株的至少一个六邻体多肽，其中所述六邻体多肽的一个或多个高变区(HVR)与所述Ad基因组编码的HVR不同，和/或向患有癌症的哺乳动物施用Ad，所述Ad包含(a)编码第一六邻体多肽的核酸和(b)第二六邻体多肽，其中第一六邻体多肽的氨基酸序列不同于第二六邻体多肽的氨基酸序列。哺乳动物可以是人类。癌症可以是前列腺癌，卵巢癌，肺癌，肝细胞癌，胰腺癌，肾癌，黑素瘤，脑癌，结肠癌，淋巴瘤，骨髓瘤，淋巴细胞性白血病或骨髓性白血病。施用可包括全身或局部施用(如，静脉内，瘤内，肌内，器官内，淋巴结内施用)。
本文证明了Ad657及其变体能够将治疗性基因递送至细胞以表达治疗性多肽。因此，可将重组Ad包括嵌合Ad用作用于癌症的核酸、疫苗和/或溶瘤病毒疗法的局部或全身递送媒介物。
在实例和附图以及以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将是明显的。重组腺病毒(Ad)，其包含(a)编码来自第一Ad株的六邻体多肽的Ad基因组，以及(b)编码来自一种或多种不同Ad株的至少一个六邻体多肽核酸的核酸，其中六邻体多肽的至少一个高变区(HVR)不同于由第一Ad株的Ad基因组编码的HVR。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中第一Ad株和一种或多种不同Ad株在血清型上是不同的。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中第一Ad株是人Ad6株，并且其中第二Ad株是人Ad57株。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其还包含编码靶向多肽，抗原，酶，受体，配体或标签的核酸。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中所述靶向多肽包含选自SEQ ID NO:1-41和SEQ ID NO:46-47的氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中所述重组Ad是可复制型Ad。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中可复制型Ad是单周期Ad或条件复制型Ad(CRAd)。
本发明的另一方面涉及这样的重组腺病毒(Ad)，其包含(a)来自第一Ad株的Ad衣壳多肽和(b)来自一种或多种不同Ad株的至少一个六邻体多肽，其中六邻体多肽的高变区(HVR)或衣壳多肽与第一Ad株的HVR或衣壳多肽不同。
本发明的另一方面涉及这样的重组腺病毒(Ad)，其包含(a)编码第一六邻体多肽的核酸和(b)编码第二六邻体多肽的核酸，其中第一六邻体多肽的氨基酸序列不同于第二六邻体多肽的氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中核酸编码的至少一个六邻体多肽不同于所述第二六邻体多肽的高变区的氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中所述核酸来自第一Ad株，并且其中所述第二六邻体多肽来自第二Ad株。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中所述第一Ad株是第一人Ad株，并且其中所述第二Ad株是不同于所述第一人Ad株的第二人Ad株。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中所述第一Ad株和所述第二Ad株在血清型上是不同的。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中所述第一Ad株是人Ad6株，并且其中所述第二Ad株是人Ad57株。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其还包含靶向多肽。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中所述靶向多肽包含氨基酸序列TARGEHKEEELI(SEQ ID NO:1)。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中所述重组Ad是可复制型Ad。
本发明的另一方面涉及这样的重组Ad，其中所述可复制型Ad是单周期Ad或条件复制型Ad(CRAd)。
本发明的另一方面涉及治疗患有癌症的哺乳动物的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用本文所述的重组腺病毒(Ad)。
本发明的另一方面涉及这样的方法，其中所述癌症选自前列腺癌，卵巢癌，肺癌，肝细胞癌，胰腺癌，肾癌，黑素瘤，脑癌，结肠癌，淋巴瘤，骨髓瘤，淋巴细胞性白血病和骨髓性白血病。
本发明的另一方面涉及这样的方法，其中所述施用包括全身施用。
本发明的另一方面涉及这样的方法，其中全身施用包括肌内，鼻内或静脉内施用。
本发明的另一方面涉及这样的方法，其中所述施用包括局部施用。
本发明的另一方面涉及这样的方法，其中所述局部施用包括瘤内注射。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管那些相似或等同于本文所述的方法和材料可用于实施本发明的方法，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在有冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不意图是限制性的。
附图和以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见的。
附图简述
图1示出背景特异性肽从噬菌体到腺病毒的翻译。A)包含Ad5纤毛HIβ片层的噬菌体展示文库的简图，所述片层在结构上限制了随机12-mer肽文库。下面显示Ad5 HVR5六邻体中β7和β8片层之间的结构相似位点的绘图。B)HI文库中12.51和12.52及其插入六邻体的HVR5时的位置的一级氨基酸比对。C)代表用肽修饰的Ad5 GFP-Luc表达病毒。
图2示出体外转导A)用104vp/细胞的所示载体感染C2C12细胞，感染后2天通过荧光显微镜检查GFP表达。B)用所示Ad的不同MOI感染后2天，来自C2C12细胞的荧光素酶活性。
图3示出在小鼠中的体内转导。A)通过静脉内(IV)或肌内(IM)途径注射后1天，小鼠的荧光素酶成像。IM注射的小鼠在每个四头肌中接受109vp。IV注射的小鼠通过尾静脉接受1010vp。B)在注射后所示天数通过成像定量荧光素酶活性。通过单向ANOVA，*p<0.05。通过单向ANOVA，***p<0.001。
图4示出在仓鼠中的体内转导。A)通过IM途径注射1010vp后1天，仓鼠肌肉中的荧光素酶活性。通过T检验，**p<0.01。
图5示出单次IM免疫后16周基于基因的免疫应答。IM注射后16周，对来自图3的小鼠进行采血，并通过ELISA以系列稀释液分析其血清以检测针对GFP蛋白的抗体。通过单向ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。通过单向ANOVA，****p<0.0001。与PBS组相比，在1：10,000至1：1000的血清稀释度下，所有注射Ad的小鼠均产生显著的抗GFP抗体。Ad5-GL-HVR-12.51和12.52与Ad5-GL的比较以黑色星号显示。Ad5-GL-HVR-12.51和Ad5-GL-HVR-12.52之间的比较以灰色星号显示。OD0.06处的灰色点划线表示区分不同于PBS组的抗体的95％置信区间。
图6示出人腺病毒血清型的全基因组序列的系统树。
图7示出显示六邻体和E3区变异的Ad5、Ad6和Ad57的比对。(A)Ad6和Ad57基因组的Pustell DNA比对。方框表示两种病毒之间变异最高的六邻体和E3区。(B)来自Ad5、Ad6和Ad57的六邻体蛋白中高变区的ClustalW氨基酸比对。用MacVector进行比对。
图8示出用Ad57 HVR替代Ad6 HVR构建Ad657的卡通图。缩写：HVR，高变区。
图9示出体外溶瘤活性。LNCaP和DU145细胞用所示病毒以所示vp/细胞处理5天。细胞用结晶紫染色，并通过OD595测量细胞活力。细胞活力(％)通过将样品的OD值除以相同96孔板上未经处理的对照细胞的均值OD值，并将该值乘以100来计算。(A)LNCaP细胞杀伤。(B)DU145杀伤。缩写：vp，病毒颗粒。
图10示出溶瘤Ad对肝脏损伤的影响。通过尾静脉向C57BL/6小鼠(每组n＝6)注射每种病毒1011vp。(A)Kaplan-Meier生存分析。(B)注射后3天抽血进行ALT测量(通过ANOVA，****p＜0.001)。缩写：ALT，丙氨酸转氨酶；vp，病毒颗粒。
图11示出单次i.v.施用后，Ad6和Ad657在裸鼠的DU145肿瘤异种移植物中的抗癌活性。用所示病毒以3×1010vp单剂量或用PBS i.v.注射具有已建立的DU145肿瘤的裸鼠(每组n＝9)。(A)单次i.v.注射对肿瘤生长的影响。用卡尺测量肿瘤尺寸，并将肿瘤体积计算为宽度2×长度×1/2。数据显示为均值±SE。通过如本文所述的ANOVA或通过T检验，*p<0.05，****p＝0.0001。黑色星号和向上黑色箭头指示在本文所述的选定日Ad6组和PBS组之间的统计差异。灰色星号和向上箭头指示在所示日Ad657组和PBS组之间的差异。带阴影的白色星号和向下灰色箭头指示在所示日Ad6和Ad657组之间的统计差异。(B)单次i.v.注射对存活的影响。当肿瘤体积达到2000μL或满足其他处死标准(如，溃疡)时，对动物实施安乐死并绘制Kaplan-Meier生存曲线(通过对数秩分析，*p<0.05，**p<0.01)。缩写：i.v.，静脉内。
图12示出荧光素酶成像的裸鼠。单次i.v.注射3×1010vp的Ad6和Ad657-GFP-Luc(缺失12.5K，6.7K，19K，11.6K(ADP)，10.4K(RIDα)，14.5K(RIDβ)和14.7K的部分和E4 34K部分缺失)后4天。缩写：i.v.，静脉内；vp，病毒颗粒。
图13示出荧光素酶成像的裸鼠。备注：单次i.v.注射3×1010vp的Ad657-GFP-Luc后14天。缩写：i.v.，静脉内；vp，病毒颗粒。
图14示出血浆HIV Env结合滴度。用不同SC-Ad和gp140蛋白免疫以大箭头显示在图上方。通过ELISA显示每只动物在每次免疫之前和之后的中点F8gp140结合滴度。虚线表示该测定中抗体的最小检测限。符号在每个时间点沿x方向分布以允许观测单个测量结果。SC-Ad6-Ebov是阴性对照Ad疫苗。这组动物没有用gp140加强。与SC-Ad6-Ebov组相比，通过单向ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图15示出血浆HIV中和滴度。利用TZM-b1中和测定对所示病毒进行中和。所有数值均与仅病毒的孔相比进行计算。每个点代表每只动物的均值。
图16示出血浆ADCC活性。用CD16-KHYG-1效应细胞测试血浆样品，以杀死CEM.NKR.CCR5.CD4+-Luc，其为用SHIVSF162P3感染的靶细胞。每个点代表每只动物的均值。通过单向ANOVA相比SC-Ad6-Ebov组，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。
图17示出粘膜ADCC活性。用CD16-KHYG-1效应细胞测试阴道冲洗液和唾液样品，以杀死CEM.NKR.CCR5.CD4+-Luc，其为用SHIVSF162P3感染的靶细胞。每个点代表每只动物的均值。通过单向ANOVA相比SC-Ad6-Ebov组，*p<0.05。
图18示出来自PBMC和淋巴结的IFN-γ分泌细胞。PBMC和淋巴结细胞由ELISPOT通过对IFN-γ染色进行分析。抗Env表示用保守的HIV Env肽和SC-Ad刺激的细胞。对每个刺激孔中的斑点形成细胞(SFC)的总数目进行计数并以对照培养基为背景进行调整。每个点代表每只动物的均值。通过单向ANOVA，*p<0.05。
图19示出粘膜T细胞运输和活化。从第二次蛋白加强后收集的直肠活检中收获T细胞，并通过流式细胞术分析CD4，CD8，α4β7整联蛋白，CD69和FoxP3。每个点代表每只动物的均值。
图20示出血液和淋巴结中的Tfh细胞应答。用HIV-1Env蛋白刺激第40周收集的PBMC和淋巴结细胞，然后检查CD3+，CD4+，CXCR5+和IL-21的共表达。每个点代表每只动物的均值。通过单向ANOVA，*p<0.05。
图21示出针对重复的直肠SHIVSF162P3攻击的保护。每周用4.3TCID50(对于恒河猴PBMC)的SHIVSF162P3对所示组进行直肠攻击。血浆样品进行SHIV病毒RNA拷贝分析。RNA拷贝高于10的动物被视为受感染，并将感染该动物所需的攻击次数用作用于Kaplan-Meier生存分析的事件。
图22示出SHIVSF162P3获得和病毒载量。A)将图8中的动物按其初始SC-Ad初免途径(IM或IN)分组产生8组，并进行Kaplan-Meier分析。B)在攻击研究过程中的血浆SHIVSF162P3病毒RNA水平。
图23示出组织中的SHIV病毒载量。收集来自PBMC和死后组织的RNA，并进行qPCR以检测分析SHIV病毒RNA。
图24示出实施例7中使用的单周期腺病毒疫苗。A)携带F8和G4进化枝B HIV包膜基因的SC-Ad血清型6和657的图。B)进化枝C Ad六邻体的比对，包括疫苗上展示的Ad6和57六邻体。
图25示出唾液和阴道HIVenv结合滴定。当针对F8测试时，显示所示样品在所示稀释度时的ELISA OD450水平。这些粘膜样品中的抗体水平低，无法达到测定的饱和度。为此，无法可靠地为大多数动物计算EC50值。IN-IM-IM组的恒河猴Rh13-091是唯一可计算EC50的动物(EC50＝4580)。在使用SF162gp140的ELISA中观测到相似的结果。
图26示出表达来自丙型肝炎和巨细胞病毒(CMV)gB的抗原基因的Ad657，产生体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。显示的是接种Ad657-HCV而非CMV gB的小鼠中对负载丙型肝炎肽的靶细胞的杀伤。
图27示出表达来自Ad657的人GMCSF诱导了GMCSF依赖性TF-1人成红血细胞的增殖。
图28是示出Ad6单次IV注射相对于A549肺肿瘤的图。
图29是示出Ad6单次IV或IT注射相对于Panc1胰腺肿瘤的图。
图30是示出免疫活性仓鼠中Ad6单次IV注射相对于肾癌的图。
图31是示出通过在六邻体的HVR5中展示12.51细胞结合肽的Ad在B16黑素瘤和A549肺肿瘤/癌细胞中的荧光素酶活性的图。
图32是示出通过在六邻体的HVR5中展示12.51细胞结合肽的Ad在肝细胞癌和肾癌中的荧光素酶活性的图。
图33示出将插入来自不同Ad血清型的各个HVR与插入细胞靶向/去靶向肽或新氨基酸如半胱氨酸到六邻体中组合来进行靶向化学修饰和屏蔽的图。描绘了嵌合HVR构建体，其组合来自不同Ad血清型的不同HVR以调节与细胞和血液因子的天然相互作用从而改善药理学，并与在不同HVR中插入细胞结合和细胞去靶向肽组合以改变细胞进入和细胞回避。如果从100个Ad中替代一个HVR，这会形成100种不同六邻体嵌合体。如果全部7个HVR各自接受不同的Ad HVR，此组合库会等于7100种变体。如果将一个1肽引入7个HVR，这会等于7X 7100种变体。如果将10个不同肽引入7个HVR，这会等于10X 7X7100种变体，以此类推。
图34示出代表性的组合的六邻体和肽组合的质粒图谱。示出的是具有来自Ad6的HVR1和来自Ad57的HVR 2-7的六邻体以及将细胞靶向肽插入个体HVR。
图35示出嵌合HVR构建体，其组合了来自不同Ad血清型的不同HVR以调节与细胞和血液因子的自然相互作用从而改善药理学，并组合了在不同HVR中插入细胞结合和细胞去靶向肽以改变细胞进入和细胞回避。在该示例中，将单个半胱氨酸氨基酸插入Ad657的HVR1和HVR5以调节药理学，并允许聚合物(如，聚乙二醇)或其他部分(如，成像剂如荧光团)的靶向缀合。
图36示出聚乙二醇(PEG)与Ad657-HVR1-C的缀合。A)有和无PEG化的Ad蛋白的SDS-PAGE。箭头示出尺寸由于PEG与六邻体的化学附着而增加。B)通过马来酰亚胺-PEG的靶向PEG化和非靶向NHS-PEG对病毒感染的作用。
图37示出聚乙二醇(PEG)与Ad657-HVR5-C的缀合。A)有和无PEG化的Ad蛋白的SDS-PAGE。B)有和无PEG化以及有和无近红外荧光成像标签IR800的Ad蛋白的SDS-PAGE的近红外成像。C)通过荧光素酶成像显示的腹膜内注射马来酰亚胺-PEG化的Ad657-HVR5-C后的体内转导。
图38示出裸鼠的荧光素酶成像。A)相对于远处的DU145前列腺肿瘤，单次I.V.注射Ad6治疗后的1，4，7，14，28和42天。B)向具有LNCaP前列腺肿瘤的小鼠I.V.注射复制型Ad5-GFPLUC后3、7和19天。
图39示出E1A基因中具有修饰的癌症特异性条件复制型Ad(CRAd)dl1101+dl1107的示意图。
图40是示出Ad6和Ad657均可用作靶向癌症疗法的CRAd的图。
图41是示出Ad治疗周期的示意图。A)利用Ad进行血清型转换的示意图。B)示例性治疗周期的示意图，其中可将Ad6和Ad657通过血清型转换结合共价聚合物缀合用于多轮治疗。
图42显示单次IV注射具有E3A基因中的缺失(12.5K，6.7K，19K，11.6K)但保留E3B基因(10.4K，14.5K和14.7K)和保留E4 34K的Ad6和Ad6-F35后，DU145前列腺肿瘤中的血清型转换和在靶荧光素酶活性。其肿瘤抵抗先前单次IV注射的具有完整E3基因的Ad657和CRAd657的小鼠通过单次IV注射来注射所示载体。
图43是可复制型Ad(RC-Ad)的示意图，其中E1表达受天然E1启动子控制；变体CRAd-Probasin-E1A(Ad-PB)，其中E1表达受前列腺特异性probasin启动子控制；CRAd-dl1101，其中消除p300途径结合，易感于正常细胞中的IFN途径；CRAd-dl1107，其中消除pRB结合允许病毒杀死具有RB途径破坏的癌细胞，但在RB+正常细胞中被阻抑；CRAd-dl1101/07，其中消除p300途径结合，易感于IFN途径，pRB结合被消除允许病毒杀死具有RB途径破坏的癌细胞，但在RB+正常细胞中被阻抑。
图44(A和B)示出用可复制型Ad5，Ad6，Ad657感染对非癌细胞的影响以及Ad6和Ad657的修饰为条件复制型Ad(CRAd)的影响。
图45显示可复制型Ad5，Ad6，Ad657和所示CRAd对癌细胞的杀伤。
图46显示将Ad6和Ad657修饰为条件复制型Ad(CRAd)。
图47显示将Ad6和Ad657修饰为条件复制型Ad(CRAd)。
图48显示可复制型Ad6或所示CRAd对小鼠中DU145肿瘤生长的体内作用。
图49显示在具有人前列腺肿瘤的小鼠中单次静脉内注射后，在体内具有完整E3区的可复制型Ad657和条件复制型Ad657-dl1101/07的体内作用。
图50显示PEG化在体内将腺病毒对肝脏去靶向。
图51显示用来自黑猩猩AdC68的更短纤毛修饰Ad657并且添加密码子摆动E4 34.K基因改变了体外功效。
图52显示有和无CRAd修饰的6/56/6病毒对人前列腺癌细胞的杀伤。
图53显示通过具有完整E3区的CRAd657-dl1101/07-FOLR的单次肌内免疫BALB/c小鼠后，产生针对人癌症抗原叶酸受体α的抗体应答。
图54描绘了可例如通过PEG化或具有生物素受体肽(BAP)的“BAP化”来修饰的AdHVR上的位点。
图55是具有E1蛋白中的突变以将病毒转化为条件复制型Ad(CRAd)的Ad的变体的示意图。
图56示出野生型E1A多肽的N末端部分和CRAd变体dl1101，dl1107和dl1101/1107的E1AN末端的氨基酸序列。
图57示出Ad种类C中的示例Ad6和Ad种类D中的示例Ad26中的不同E3免疫逃避基因的的示意图。这两个Ad都表达E3 12.5K，6.7K，19K，10.4K(RIDα)，14.5K(RIDβ)和14.7K基因的大小和序列变体，并描述了这些E3编码蛋白的功能。
图58显示免疫活性仓鼠中通过Ad6-Luc病毒的PEG化和E3缺失对溶瘤病毒抗肿瘤活性的影响。Ad6-Luc和Ad6-Luc-20K PEG均具有全部E3基因和E434K完整。Ad6-deltaE3-Luc具有E3 12.5K和E4 34K的部分缺失，以及E3 6.7K，19K，11.6K(ADP)，10.4K(RIDα)，14.5K(RIDβ)和14.7K基因的完全缺失。当溶瘤腺病毒中不存在这些免疫逃避基因时，溶瘤功效在这种免疫活性动物模型中丧失。
图59是Ad657的质粒图谱，其中E3 12.5K和E4 34K部分缺失，而且E36.7K，19K，11.6K(ADP)，10.4K(RIDα)，14.5K(RIDβ)和14.7K基因完全缺失。
图60描绘了具有和不具有dl1101/1107CRAd修饰以及具有和不具有所选E3免疫逃避基因的缺失的CRAd 657构建体。
图61描绘了具有E3插入位点的CRAd657。这些具有和不具有本文所述的dl1101/1107CRAd修饰，并且具有和不具有E3免疫逃避修饰。
图62描绘了CRAd657+/-Ad35纤毛或黑猩猩C68纤毛+/-K7肽。这些具有和不具有先前图片中描述的dl1101/1107CRAd修饰，并且具有和不具有E3免疫逃避修饰。在一些情况下，在E4之后和纤毛之前包含密码子摆动E4 34K基因，以补偿E3B基因缺失时E4 34K部分缺失。
图63描绘了CRAd657+/-Ad35纤毛或黑猩猩C68纤毛+/-K7肽。这些具有和不具有先前图片中描述的dl1101/1107CRAd修饰，并且具有和不具有E3免疫逃避修饰。
图64描绘了表达叶酸受体α的CRAd657+/-Ad35纤毛或黑猩猩C68纤毛+/-K7肽。
图65描绘了表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的CRAd657+/-Ad35纤毛或黑猩猩C68纤毛+/-K7肽。
图66描绘了在一种病毒中表达4-1BBL或GMCSF或IL21或CD40L及组合的CRAd657+/-Ad35纤毛或黑猩猩C68纤毛+/-K7肽。
图67描绘了具有Ad6 HVR1和Ad57 HVR2-7的Ad6/57+/-Ad35纤毛或黑猩猩C68纤毛+/-K7肽。
图68描绘了具有Ad6 HVR1，Ad57 HVR2-6，Ad6 HVR7的Ad6/57/6+/-Ad35纤毛或黑猩猩C68纤毛+/-K7肽。
图69描绘了表达GFP荧光素酶的具有Ad6 HVR1，Ad57 HVR2-6，Ad6HVR7的Ad6/57/6+/-Ad35纤毛或黑猩猩C68纤毛+/-K7肽。
图70示出血清型转换后的荧光素酶成像。通过单次IV注射Ad657或CRAd657治疗体侧具有LNCaP前列腺肿瘤的小鼠。单次IV注射后5个月有残留肿瘤的小鼠，通过血清型转换表达GFP荧光素酶的所示Ad6/57/6变体(具有和不具有变体纤毛和密码子优化的E4 34K基因)进行治疗。所示Ad6/57/6变体包括具有不同纤毛蛋白修饰(包括在纤毛蛋白上添加7个赖氨酸(K7)，将黑猩猩C68纤毛蛋白接枝到Ad6纤毛蛋白上在其KKTK柔性结构域之后，以及具有Ad35纤毛蛋白)的Ad6/57/6病毒。7天后对小鼠进行荧光素酶活性成像。
图71示出用具有和不具有变体纤毛蛋白和密码子优化的E4 34K基因的Ad549/57/6以所示病毒颗粒(vp)/细胞处理的A549人肺癌细胞。7天后，将细胞用结晶紫染色，并在读板仪中分析孔。高OD值表示存在活细胞。低OD表示粘附细胞死亡和损失。
发明详述
本发明提供了用于核酸递送、接种疫苗和/或治疗癌症的方法和材料。例如，本发明提供了利用一种或多种重组Ad(如，Ad657及其变体)作为溶瘤剂用于蛋白/多肽的核酸递送、接种疫苗和/或治疗癌症的方法和材料。
腺病毒二十面体由其六邻体蛋白的720个拷贝组成。该病毒不利用此蛋白来结合受体，但是这种重复蛋白的纳米晶格提供了与蛋白、细胞和药物的相互作用(如，天然相互作用和非天然相互作用)的基质。能够中和Ad的抗体可靶向Ad上的六邻体多肽的高变区(HVR)。
在一些情况下，本发明提供了具有溶瘤抗癌活性的重组Ad。例如，重组Ad可源自第一Ad，并且可包括来自一种或多种不同Ad的六邻体HVR。HVR可源自任何种类C的Ad，例如Ad1，Ad2，Ad5，Ad6和Ad57。在实施方案中，重组Ad可源自第一Ad，并且可包括来自至少一种其他Ad的一个或多个六邻体HVR，其中至少一个六邻体HVR不同于第一Ad的HVR(一个或多个)。第一Ad株可以是人Ad6株，第二Ad株可以是人Ad57株。六邻体穿梭质粒图谱(图34)显示向六邻体插入来自不同Ad血清型的个体HVR和插入细胞靶向/去靶向肽或新氨基酸(如，半胱氨酸)的组合以进行靶向化学修饰和屏蔽。在一个实施方案中，重组Ad包含氨基酸取代，如多肽中的半胱氨酸取代，以及修饰如PEG化和BAP化。本文证明了将聚合物和其他化学修饰靶向到Ad657六邻体中插入的半胱氨酸的能力。
证明了Ad657作为针对人前列腺癌的溶瘤剂。将Ad6 HVR替换为来自Ad57的HVR，以产生被称为Ad657的嵌合种类C溶瘤病毒。Ad657和Ad6作为全身溶瘤疗法通过单次i.v.注射具有人癌瘤的裸鼠进行了测试。可将Ad657用作癌症的局部或全身溶瘤病毒疗法。这些数据还证明用溶瘤种类C Ad进行血清型转换的惊人效果。
在一些情况下，本发明提供了利用本文提供的一种或多种重组Ad来治疗患有癌症、感染性疾病和/或遗传性疾病或处于患有这些疾病的风险中的哺乳动物的方法。例如，可将一种或多种重组Ad施用于患有癌症或处于患癌风险的哺乳动物，以减少哺乳动物(如，人)中的癌细胞数目(如，通过感染和杀死癌细胞)。例如，可将一种或多种重组Ad施用于患有癌症或处于患癌风险的哺乳动物，以刺激哺乳动物(如，人)中的抗癌免疫应答。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657及其变体)不被哺乳动物的免疫系统破坏。例如，重组Ad不被施用了重组Ad的哺乳动物中的抗原呈递细胞(APC)，巨噬细胞和/或其他免疫细胞破坏。
在一些情况下，可施用本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657及其变体)进行多轮(如，两轮或更多轮)治疗。例如，本文所述的第一重组Ad可避免能够中和本文所述的第二重组Ad的抗体，反之亦然。在用本文所述的一种或多种重组Ad治疗患有癌症的哺乳动物的情况下，可向哺乳动物施用第一重组Ad进行第一轮治疗，然后可施用第二重组Ad进行第二轮治疗。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657及其变体)可以是可复制型Ad(RC-Ad)。例如，RC-Ad可以是包含编码E1多肽的核酸的RC-Ad(如，E1+RC-Ad)。例如，RC-Ad可以是单周期Ad(SC-Ad)，其包括编码与感染性病毒后代相关的一种或多种多肽的一个或多个核酸(如，pIIIa和E3)的缺失。例如，RC-Ad可以是条件复制型Ad(CRAd)。单周期Ad的示例以及如何制备和应用它们的示例在其他地方提供(国际专利申请公开号WO2009/111738)。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657及其变体)可以是复制缺陷型Ad(RD-Ad)。例如，RD-Ad可以是包含编码E1多肽的核酸缺失的RD-Ad(如，E1缺失型RD-Ad)。
本文实施例证明，CRAd 657及其变体在癌细胞中是条件复制型Ad(CRAd)，并且用CRAd 657及其变体感染细胞降低细胞活力和肿瘤体积。因此，可将CRAd 657及其变体在患有癌症的受试者中用作局部或全身性溶瘤病毒疗法。
而且，证明了可将CRAd用于表达抗原并用作针对病毒如针对人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)和丙型肝炎病毒(HCV)进行疫苗接种的疫苗。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657及其变体)可结合细胞表面受体(如，促进病毒进入细胞)。例如，本文所述重组Ad可结合柯萨奇-腺病毒受体(CAR)和/或Fc受体(如，FcμR和FcγR)、补体受体(如，CR3和/或C2qR)。
本发明的一方面，CRAd可包含编码与Ad异源的多肽的核酸，所述多肽例如抗原、细胞表面受体、细胞靶向多肽等。例如，CRAd-657-dl1101/1107-FolR是包含完整E3并表达人叶酸受体α的重组Ad。本文证明可将CRAd用于产生针对已知癌症抗原例如叶酸受体α的抗体。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)能避免结合(如不结合)清道夫(scavenger)受体(如，以促进病毒进入细胞)。例如，本文所述重组Ad避免结合SREC受体和/或SR-A受体。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)能避免吞噬作用。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)是非致病性的(如，对于如本文所述被治疗的哺乳动物)。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)能感染分裂细胞(如，仅能感染分裂细胞)。
本文所述重组Ad可以是通过重组DNA技术和本领域技术人员已知的方法产生的任何合适的重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad)。重组Ad可以是通过重组来自除重组Ad所源自的Ad之外的任何生物体的物质(如，核酸和/或多肽)而产生的任何Ad。例如，重组Ad可包括天然不存在于该Ad中(如，在重组之前天然不存在于该Ad中)的一种或多种物质。在一些情况下，本文提供的重组Ad可以是嵌合Ad(如，可包括来自两种或更多种(如，两种，三种，四种，五种或更多种)不同Ad基因组的病毒元件)。
已将这些实施方案应用于组合来自不同Ad的不同HVR(即，混排HVR)的Ad的背景中。例如，Ad6的HVR1与Ad57的HVR2-7，或Ad6的HVR1和7与Ad57的HVR2-6，或者来自Ad6的HVR1和7与来自Ad657的HVR2-6。
Ad中非天然存在的核酸和/或多肽可来自任何合适的来源。在一些情况下，该Ad中非天然存在的核酸和/或多肽可来自非病毒生物体。在一些情况下，在该Ad中非天然存在的核酸和/或多肽可来自Ad以外的病毒。在一些情况下，该Ad中非天然存在的核酸和/或多肽可来自获自不同种类的Ad。在一些情况下，该Ad中非天然存在的核酸和/或多肽可来自不同的Ad株(如，血清型不同的株)。在一些情况下，该Ad中非天然存在的核酸和/或多肽可以是合成核酸和/或合成多肽。
本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)可源自任何合适的Ad(如，可包括来自任何合适的Ad的基因组骨架)。在一些情况下，本文所述重组Ad可源自具有低血清阳性率的Ad。例如，50％或更少(如，50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％或更少)的哺乳动物(如，人)可能已暴露于衍生本文所述重组Ad的Ad。关于血清阳性率，种类C腺病毒Ad6和Ad657的阳性率低于原型Ad5病毒。在一些情况下，本文所述重组Ad可源自具有减少或消除的副作用(如，吞噬作用和肝损伤)的Ad。重组Ad可源自从任何合适的动物物种分离的Ad。例如，Ad可分离自人，非人灵长类动物(例如猴如旧大陆猴物种，例如恒河猴)，鱼类，蛙类和蛇类。在一些情况下，本文所述重组Ad可源自人Ad(HAd或HAdV)。重组Ad可源自任何种类的Ad(如，A，B，C，D，E，F或G)。在一些情况下，本文所述重组Ad可源自种类C Ad(如，人种类C Ad(HAd-C))。重组Ad可源自任何合适的Ad血清型(如2、5、6或57)。在一些情况下，本文所述重组Ad可源自Ad血清型6(Ad6；如人Ad6)。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657及其变体)可包含含有对编码多肽(或其片段)和/或一种或多种Ad基因组的病毒元件的一个或多个核酸进行一个或多个修饰的Ad基因组。一个或多个修饰可以是任何适当的修饰。在一些情况下，修饰可有效抑制经修饰的多肽结合另一多肽如p300和/或pRB的能力。在一些情况下，修饰可有效中和一种或多种干扰素途径。可对编码多肽或病毒元件的核酸进行修饰的实例包括但不限于取代、缺失、插入和突变。
Ad，如Ad657及其变体，可被修饰并保留全部E1A基因，或被修饰以缺失其编码蛋白的选定区域和功能。
图57显示Ad种类C示例Ad6和Ad种类D示例Ad26中不同E3免疫逃避基因的示意图，以及描述这些E3编码蛋白的功能。这两种Ad都表达E3 12.5K，6.7K，19K，10.4K(RIDα)，14.5K(RIDβ)和14.7K基因的大小和序列变体。19K减少MHC I和MIC蛋白在细胞表面的展示，从而保护受感染细胞免受T细胞和NK细胞的伤害。RID蛋白保护受感染细胞免于诱导死亡的配体(FAS，TRAIL，TNFR和EGFR)的影响。14.7K抑制受感染细胞中凋亡的内在激活。种类C Ad也表达11.6K，被称为腺病毒死亡蛋白(ADP)。ADP的过表达加速细胞死亡，但总体细胞死亡是相等的。种类D病毒还表达两种新的变体，被称为49K和31K。49K的分泌形式与T细胞和NK细胞上的CD46结合，导致这些细胞的下调和NK细胞对I类MHC缺陷型细胞的细胞杀伤效率较低。已对Ad657质粒进行修饰以保留所有天然E3免疫逃避基因(12.5K，6.7K，19K，11.6K(ADP)，10.4K(RIDα)，14.5K(RIDβ)和14.7K)和E4 34K或以缺失选定区域。Ad657及其变体还通过添加49K和31K进行修饰，以向这些种类C病毒平台提供这些额外功能。
可修饰Ad如Ad657及其变体以保留全部E3免疫逃避基因，或缺失选定区域和其编码蛋白的功能。关于E3突变：19k下调感染细胞上的MHCI和MIC蛋白；ADP过表达加速细胞死亡，但不增加被杀死的细胞数目；10k和14k蛋白(RIDα和RIDβ)组合以阻断外源性凋亡蛋白(如，FAS，TRAIL，TNF，TNFR和EGFR)的细胞杀伤；14.7k蛋白抑制内在细胞凋亡信号传导。
保留这些E3蛋白可使溶瘤持续更长的时间，而使其缺失可增加免疫刺激。
测试溶瘤功效的数据表明完整E3介导更好的功效。
DE3构建体缺失了12.5k的一部分且包含14.7k，DE3A构建体缺失了E312.5k的一部分且包含19k，以及DE3ADP构建体缺失了E3 12.5k的一部分且包含ADP。
令人惊讶地，缺失所有E3基因使溶瘤病毒在阻抑肿瘤生长方面的有效性变低。
在实施方案中，本发明涵盖单周期腺病毒，如SC-Ad657及其变体。评估具有编码多肽的异源核酸的重组SC-Ad病毒用作疫苗。仅单次免疫后，SC-Ad657疫苗本身就产生针对HIV包膜蛋白的显著的循环抗体滴度。
类似地，携带乙型和丙型肝炎抗原基因的Ad657能够产生针对肝炎和巨细胞病毒的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
通过将来自人乳头瘤病毒的合成肽插入HVR5来修饰Ad657。在一个实施方案中，变体Ad657-HVR5-HPV六邻体的氨基酸序列以SEQ ID NO:57定义。修饰允许展示该抗原用于疫苗目的，以及通过结合与HPV肽相互作用的蛋白而重新靶向。
在另一实施方案中，本文证明Ad657表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
因此，从本文实例中，证明了重组Ad如Ad657及其变体可用于表达异源蛋白，如多肽抗原和细胞靶向多肽。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)可包含含有一个或多个取代的Ad基因组。例如，可取代编码多肽(或其片段)的一个或多个核酸和/或由Ad基因组编码的一个或多个病毒元件。取代可以是任何适当的取代。在一些情况下，可将编码第一Ad的基因组的衣壳多肽的一个或多个核酸取代为编码第二Ad的衣壳多肽的一个或多个核酸，以产生嵌合Ad。例如，当重组Ad包括来自第一Ad的基因组，其中将该基因组中编码衣壳多肽的核酸取代为编码来自第二Ad(如，不同于Ad骨架的Ad)的衣壳多肽的核酸时，编码形成第二Ad的衣壳多肽的核酸可表达一个或多个衣壳多肽，并且表达的衣壳多肽(一种或多种)可掺入重组Ad的衣壳中。衣壳多肽的示例包括但不限于六邻体多肽，纤毛多肽，五邻体基质多肽，IIIa多肽，IX多肽和pVI多肽。
Ad纤毛蛋白是三个明显相同亚基的复合物，其介导初始细胞附着步骤。天然Ad6纤毛蛋白包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列，并结合CAR。
本发明的一方面，产生了纤毛经修饰的重组和嵌合Ad，其具有对于亲本或“骨架”Ad而言非天然的纤毛蛋白。
一种嵌合Ad即AdF35纤毛嵌合体具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列，并且比Ad5和Ad6纤毛蛋白更短，并将病毒重新靶向CD46。
一种纤维经修饰的重组Ad，其包含具有SEQ ID NO:62的序列的K7纤毛，将病毒靶向于细胞上的硫酸肝素蛋白聚糖和负电荷。
一种重组嵌合Ad，6/FC68纤毛包含SEQ ID NO:63的序列，是具有来自黑猩猩腺病毒C68的纤毛蛋白的嵌合Ad。该纤毛蛋白比Ad5或Ad6纤毛蛋白更短，并结合CAR。
一种重组嵌合Ad，6/FC68-K7纤毛包含SEQ ID NO:64的序列，是具有来自黑猩猩腺病毒C68的纤毛蛋白的嵌合Ad。该纤毛蛋白比Ad5或Ad6纤毛蛋白更短。6/FC68-K7纤毛结合CAR，并被重新靶向于硫酸肝素和负电荷。
一种重组嵌合Ad，6/FC68-HI-K7纤毛包含SEQ ID NO:65的序列，是具有来自黑猩猩腺病毒C68的纤毛蛋白的嵌合Ad。该纤毛蛋白比Ad5或Ad6纤毛蛋白更短。6/FC68-HI-K7纤毛结合CAR，并被重新靶向于硫酸肝素和负电荷。
在一些情况下，重组Ad可包括来自第一Ad的基因组，其中该基因组中编码六邻体多肽的核酸(如，编码六邻体多肽的核酸的HVR)被来自第二Ad的编码六邻体多肽的核酸(如，编码六邻体多肽的核酸的HVR)取代。在一些情况下，本文所述重组Ad可包含来自第一Ad的基因组，其具有一个或多个HVR被来自第二Ad的一个或多个HVR取代。例如，重组Ad可以是嵌合体，特别是Ad657(如，可包括Ad6基因组，其中六邻体HVR被取代为Ad57六邻体HVR)。在重组Ad包括来自第一Ad的基因组，其中基因组中编码六邻体多肽的核酸被来自第二Ad的编码六邻体多肽的核酸取代的情况下，重组Ad可包括来自第二Ad的约1至约720个六邻体多肽。例如，当重组Ad为Ad657时，Ad657可包含Ad6基因组和720个包含Ad57六邻体HVR的六邻体多肽。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)可包括含有一个或多个核酸缺失的Ad基因组。核酸缺失可以是任何合适的核酸缺失。核酸缺失可以是完全缺失(如，缺失编码多肽的核酸)或部分缺失(如，缺失编码多肽的核酸中的一个或多个核苷酸)。核酸缺失可减少或消除由缺失核酸编码的多肽的转录和翻译。可缺失任何合适的核酸。在一些情况下，可缺失编码与传染性后代产生有关的多肽的核酸。可在本文所述重组Ad中缺失和/或修饰的核酸的示例可编码E1(如，E1A和E1B)，E2，E3，E4，pIIIA，纤毛，E1B，并且包括病毒增强子和启动子。例如，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)可包括Ad基因组，其包含编码E1多肽的核酸中的一个或多个核苷酸的缺失。在一些情况下，本文所述重组Ad可包含编码E1多肽的核酸中的一个或多个取代。
在特定实施方案中，本文所述重组Ad经修饰以包含probasin启动子，其包含例如SEQ ID NO:48的核酸；将本文所述重组Ad修饰为包含编码E1多肽的核酸中的dl1101缺失；将本文所述重组Ad修饰为包含编码E1多肽的核酸中的dl1107缺失；将本文所述重组Ad修饰为包含dl1101缺失和dl1107缺失。关于E1A多肽(如，野生型Ad E1A和CRAd-657-dl1101，CRAd-657-dl1107和CRAd-657-dl1101/1107变体)的N末端氨基酸序列，请参见本文的实例和图56。
在一个实施方案中，变体CRAd-657-dl1101/1107-FolR包含完整E3并表达癌细胞上可见的人叶酸受体α。
通常，可将Ad修饰为包括本文所述的CRAd修饰。
在一些情况下，本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)可包括含有一个或多个核酸插入的Ad基因组。例如，核酸插入物可包括编码多肽的核酸。可将核酸插入本文所述重组Ad的基因组的任何合适位置。在一些情况下，可将编码多肽的核酸插入本文所述重组Ad的基因组的HVR(如，HVR5环)。例如，当将编码多肽的核酸插入本文所述重组Ad的基因组的HVR时，所述编码多肽的核酸可表达一个或多个多肽，并且可将表达的多肽(一种或多种)掺入重组Ad的衣壳中。在将编码多肽的核酸插入本文所述重组Ad的基因组的HVR的情况下，重组Ad可在其表面呈递由插入的核酸编码的约1个至约720个多肽。核酸插入物可以是编码任何合适的多肽的核酸。在一些情况下，核酸插入物可编码多肽抗原。
在一些情况下，核酸插入物可编码靶向多肽。可包含在本文所述重组Ad中的靶向多肽的示例包括但不限于肽12.51(TARGEHKEEELI；SEQ ID NO:1)，肽12.52(LRQTGAASAVWG；SEQ ID NO:2)，12.53(ARRADTQWRGLE；SEQ ID NO:3)，VSV(GTWLNPGFPPQSCGYATVT；SEQ IDNO:4)，RGD(CDCRGDCFC；SEQ ID NO:5)，α4整联蛋白结合肽(NMSLDVNRKA；SEQ ID NO:6)，Met3-4(ISLSSHRATWVV；SEQ ID NO:7)，L10.1F(WTMGLDQLRDSSWAHGGFSA；SEQ ID NO:8)，L10.1RGDF(WTMGLDQLRGDSSWAHGGFS；SEQ ID NO:9)，L10.2F(RSVSGTEWVPMNEQHRGAIW；SEQID NO:10)，L10.5F(TELRTHTSKELTIRTAASSD；SEQ ID NO:11)，S5.1(DRAIGWQDKLYKLPLGSIHN；SEQ ID NO:12)，DU9C.1(MGSWEKAALWNRVSASSGGA；SEQ ID NO:13)，DU9C.2(MAMGGKPERPADSDNVQVRG；SEQ ID NO:14)，DU9A.7(MASRGDAGEGSTQSNTNVPS；SEQID NO:15)，XS.1(GPEDTSRAPENQQKTFHRRW；SEQ ID NO:16)，REDVmyc(MGREDVGEQKLISEEDLGGS；SEQ ID NO:17)，RGD-4C(ACDCRGDCFCG；SEQ ID NO:18)，REDV-4C(ACDCREDVCFCG；SEQ ID NO:19)，SKBR5C1(GQIPITEPELCCVPWTEAFY；SEQ ID NO:20)，231R10.1(PQPPNSTAHPNPHKAPPNTT；SEQ ID NO:21)，HepaCD8(VRWFPGGEWGVTHPESLPPP；SEQID NO:22)，K20(KKKKKKKKKKKKKKKKKKK；SEQ ID NO:23)，BAP(GLNDIFEAQKIEWH；SEQ ID NO:24)，CALM BP(CAAARWKKAFIAVSAANRFKKIS；SEQ ID NO:25)，EBV(EDPGFFNVEIPEFP；SEQ IDNO:26)，#1-5(GGHGRVLWPDGWFSLVGISP；SEQ ID NO:27)，##4*-5(MARTVTANVPGMGEGMVVVPC；SEQ ID NO:28)，1-1(GVSKRGLQCHDFISCSGVPW；SEQ ID NO:29)，1-2(NQSIPKVAGDSKVFCWWCAL；SEQ ID NO:30)，1-3(QSTPPTKHLTIPRHLRNTLI；SEQ ID NO:31)，1-4(DMSFQLVTPFLKALPTGWRG；SEQ ID NO:32)，1-5(GGHGRVLWPDGWFSLVGISP；SEQ ID NO:33)，1-5con(FSLVGISP；SEQ ID NO:34)，1-6(QIMMGPSLGYYMPSESIFAY；SEQ ID NO:35)，2-11(ISWDIWRWWYTSEDRDAGSA；SEQ ID NO:36)，2-14(VWGMTTSDHQRKTERLDSPE；SEQ ID NO:37)，2-20(MTSAQTSEKLKAETDRHTAE；SEQ ID NO:38)，2-9(MGSRSAVGDFESAEGSRRP；SEQ ID NO:39)，3b-6(MGRTVQSGDGTPAQTQPSVN；SEQ ID NO:40)，4*-5(MARTVTANVPGMGEGMVVVP；SEQ IDNO:41)，CLL肽，PD-1，GLA多肽(如，因子X)，抗原基因，融合蛋白，融合生成性糖蛋白，单链抗体和来自其他病毒的衣壳蛋白。靶向多肽可靶向任何合适的细胞类型。可被包括于本文所述重组Ad中的靶向多肽靶向的细胞类型的示例包括但不限于肌细胞(如，骨骼肌细胞)，肿瘤，癌细胞，肾细胞，肝细胞，粘膜细胞，碳水化合物和细胞膜。
实例证明在噬菌体文库上相容结构背景中选择的肽可被翻译到Ad六邻体蛋白中。例如，对于12.51肽，该插入位点增加了肌肉转导，同时降低肝脏中的脱靶感染。因此，这种靶向肌肉组织的重组Ad可用作载体用于基于基因的肌肉接种疫苗或用于基因治疗应用/递送至肌肉。
在一些情况下，核酸插入物可使病毒去靶向(如，通过破坏给定HVR上发生的细胞和蛋白相互作用)。在一些情况下，核酸插入物可编码可检测的标记。可检测标记的示例包括但不限于荧光团(如，绿色荧光蛋白(GFP)，mCherry和mBFP)和酶(如，荧光素酶，DNA酶，蛋白酶，转运蛋白和聚合酶)。
本文还提供了含有本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657及其变体)的表达载体。表达载体可将本文所述重组Ad运载至另一细胞(如，癌细胞)，在其中它可被复制和/或表达。表达载体，通常也称为表达构建体，通常是具有控制特定核酸表达的增强子/启动子区的质粒或载体。将表达载体引入细胞后，其可利用细胞蛋白合成机制在细胞中产生病毒。在一些情况下，含有本文所述重组Ad的表达载体可以是病毒载体。例如，包含本文所述重组Ad的表达载体可以是逆转录病毒载体。在一些情况下，还可设计包含本文所述重组Ad的表达载体，以允许插入一个或多个转基因(如，在多克隆位点处)。例如，包含本文所述重组Ad的表达载体还可包含编码可检测标记的核酸。可检测标记的示例包括但不限于荧光团(如，绿色荧光蛋白(GFP)，mCherry和mBFP)和酶(如，荧光素酶，重组酶，核酸酶和转录因子)。
本发明还提供了利用一种或多种本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)的方法和材料。在一些情况下，可将本文提供的重组Ad用于治疗患有癌症或处于患癌风险的哺乳动物。例如，用于治疗患有癌症或处于患癌风险的哺乳动物的方法可包括向该哺乳动物施用一种或多种本文所述重组Ad。在一些情况下，用于治疗患有癌症或处于患癌风险的哺乳动物的方法可包括向哺乳动物施用一种或多种编码本文所述重组Ad的表达载体或编码本文所述重组Ad的核酸。在一些情况下，可向哺乳动物施用一种或多种本文所述的重组Ad，以减少哺乳动物中癌细胞的数量(如，阻抑和/或延迟肿瘤生长)和/或以增加哺乳动物的存活。
证明了通过血清型转换溶瘤腺病毒来靶向癌性肿瘤。通过静脉内(IV)注射Ad657一次来治疗在其侧面具有DU145或LNCaP前列腺肿瘤的小鼠。用具有纤毛修饰并表达GFP荧光素酶的替代Ad6或Ad6/57/6溶瘤病毒变体对这些小鼠第二次进行治疗，并通过成像测量荧光素酶活性。Ad6具有Ad6六邻体和靶向CAR的纤毛。Ad6-F35具有Ad6六邻体和靶向CD46的Ad35纤毛。Ad6/57/6具有来自Ad6的HVR1和7，以及来自Ad57的HVR2-6。Ad6/57/6病毒具有Ad6纤毛，AdC68纤毛或Ad35纤毛。图9中的这些数据显示用靶向肿瘤且肝脏的脱靶感染更低的病毒进行血清型转换溶瘤的惊人能力。
在血清型转换的另一示例中，通过单次静脉内(IV)注射Ad657或CRAd657来治疗在其侧面具有LNCaP前列腺肿瘤的小鼠。5个月后，用表达GFP荧光素酶和纤毛变体K7(添加了7个赖氨酸)，F35(具有Ad35纤毛)或KKTK-C68(Ad6 KKTK柔性结构域之后融合黑猩猩C68纤毛)的替代Ad6/57/6溶瘤病毒对些小鼠再次进行治疗。KKTK-C68病毒还添加密码子优化的E434K基因以提高病毒生产力。通过成像测量荧光素酶活性。所有Ad6/57/6均具有六邻体，其具有来自Ad6的HVR1和7与来自Ad57的HVR 2-6。Ad6/57/6和KKTK-C68具有靶向CAR的纤毛。Ad6/57/6-F35具有靶向CD46的Ad35纤毛。K7增加与细胞负电荷的结合，包括结合硫酸肝素蛋白聚糖。图70表明用靶向肿瘤且肝脏的脱靶感染更低的病毒进行血清型转换溶瘤的能力。
可如本文所述治疗患有或有风险患有癌症、传染病和/或遗传病的任何合适的哺乳动物。例如，如本文所述，可对患有癌症、传染病和/或遗传病的人，非人灵长类动物(如，猴)，马，牛类，猪类，狗，猫，小鼠，大鼠和饲养动物进行癌症的治疗。在一些情况下，可治疗患有癌症的人。在一些情况下，如本文所述治疗的哺乳动物(如，人)不是用于产生本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)的Ad的天然宿主。例如，用本文所述重组Ad657治疗的人可能缺乏对Ad6的任何预先存在的获得性免疫。
具有任何类型癌症的哺乳动物可如本文所述进行治疗。在一些情况下，癌症可包括一种或多种实体瘤。在一些情况下，癌症可以是血液癌。可如本文所述进行治疗的癌症的示例包括但不限于前列腺癌，卵巢癌，肺癌，肝细胞癌，胰腺癌，肾癌，黑素瘤，脑癌，结肠癌，淋巴瘤，骨髓瘤和白血病(如，淋巴细胞性白血病和骨髓性白血病)。
在一些情况下，本文所述方法还可包括鉴定哺乳动物患有癌症。用于鉴定哺乳动物患有癌症的方法的示例包括但不限于体检，实验室化验(如，血液和/或尿)，活检，影像学检查(如，X光，PET/CT，MRI和/或超声)，核医学扫描(如，骨骼扫描)，内窥镜检查和/或基因测试。一旦被鉴定为患有癌症、传染病和/或遗传病，就可向哺乳动物施用或指导自我施用一种或多种本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)或编码一种或多种本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)的核酸(如，表达载体)。
一种或多种本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)可通过任何合适的途径施用。在一些情况下，施用可以是局部施用。在一些情况下，施用可以是全身施用。施用途径的示例包括但不限于静脉内，肌内，皮下，口服，鼻内，吸入，经皮，肠胃外，肿瘤内，经输尿管(retro-ureter)，囊下，阴道和直肠施用。在施用多轮治疗的情况下，第一轮治疗可包括通过第一途径(如，静脉内)向哺乳动物(如，人)施用一种或多种本文所述重组Ad，以及第二轮治疗可包括通过第二途径(如，肌内)向哺乳动物施用一种或多种本文所述重组Ad。
如本文所用，术语“药物组合物”是指一种或多种本发明的重组和/或嵌合Ad与惰性或活性载体的组合，使得该组合物特别适合于治疗用途。可将一种或多种本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)配制成组合物(如，药物组合物)，以施用于哺乳动物(如，患有或有风险患有癌症的哺乳动物)。例如，可将一种或多种重组Ad配制成药学上可接受的组合物，以施用于患有癌症或处于患癌风险的哺乳动物。在一些情况下，可将一种或多种重组Ad与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。可配制用于以固体或液体形式施用的药物组合物，包括但不限于无菌溶液，悬浮液，缓释制剂，片剂，胶囊剂，丸剂，散剂，薄饼和颗粒剂。可用于本文所述药物组合物的药学上可接受的载体，填充剂和媒介物包括但不限于盐水(如，磷酸盐缓冲盐水，离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，缓冲物质例如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质类，例如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂，合适的药物载体描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences”(E.W.Martin，第18版)。合适的赋形剂的选择和使用教导于Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro编,第20版，Lippincott Williams&Wilkins 2003)。
可将包含一种或多种本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657)的组合物(如，药物组合物)作为疫苗施用于哺乳动物(如，患有癌症或处于患癌风险的哺乳动物)。疫苗可以是预防性或治疗性的。
在一些情况下，本文所述方法还可包括向哺乳动物(如，患有癌症的哺乳动物)施用用于治疗癌症的一种或多种其他药剂/手段。用于治疗癌症的一种或多种其他药剂/手段可包括任何合适的癌症治疗。在一些情况下，癌症治疗可包括手术。在一些情况下，癌症治疗可包括放射疗法。在一些情况下，癌症治疗可包括药物疗法的施用，例如化学疗法，激素疗法，靶向疗法和/或细胞毒性疗法。例如，可向患有癌症的哺乳动物施用一种或多种本文所述重组Ad(如，具有溶瘤抗癌活性的重组Ad，例如重组Ad657及其变体)，并施用用于治疗癌症的一种或多种其他药剂/手段。在用一种或多种本文所述重组Ad治疗并用一种或多种用于治疗癌症、传染病和/或遗传病的其他药剂/手段治疗患有癌症的哺乳动物的情况下，用于治疗癌症、传染病和/或遗传病的其他药剂/手段可同时或独立地施用。例如，可将一种或多种本文所述重组Ad和用于治疗癌症、传染病和/或遗传病的一种或多种其他药剂一起配制以形成单一组合物。在一些情况下，可先施用一种或多种本文所述重组Ad，然后施用用于治疗癌症、传染病和/或遗传病的一种或多种其他药剂，反之亦然。
实施例
实施例1.腺病毒
50年以来，只有4种已知的种类C人Ad，包括Ad1、Ad2、Ad5和Ad6(参见，例如，Weaver等人,2011Virology.412:19–27)。2001年，现场分离株#16700被鉴定为第5种种类C腺病毒，而且针对其同源病毒使用每种抗血清时，使用针对Ad1、2、5和6的抗血清进行的病毒中和测试显示高水平的中和(倒数滴度为500-16,000)(Lukashev等人,2008J Gen Virol.89:380–388)。相反地，抗Ad1、2和5抗体针对#16700的交叉反应性较弱(倒数滴度为32-64)。抗Ad6血清针对#16700表现出更高的交叉反应性，但与Ad6本身相比，为了中和#16700，中和需要高10倍的血清浓度。随后的序列比较确认#16700是新的种类C腺病毒并将其重命名为Ad57(参见，例如Walsh等人,2011J.Clin Microbiol.49:3482-3490)。
评估了15种人Ad针对乳腺、卵巢、肝脏、前列腺、肾脏和B细胞恶性肿瘤的溶瘤活性。在针对DU145人前列腺肿瘤的测试中，单次肿瘤内或静脉内(i.v.)注射后种类C Ad6比种类C Ad5或种类B病毒Ad11和Ad35更有效。在免疫活性叙利亚仓鼠中，Ad6也比Ad5和Ad11更有效。
重组腺病毒的构建
利用本领域技术人员已知的方法，通过重组DNA技术构建重组腺病毒。重组Ad源自第一Ad(如，可包括第一Ad例如Ad6的基因组)，并且可包括来自第二Ad(如，Ad57)的六邻体HVR。在重组Ad包括Ad6基因组和Ad57六邻体HVR的情况下，重组Ad可以是被称为Ad657的嵌合Ad。
为了获得Ad657，合成了Ad57 HVR序列并将其插入质粒中的Ad6六邻体中，该质粒具有位于pVI和六邻体之间的
Figure BDA0003130270520000261
将其重组到各种pAd6质粒中以产生Ad657及其变体。Ad657六邻体的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示。Ad657变体的质粒图谱参见图34和图59至图65。
关于Ad657的变体，Ad57 HVR序列是用经半胱氨酸、柔性氨基酸和允许插入其他肽的限制性位点修饰的HVR1合成的。将其插入到质粒的Ad6六邻体中，该质粒具有位于pVI和六邻体之间的
Figure BDA0003130270520000271
将其重组到各种pAd6质粒中以产生在HVR1中具有半胱氨酸的Ad657变体，该变体被称为Ad657-HVR1-XXA，包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的六邻体。
关于Ad657的变体，Ad57 HVR序列是用经半胱氨酸、柔性氨基酸和允许插入其他肽的限制性位点修饰的HVR5合成的。其被插入到质粒的Ad6六邻体中，该质粒具有位于pVI和六邻体之间的
Figure BDA0003130270520000272
其被重组到各种pAd6质粒中以产生在HVR5中具有半胱氨酸的Ad657变体，该变体被称为Ad657-HVR5-XXA，包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的六邻体。
关于Ad657的变体，Ad57 HVR序列是用经半胱氨酸、柔性氨基酸和允许插入其他肽的限制性位点修饰的HVR1合成的。其被插入到质粒的Ad6六邻体中，该质粒具有位于pVI和六邻体之间的
Figure BDA0003130270520000273
其被重组到各种pAd6质粒中以产生在HVR1中不含半胱氨酸但具有允许将肽插入HVR1的限制性位点的Ad657变体，该变体被称为Ad657-HVR1-XA，包含具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的六邻体。
关于Ad657的变体，Ad57 HVR序列是用经半胱氨酸、柔性氨基酸和允许插入其他肽的限制性位点修饰的HVR5合成的。其被插入到质粒的Ad6六邻体中，该质粒具有位于pVI和六邻体之间的
Figure BDA0003130270520000274
其被重组到各种pAd6质粒中以产生在HVR5中不含半胱氨酸但具有允许肽插入HVR5的限制性位点的Ad657变体，该变体被称为Ad657-HVR5-XA，包含具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的六邻体。
关于Ad657的变体，Ad657 HVR1-XA序列通过将生物素受体肽插入HVR1进行修饰。其被重组到各种pAd6质粒中以产生在HVR1中有BAP的Ad657变体，该变体被称为Ad657-HVR1-PSTCD，包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的六邻体。
生物素受体肽的插入使病毒变体从肝脏去靶向，允许病毒被亲和素或链霉亲和素和生物素化配体重新靶向，并允许病毒在单体亲和素或链霉亲和素柱上进行纯化。
关于Ad657的变体，Ad657 HVR1-XA序列通过将生物素受体肽插入HVR1进行修饰。其被重组到各种pAd6质粒中以产生在HVR1中有BAP的Ad657变体，该变体被称为Ad657-HVR5-PSTCD，包含具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的六邻体。
关于Ad657的变体，Ad657 HVR5-XA序列通过将来自HIV包膜的合成V1/V2环插入HVR5进行修饰，该变体被称为Ad657-HVR5-V1/V2，包含具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的六邻体。
来自HIV包膜的合成V1/V2环的插入允许展示该抗原以用作疫苗以及通过结合与HIV包膜相互作用的蛋白而重新靶向。
关于Ad657的变体，Ad657 HVR5-XA序列通过将来自人乳头状瘤病毒的合成肽插入HVR5进行修饰，该变体被称为Ad657-HVR5-HPV，包含具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的六邻体。
来自人乳头瘤病毒的合成肽的插入允许将HPV肽展示为抗原以用于疫苗目的以及用于通过结合与HPV肽相互作用的蛋白来重新靶向。
本发明的另一方面，产生了具有Ad6 HVR1和Ad57 HVR 2-7的嵌合Ad，该嵌合体被称为Ad6/57HVR嵌合体，包含具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的六邻体。
本发明的又一方面，产生了具有Ad6 HVR1和7以及Ad57 HVR2-6的嵌合Ad，该嵌合体被称为Ad6/57/6HVR嵌合体，包含具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的六邻体。
实施例2.用于基因递送的重新靶向和去靶向的重组腺病毒
腺病毒是用于基因递送和基于基因的免疫的稳健载体。用于绝大多数这些应用的原型腺病毒是人种类C腺病毒血清型5(HAdV-C5或Ad5)。在体外，Ad5通过其纤毛和五邻体基质蛋白与细胞表面受体的组合相互作用结合并进入细胞。该三聚体纤毛结合柯萨奇-腺病毒受体(CAR)，并且缺乏CAR的细胞相对抵抗感染，除非它们也表达可被五邻体基质上的RGD基序结合的αv整联蛋白。
在体内，这些相互作用仍然被利用，但它们的重要性因注射途径而异。如果直接注射到实体组织或肿瘤中，CAR和整联蛋白相互作用占主导地位。如果静脉内注射(IV)，由于Ad5与维生素K依赖性凝血因子结合的影响，这些相互作用成为次要的。血液因子X(FX)以次纳摩尔的亲和力与Ad5的六邻体结合，因此在IV注射后使Ad5能够有效转导肝脏肝细胞。在没有FX的情况下，肝脏转导急剧减少。
与其他载体如仅具有4.5kb的DNA序列的腺相关病毒(AAV)载体相比，腺病毒载体在携带多达36千碱基对(kbp)的非常大的cDNA序列的能力方面有些独特。在递送非常大的转基因如14kbp肌营养不良蛋白cDNA时，这种有效载荷能力对于早期探索用于肌肉基因疗法的Ad载体是合理的。在新生小鼠中IV施用可介导肌肉基因递送，但是这种能力在成年小鼠中丧失。转染随年龄减少的部分原因是Ad病毒粒子的尺寸非常大(即，100nm)以及肌细胞上的CAR受体随年龄损失。尽管事实上骨骼肌细胞上不存在CAR，但利用Ad5和其他血清型时肌内(IM)途径是迄今为止基于基因的疫苗最受欢迎的途径。
因此，肌肉的Ad5和其他Ad血清型转导对于基因疗法或基于基因的接种疫苗可以是足够的。然而，肌肉中缺乏病毒的主要受体降低病毒的功效，而且需要递送更多的载体才能达到期望效果。
在腺病毒中构建肽经修饰的六邻体
C2C12小鼠肌细胞上的12氨基酸(12聚体)肽选自在Ad5的结(knot)区H和Iβ片层之间展示的随机肽文库(图1A)。针对成肌细胞选择肽12.51(TARGEHKEEELI；SEQ ID NO:1)和12.52(LRQTGAASAVWG；SEQ ID NO:2)，并针对非靶细胞进行了预清除，以获得特异性结合肌细胞的肽。在大多数情况下，小肽具有相对低的亲和力。因此推断，在Ad5六邻体的720个拷贝上展示这些肌肉选择的肽可能能够更好地实现肌肉基因递送。如果IM注射后任何载体泄漏到血液中，该插入位点也可能具有使结合六邻体的FX失活以从肝脏“去靶向”载体的益处。
将这些肌肉选择肽插入两个其他β片层之间(其也限制了病毒上的高变环)，评估了修饰的Ad调节趋向性的能力。将肽12.51和12.52引入受Ad5六邻体中β7和β8片层限制的高变区(HVR)5环。评估了在小鼠和仓鼠中静脉内和肌内注射后这些病毒在体内转导组织的能力。
腺病毒
缺失E1的Ad5-GL(RD-Ad5-GL)表达绿色荧光蛋白-荧光素酶(GFP-荧光素酶，GL)融合蛋白，如其他地方所述(参见，例如Crosby等人,2002J.Virol.,76:6893-6899；Khare等人,2011Mol.Ther.,19:1254-1262；以及Khare等人,2012J.Virol.,86:2293-2301)。根据本领域技术人员已知的方法，将肌肉选择肽12.51和12.52插入Ad5六邻体上HVR5位置处的其β7和β8片层之间，该片层结构类似于来自Ad5的结区(knob region)的H和Iβ片层(图1A)。具有柔性前导序列的肽替换Ad5中的整个HVR5环(图1B)。这些经修饰的六邻体序列通过细菌中的red重组被引入表达绿色荧光蛋白-荧光素酶融合蛋白的复制缺陷型Ad5(RD-Ad5-GL)中(参见，例如Campos等人,2004Hum.Gene Ther.,15:1125-1130)。通过将编码肽12.51和12.52(图1B)的退火寡核苷酸插入质粒pHVR5展示(图1A下方)来构建肽修饰的Ad以产生重组Ad，Ad5-HVR5-12.51和Ad5-HVR5-12.52。
消化所得到的质粒并用于red重组至pAd5-GL中。这些载体在293细胞中被拯救，在两个连续CsCl梯度上纯化，并在Econopac 10-DG色谱柱(Bio-Rad)上脱盐至含有0.5M蔗糖的50mM Tris pH 8中，并储存于-80℃。
体外病毒测试
C2C12小鼠成肌细胞购自美国典型组织培养物中心(Manassas,VA)。293细胞获自Microbix(Toronto,Ontario,Canada)。将细胞维持在含有10％FBS(Invitrogen)的DMEM中。
在注射前一天将C2C12肌细胞铺板于6孔板(Corning)。将病毒用于感染具有5％FBS的DMEM中的细胞。在绿色荧光下观测前将细胞温育2天。
动物实验按照动物保护法、PHS动物保护政策和NIH实验室动物护理和使用指南原则的规定，经梅奥临床机构动物护理和使用委员会批准。将雌性CD-1小鼠(Charles River)麻醉，并在所示时间肌内(IM)或静脉内(IV)注射1010vp的所示病毒。将动物麻醉并注射3mg的d-荧光素(Molecular Imaging Products)，在Xenogen成像系统上进行成像。之后，将动物麻醉并在血清分离器中收集血液用于ELISA。
ELISA如下进行。Immulon 4HBX板(Thermo)在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中与100ng/孔GFP蛋白于4℃过夜温育，洗涤，并在含0.1％Tween20(TBST)的TRIS缓冲盐水中用5％牛奶于室温封闭2小时。在封闭缓冲液中制备每种血清样品的1:100,000至1:1,1000稀释液。洗涤孔，并将各自的100μL一式三份添加到GFP包被的板中，并于室温温育3小时。洗涤孔并将山羊抗小鼠-HRP二抗(Pierce Chemical)的1/10,000稀释液添加到每个孔中。将板于室温温育2小时，洗涤，然后加入50μL的1Step Ultra TMB ELISA(Thermo Fisher ScientificInc.)用于HRP检测，然后加入50μL的2M H2SO4。利用Beckman Coulter DTX880测定450nm处的吸光度。
用Prism(Graphpad)进行统计分析。通过单向ANOVA继之以Tukey’s HSD计算统计显著性。
小鼠C2C12肌细胞中的体外转导
将RD-Ad5-GL、RD-Ad5-GL-HVR5-12.51和RD-Ad5-HVR5-12.52以病毒颗粒(vp)/细胞表示的不同感染复数(MOI)用于感染小鼠C2C12成肌细胞。当通过荧光显微术观测来自GFP融合蛋白的绿色荧光时，两种经肽修饰的载体介导的转导均显著优于RD-Ad5-GL(图2A)。当测量荧光素酶活性时，在RD-Ad5-GL-12.51和12.52感染的细胞中观测到显著增加(图2B)。当其中一种肽12.51被插回Ad5的结区时，该肽在C2C12成肌细胞上的体外转导增加了14倍。
小鼠肌内注射后的体内转导
将109vp的Ad5-GL、Ad5-GL-HVR5-12.51和Ad5-GL-HVR5-12.52通过IM途径注射到小鼠的两个四头肌中，并在不同时间进行荧光素酶成像(图3A上方图)。在所有时间点，Ad5-GL-HVR5-12.51产生的荧光素酶活性都比Ad5-GL更高2至3倍(单向ANOVA，第1天时p<0.05)(图3B左图)。Ad5-GL-HVR5-12.52在肌肉中的活性低于Ad5-GL和HVR5-12.51，而其在体外的活性更强。
小鼠静脉内注射后的体内转导
3×1010vp的Ad5-GL、Ad5-GL-HVR5-12.51和Ad5-GL-HVR5-12.52通过IV途径注射到小鼠体内，并进行荧光素酶成像(图3A下方)。与肌肉中的结果相反，只有未修饰的Ad5-GL介导强的肝脏转导。Ad5-GL的肝脏转导比Ad5-GL-HVR5-12.51和Ad5-GL-HVR5-12.52高60倍(单向ANOVA，第1天时p<0.001)(图3B右图)，表明重组Ad靶向肌肉组织，同时减少肝脏中的脱靶感染。
仓鼠肌内注射后的体内转导
为了测试经12.51修饰的载体是否在小鼠以外的其他物种中起作用，将1010vp的Ad5-GL和Ad5-GL-HVR5-12.51通过IM注射到较大叙利亚仓鼠的两个四头肌中，并在24小时后进行荧光素酶成像(图4)。在这种情况下，Ad5-GL-HVR5-12.51介导的荧光素酶活性比Ad5-GL高7倍(单向ANOVA，第1天p<0.01)。
小鼠中肌内注射后基于基因的免疫
IM注射后16周，收集如上所述和如图3所示治疗的小鼠的血清，并通过ELISA分析连续稀释液中针对转基因编码的GFP的抗体(图5)。与PBS组相比，在1:10,000至1:1000的血清稀释液中，所有注射Ad的小鼠均产生了显著的抗GFP抗体(通过单向ANOVA，p<0.0001)。然而，Ad5-GL-HVR-12.51产生的抗体高于Ad5或Ad5-HVR5-12.52。在1:1000至1:10,000稀释度的血清中，Ad5-GL-HVR-12.51显著高于Ad5-GL(通过单向ANOVA，p<0.01至0.0001)。在1:1000稀释度的血清中，12.51显著高于12.52(p<0.05)。在1：1000和1：10,000释度的血清中，Ad5-GL-12.52显著高于Ad5-GL(p<0.05至0.001)。
该实施例证明，在噬菌体文库上的相容结构背景下选择的肽可被翻译到Ad六邻体蛋白中。例如，对于12.51肽，该插入位点增加肌肉转导，同时减少肝脏中的脱靶感染。因此，这种靶向肌肉组织的重组Ad可用作载体用于基于基因的肌肉接种疫苗或用于基因治疗应用/递送至肌肉。
本发明的另一方面涉及重组和/或嵌合Ad，其包含插入Ad657 HVR以及Ad6和C68HI环中的其他细胞靶向肽，如表1所述。
表1.
插入Ad657 HVR以及Ad6和C68 HI环中的其他细胞靶向肽
Figure BDA0003130270520000321
Figure BDA0003130270520000331
B细胞癌选择的肽:
Figure BDA0003130270520000332
合成编码所示肽的DNA及其互补DNA，其侧翼是用于连接到Ad质粒(例如，XA六邻体质粒或pAd6-NdePfl纤毛穿梭质粒)中的粘性末端。将这些退火寡核苷酸连接到Ad的HVR或HI环中。将这些质粒用于重组到各种Ad骨架质粒中。
一些肽用于靶向细胞上的新受体。如果病毒在表达细菌生物素连接酶BirA的细胞中生长，则其他如小BAP可用于亲和素靶向和纯化。钙调蛋白肽允许病毒与钙调蛋白或钙调蛋白融合蛋白结合，用于重新靶向或病毒纯化。
因此，这种靶向特定组织/细胞受体的重组Ad可用作载体用于靶向的细胞和/或组织中的基于基因的接种疫苗或用于基因疗法应用。
实施例3.插入来自不同Ad血清型的个体HVR以及插入细胞靶向/去靶向肽或新氨基酸
六邻体穿梭质粒图谱(图34)显示向六邻体插入来自不同Ad血清型的个体HVR和插入细胞靶向/去靶向肽或新氨基酸如半胱氨酸的组合，用于进行靶向化学修饰和屏蔽。
在某些实施方案中，将细胞结合肽12.51、VSV、RGD(参见表1)插入HVR1或HVR5，这些实施方案用作将这些和其他肽插入Ad的任何HVR的示例(图34)。另一个示例显示将生物素受体肽(BAP)插入这些HVR中，从而允许利用亲和素或链霉亲和素和生物素化配体或利用亲和素融合蛋白或链霉亲和素融合蛋白重新靶向载体。BAP插入还允许在单体亲和素或链霉亲和素柱上纯化病毒进行载体生产。同样，Ad57-HVR1-XXA和XA显示将半胱氨酸插入该位点以允许利用马来酰亚胺或其他半胱氨酸反应剂进行靶向化学修饰的示例(图34)。
这些实施方案同样已应用于组合来自不同Ad的不同HVR(即，混排HVR)的Ad的情况。例如，Ad6的HVR1与Ad57的HVR2-7或Ad6的HVR1和7与Ad57的HVR2-6。在另一实施方案中，6/56/6病毒具有来自Ad6的HVR1和7与来自Ad657的HVR2-6。
实施例4.经半胱氨酸修饰的六邻体修饰的Ad657-HVR5C的靶向化学缀合
图35描绘了Ad变体，显示向六邻体插入来自不同Ad血清型的个体HVR和插入新氨基酸如半胱氨酸的组合进行靶向化学修饰和屏蔽。
比较非靶向化学缀合与靶向化学缀合对经半胱氨酸修饰的六邻体修饰的Ad657-HVR1C的屏蔽和功能的影响(图36)。本实施例表明将聚合物和其他化学修饰靶向插入至Ad六邻体的半胱氨酸的能力。非靶向PEG使病毒感染失活，而靶向半胱氨酸的PEG化保留病毒功能。
本发明的一方面，涵盖使用聚合物或插入的肽/蛋白来向抗体、蛋白、细胞进行去靶向、重新靶向和屏蔽。图54描述了可例如通过PEG化或“BAP化”修饰的Ad HVR的位点。
在实施方案中，不同Ad血清型和/或变体包括聚合物屏蔽以允许Ad6和Ad657变体的多次给药。显示了示例性治疗周期，其中可通过血清型转换与共价聚合物缀合组合将Ad6和Ad657用于多轮治疗(图41B)。
表达GFP荧光素酶的Ad657-HVR1C由细胞产生并在CsCl梯度上纯化。将该病毒用5kDa聚乙二醇(PEG)共价修饰。将病毒用与病毒蛋白上的胺/赖氨酸随机反应的NHS-PEG处理，或用与使用XXA穿梭质粒插入HVR1的半胱氨酸特异性反应的马来酰亚胺PEG处理。这些未修饰或经修饰的病毒随后通过最终CsCl旋转继之以脱盐进行纯化。所示病毒在SDS-PAGE凝胶上分离，用SyproRuby染色，并通过成像可视化(图36A)。这表明NHS-PEG化随机修饰许多病毒蛋白，如通过蛋白表观质量的增加所证明(由箭头指示)。相反地，与HVR1中的半胱氨酸进行的靶向性马来酰亚胺PEG反应仅修饰六邻体，不损坏其他病毒壳粒蛋白。评估了聚乙二醇化对病毒功能的影响。
将所示病毒与A549细胞一起温育，并通过荧光素酶测定测量它们感染细胞的能力。这表明随机NHS-PEG化将病毒活性降低了超过90％，而马来酰亚胺-PEG则没有(图36B)。
向免疫活性叙利亚仓鼠植入皮下HaK肾癌肿瘤。当这些达到200μl体积时，对它们通过静脉内途径用所示Ad6病毒注射一次，其中所示Ad6病毒由具有和不具有E3(DE3)和具有或不具有随机NHS-PEG化构建而来。随时间测量肿瘤尺寸。数据显示，溶瘤病毒Ad6-deltaE3-Luc中缺失所有E3基因使病毒在减少肿瘤体积方面的效果不如溶瘤亲本病毒Ad6-Luc。数据还显示Ad6可被PEG化并保持功效(参见Ad6-Luc相比Ad6-Luc-20kDa PEG)(图58)。
经半胱氨酸修饰的六邻体修饰的Ad(如，Ad657-HVR5C)的靶向性化学缀合。表达GFP荧光素酶的Ad657-HVR5C由细胞产生并在CsCl梯度上纯化。该病毒用半胱氨酸(使用其XXA穿梭质粒插入HVR5)特异性反应的马来酰亚胺-IR800近红外荧光团、马来酰亚胺-生物素或5kDa马来酰亚胺-PEG共价修饰。所示Ad和经修饰的Ad在SDS-PAGE凝胶上分离，用SyproRuby染色，并通过成像可视化(图37A)。病毒蛋白的SDS-PAGE继之以近红外成像表明，HVR-C可用成像剂标记(图37B)。通过腹膜内注射PEG化Ad病毒，表明PEG化对体内Ad病毒功能的影响。通过成像可检测的荧光素酶活性表明了感染荷瘤小鼠中细胞的能力。图37C表明将聚合物和其他化学修饰靶向到插入Ad657六邻体区的半胱氨酸的能力。此外，证明PEG化在体内使腺病毒对肝脏去靶向(图50)。
实施例5.Ad657表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)
将携带人GMCSF的cDNA的Ad657用于感染A549细胞，并且将不同量的上清液添加至GMCSF生长依赖性TF-1细胞中。增加的细胞数目表明功能性人细胞因子的表达(图27)。数据表明可将重组Ad用于表达异源蛋白。
实施例6.用于针对癌细胞的全身病毒疗法的溶瘤腺病毒Ad657
图6显示比对选定的完整Ad基因组产生的系统树，其将Ad57与其他与Ad6同源性最高的种类C病毒聚类。
Ad57表现为与Ad6几乎相同，但在六邻体高变区(HVR)和E3免疫逃避基因中存在序列差异(图7)。Ad6和Ad57之间其他暴露的病毒衣壳蛋白，包括纤毛、五邻体基质、IIIa和IX几乎相同。中和数据与大多数腺病毒中和抗体靶向Ad上的HVR的事实一致。Ad6抗血清和Ad57之间的低交叉反应性被认为是由于抗体可能靶向其共同的纤毛蛋白(Lukashev等人,2008J Gen Virol.89:380-388)。
在该实施例中，证明了Ad657作为针对人前列腺癌的溶瘤剂的效用。Ad6HVR被来自Ad57的HVR替换，以产生被称为Ad657的嵌合种类C溶瘤病毒。Ad657和Ad6作为全身溶瘤疗法在携带人前列腺癌肿瘤的裸鼠中通过单次i.v.注射进行了测试。如下在前列腺癌小鼠模型中评估该病毒的肝脏和肿瘤趋向性。
DU145人前列腺癌细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA，USA)，并通过RADIL的IMPACT测试证实不含特定病原体。293细胞获自Microbix(Toronto,Ontario,Canada)。将细胞维持在含有10％FBS的DMEM(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)中。
克隆Ad6，Tonsil 99株(ATCC VR-1083)的基因组，如其他地方所述(参见，例如，Weaver等人,2013PLoS One.8:e73313)。由Genscript合成对应于天然ApaI和SacI位点之间的Ad57六邻体的盒。将该片段克隆到含有Ad6 pVI和六邻体基因(它们之间具有
Figure BDA0003130270520000361
抗性基因-FRT盒)的穿梭质粒pUC57-Ad6 Hexon-FZF中进行细菌中的同源重组，如其他地方所述(参见，例如Campos等人,2004Hum Gene Ther.15:1125–1130；以及Khare等人,2012J Virol.86:2293–2301)。Ad6 ApaI-SacI片段被Ad57片段替换，产生质粒pUC57-Ad6/57Hexon-FZF。通过red重组将其重组至Ad6基因组(Campos等人,2004Hum GeneTher.15:1125–1130)。图59显示具有E3缺失的Ad657的质粒图谱。通过转染至293细胞挽救病毒，并从10plate CellStack(Corning Life Sciences,Lowell,MA,USA)产生病毒。表达绿色荧光蛋白-荧光素酶(GFP-Luc)融合蛋白的病毒具有在Ad纤毛和E4之间插入的CMV-GFP-Luc表达盒，并且缺失E3以便为该插入物腾出空间。病毒在两个CsCl梯度上纯化，并通过OD260计算病毒颗粒(vp)数目。
为了检查体外溶瘤活性，在具有5％FBS和抗生素-抗真菌剂的DMEM(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)中以vp/细胞表示的所示感染复数(MOI)处理细胞。5天后，去除培养基并用结晶紫(0.05％结晶紫，3.7％甲醛，在磷酸盐缓冲盐水中；Invitrogen，GrandIsland，NY，USA)处理细胞10分钟。细胞用PBS洗涤两次，然后在0.1％十二烷基硫酸钠的PBS中于37℃温育过夜以溶解结晶紫。在Beckman Coulter DTX 880读板仪OD595处测量结晶紫吸光度。细胞活力(％)通过将样品的OD除以同一96孔板上未处理的对照细胞的均值OD并将该数字乘以100来计算。
根据实验室动物护理评估和认证协会的指导方针，将动物饲养于梅奥临床研究动物设施中。该研究按照动物保护法、PHS动物保护政策的规定，经梅奥临床研究动物使用和护理委员会批准。在4周龄的裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN，USA)中通过皮下注射在100μL DMEM/50％Matrigel(BD Biosciences，San Jose,CA,USA)中的1×107DU145细胞引发皮下肿瘤。肿瘤体积使用等式宽度2×长度×1/2来计算。当肿瘤体积达到约200μL时，将小鼠分配成不同的组并通过单次i.v.注射尾静脉治疗。当肿瘤体积达到约2000μL或动物垂死、处于困境或肿瘤上方皮肤破裂时，使动物安乐死。
对于血液丙氨酸氨基转移酶(ALT)测量，每组6只C57BL/6小鼠通过尾静脉i.v.注射1011vp的Ad5、Ad6或Ad657，并在3天后收集血液，使用ALT活性测定(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)进行ALT测量。
通过重复测量ANOVA或单向ANOVA接着是Tukey’s HSD检验，使用Prism(Graphpad)进行统计分析。绘制Kaplan-Meier生存曲线并通过对数秩检验进行比较。
除它们的六邻体HVR外，Ad57的病毒壳粒基因几乎与Ad6相同(图6和图7)。为了产生Ad57和Ad6的嵌合病毒，将对应于Ad57六邻体HVR的盒重组至野生型Ad6基因组中(图8)。该病毒在293细胞中被挽救和生产，并在CsCl梯度上纯化。考虑到基础病毒基因组是Ad6，这些六邻体嵌合病毒被称为Ad657(图59)。
通过用10、100或1000vp/细胞感染LNCap和DU145细胞来评估体外溶瘤活性。为了比较Ad5、Ad6和Ad657对肝脏的损害，将每种病毒以1011vp的高剂量通过尾静脉内注射到免疫活性的C57BL/6小鼠。注射Ad5的动物在2天内变得垂死，不得不实施安乐死(图10A)。与PBS相比，对于Ad5和Ad6的存活率显著降低(通过对数秩分析，分别为p＝0.0001和0.0009)。与PBS相比，Ad657的存活率也降低(p＝0.0578)。暴露于Ad6或Ad657后的存活率显著优于Ad5治疗的小鼠(分别为p＝0.0001和0.0001)。Ad6和Ad657存活率没有统计学差异(p＝0.248)。
注射后3天在存活的Ad6和Ad657动物中测量血液中的ALT。未测试Ad5处理的动物，因为该组的大多数需要被处死。该测定表明，就血液中肝脏ALT酶的释放而言，Ad6引起的肝脏损伤水平相对较低(图10B)。与PBS处理的小鼠相比，Ad6和Ad657组都具有低但明显的ALT水平(对两种病毒通过单向ANOVA和Tukey’s多重比较检验，p<0.001)。Ad657的ALT水平低于Ad6(ANOVA，p<0.001)。这与i.v.注射荧光素酶表达病毒后肝脏中Ad6感染水平高于Ad657一致(图12)。一只Ad657动物在第3天取血后失去。6天时，大多数Ad6动物变得垂死(图10A)。相比之下，50％的Ad657动物在治疗2周后存活。
为了比较Ad6和Ad657对人DU145前列腺肿瘤的溶瘤活性，将裸鼠用DU145细胞进行s.c.移植。将动物分成具有平均为200μL的相似肿瘤尺寸的组，每组9只小鼠通过i.v.途径用3×1010vp剂量的Ad6或Ad657单次治疗(图11)。
与用PBS注射的对照动物相比，该单次i.v.注射Ad6和Ad657减少了肿瘤尺寸。与PBS组相比，7天内Ad6组的肿瘤显著更小(通过双向ANOVA和Tukey’s多重比较检验，p<0.05)。到第14天，Ad657组的肿瘤与PBS组的肿瘤显著不同(ANOVA，p<0.01)。到第38天时，Ad6和Ad657都与PBS保持显著差异(通过双向ANOVA，p<0.0001)。该比较在第38天结束，此时PBS组中的第一只动物不得不被处死，因为后续比较会由于动物数量的变化而出现偏差。Ad6和Ad657组的肿瘤尺寸直到第38天才出现显著差异，此时Ad657的肿瘤体积显著更大(通过双向ANOVA，p<0.05)(图11A)。Ad6和Ad657肿瘤尺寸之间的这种差异一直持续到第52天(通过T检验，p＝0.04)，此后肿瘤没有显著差异。
当评估由于所有原因引起的存活时，与用PBS处理的动物相比，Ad6和Ad657均显著延长存活(图11B，通过对数秩分析分别为p<0.01和0.05)。由于所有原因导致的Ad6存活显著优于Ad657(p<0.05)。然而，这是归因于所有所致的存活的人为结果，因为按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南，由于肿瘤上面皮肤形成溃疡而非由于肿瘤过大，3只Ad657动物必需被处死。在一些情况下，溃疡实际上与有效的肿瘤控制有关。与Ad6一样，表达GFP荧光素酶的Ad657在单次i.v.注射后在远处的DU145皮下肿瘤中产生显著的荧光素酶活性(图12和图13)。这表明单次全身治疗后，Ad6和Ad657在前列腺肿瘤中均可介导溶瘤作用。
该实施例表明，可将Ad657用作前列腺癌的局部或全身溶瘤病毒疗法。这些数据还表明使用溶瘤种类C Ad的血清型转换的惊人效果。
在肿瘤细胞和/或癌性肿瘤中评估了Ad的溶瘤活性。在免疫活性仓鼠中，评估了Ad6单次IV注射对于A549肺肿瘤细胞(图28)；评估了Ad6单次IV或肿瘤内(IT)注射对于Panc1胰腺肿瘤(图29)，以及评估了Ad6单次IV注射对于肾癌(图30)。
图38显示裸鼠的荧光素酶成像。A)单次I.V.注射Ad6治疗后1、4、7、14、28和42天对于远处的DU145前列腺肿瘤。B)I.V.注射复制型Ad5-GFPLUC至携带LNCaP前列腺肿瘤的小鼠后3、7和19天。
可得出结论，IV注射后Ad6到达远处的靶细胞。
在另一实施方案中，将具有和不具有插入六邻体的HVR5中的肽文库产生肽12.51和12.52的表达荧光素酶的Ad以所示病毒颗粒数目(vp)在所示细胞系B16黑色素瘤和A549肺癌细胞上温育，并测量荧光素酶活性。证明了通过具有肽修饰的六邻体的Ad改善对癌细胞的感染(图31)。
具有经肽修饰的六邻体的Ad改善了对癌细胞的感染
将具有和不具有插入六邻体的HVR5中的肽文库产生肽12.51和12.52的表达荧光素酶的Ad以每种病毒104vp在所示肝细胞癌细胞系上温育，并测量荧光素酶活性。证明了通过具有经肽修饰的六邻体的Ad改善对癌细胞的感染(图32)。
实施例7.恒河猴中通过用复制型单周期腺病毒全身和粘膜免疫产生的不同HIV-1定向免疫应答
大多数基于基因的腺病毒疫苗是复制缺陷型Ad(RD-Ad)载体，其E1基因缺失以防止它们复制和引起Ad感染。辅助依赖型腺病毒(HD-Ad)已缺失所有Ad基因，并且也是复制缺陷性的。E1缺失的Ad疫苗可感染细胞，递送它的一个拷贝的抗原基因，并表达该抗原的单个拷贝(如，“1X”)。它们是安全的，但不会复制转基因或其表达。
相反地，相比E1缺失的载体，E1+可复制型Ad(RC-Ad)疫苗可感染相同的细胞，复制抗原基因DNA10,000倍，产生实质性更多的抗原，并且激发更强的免疫应答。虽然RC-Ad比RD-Ad效力更高，但可复制型Ad可能有导致人类中明显的腺病毒感染的真正风险。
为了利用转基因DNA复制，但避免腺病毒感染的风险，开发了具有关键病毒晚期蛋白pIIIa基因缺失的单周期Ad(SC-Ad)载体(Crosby等人,2014.Virology 462-463:158-165；Crosby等人,2015J Virol 89:669-675；Anguiano-Zarate等人,2018J InfectiousDis 218:1883-1889；以及Crosby等人,2017Genes(Basel)8:E79)。SC-Ad保留了其E1基因以允许它复制其基因组，但pIIIa的不存在阻断了传染性后代病毒的产生。SC-Ad复制其基因组和转基因以及RC-Ad(高达10,000倍；Crosby等人,2014.Virology 462-463:158-165)。RC-Ad和SC-Ad比RD-Ad载体产生更多的转基因蛋白(Crosby等人,2014.Virology 462-463:158-165)。SC-Ad比RD-Ad或RC-Ad产生更稳健和更持久的免疫应答(Crosby等人,2015JVirol 89:669-675)。在头对头比较中，SC-Ad产生显著更高的抗体和针对流感病毒的更好保护(Crosby等人,2017J Virol91:e00720-16)。
在该研究中，恒河猴用表达获自HIV-1患者的进化枝B包膜序列(在其抗体应答经历扩展中和宽度(expansion neutralization breadth)之前和之后)的SC-Ad进行免疫。恒河猴通过单次全身IM免疫或通过单次粘膜鼻内(IN)免疫进行免疫。然后动物通过相同或替代途径用SC-6Ad加强，然后是蛋白加强。本实施例描述了这些不同SC-Ad免疫策略如何影响HIV结合的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和中和抗体的产生，以及它们对细胞免疫应答的影响，包括血液和淋巴结中的T滤泡辅助(pTfh)细胞。
表达HIV-1包膜蛋白gp140的单周期腺病毒
将来自HIV患者VC10014的抗体中和宽度扩展之前(G4)和紧接其峰值之前(F8)出现的进化枝B gp160包膜序列用作免疫原(Malherbe等人,2014J Virol88:12949-12967)。将基序优化的G4和F8 gp160序列重组至基于人Ad血清型6和57的SC-Ad(参见，例如，Crosby等人,2014.Virology 462-463:158-165；Crosby等人,2015J Virol 89:669-675；Anguiano-Zarate等人,2018J Infectious Dis 218:1883-1889；以及Nguyen等人,2018Oncolytic Virotherapy 7:43–51)。还使用了表达埃博拉病毒糖蛋白的对照SC-Ad。病毒被挽救和纯化，如其他地方所述(参见，例如，Crosby等人,2014.Virology 462-463:158-165；Crosby等人,2015J Virol 89:669-675；and Anguiano-Zarate等人,2018JInfectious Dis218:1883-1889)。
SC-Ad载体中使用的从感染HIV进化枝B的受试者克隆的包膜基因F8经基序优化并通过定点诱变修饰以表达未切割的三聚体gp140。表达、纯化和抗原表征的细节已在其他地方描述(参见，例如Malherbe等人,2014J Virol88:12949-12967)。
印度起源的雌性成年恒河猴(rhesus macaques，Macaca mulatta)以特定无病原体繁殖群饲养于德克萨斯大学MD安德森癌症中心(Bastrop TX)的Michael Keeling比较医学研究中心。所有动物处理均按照梅奥诊所和德克萨斯大学MD安德森癌症中心的政策和程序、动物保护法的规定、PHS动物保护政策、NIH实验动物护理和使用指南的原则进行。
恒河猴用氯胺酮麻醉并用2x1010病毒颗粒(vp)的所示SC-Ad疫苗通过鼻内(IN)或肌内(IM)途径进行免疫。动物用组合有AdjuplexTM佐剂的50μg纯化的三聚体重组F8 gp140通过IM途径来加强，如其他地方所述(参见，例如Malherbe等人,2014J Virol 88:12949-12967；以及Hessell等人,2016J Immunol 196:3064-3078)。
在EDTA中收集外周静脉血样品。在分离外周血单核细胞(PBMC)之前，将血浆分离并立即储存于-80℃。在Ficoll-Hypaque密度梯度上从血液中制备PBMC。唾液和阴道拭子用Wek-Cel Spears收集于1ml含有蛋白酶抑制剂的PBS中，涡旋，并以2,000r.p.m离心后收集上清液，如其他地方所述(参见，例如Kozlowski等人,1997Infect Immun 65:1387-1394)。在进一步使用前，样品于-80℃冷冻保存。
用于检测抗原特异性IFN-γ产生细胞的ELISPOT试验
新鲜分离的PBMC用F8 gp140蛋白(1μg/mL)或热灭活的Ad6(7.0X108 vp/孔)刺激，以通过酶联免疫斑点(ELISPOT)试验确定IFN-γ产生细胞的数目，其使用其他地方描述的方法(参见，例如Nehete等人,2017Comp Med 67:67-78；Nehete等人,2013PLoS One 8:e79836；以及Nehete等人,2017J Am Assoc Lab Anim Sci 56:509-519)。简言之，将PBMC的等分试样(105/孔)一式两份接种于用一抗IFN-γ抗体预包被的96孔板(聚偏二氟乙烯背衬板，MAIP S 45，Millipore，Bedford，MA)的孔中，并将淋巴细胞用Con A、F8 gp140蛋白或热灭活的Ad6刺激。于37℃温育30-36小时后，取出细胞并用PBS彻底洗涤孔，并按照制造商提供的方案进行显色。结果表示为减去仅用培养基(阴性对照)的重复孔后的IFN-γ斑点形成细胞(SFC)/105个PBMC，如果大于背景的两倍且大于5个SFC/105个PBMC，则认为是阳性。
抗体ELISA
在定期收集的血浆样品中针对F8 gp140或SF162 gp140测量HIV-1包膜结合抗体滴度，如其他地方所述(Malherbe等人,2014J Virol 88:12949-12967；以及Hessell等人,2016J Immunol 196:3064-3078)。
中和试验
HIV中和使用TZM-bl中和测定法进行，如其他地方所述(Malherbe等人,2014JVirol 88:12949-12967；以及Hessell等人,2016J Immunol196:3064-3078)。所有值均与仅病毒的孔相比来进行计算。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
CEM.NKR.CCR5.CD4+-Luc靶细胞用50ng SHIVSF162P3感染并培养4天，如其他地方所述(参见，例如Alpert等人,2012PLoSPathog 8:e1002890)。于室温将每个样品的2倍系列稀释液添加到受感染的靶标中20分钟。将CD16-KHYG-1效应细胞以10:1的效应细胞与靶标的比例加入，并将这些再温育8小时。将细胞裂解并用Bio-Tek读板仪测量荧光素酶活性。
流式细胞术
将从直肠和淋巴结活检收集的细胞与0.2μg gp140或单独的培养基在GolgiPlugTM(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)存在下温育过夜最后4小时。培养后，收获细胞并与一组与恒河猴样品交叉反应的人抗体一起在冰上温育45分钟。该组包括以下用荧光染料标记的抗体：CD8(Qdot655)、α4β7(PE)和CXCR5(PE)，均获自非人类灵长类试剂资源(NonhumanPrimate Reagent Resource)；CD69(BV737,克隆FN50)和FoxP3(PECy5,克隆:PCH101)，获自eBioscience，IL-21(BV421,克隆:3A3-N2.1),CD45(BV786,D058-1283)和CD3(克隆SP34-2，PE-Cy7标记)，均获自BD Bioscience(San Jose,CA)；CD4(Pacific Blue，克隆OKT4)，来自ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)。按照制造商的建议确定抗体的稀释度。通过使用获自Invitrogen(Carlsbad,CA)的live-dead可固定死细胞染色试剂盒排除死细胞。随后，将细胞用含2％FBS和2mM EDTA的PBS洗涤两次，然后用FoxP3 Fix/Perm试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)进行固定和透化。细胞内标志物FoxP3和IL-21在透化缓冲液中染色。利用补偿对照(OneComp eBeAds，(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)和荧光减一(FMO)对照两者。所有样品在LSRFortessa X-20分析仪(BDBiosciences,San Jose,CA)上收集并使用FlowJo软件(FlowJo,LLC,Ashland,Oregon)进行分析。每份样品收集约2x105至1x106个事件。
SHIVSF162P3直肠攻击
SHIVSF162P3病毒源自R157收获3(3.16.12)。该原液的P27含量为66ng/ml，RNA含量Log～9.35，印度来源恒河猴PBMC中的TCID50：1288/ml，以及TZM-bl细胞中的TCID50：4.1x104/ml。使用1ml的1:300稀释的原液。这等于在恒河猴PBMC上的4.3TCID50和在TZM-bl细胞上的137TCID50。将该剂量用于每周直肠内(IR)攻击。分析血浆样品的SHIV病毒RNA拷贝数(通过Leidos Biomedical Research,Inc.，Frederick National Laboratory)。认为RNA拷贝数高于10的动物被感染，将感染该动物所需的攻击次数用作Kaplan-Meier生存分析的事件。一旦被感染，动物就不再受攻击。在研究结束前，通过相同的方法定期监测血浆病毒载量。
组织中的SHIVSF162P3病毒载量
在研究结束时收集PBMC和死后组织。通过qPCR分析PBMC和消化道样品的SHIVSF162P3病毒RNA。将Prism 7图形软件用于所有统计分析。
表达HIV-1gp160的SC-Ad
在来自HIV患者VC10014的抗体中和宽度的扩展之前(G4 gp160)和紧接其峰值之前(F8 gp160)鉴定了进化枝B包膜蛋白序列。将这些gp160序列插入SC-Ad6和SC-Ad657中，在强的巨细胞病毒启动子控制下(图24A)。Ad57是种类C人Ad，它与Ad6几乎相同，但在其六邻体高变区(HVR)和E3免疫逃避基因中存在变异(图24B)。大多数Ad中和抗体靶向Ad的六邻体HVR(Pichla-Gollon等人,2007J Virol 81:1680-1689；以及Sumida等人,2005J Immunol174:7179-7185)。鉴于此，将Ad6的HVR用来自Ad57的HVR替换，以生成被称为Ad657的嵌合种类C Ad载体。SC-Ad6和SC-Ad657都保留了所有Ad基因，包括E1并且缺少功能性pIIIA和E3基因(图24A)。因此，两种SC-Ad都可复制其基因组以扩增gp160表达，但不会产生后代Ad病毒。两种病毒都在293-IIIA细胞中被挽救和产生，并在CsCl梯度上纯化。当用于感染A549细胞时，通过Western印迹确定两种载体都产生了gp160。
不同的Ad载体通过全身肌内(IM)途径和多种粘膜途径(包括口服管饲法、口服肠包衣胶囊、鼻内(IN)和阴道内(IVAG))之前在恒河猴中进行测试。在小动物中通过IM、IN和IVAG途径测试SC-Ad-G4显示，通过IVAG途径引发的抗体应答可忽略不计。相反地，小鼠和仓鼠的IN免疫均产生了强烈的抗体应答。鉴于这些数据和在人类中进行IVAG免疫的潜在困难，在随后的恒河猴研究中选择IN途径作为粘膜免疫途径。
恒河猴的单次粘膜免疫和全身性免疫
将2x1010vp的SC-Ad6-G4 Env用于通过单次IM或IN免疫接种8只雌性恒河猴的组(图14)。该剂量相对较低，比最近使用的通过混合IN和IM免疫递送的RC-Ad HIV包膜疫苗低约7.5倍。阴性对照载体组用表达埃博拉病毒糖蛋白(gp)的SC-Ad6进行IN免疫。4周后，测定血浆样品中针对F8 gp140的Env结合抗体(图14)。这显示单次免疫后IM免疫途径组的中点结合滴度显著更高(通过ANOVA，p<0.01)。SF162中和抗体(NAb)滴度在这个时间点也有所升高，但通过ANOVA各个途径组未达到显著性。
第4周使用SC-Ad6的IM相比IN加强
据报道，通过用不同途径加强可避免由一次Ad IM免疫产生的抗腺病毒中和抗体(Xiang等人,2003J Virol 77:10780-10789)。为了测试该途径概念以能够在恒河猴中重复使用相同的Ad血清型，每个SC-Ad6初免的组被分成2组，每组4只。这些各自都在第4周用表达替代F8 Env的SC-Ad6通过IM或IN途径加强。在此加强后3周收集的血浆样品显示，IM-IM、IM-IN和IN-IM组在动物中引发-加强的中点结合滴度升高。IN-IN组未观测到可检测的抗体(图14)。
第13周的SC-Ad657加强
然后第13周通过用表达G4 Env的SC-Ad657的血清型转换对动物进行加强。使用与先前加强中相同的途径。第15周的滴度显示，IM初免动物的Env结合滴度升高到接近350，但这些水平与对照没有显著差异(图14)。相反地，IN-IM-IM组中的抗体显著高于载体对照和IN-IN-IN组(p<0.01)。即使在3次免疫后，IN-IN-IN组仍显示无Env抗体。
第24周重组三聚体Env蛋白加强
大多数HIV疫苗研究通过蛋白加强增强Ad免疫以增强抗体应答。例如，最近一项研究中，使用RD-Ad26载体两次，并用佐剂化的gp140蛋白加强3次(Barouch等人,2015Science349(6245):320-4)。为了确定该策略是否会增强SC-Ad疫苗，所有SC-Ad-Env组都通过IM途径用与ADJUPLEXTM佐剂混合的50μg重组F8三聚体gp140蛋白加强。F8三聚体蛋白在所有组中将中点结合滴度提高了两个数量级(图14)。这种蛋白免疫也将IN-IN-IN提高到与其他组相当的水平，即使早前的SC-Ad免疫后未检测到Env结合抗体。
第二次蛋白加强后血浆中的结合和中和抗体
第38周时动物用蛋白第二次加强。到第40周时，这将F8结合性血浆抗体滴度增加到接近105，并且所有组变得与对照显著不同(图14)。第40周时，针对1A级SF162病毒的中和抗体(NAb)滴度增加到100至10,000(图15)。除IN-IN-IN组中滴度处于背景水平的两只动物外，大多数动物中针对1B级病毒SS1196和2级JRCSF病毒的NAb增加到100(图15)。
第二次蛋白加强后的ADCC活性
对SHIVSF162P3感染的细胞测试了第40周血浆中的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。ADCC活性在有过至少一次IN粘膜SC-Ad免疫的动物中通常更高(图16)。接受粘膜免疫的所有动物的最大％ADCC显著高于SC-Ad-埃博拉病毒对照动物(对于IM-IN-IN、IN-IM-IM和IN-IN-IN，p分别<0.05、0.0001、0.0001)。当通过50％ADCC滴度进行比较时，只有IN SC-Ad初免组具有显著高于对照的ADCC活性(通过ANOVA，对于(IN-IM-IM和IN-IN-IN组)p<0.05和0.001)。
第二次蛋白加强后唾液和阴道清洗液中的抗体应答
以上数据监测血浆中的全身抗体应答。第40周时还收集了唾液和阴道清洗液样品，并测量这些粘膜部位中的抗体。当通过ELISA测定唾液和阴道清洗液的F8和SF162 env结合时，在除SC-Ad-埃博拉病毒对照组之外的大多数组中观测到这些应答(图25)。
对这些粘膜抗体似乎存在局部影响。在主要通过IN途径(IM-IN-IN和IN-IN-IN)用SC-Ad免疫的动物中，靠近该免疫部位的唾液中的结合抗体较高，但在更远的阴道部位较低(图25)。当在这些粘膜样品中测量ADCC活性时，这些应答是高度变化的(图17)。尽管如此，与对照动物相比，在IN-IN-IN组中观测到更高的ADCC活性(ANOVA，p<0.05)。
一次蛋白加强后的全身性细胞免疫应答
对紧接第二次F8 Env蛋白加强前收集的样品，通过ELISPOT测定第38周PBMC中针对Env和针对腺病毒的T细胞。所有Env免疫的动物在其PBMC中都具有Env特异性IFN-γ分泌细胞(图18A)。在接受至少一次粘膜免疫的动物中，Env特异性IFN-γSFC的水平通常增加。然而，与SC-Ad埃博拉病毒免疫的对照动物相比时，IFN-γSFC仅在IN-IN-IN SC-Ad组中显著更高(ANOVA，p<0.05)。在该时间点，与抗-Env SFC相比，所有组的抗-Ad SFC都相对较低。
第二次蛋白加强后的全身性细胞免疫应答
第40周时，通过ELISPOT测定PBMC和腹股沟淋巴结细胞中的Env特异性IFN-γSFC(图18B)。该蛋白加强将PBMC和淋巴结中的Env特异性SFC增加到所有Env免疫动物中相似的水平。
粘膜细胞运输
第40周时对直肠活检样品的流式细胞术显示直肠部位有相似数量的α4β7CD4和CD8细胞(图19A)。IN初免组中有数量增加的趋势，但这些未达到显著性。直肠组织中活化的CD69+CD4+细胞数目在各组之间相似(图19B)。类似地，该粘膜部位中的FoxP3+CD4+细胞没有明显不同(图19B)。
抗原特异性Tfh细胞分布
第40周时测量PBMC和淋巴结样品中的CXCR5+IL-21+CD4+滤泡辅助T(Tfh)细胞(图20)。与其他组相比，由Ad和蛋白仅通过IM途径免疫的动物在PBMC中具有显著更高的外周Tfh(pTfh)细胞(图20)。在淋巴结中，Tfh细胞在对照组和仅IM组中最低。相反地，在最后一次蛋白加强后，接受至少一次IN粘膜免疫的动物中大约有一半在其淋巴结中可检测到Tfh(图20)。
利用SHIVSF162P3进行直肠攻击
用HIV分离株SHIVSF162P3直肠攻击经免疫的恒河猴。将四只未免疫的对照动物加入研究中，每组每周通过直肠接种由NIH提供的SHIVSF162P3攻击原液的1ml 1:300稀释液进行攻击。该攻击等同于在恒河猴PBMC上的4.3TCID50和在TZM-bl细胞上的137TCID50。第一次攻击后，未免疫对照组中的2只动物和IM-IM-IM组中的2只动物被感染(图21)。每个混合途径组(IM-IN-IN和IN-IM-IM)中的一只动物在一次攻击后被感染。在第一次攻击后，IN-IN-IN组中没有动物被感染。血浆中的病毒载量表明，除埃博拉病毒组动物外的所有动物在3次攻击后均达到高病毒载量(图22B)。IN-IN-IN组中的动物在达到这些高病毒载量方面有延迟。
随着攻击的继续，所有组中的动物都被感染，除了埃博拉病毒组中的一只动物在7次攻击后保持未感染。回顾性检查Trim5α和MHC等位基因(表2)。该分析未显示抗性埃博拉病毒组动物中明显的保护性基因。大多数动物无法用可能使它们受到适度保护的等位基因进行分类，但大多数组至少有一只动物凭借这些等位基因具有更高的保护可能性。应当注意的是，IM-IM-IM和IN-IN-IN组中有2/4只动物具有Trim5a和MHC等位基因，这可能预示着针对SIVsmm和可能地SHIVSF162P3具有更高的先天保护可能性(表2)。
表2回顾性筛选SIV保护性基因等位基因
Figure BDA0003130270520000481
当根据动物是否用SC-Ad通过IM或IN途径初免进行分组并进行Kaplan-Meier生存分析时，8只IM初免动物的感染与对照动物的感染平行(图22A)。相反地，用SC-Ad-Env通过粘膜IN途径初免的8只动物中感染稍有延迟。
组织中的死后病毒载量
攻击研究在第一次攻击后9周终止。分离PBMC和消化道组织，纯化RNA，并评估SHIV病毒基因组(图22B)。死后PBMC具有不同水平的SHIV病毒RNA，IN-IN-IN组的水平略低于IM-IM-IM组。结肠中的平均病毒RNA在IN-IN-IN组中比IM-IM-IM组低15倍(图23)。通过ANOVA该差异未达到显著性，但双尾T检验得到的p值为0.0079。
该实施例证明可将复制型SC-Ad载体用作针对HIV-1和其他传染病进行接种疫苗的稳健且安全的平台。SC-Ad能够在受感染的人细胞中将抗原和细胞因子基因扩增多达10,000倍。免疫应答的增强程度远高于RD-Ad载体介导的那些应答，而RD-Ad载体目前正在人体中作为HIV-1疫苗进行测试。HIV疫苗可转移到利用SC-Ad载体(例如基于具有低血清阳性率的重组Ad的SC-Ad载体)来扩展HIV抗原基因的疫苗平台。
实施例8.针对丙型肝炎病毒(HCV)抗原的免疫应答的体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定
小鼠用表达CMV巨细胞病毒(CMV)糖蛋白B(gB)cDNA或HCV抗原2.4的Ad657免疫。在注射到免疫小鼠中之前，同系(syngeneic)细胞用HCV肽脉冲并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记。通过在HCV而非CMV免疫的动物中经标记细胞的减少，观测到针对HCV的同类(cognate)CTL活性(图26)。
实施例9.条件复制型Ad(CRAd)
图39和图43显示Ad6、Ad657及其变体中涉及E1蛋白突变以将病毒转化为条件复制型Ad(CRAd)的突变的示意图。这些包括分别阻断与p300和pRB结合的dl1101和/或dl1107。
图56显示野生型Ad中E1A以及Ad变体E1Adl1101、E1Adl1107和E1A dl1101/1107的N末端氨基酸序列。
还显示了用SEQ ID NO:44的前列腺特异性启动子probasin-E1 DNA序列替代AdE1启动子以产生CRAd，Ad-PB(图55)。probasin启动子是雄激素依赖性的，因而将在雄性激素敏感性肿瘤如LNCaP中起作用，但在雄性激素抗性肿瘤如DU145中不起作用。
A549细胞用所示Ad6或Ad657变体以所示病毒浓度(vp/细胞)感染，5天后通过结晶紫染色测量细胞活力(图40)。
通过复制缺陷型Ad(RD-Ad)、Ad6、CRAd6-dl1101/dl1107或CRAd6-PB对非癌细胞的杀伤。显示了将Ad6和Ad657修饰为条件复制型Ad(CRAd)(图44)。
图45示出可复制型Ad5、Ad6、Ad657和所示CRAd对癌细胞的杀伤。显示了将Ad6和Ad657修饰为条件复制型Ad(CRAd)。
图46示出的结果显示将Ad6和Ad657修饰为在乳腺癌细胞中的条件复制型Ad(CRAd)。
图47示出的结果显示将Ad6和Ad657修饰为在前列腺癌细胞和肺癌细胞中的条件复制型Ad(CRAd)。
可复制型Ad6或所示CRAd对小鼠中DU145肿瘤生长的体内作用。图48示出单次静脉内注射具有人前列腺肿瘤的小鼠后，Ad6和Ad657的修饰在体内为条件复制型Ad(CRAd)。
可复制型Ad6或所示CRAd对具有DU145肿瘤的小鼠存活的体内作用。图49示出单次静脉内注射具有人前列腺肿瘤的小鼠后，Ad6和Ad657的修饰在体内为条件复制型Ad(CRAd)。
图51显示用来自黑猩猩AdC68的较短纤毛修饰Ad657降低了功效。
在一个实施方案中，Ad 6/56/6病毒具有来自Ad6的HVR1和7与来自Ad657的HVR 2-6。图52显示在具有和不具有CRAd修饰的情况下Ad 6/56/6病毒杀死人肺癌细胞。
通过涉及E3蛋白突变的Ad变体对肿瘤细胞的杀伤。免疫活性叙利亚仓鼠皮下植入HaK肾癌肿瘤。当其达到200μl体积时，通过静脉内途径单次注射所示Ad6病毒，其由具有和不具有E3(DE3)以及具有或不具有随机NHS-PEG化构建而来。随时间测量肿瘤尺寸。数据显示缺失所有E3基因使溶瘤病毒的有效性降低(Ad6-deltaE3-Luc相比Ad6-Luc)(图58)。
Ad纤毛蛋白是介导初始附着步骤的三个明显相同亚基的复合物。天然Ad6纤毛蛋白包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列并结合CAR。
本发明的另一方面，产生了具有对于亲本Ad而言非天然的不同纤毛蛋白的纤毛修饰的重组Ad。产生了包含来自不同Ad株的衣壳蛋白的重组Ad，包括CRAd，例如，包含异源Ad35纤毛多肽或黑猩猩C68纤毛多肽、+/-K7肽的重组Ad(图62至图69)。
嵌合Ad，AdF35纤毛嵌合体，具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列，比Ad5和Ad6纤毛蛋白更短，并将病毒重新靶向于CD46。
纤毛经修饰的重组Ad，包含具有SEQ ID NO:62的序列的K7纤毛，其将病毒靶向于细胞上的硫酸肝素蛋白聚糖和负电荷。
重组嵌合Ad，6/FC68纤毛包含SEQ ID NO:63的序列，是具有来自黑猩猩腺病毒C68的纤毛蛋白的嵌合Ad。该纤毛蛋白比Ad5或Ad6纤毛蛋白更短并结合CAR。
重组嵌合Ad，6/FC68-K7纤毛包含SEQ ID NO:64的序列，是具有来自黑猩猩腺病毒C68的纤毛蛋白的嵌合Ad。该纤毛蛋白比Ad5或Ad6纤毛蛋白更短。6/FC68-K7纤毛结合CAR，并重新靶向于硫酸肝素和负电荷。
重组嵌合Ad，6/FC68-HI-K7纤毛包含SEQ ID NO:65的序列，是具有来自黑猩猩腺病毒C68的纤毛蛋白的嵌合Ad。该纤毛蛋白比Ad5或Ad6纤毛蛋白更短。6/FC68-HI-K7纤毛结合CAR并重新靶向于硫酸肝素和负电荷。
实施例10.腺病毒的血清型转换
图41是示出Ad治疗周期的示意图。在实施方案中，举例说明了在治疗过程中用不同Ad进行血清型转换(图41A)。
溶瘤腺病毒血清型转换后的前列腺肿瘤靶向
通过单次静脉内(IV)注射Ad657或CRAd657来治疗在其侧面具有DU145前列腺肿瘤的小鼠。这些小鼠用表达GFP荧光素酶的替代Ad6溶瘤病毒或Ad6-F35进行第二次治疗，并通过成像测量荧光素酶活性。Ad6具有Ad6六邻体和靶向CAR的纤毛。Ad6-F35具有Ad6六邻体和靶向CD46的Ad35纤毛。图42显示用靶向肿瘤且肝脏脱靶感染降低的病毒进行血清型转换溶瘤的能力。
在血清型转换的另一实例中，通过单次静脉内(IV)注射3e10病毒颗粒(vp)的Ad657或CRAd657治疗在其侧面具有LNCaP前列腺肿瘤的小鼠。5个月后，这些小鼠用3e10 vp的表达GFP荧光素酶和纤毛变体K7(添加7个赖氨酸)、F35(具有Ad35纤毛)或KKTK-C68(Ad6KKTK柔性结构域之后融合黑猩猩C68纤毛)的替代Ad6/57/6溶瘤病毒进行第二次治疗。KKTK-C68病毒还添加了密码子优化的E4 34K基因以提高病毒生产力。7天后通过成像测量荧光素酶活性。所有Ad6/57/6都有具有来自Ad6的HVR1和7与来自Ad57的HVR2-6的六邻体。Ad6/57/6和KKTK-C68具有靶向CAR的纤毛。Ad6/57/6-F35具有靶向CD46的Ad35纤毛。K7增加与细胞上的负电荷的结合，包括结合硫酸肝素蛋白聚糖。图70显示用靶向肿瘤且肝脏脱靶感染降低的病毒进行血清型转换溶瘤的能力。
非人灵长类动物接种疫苗期间的血清型转换
在图14至图25中，恒河猴用表达HIV包膜的复制型单周期Ad6免疫，然后用表达HIV包膜的单周期Ad657通过血清型转换加强。在这些免疫后，每只动物都用包膜蛋白加强。每张图示出产生获得性抗体或细胞免疫应答，以及动物如何抵抗SHIVSF162P3病毒的直肠攻击。图14记录了血清型转换的价值，其中改变为Ad657产生抗体应答的显著增加。
实施例11.溶瘤癌症疫苗
BALB/c小鼠通过肌内途径用1010病毒颗粒的具有完整E3且表达人叶酸受体α的CRAd-657-dl1101/1107-FolR或用PBS进行免疫。一次免疫后2周，收集血清并利用抗IgM抗体通过ELISA分析抗叶酸受体α抗体进行检测(免疫后的这种早期时间点时所有抗体为IgM)。数据显示通过该CRAd产生针对已知癌症抗原叶酸受体α的抗体。通过T检验，p–0.07(图53)。
实施例12.E3免疫逃避基因对溶瘤活性的影响
图57示出Ad中不同E3免疫逃避基因的示意图。E3 19K保护受感染细胞免受T细胞和NK细胞的伤害。RID蛋白保护受感染的细胞免受死亡诱导配体(FAS、TRAIL、TNFR和EGFR)的影响。14.7K抑制受感染细胞中凋亡的内在激活。种类C Ad还表达11.6K，被称为腺病毒死亡蛋白(ADP)。ADP的过表达加速细胞死亡，但总体细胞死亡是相等的。种类49K与T细胞和NK细胞上的CD46结合，导致这些细胞的下调和NK细胞对I类MHC缺陷细胞的细胞杀伤效率更低。
图58显示当溶瘤腺病毒中不存在这些免疫逃避基因时，在肾癌的免疫活性仓鼠模型中，E3 12.5K的部分缺失和E3 6.7K、19K、11.6K(ADP)、10.4K(RIDα)、14.5K(RIDβ)和14.7K基因的完全缺失降低了溶瘤功效。
其他实施方案
应当理解，虽然已结合其详细说明描述了本发明，但前述描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH
<120> 腺病毒和使用腺病毒的方法
<130> ADZE 1 US SEQ
<150> 62/770,631
<151> 2018-11-21
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向多肽
<400> 40
Met Gly Arg Thr Val Gln Ser Gly Asp Gly Thr Pro Ala Gln Thr Gln
1 5 10 15
Pro Ser Val Asn
20
<210> 41
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向多肽
<400> 41
Met Ala Arg Thr Val Thr Ala Asn Val Pro Gly Met Gly Glu Gly Met
1 5 10 15
Val Val Val Pro
20
<210> 42
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺病毒E1A N末端多肽
<400> 42
Met Arg His Ile Ile Cys His Gly Gly Val Ile Thr Glu Glu Met Ala
1 5 10 15
Ala Ser Leu Leu Asp Gln Leu Ile Glu Glu Val Leu Ala Asp Asn Leu
20 25 30
Pro Pro Pro Ser His Phe Glu Pro Pro Thr Leu His Glu Leu Tyr Asp
35 40 45
Leu Asp Val Thr Ala Pro Glu Asp Pro Asn Glu Glu Ala Val Ser Gln
50 55 60
Ile Phe Pro Glu Ser Val Met Leu Ala Val Gln Glu Gly Ile Asp Leu
65 70 75 80
Phe Thr Phe Pro Pro Ala Pro Gly Ser Pro Glu Pro Pro His Leu Ser
85 90 95
Arg Gln Pro Glu Gln Pro Glu Gln Arg Ala Leu Gly Pro Val Ser Met
100 105 110
Pro Asn Leu Val Pro Glu Val Ile Asp Leu Thr Cys His Glu Ala Gly
115 120 125
Phe Pro Pro Ser
130
<210> 43
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E1A N末端多肽
<400> 43
Met Arg His Ile Glu Glu Val Leu Ala Asp Asn Leu Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
His Phe Glu Pro Pro Thr Leu His Glu Leu Tyr Asp Leu Asp Val Thr
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Pro Asn Glu Glu Ala Val Ser Gln Ile Phe Pro Glu
35 40 45
Ser Val Met Leu Ala Val Gln Glu Gly Ile Asp Leu Phe Thr Phe Pro
50 55 60
Pro Ala Pro Gly Ser Pro Glu Pro Pro His Leu Ser Arg Gln Pro Glu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Gln Arg Ala Leu Gly Pro Val Ser Met Pro Asn Leu Val
85 90 95
Pro Glu Val Ile Asp Leu Thr Cys His Glu Ala Gly Phe Pro Pro Ser
100 105 110
<210> 44
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E1A N末端多肽
<400> 44
Met Arg His Ile Ile Cys His Gly Gly Val Ile Thr Glu Glu Met Ala
1 5 10 15
Ala Ser Leu Leu Asp Gln Leu Ile Glu Glu Val Leu Ala Asp Asn Leu
20 25 30
Pro Pro Pro Ser His Phe Glu Pro Pro Thr Leu His Glu Leu Tyr Asp
35 40 45
Leu Asp Val Thr Ala Pro Glu Asp Pro Asn Glu Glu Ala Val Ser Gln
50 55 60
Ile Phe Pro Glu Ser Val Met Leu Ala Val Gln Glu Gly Ile Asp Leu
65 70 75 80
Phe Thr Phe Pro Pro Ala Pro Gly Ser Pro Glu Pro Pro His Leu Ser
85 90 95
Arg Gln Pro Glu Gln Pro Glu Gln Arg Ala Leu Gly Pro Val Cys His
100 105 110
Glu Ala Gly Phe Pro Pro Ser
115
<210> 45
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E1A N末端多肽
<400> 45
Met Arg His Ile Glu Glu Val Leu Ala Asp Asn Leu Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
His Phe Glu Pro Pro Thr Leu His Glu Leu Tyr Asp Leu Asp Val Thr
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Pro Asn Glu Glu Ala Val Ser Gln Ile Phe Pro Glu
35 40 45
Ser Val Met Leu Ala Val Gln Glu Gly Ile Asp Leu Phe Thr Phe Pro
50 55 60
Pro Ala Pro Gly Ser Pro Glu Pro Pro His Leu Ser Arg Gln Pro Glu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Gln Arg Ala Leu Gly Pro Val Cys His Glu Ala Gly Phe
85 90 95
Pro Pro Ser
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞结合肽
<400> 46
Arg Glu Asp Val Tyr
1 5
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 乳腺癌结合肽
<400> 47
Ile Ser Leu Ser Ser His Arg Ala Thr Trp Val Val
1 5 10
<210> 48
<211> 1608
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Probasin-E1核酸
<400> 48
Thr Cys Gly Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Thr Ala Thr Cys Gly
1 5 10 15
Ala Thr Ala Ala Gly Cys Thr Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Thr Ala
20 25 30
Thr Gly Ala Thr Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys
35 40 45
Thr Thr Ala Gly Thr Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Ala Ala
50 55 60
Thr Ala Gly Gly Gly Ala Cys Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys
65 70 75 80
Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Cys
85 90 95
Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly
100 105 110
Gly Cys Ala Thr Thr Gly Gly Gly Cys Ala Thr Thr Gly Thr Cys Cys
115 120 125
Ala Thr Gly Cys Cys Thr Ala Gly Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys
130 135 140
Thr Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Thr Thr Gly
145 150 155 160
Thr Ala Thr Ala Cys Thr Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala
165 170 175
Ala Thr Gly Thr Thr Cys Thr Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr
180 185 190
Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Gly Thr Thr
195 200 205
Thr Ala Ala Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Cys
210 215 220
Cys Ala Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Thr Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr
245 250 255
Ala Gly Thr Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Thr Ala Ala Thr Ala
260 265 270
Gly Gly Gly Ala Cys Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Cys
275 280 285
Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Cys Cys Thr
290 295 300
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys
305 310 315 320
Ala Thr Thr Gly Gly Gly Cys Ala Thr Thr Gly Thr Cys Cys Ala Thr
325 330 335
Gly Cys Cys Thr Ala Gly Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Thr Cys
340 345 350
Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Thr Thr Gly Thr Ala
355 360 365
Thr Ala Cys Thr Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala Ala Thr
370 375 380
Gly Thr Cys Ala Ala Thr Gly Thr Cys Thr Gly Thr Gly Thr Ala Cys
385 390 395 400
Ala Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr
405 410 415
Gly Cys Ala Ala Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Thr
420 425 430
Gly Cys Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala
435 440 445
Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys
450 455 460
Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala
465 470 475 480
Cys Cys Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Gly Gly Thr Cys
485 490 495
Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys Gly Ala
500 505 510
Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Gly Cys Gly Cys Ala
515 520 525
Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala Cys Cys Cys Gly Gly
530 535 540
Thr Gly Ala Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala Ala Gly Ala Gly Gly
545 550 555 560
Cys Cys Ala Cys Thr Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Ala
565 570 575
Gly Cys Gly Ala Gly Thr Ala Gly Ala Gly Thr Thr Thr Thr Cys Thr
580 585 590
Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Gly Cys Thr Cys Cys Gly
595 600 605
Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala
610 615 620
Thr Gly Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly
625 630 635 640
Cys Cys Ala Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr Thr Ala Thr Thr
645 650 655
Ala Cys Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly
660 665 670
Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala
675 680 685
Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Thr Ala
690 695 700
Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Ala Ala Thr Cys Thr Thr Cys
705 710 715 720
Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Gly Cys Cys Ala Thr Thr Thr
725 730 735
Thr Gly Ala Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr Thr
740 745 750
Cys Ala Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr Thr
755 760 765
Thr Ala Gly Ala Cys Gly Thr Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys
770 775 780
Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly
785 790 795 800
Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Thr Cys Gly Cys Ala Gly Ala
805 810 815
Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Thr
820 825 830
Ala Ala Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly
835 840 845
Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Cys Thr Thr Ala Thr
850 855 860
Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys
865 870 875 880
Gly Cys Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly
885 890 895
Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Cys Cys Cys
900 905 910
Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys
915 920 925
Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Thr Gly
930 935 940
Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Cys Thr Ala Thr Gly Cys
945 950 955 960
Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala
965 970 975
Gly Gly Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Thr Cys Thr Thr Ala Cys Cys
980 985 990
Thr Gly Cys Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr
995 1000 1005
Thr Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Gly
1010 1015 1020
Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly
1025 1030 1035
Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Thr Gly Thr
1040 1045 1050
Thr Ala Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys
1055 1060 1065
Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Cys Gly Gly Thr Thr
1070 1075 1080
Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Thr Cys Ala Thr Thr
1085 1090 1095
Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala
1100 1105 1110
Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Ala
1115 1120 1125
Thr Thr Ala Thr Gly Thr Gly Thr Thr Cys Gly Cys Thr Thr Thr
1130 1135 1140
Gly Cys Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr
1145 1150 1155
Gly Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Thr Thr Thr Gly Thr Cys Thr
1160 1165 1170
Ala Cys Ala Gly Thr Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr
1175 1180 1185
Thr Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Thr Cys Gly Gly Thr Gly
1190 1195 1200
Ala Thr Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr
1205 1210 1215
Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr
1220 1225 1230
Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Ala Cys Ala
1235 1240 1245
Gly Thr Thr Thr Thr Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala
1250 1255 1260
Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly Thr Ala Thr Thr Gly Thr Gly
1265 1270 1275
Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Cys
1280 1285 1290
Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly
1295 1300 1305
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys
1310 1315 1320
Cys Ala Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly
1325 1330 1335
Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys Cys Gly Gly Cys
1340 1345 1350
Gly Thr Cys Cys Thr Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys
1355 1360 1365
Cys Thr Gly Cys Thr Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys
1370 1375 1380
Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly
1385 1390 1395
Thr Gly Thr Cys Thr Ala Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala
1400 1405 1410
Ala Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Gly Gly Ala Thr Ala
1415 1420 1425
Gly Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Thr Cys
1430 1435 1440
Cys Thr Thr Cys Thr Ala Ala Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys
1445 1450 1455
Cys Thr Gly Ala Gly Ala Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Gly Gly
1460 1465 1470
Thr Gly Gly Thr Cys Cys Cys Gly Cys Thr Gly Thr Gly Cys Cys
1475 1480 1485
Cys Cys Ala Thr Thr Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Thr Thr Gly
1490 1495 1500
Cys Cys Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly
1505 1510 1515
Gly Gly Cys Gly Thr Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly
1520 1525 1530
Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Thr Ala Thr Cys Gly Ala Gly Gly
1535 1540 1545
Ala Cys Thr Thr Gly Cys Thr Thr Ala Ala Cys Gly Ala Gly Thr
1550 1555 1560
Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly
1565 1570 1575
Ala Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Ala Ala Cys
1580 1585 1590
Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Ala Ala Gly
1595 1600 1605
<210> 49
<211> 959
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 六邻体多肽
<400> 49
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ser
1 5 10 15
Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala
20 25 30
Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe Arg Asn Pro
35 40 45
Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu
50 55 60
Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Ala Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met
85 90 95
Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr
100 105 110
Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly
115 120 125
Ala Pro Asn Ser Cys Glu Trp Asp Glu Asp Asp Thr Gln Val Gln Val
130 135 140
Ala Ala Glu Asp Asp Gln Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Gln Leu Pro
145 150 155 160
Gln Gln Arg Asn Gly Lys Lys Thr His Val Tyr Ala Gln Ala Pro Phe
165 170 175
Ala Gly Glu Ala Ile Asn Lys Asn Gly Leu Gln Ile Gly Thr Asn Gly
180 185 190
Ala Ala Thr Glu Gly Asn Lys Glu Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln
195 200 205
Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu Ser Gln Trp Asn Glu Ala Glu Ser Ser
210 215 220
Val Ala Gly Gly Arg Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro Cys
225 230 235 240
Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg Pro Thr Asn Ser Asn Gly Gly Gln Gly Val
245 250 255
Met Val Glu Gln Asn Gly Lys Leu Glu Ser Gln Val Glu Met Gln Phe
260 265 270
Phe Ser Thr Ser Val Asn Ala Met Asn Glu Ala Asn Ala Ile Gln Pro
275 280 285
Lys Leu Val Leu Tyr Ser Glu Asp Val Asn Met Glu Thr Pro Asp Thr
290 295 300
His Leu Ser Tyr Lys Pro Gly Lys Ser Asp Asp Asn Ser Lys Ala Met
305 310 315 320
Leu Gly Gln Gln Ser Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Ala Phe Arg
325 330 335
Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly
340 345 350
Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln
355 360 365
Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly
370 375 380
Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr
385 390 395 400
Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Thr Glu Asp Glu Leu
405 410 415
Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly Ile Gly Val Thr Asp Thr Tyr
420 425 430
Gln Ala Ile Lys Ala Thr Asn Gly Asn Gly Gly Ala Thr Thr Trp Ala
435 440 445
Gln Asp Asn Thr Phe Ala Glu Arg Asn Glu Ile Gly Val Gly Asn Asn
450 455 460
Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu Asn Ala Asn Leu Trp Arg Asn Phe Leu
465 470 475 480
Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Lys Leu Lys Tyr Asn Pro
485 490 495
Thr Asn Val Glu Ile Ser Asp Asn Pro Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn
500 505 510
Lys Arg Val Val Ala Pro Gly Leu Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu Gly
515 520 525
Ala Arg Trp Ser Leu Asp Tyr Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His
530 535 540
His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly
545 550 555 560
Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile
565 570 575
Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe
580 585 590
Arg Lys Asp Val Asn Met Val Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu
595 600 605
Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile Lys Phe Asp Ser Ile Cys Leu Tyr Ala
610 615 620
Thr Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met
625 630 635 640
Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Ser Ala
645 650 655
Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala Thr Asn Val Pro Ile
660 665 670
Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ala Phe Thr
675 680 685
Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr Pro Ser Leu Gly Ser Gly Tyr Asp Pro
690 695 700
Tyr Tyr Thr Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr
705 710 715 720
Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ala Ile Thr Phe Asp Ser Ser Val
725 730 735
Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile
740 745 750
Lys Arg Ser Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn Met
755 760 765
Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val Gln Met Leu Ala Asn Tyr Asn Ile Gly
770 775 780
Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro Glu Ser Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser
785 790 795 800
Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg Gln Val Val Asp Asp Thr
805 810 815
Lys Tyr Lys Asp Tyr Gln Gln Val Gly Ile Ile His Gln His Asn Asn
820 825 830
Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr Met Arg Glu Gly Gln Ala
835 840 845
Tyr Pro Ala Asn Val Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Lys Thr Ala Val Asp
850 855 860
Ser Ile Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp Arg Thr Leu Trp Arg Ile
865 870 875 880
Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly Ala Leu Thr Asp Leu Gly
885 890 895
Gln Asn Leu Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala Leu Asp Met Thr Phe
900 905 910
Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Pro Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu
915 920 925
Val Phe Asp Val Val Arg Val His Gln Pro His Arg Gly Val Ile Glu
930 935 940
Thr Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr
945 950 955
<210> 50
<211> 967
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 六邻体多肽
<400> 50
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ser
1 5 10 15
Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala
20 25 30
Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe Arg Asn Pro
35 40 45
Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu
50 55 60
Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Ala Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met
85 90 95
Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr
100 105 110
Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly
115 120 125
Ala Pro Asn Ser Cys Glu Trp Asp Glu Asp Asp Thr Gln Val Gln Val
130 135 140
Ala Ala Glu Asp Asp Gln Asp Asp Asp Ser Ser Cys Ser Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Glu Glu Glu Glu Gln Leu Pro Gln Gln Arg Asn Gly Lys Lys Thr
165 170 175
His Val Tyr Ala Gln Ala Pro Phe Ala Gly Glu Ala Ile Asn Lys Asn
180 185 190
Gly Leu Gln Ile Gly Thr Asn Gly Ala Ala Thr Glu Gly Asn Lys Glu
195 200 205
Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu Ser
210 215 220
Gln Trp Asn Glu Ala Glu Ser Ser Val Ala Gly Gly Arg Val Leu Lys
225 230 235 240
Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg Pro Thr
245 250 255
Asn Ser Asn Gly Gly Gln Gly Val Met Val Glu Gln Asn Gly Lys Leu
260 265 270
Glu Ser Gln Val Glu Met Gln Phe Phe Ser Thr Ser Val Asn Ala Met
275 280 285
Asn Glu Ala Asn Ala Ile Gln Pro Lys Leu Val Leu Tyr Ser Glu Asp
290 295 300
Val Asn Met Glu Thr Pro Asp Thr His Leu Ser Tyr Lys Pro Gly Lys
305 310 315 320
Ser Asp Asp Asn Ser Lys Ala Met Leu Gly Gln Gln Ser Met Pro Asn
325 330 335
Arg Pro Asn Tyr Ile Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln
355 360 365
Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr
370 375 380
Gln Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met
385 390 395 400
Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu
405 410 415
Asn His Gly Thr Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly
420 425 430
Gly Ile Gly Val Thr Asp Thr Tyr Gln Ala Ile Lys Ala Thr Asn Gly
435 440 445
Asn Gly Gly Ala Thr Thr Trp Ala Gln Asp Asn Thr Phe Ala Glu Arg
450 455 460
Asn Glu Ile Gly Val Gly Asn Asn Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu Asn
465 470 475 480
Ala Asn Leu Trp Arg Asn Phe Leu Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr Leu
485 490 495
Pro Asp Lys Leu Lys Tyr Asn Pro Thr Asn Val Glu Ile Ser Asp Asn
500 505 510
Pro Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn Lys Arg Val Val Ala Pro Gly Leu
515 520 525
Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu Gly Ala Arg Trp Ser Leu Asp Tyr Met
530 535 540
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<220>
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Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Thr Glu Asp Glu Leu
405 410 415
Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly Ile Gly Val Thr Asp Thr Tyr
420 425 430
Gln Ala Ile Lys Ala Thr Asn Gly Asn Gly Gly Ala Thr Thr Trp Ala
435 440 445
Gln Asp Asn Thr Phe Ala Glu Arg Asn Glu Ile Gly Val Gly Asn Asn
450 455 460
Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu Asn Ala Asn Leu Trp Arg Asn Phe Leu
465 470 475 480
Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Lys Leu Lys Tyr Asn Pro
485 490 495
Thr Asn Val Glu Ile Ser Asp Asn Pro Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn
500 505 510
Lys Arg Val Val Ala Pro Gly Leu Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu Gly
515 520 525
Ala Arg Trp Ser Leu Asp Tyr Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His
530 535 540
His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly
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Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile
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Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe
580 585 590
Arg Lys Asp Val Asn Met Val Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu
595 600 605
Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile Lys Phe Asp Ser Ile Cys Leu Tyr Ala
610 615 620
Thr Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met
625 630 635 640
Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Ser Ala
645 650 655
Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala Thr Asn Val Pro Ile
660 665 670
Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ala Phe Thr
675 680 685
Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr Pro Ser Leu Gly Ser Gly Tyr Asp Pro
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755 760 765
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Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr Met Arg Glu Gly Gln Ala
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Tyr Pro Ala Asn Val Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Lys Thr Ala Val Asp
850 855 860
Ser Ile Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp Arg Thr Leu Trp Arg Ile
865 870 875 880
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 六邻体多肽
<400> 59
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Thr Thr
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<220>
<223> 纤毛多肽
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Leu Ser Ser Val Asn Leu Val Leu Arg Phe Asp Asp Asn Gly Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤毛多肽
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<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纤毛多肽
<400> 62
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275 280 285
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20 25 30
Phe Val Ser Pro Asn Gly Phe Gln Glu Ser Pro Pro Gly Val Leu Ser
35 40 45
Leu Arg Leu Ser Glu Pro Leu Val Thr Lys Asn Gly Glu Ile Thr Leu
50 55 60
Lys Leu Gly Glu Gly Val Asp Leu Asp Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ser
65 70 75 80
Asn Thr Ala Thr Lys Ala Ala Ala Pro Leu Ser Phe Ser Asn Asn Thr
85 90 95
Ile Ser Leu Asn Met Asp His Pro Phe Tyr Thr Lys Asp Gly Lys Leu
100 105 110
Ser Leu Gln Val Ser Pro Pro Leu Asn Ile Leu Arg Thr Ser Ile Leu
115 120 125
Asn Thr Leu Ala Leu Gly Phe Gly Ser Gly Leu Gly Leu Arg Gly Ser
130 135 140
Ala Leu Ala Val Gln Leu Val Ser Pro Leu Thr Phe Asp Thr Asp Gly
145 150 155 160
Asn Ile Lys Leu Thr Leu Asp Arg Gly Leu His Val Thr Thr Gly Asp
165 170 175
Ala Ile Glu Ser Asn Ile Ser Trp Ala Lys Gly Leu Lys Phe Glu Asp
180 185 190
Gly Ala Ile Ala Thr Asn Ile Gly Asn Gly Leu Glu Phe Gly Ser Ser
195 200 205
Ser Thr Glu Thr Gly Val Asp Asp Ala Tyr Pro Ile Gln Val Lys Leu
210 215 220
Gly Ser Gly Leu Ser Phe Asp Ser Thr Gly Ala Ile Met Ala Gly Asn
225 230 235 240
Lys Glu Asp Asp Lys Leu Thr Leu Trp Thr Thr Pro Asp Pro Ser Pro
245 250 255
Asn Cys Gln Ile Leu Ala Glu Asn Asp Ala Lys Leu Thr Leu Cys Leu
260 265 270
Thr Lys Cys Gly Ser Gln Ile Leu Ala Thr Val Ser Val Leu Val Val
275 280 285
Gly Ser Gly Asn Leu Asn Pro Ile Thr Gly Thr Val Ser Ser Ala Gln
290 295 300
Val Phe Leu Arg Phe Asp Ala Asn Gly Val Leu Leu Thr Glu His Ser
305 310 315 320
Thr Leu Lys Lys Tyr Trp Gly Tyr Arg Gln Gly Asp Ser Ile Asp Gly
325 330 335
Thr Pro Tyr Thr Asn Ala Val Gly Phe Met Pro Asn Leu Lys Ala Tyr
340 345 350
Pro Lys Ser Gln Ser Ser Thr Thr Lys Asn Asn Ile Val Gly Gln Val
355 360 365
Tyr Met Asn Gly Asp Val Ser Lys Pro Met Leu Leu Thr Ile Thr Leu
370 375 380
Asn Gly Thr Asp Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Lys Lys Lys Lys Lys
385 390 395 400
Lys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Ser Met Ser Phe Ser Tyr
405 410 415
Thr Trp Thr Asn Gly Ser Tyr Val Gly Ala Thr Phe Gly Ala Asn Ser
420 425 430
Tyr Thr Phe Ser Tyr Ile Ala Gln Glu
435 440

Claims (26)

1.重组腺病毒(Ad)，其包含(a)来自第一Ad株的Ad衣壳多肽，和(b)来自一种或多种不同Ad株的至少一个六邻体多肽，其中所述六邻体多肽的至少一个高变区(HVR)与所述第一Ad株的HVR不同。
2.权利要求1所述的重组Ad，其中所述第一Ad株和一种或多种不同Ad株的血清型不同。
3.权利要求1至2所述的重组Ad，其中所述第一Ad株是人Ad6株，并且其中第二Ad株是人Ad57株。
4.权利要求1至3中任一项所述的重组Ad，其还包含来自一种或多种不同Ad株的衣壳多肽，其中所述衣壳多肽不同于所述第一Ad株的衣壳多肽。
5.权利要求1至4中任一项所述的重组Ad，其还包含一种或多种靶向多肽、抗原多肽、酶、受体或配体。
6.权利要求5所述的重组Ad，其中所述靶向多肽包含选自SEQ ID NO:1-41和SEQ IDNO:46-47的氨基酸序列。
7.权利要求1至6中任一项所述的重组Ad，其还包含氨基酸取代和/或氨基酸修饰，其中所述氨基酸取代为半胱氨酸，并且所述氨基酸修饰选自PEG化和BAP化。
8.权利要求1至7中任一项所述的重组Ad，其中所述重组Ad是条件复制型Ad(CRAd)。
9.权利要求8所述的重组Ad，其包含SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
10.重组腺病毒(Ad)，其包含(a)编码来自第一Ad株的六邻体多肽的Ad基因组，和(b)编码来自一种或多种不同Ad株的至少一个六邻体多肽的核酸，其中所述六邻体多肽的至少一个高变区(HVR)与所述第一Ad株的Ad基因组编码的HVR不同。
11.权利要求10所述的重组Ad，其中所述第一Ad株和一种或多种不同Ad株的血清型不同。
12.权利要求10至11所述的重组Ad，其中所述第一Ad株是人Ad6株，并且其中第二Ad株是人Ad57株。
13.权利要求10至12中任一项所述的重组Ad，其还包含来自一种或多种不同Ad株的衣壳多肽，其中所述衣壳多肽不同于所述第一Ad株的衣壳多肽。
14.权利要求10至13中任一项所述的重组Ad，其还包含编码靶向多肽、抗原多肽、酶、受体或配体的一个或多个核酸。
15.权利要求14所述的重组Ad，其中所述核酸编码具有选自SEQ ID NO:1-41和SEQ IDNO:46-47的氨基酸序列的靶向多肽。
16.权利要求10至15中任一项所述的重组Ad，其还包含氨基酸取代和/或氨基酸修饰，其中所述氨基酸取代为半胱氨酸，并且所述氨基酸修饰选自PEG化和BAP化。
17.权利要求10至16中任一项所述的重组Ad，其包含进一步的修饰，其中所述重组Ad是条件复制型Ad(CRAd)。
18.权利要求17所述的重组Ad，其包含编码SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45的氨基酸序列的核酸。
19.用于治疗患有癌症的哺乳动物的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用权利要求1至18中任一项所述的重组腺病毒(Ad)。
20.权利要求19所述的方法，其中所述癌症选自：前列腺癌，卵巢癌，肺癌，肝细胞癌，胰腺癌，肾癌，黑素瘤，脑癌，结肠癌，淋巴瘤，骨髓瘤，淋巴细胞性白血病，以及骨髓性白血病。
21.权利要求19至20中任一项所述的方法，其中所述施用包括全身施用。
22.权利要求21所述的方法，其中全身施用包括肌内、鼻内或静脉内施用。
23.权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述施用包括局部施用。
24.权利要求24所述的方法，其中所述局部施用包括肿瘤内注射。
25.权利要求1至18中任一项所述的重组Ad在治疗癌症中的用途。
26.重组腺病毒(Ad)作为治疗癌症的药物的用途，其中所述重组腺病毒(Ad)包含(a)来自第一Ad株的Ad衣壳多肽，和(b)来自一种或多种不同Ad株的至少一个六邻体多肽，其中所述六邻体多肽的至少一个高变区(HVR)与所述第一Ad株的HVR不同。
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