CN116789847B - 融合蛋白、病毒样颗粒以及疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种融合蛋白、病毒样颗粒以及疫苗,所述融合蛋白包含新型冠状病毒的RBD蛋白和人腺病毒的纤毛蛋白。相对于传统技术,本发明的有益效果包括:本申请的融合蛋白和人腺病毒衣壳蛋白能够自组装成具有12面体结构的纳米颗粒,例如直径为10‑80nm,诱导机体产生高效价中和抗体应答。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和分子生物学技术领域,特别涉及一种融合蛋白、病毒样颗粒以及疫苗。
背景技术
2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)自2019年12月以来暴发流行,当前仍在世界范围内广泛流行。接种疫苗是预防、控制传染性疾病的最有效手段,研发新型安全性高、生产方便、价格便宜的COVID-19疫苗仍有必要,不同类型的疫苗各有其优缺点。亚单位疫苗由重组表达的一种或多种病毒抗原组成,生产相对容易且安全性高。新冠病毒刺突糖蛋白(S)的受体结合域(RBD)含有主要的中和表位,是新冠亚单位疫苗疫苗研发的最主要靶抗原。
重组RBD在佐剂的辅助下可以诱导抗体应答,有极高的安全性。但重组RBD蛋白单体免疫原性较弱,需要极高的免疫剂量,需要佐剂辅助,诱导T细胞应答能力弱。因此基于RBD的疫苗需要采取一些方法增强其免疫效果,如新型佐剂等,而目前进入临床试验的中科院微生物所研发的重组RBD疫苗是基于结构改造的RBD二聚体蛋白,中和抗体滴度提高了10-100倍。提升免疫效果的另一个策略是制备病毒样颗粒(VLP),VLP为纳米颗粒,可以极大增强其免疫效果,有强免疫原性等优点,而且VLP由自组装的抗原蛋白组成,没有核酸,因此作为疫苗安全性更高,人乳头状病毒疫苗、戊型肝炎疫苗、乙肝疫苗的成功证明了病毒样颗粒疫苗的优势。因此,如何制备新型冠状病毒样颗粒对高免疫效果新型冠状病毒肺炎疫苗的研发至关重要。
发明内容
本申请实施例的目的包括提供一种融合蛋白、病毒样颗粒以及疫苗,本申请的融合蛋白和人腺病毒衣壳蛋白能够自组装成具有12面体结构的纳米颗粒,诱导机体产生高效价中和抗体应答。
在本申请的第一方面,提供一种融合蛋白,所述融合蛋白包含新型冠状病毒的RBD蛋白和人腺病毒的纤毛蛋白;
在本申请的一些实施方式中,所述新型冠状病毒为wuhan原始株或其变异株。
在本申请的一些实施方式中,所述人腺病毒为Ad3、Ad5、Ad7、、Ad4和Ad55中的任意一种型别或者多种型别。
在本申请的一些实施方式中,所述人腺病毒的纤毛蛋白如SEQ ID NO.12或者SEQID NO.16所示。
在本申请的一些实施方式中,所述新型冠状病毒的RBD蛋白如SEQ ID NO.13或者SEQ ID NO.18所示。
在本申请的一些实施方式中,所述新型冠状病毒的RBD蛋白和所述人腺病毒的纤毛蛋白通过多肽柔性链A连接。
在本申请的一些实施方式中,所述多肽柔性链A包括GS柔性链A。
在本申请的一些实施方式中,所述GS柔性链如SEQ ID NO.20或者SEQ ID NO.22所示。
在本申请的一些实施方式中,所述融合蛋白还包含表达标签。
在本申请的一些实施方式中,所述表达标签和所述新型冠状病毒的RBD蛋白连接。
在本申请的一些实施方式中,所述表达标签和所述新型冠状病毒的RBD蛋白通过多肽柔性链B连接;可选地,所述多肽柔性链B如SEQ ID NO.21或者SEQ ID NO.23所示。
在本申请的第二方面,提供一种病毒样颗粒,所述病毒样颗粒包含自组装的在第一方面中所述的融合蛋白以及人腺病毒五邻体基座蛋白。
在本申请的一些实施方式中,所述病毒样颗粒呈现十二面体3倍折叠对称形式,所述新型冠状病毒的RBD蛋白展示在所述病毒样颗粒的表面。
在本申请的一些实施方式中,所述病毒样颗粒的直径为10nm-80nm。
在本申请的第三方面,提供一种疫苗,所述疫苗包括在本申请第一方面中所述的融合蛋白或者第二方面中所述的病毒样颗粒。
在本申请的第四方面,提供一种核酸分子,所述核酸分子包含编码第一方面中所述的融合蛋白或者第二方面中所述的病毒样颗粒的核酸片段。
在本申请的第五方面,提供一种载体,所述载体包含第四方面中所述的核酸分子。
在本申请的第六方面,提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含第四方面所述的核酸分子或者第五方面所述的载体。
在本申请的第七方面,疫苗的制备方法,其特征在于,所述制备方法使用第四方面中所述的核酸分子、第五方面中所述的载体或者第六方面中所述的宿主细胞。
相对于传统技术,本申请的有益效果包括:
本申请的融合蛋白和人腺病毒衣壳蛋白能够自组装成具有12面体结构的纳米颗粒(例如直径为10-80nm),诱导机体产生高效价中和抗体应答。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对本领域技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为人腺病毒fiber氨基酸序列多重比对;
图2为fiber-RBD的表达;
图3为Ad7P55F-oRBD病毒样颗粒的表达纯化;
图4为Ad7P55F-oRBD病毒样颗粒透射电镜结构;
图5为Ad7P55F-oRBD病毒样颗粒的免疫应答。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例,对本发明作进一步详细的说明。应理解,这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式和实施例,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改,得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外,在下文的描述中,给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解,应理解,本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处,本文中使用的术语或短语具有以下含义:
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目,也包括相关所列项目的任意的和所有的组合,所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是,当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时,应当理解,在本申请中,该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案,还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如,“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如,“A,及/或,B,及/或,C,及/或,D”的技术方案,包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案),也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合,也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合,还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等,如无特别限定,指在数量上大于2或等于2。例如,“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中,“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”,以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中,“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例,应当理解,并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中,“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的,表示内容上的差异,但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中,“可选地”、“可选的”、“可选”,指可有可无,也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”,如无特别说明,且无矛盾之处或相互制约关系,则每项“可选”各自独立。
本发明中,“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中,术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的,不能理解为指示或暗示相对重要性或数量,也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的,应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中,涉及到数值区间(也即数值范围),如无特别说明,可选的数值分布在上述数值区间内视为连续,且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值),以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明,当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时,包括该数值范围的两个端点整数,以及两个端点之间的每一个整数,在本文中,相当于直接列举了每一个整数,比如t为选自1~10的整数,表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外,当提供多个范围描述特征或特性时,可以合并这些范围。换言之,除非另有指明,否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数,如无特别限定,既允许为恒温处理,也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是,所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中,%(w/w)与wt%均表示重量百分比,%(v/v)指体积百分比,%(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突,否则,本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时,相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时,被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中,但以能够实施本发明为限。应当理解,当引用内容与本申请中的描述相冲突时,以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
新冠病毒通过其棘突(S)蛋白上的受体结合结构域(RBD)与人体细胞表面的血管紧张素酶2(ACE2)结合来识别宿主细胞。
腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70-90nm的颗粒,由252个壳粒呈20面体排列构成。每个壳粒的直径为7-9nm。衣壳里是线状双链DNA分子,约含4.7kb,两端各有长约100bp的反向重复序列。由于每条DNA链的5'端同相对分子质量为55×103Da的蛋白质分子共价结合,可以出现双链DNA的环状结构。人腺病毒已知有52种血清型,分别命名为ad1-ad52。六邻体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白,12个顶端是5个五邻体基座亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物,12根纤毛以五邻体基座蛋白为基底由衣壳表面伸出,纤毛顶端形成头节区。纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合。
本申请的第一方面
本申请提供一种融合蛋白,所述融合蛋白包含新型冠状病毒的RBD蛋白和人腺病毒的纤毛蛋白。
重组RBD蛋白单体免疫原性较弱,需要极高的免疫剂量,需要佐剂辅助,诱导T细胞应答能力弱,而天然状态的S蛋白是三聚体结构,RBD免疫原性低的原因可能由于单体和三聚体结构的差异导致的。本申请的融合蛋白,能够形成三聚体结构的RBD,有更强的诱导中和抗体能力。
可选地,所述新型冠状病毒为wuhan原始株或其变异株;所述变异株例如omicron,可以理解的是,包括但不限于此。
本申请对所述人腺病毒的类型(可以说是“型别”)不做特别限定,包括但不限于Ad3、Ad5、Ad7、Ad4和Ad55,可以是其中一种,也可以是其中多种。
可选地,所述人腺病毒的纤毛蛋白如SEQ ID NO.12或者SEQ ID NO.16所示。
可选地,所述新型冠状病毒的RBD蛋白如SEQ ID NO.13或者SEQ ID NO.18所示。
可以理解的是,所述融合蛋白包含新型冠状病毒的RBD蛋白和所述人腺病毒的纤毛蛋白可以直接连接,也可以间接连接,例如通过任意合适的Linker的连接,任意合适的Linker包括但不限于多肽柔性链A,进一步地,所述多肽柔性链A包括GS柔性链A,例如所述GS柔性链A可以如SEQ ID NO.20或者SEQ ID NO.22所示。
可选地,所述融合蛋白还包含表达标签。可以理解的是,本申请对表达标签不做特别限定,可以是任意合适的表达标签,例如标签、信号肽或导肽、可检测的标记(例如,荧光素酶、绿色荧光蛋白),或其任何组合。可选地,所述表达标签选自6His、8His、T4-coil、GCN4和CMP中的一种或者多种。
可选地,所述表达标签和所述新型冠状病毒的RBD蛋白连接。可以理解的是,所述表达标签和所述新型冠状病毒的RBD蛋白可以直接连接,也可以间接连接,例如通过任意合适的Linker的连接,任意合适的Linker包括但不限于多肽柔性链B,例如所述多肽柔性链B如SEQ ID NO.21或者SEQ ID NO.23所示。
本申请的第二方面
本申请提供一种病毒样颗粒,所述病毒样颗粒包含自组装的所述的融合蛋白以及人腺病毒五邻体基座蛋白。
本申请对所述人腺病毒五邻体基座蛋白不做特别限定,包括但不限于人腺病毒Ad3、Ad5、Ad7、Ad4和Ad55等的五邻体基座蛋白。
可选地,所述病毒样颗粒呈现十二面体3倍折叠对称形式,所述新型冠状病毒的RBD蛋白展示在所述病毒样颗粒的表面。
可选地,所述病毒样颗粒的直径为10nm-80nm。
本申请的第三方面
本申请提供一种疫苗,所述疫苗包括第一方面所述的融合蛋白或者第二方面所述的病毒样颗粒。
可以理解地,本申请的疫苗包含药学上可接受的载体和/或赋形剂、佐剂等。可选地,所述疫苗过注射进行施用。可选地,所述疫苗为注射液或冻干粉剂。可选地,所述融合蛋白或者所述的病毒样颗粒以有效量(例如预防或治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病的有效量)存在。可选地,所述的疫苗以单位剂量形式存在。
本申请的第四方面
本申请提供一种核酸分子,所述核酸分子包含编码第一方面所述的融合蛋白或者第二方面所述的病毒样颗粒的核酸片段。
本申请的第五方面
本申请提供一种载体,所述载体包含第四方面所述的核酸分子。可以理解的是,本申请对载体的种类不做特别限定,例如选自质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体、细菌人工染色体或P1来源的人工染色体;噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体;以及,病毒载体,例如逆转录酶病毒载体(例如慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体(如单纯疱疹病毒载体)、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体;可选地,所述载体用于表达(例如在受试者(例如哺乳动物,例如人)体内表达)所述融合蛋白;进一步可选地,所述载体是用于基因治疗的载体,例如质粒,腺病毒载体,腺相关病毒载体,和慢病毒载体。
本申请的第六方面
本申请提供一种宿主细胞,所述宿主细胞包含第四方面所述的核酸分子或者第五方面所述的载体。
可选地,所述宿主细胞选自原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及真核细胞例如酵母细胞,
昆虫细胞,植物细胞和动物细胞[如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞(例如CHO)、人细胞等];可选地,所述宿主细胞是大肠杆菌细胞,例如大肠杆菌DH5α细胞;或者所述宿主细胞是人细胞(例如,293T细胞)。
本申请的第七方面
本申请提供一种疫苗的制备方法,所述制备方法使用第四方面所述的核酸分子、第五方面所述的载体或者第六方面所述的宿主细胞。
本申请在制备疫苗的过程中,新冠病毒RBD和人纤毛蛋白串联为一种融合蛋白,这种融合蛋白和所述人腺病毒五邻体基座蛋白可以克隆到一个杆粒中进行同时表达,也可以分别克隆制备两个杆粒后同时感染昆虫细胞进行同时表达,在细胞内自组装成纳米颗粒;也可以将所述融合蛋白和所述人腺病毒五邻体基座蛋白分别进行表达纯化,在体外进行混合后自组装成纳米颗粒。具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本发明中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以按照制造厂商所建议的条件,或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
昆虫细胞-杆状病毒表达系统是制备病毒样颗粒疫苗的主要平台系统,可高效表达外源基因,产量高,可以对外源蛋白进行真核细胞的转录后加工作用,包括糖基化、磷酸化、酰基化以及适当的折叠作用,还能同时表达多个蛋白进行适当的寡聚化装配。基于杆状病毒表达平台的疫苗具有安全性高、免疫原性好、生产成本低等优点,已广泛地应用于疫苗研究中,成为近年来国际上发展最快的重组蛋白疫苗平台系统,国际上已经有基于该系统的流感疫苗、人乳头状病毒疫苗等多个品种上市。
本申请的实施例基于上述昆虫细胞-杆状病毒表达系统,合成经密码子优化适应昆虫细胞表达的新冠病毒RBD基因,替换人腺病毒纤毛蛋白头基因,获得一种嵌合型RBD-FIBER基因;将这种RBD-FIBER基因和五邻体基座基因,同时克隆入pFastBac_Dual载体,转化DH10 Bac中获得重组杆粒,再转染昆虫细胞SF9拯救得到重组杆状病毒后,大量培养并收集细胞进行裂解,通过Ni-NTA亲和层析纯化。获得的重组蛋白AdP-FRBD包括了五邻体基座和重组嵌合型F-RBD,非变性条件下F-RBD为三聚体结构,电镜下观察到AdP-FRBD呈现十二面体3倍折叠对称形式的病毒样颗粒结构。可以理解的是,这只是对本申请技术方案的举例,本申请并不局限于此。采用该系统同时表达人腺病毒五邻体基座和嵌合型F-RBD蛋白,表达产量高,嵌合型F-RBD蛋白为三聚体结构,并自动组装到五邻体基座形成十二面体对称结构病毒样颗粒。纳米疫苗AdP-FRBD能诱导出针对RBD的疫苗,可以作为新冠病毒疫苗候选。
1、新冠RBD-腺病毒纤毛fiber shaft融合蛋白设计
对人腺病毒fiber结构进行分析,腺病毒fiber包括tail、shaft和knob三个结构域,其中shaft为多个重复区组成,Ad5 shaft有22个repeat region,而B组人腺病毒shaft有6个repeat region。Ad5 shaft与knob间的spacer位置参考文献Adenovirus FiberShaft Contains a Trimerization Element That Supports Peptide Fusion forTargeted Gene Delivery,J Viro(2006)。
图1人腺病毒fiber氨基酸序列多重比对。1:Ad5 fiber;2:Ad14 fiber;3:Ad55fiber;4:Ad3 fiber。
人B组腺病毒不同型别fiber高度保守,最终确定了人B组腺病毒fiber二级结构,其中repeat 6包括了spacer区序列。Ad55 fiber结构预测如下SEQ ID NO.1所示:
MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSPDGVLTLKCLTPLTTTGGSLQL
KVGGGLTVDDTDGTLQENIGTTTPLVKTGHSIGLSLGAGLGTDENKLCTKLGKGLTFNSNNICIDDNINTL
WTGINPTEANCQMMDSSESNDCKLILTLVKTGALVTAFVYVIGVSNNFNMLTTYRNINFTAELFFDSAGN
LLTSLSSLKTPLNHKSGQNMATGAITNAKSFMPSTTAYPFNNNSREKENYIYGTCHYTASDHTAFPIDISVMLNQRAIRADTSYCIRITWSWNTGDAPEGQTSATTLVTSPFTFYYIREDD(对应结构:Tail-repeat1-repeat2-repeat3-repeat4-repeat5-repeat6-knob),其中:
Tail如SEQ ID NO.2所示:MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSPD
repeat1如SEQ ID NO.3所示:GVLTLKCLTPLTTTG
repeat2如SEQ ID NO.4所示:GSLQLKVGGGLTVDDTD
repeat3如SEQ ID NO.5所示:GTLQENIGTTTPLVKTG
repeat4如SEQ ID NO.6所示:HSIGLSLGAGLGTDE
repeat5如SEQ ID NO.7所示:NKLCTKLGKGLTFNSN
repeat6如SEQ ID NO.8所示:NICIDDNINTL
knob如SEQ ID NO.9所示:WTGINPTEANCQMMDSSESNDCKLILTLVKTGALVTAFV YVIGVSNNFNMLTTYRNINFTAELFFDSAGNLLTSLSSLKTPLNHKSGQNMATGAITNAKSFMPSTTAYPFNNNSREKENYIYGTCHYTASDHTAFPIDISVMLNQRAIRADTSYCIRITWSWNTGDAPEGQTSATTLVTSPFTFYYIREDD
在此基础上,我们设计了多种fiber shaft-RBD嵌合蛋白,在杆状病毒-昆虫细胞中进行了表达验证。RBD设计了两种长度,194aa和219aa。
RBD为新冠病毒原始株wuhan株,fiber为Ad55株。A55FR融合蛋白序列如下SEQ IDNO.10所示:MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSPDGVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLTVDDTDGTLQENIGTTTPLVKTGHSIGLSLGAGLGTDENKLCTKLGKGLTFNSNNIRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKHHHHHH
或者,如SEQ ID NO.11所示:
MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSPDGVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLTVD
DTDGTLQENIGTTTPLVKTGHSIGLSLGAGLGTDENKLCTKLGKGLTFNSNNITNLCPFGEVFNATRFASV
YAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIAD
YNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYF
PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVHHHHHH
其中,fiber shaft蛋白的序列如SEQ ID NO.12所示:
MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSPDGVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLTVD
DTDGTLQENIGTTTPLVKTGHSIGLSLGAGLGTDENKLCTKLGKGLTFNSN
RBD蛋白的序列如SEQ ID NO.13所示:
NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFV
IRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEI
YQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
RBD为新冠病毒原始株wuhan株,fiber为Ad5株,保留了shaft前9个repeatregions。A5FR融合蛋白序列如下SEQ ID NO.14所示:
MKRARPSEDTFNPVYPYDTETGPPTVPFLTPPFVSPNGFQESPPGVLSLRLSEPLVTSNGMLALKMGNGLS
LDEAGNLTSQNVTTVSPPLKKTKSNINLEISAPLTVTSEALTVAAAAPLMVAGNTLTMQSQAPLTVHDSKL
SIATQGPLTVSEGKLALQTSGPLTTTDSSTLTITASPPLTTATNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNC
VADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTG
CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTN
GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVHHHHHH
或者如下SEQ ID NO.15所示:
MKRARPSEDTFNPVYPYDTETGPPTVPFLTPPFVSPNGFQESPPGVLSLRLSEPLVTSNGMLALKMGNGLS
LDEAGNLTSQNVTTVSPPLKKTKSNINLEISAPLTVTSEALTVAAAAPLMVAGNTLTMQSQAPLTVHDSKL
SIATQGPLTVSEGKLALQTSGPLTTTDSSTLTITASPPLTTATRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASV
YAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIAD
YNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYF
PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKHHHHHH
其中,fiber shaft蛋白的序列如下SEQ ID NO.16所示:
MKRARPSEDTFNPVYPYDTETGPPTVPFLTPPFVSPNGFQESPPGVLSLRLSEPLVTSNGMLALKMGNGLS
LDEAGNLTSQNVTTVSPPLKKTKSNINLEISAPLTVTSEALTVAAAAPLMVAGNTLTMQSQAPLTVHDSKL
SIATQGPLTVSEGKLALQTSGPLTTTDSSTLTITASPPLTTAT
2、新冠RBD-腺病毒纤毛fiber shaft融合蛋白表达纯化
A55FR和A5FR均有高效表达,没有信号肽时fiber和fiber-RBD主要表达在胞内(图2)。图2为fiber-RBD的表达(图中,C表示培养细胞,S表示培养上清)。图中:1)vAd55 fiber+RBD 194aa(His),目的蛋白预测大小35.54kDa,在细胞裂解物中检测到目的蛋白,目的蛋白存在降解;2)vAd55 fiber+RBD 219aa(His),目的蛋白预测大小38.57kDa,在细胞裂解物中检测到目的蛋白;5)vAd5 fiber 9R+RBD 194aa(His)目的蛋白预测大小41.8kDa,在细胞裂解物中检测到目的蛋白;6)vAd5 fiber 9R+RBD 219aa(His)目的蛋白预测大小44.61kDa,在细胞裂解物中检测到目的蛋白。
该蛋白反复多次用Ni-NTA纯化,虽然表达产量较高,但结合不上镍柱,纯化得率非常低。分析可能是因为6His标签没有暴露在蛋白表面,吸附能力较差,影响了Ni-NTA纯化效率。
3、新冠omicron变异株病毒样颗粒疫苗表达纯化
在疫苗研发过程中,新冠病毒流行株已经发生了巨大变异,omicron变异株已经成为主体。我们重新合成了omicron BA.1variant的RBD,并且将6HIS标签改为8HIS,在HIS标签和RBD之间以及在fiber和RBD之间增加了GS柔性链,构建了Ad55 Fiber-GS-RBD-GS-8HIS(55F-oRBD)融合蛋白杆粒,与Ad7P在昆虫细胞中共表达。结果成功表达并纯化获得Ad7P55F-oRBD(图3)。抗HIS抗体检测证明纯化产物中包含五邻体基座蛋白和55F-oRBD融合蛋白,抗RBD抗体检测表明纯化产物包含RBD融合蛋白。透射电镜观察纯化产物为VLP纳米颗粒结构(图4)。
Ad55fiber-GS-RBD(omicron)-GS-8HIS(SEQ ID NO.17):
MTKRVRLSDSFNPVYPYEDESTSQHPFINPGFISPNGFTQSPDGVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLTVD
DTDGTLQENIGTTTPLVKTGHSIGLSLGAGLGTDENKLCTKLGKGLTFNSNGGSGNITNLCPFDEVFNAT
RFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQT
GNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAG
FNCYFPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVGGGGSGGHHHHHHHH
其中,RBD蛋白的序列如SEQ ID NO.18所示:
NITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATV
同时,用杆状病毒表达系统合成表达了T4-GS-omicron RBD-GS-8HIS(SEQ IDNO.19):
MYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVFLSTFLGGGGSGGGGSGNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVGGGGSGGHHHHHHHH
其中,
SEQ ID NO.20:GGSG;
SEQ ID NO.21:GGGGSGG;
SEQ ID NO.22:GGGGSGGGGSG;
SEQ ID NO.23:GGGGSGG
图3为Ad7P55F-oRBD病毒样颗粒的表达纯化。图中:A.Ad55 Fiber-GS-oRBD-GS-8HIS用6HIS单抗检测;B.7P与55F-RBD共表达,用抗SARS-CoV-2Spike Omicron单抗检测;C.7P与55F-RBD共表达,用6HIS单抗检测;D.RBD抗体检测纯化的Ad7P55F-oRBD。
图4为Ad7P55F-oRBD病毒样颗粒透射电镜结构。
4、新冠omicron变异株病毒样颗粒疫苗免疫保护作用分析
用Ad7P55F-oRBD病毒样颗粒免疫小鼠,间隔14天加强免疫2次,在两次免疫后抗体水平升高。ELISA检测抗血清与RBD反应阳性,假病毒中和实验表明抗血清具有抗omicron病毒中和作用,纳米颗粒Ad7P55F-oRBD免疫相较单体oRBD、三聚体55F-oRBD和T4-oRBD蛋白在小鼠体内诱导了更高滴度的中和抗体。(图5)。图5为Ad7P55F-oRBD病毒样颗粒的免疫应答。图中:A.ELISA检测3次免疫前后血清抗体水平;B.ELISA检测4只小鼠的抗体应答,用纯化的RBD抗原包被;C.假病毒微量中和实验检测抗新冠Omicron变异株的中和效果。纳米颗粒Ad7P55F-oRBD免疫相较单体oRBD、三聚体55F-oRBD和T4-oRBD蛋白在小鼠体内诱导了更高滴度的中和抗体。55F-oRBD为oRBD与人腺病毒55型fiber融合蛋白;T4-oRBD为oRBD与T4coil标签融合蛋白;oRBD为不带三聚体标签结构的蛋白。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合,为使描述简洁,未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解,本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案,均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (9)
1. 融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包含新型冠状病毒的RBD蛋白和人腺病毒的纤毛蛋白,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
2.病毒样颗粒,其特征在于,所述病毒样颗粒包含自组装的权利要求1所述的融合蛋白以及人腺病毒五邻体基座蛋白。
3.根据权利要求2所述的病毒样颗粒,其特征在于,所述病毒样颗粒呈现十二面体3倍折叠对称形式,所述新型冠状病毒的RBD蛋白展示在所述病毒样颗粒的表面。
4.根据权利要求2或者3所述的病毒样颗粒,其特征在于,所述病毒样颗粒的直径为10nm-80nm。
5.疫苗,其特征在于,所述疫苗包括权利要求1所述的融合蛋白或者权利要求2至4中任一项所述的病毒样颗粒。
6.核酸分子,其特征在于,所述核酸分子包含编码权利要求1所述的融合蛋白或者权利要求2至4中任一项所述的病毒样颗粒的核酸片段。
7.载体,其特征在于,所述载体包含权利要求6所述的核酸分子。
8.宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包含权利要求6所述的核酸分子或者权利要求7所述的载体。
9.疫苗的制备方法,其特征在于,所述制备方法使用权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体或者权利要求8所述的宿主细胞。
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2023
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Patent Citations (5)
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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