CN113817029A - 一种新型冠状病毒s-rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用 - Google Patents
一种新型冠状病毒s-rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒S‑RBD三聚体蛋白，所述三聚体蛋白由三聚体形式的新型冠状病毒S蛋白RBD区第319～537位氨基酸片段构成。本发明制备的疫苗以S‑RBD三聚体蛋白为抗原，辅以佐剂后，免疫机体，可产生针对新型冠状病毒的高滴度保护性中和抗体，可以用于治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染和/或新型冠状病毒疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白 疫苗、其制备方法和应用。
背景技术
SARS-CoV-2，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正 冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股 正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白， 参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：刺突蛋白(spike protein，S)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白 (nucleo protein)，此外还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14，这些 蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主 要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界 处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2 亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端 S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：NTD、RBD、CTD1和CTD2，其中 RBD是受体结合结构域，主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞， 因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。
截至目前，全球获批上市的疫苗共有7款，分别是美国批准紧急使用授权 (EUA)的BNT162b2和mRNA-1273，英国批准紧急使用授权(EUA)的AZD1222， 中国国药中生(北京公司和武汉公司)和北京科兴各自附条件上市的3款新冠 灭活疫苗、康希诺生物腺病毒载体疫苗以及智飞生物重组蛋白疫苗，印度批准 紧急使用授权(EUA)国产灭活疫苗，以及俄罗斯批准上市的“卫星V”，另外还 有数十种疫苗处于临床研究不同阶段。利用基因工程技术研制重组疫苗由于其 高度的安全性和有效性已被广泛证实，加之当前新冠病毒变异株不断出现并且 占比持续上升，现有疫苗及中和抗体对特定突变株的保护效果大幅降低，引发各界对新冠疫情走势及疫苗和药物有效性的担忧。
因此，开发一种可产生针对新型冠状病毒高滴度的保护性中和抗体的重组 疫苗已成为当务之急。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中缺少可产生针对新型冠状病毒高滴 度的保护性中和抗体的重组疫苗的缺陷，提供了一种新型冠状病毒S-RBD三聚 体蛋白。
本发明提供的技术方案为：
一种新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，其特征在于，所述三聚体蛋白由三 聚体形式的新型冠状病毒S蛋白RBD区第319～537位氨基酸片段构成。
本发明基于新冠病毒S-RBD区结构学特征，利用计算生物学方法设计了一 种全新的融合蛋白，该蛋白包含有三个RBD结构域，在可以不引入任何外源连 接臂或其它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式，实现S-RBD蛋 白三聚化，利用基因工程技术重组表达并纯化出S-RBD三聚体蛋白后，与佐剂 混合制备成疫苗，按一定剂量和剂次免疫动物可产生针对新型冠状病毒高滴度 的保护性中和抗体，用于治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/ 或新型冠状病毒疾病(COVID-19)。另外，由于RBD区功能明确，结构清楚， 负责识别受体细胞的ACE区，同时针对RBD产生的抗体功能明确，最大程度 避免诱导机体产生抗体依赖的增强作用(Antibody Dependent Enhancement，ADE)。
本发明中所述的三聚体蛋白可由三个相同序列的多肽亚基通过自组装形成。 在本发明的实施方式中，上述三个相同序列之间可以包含合适的连接体(Linker) 或间隔区，其可以为寡肽或多肽，其作用可以为增加柔性。
但作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述三聚体蛋白的一级结构为 三个所述氨基酸片段按照N末端至C末端的顺序连接。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示或与其具有95％以上同源性的序列。
在上述实施方式中，本发明三聚体蛋白在可以不引入任何外源连接臂或其 它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式。
上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述融合蛋白的氨基酸序列具 有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。本领域技术人员可以对本 说明书中所述融合蛋白的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突 变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些突变后的 氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个方面，是提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含上述新 型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白。
作为优选，在本发明的实施方式中，所述融合蛋白还包含选自信号肽、标 签或免疫增强肽中的一种或几种。所述信号肽的作用可以是更有利于蛋白质的 表达；所述标签可以为，例如，Flag标签、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、谷胱 甘肽巯基转移酶(GST)，等等，其作用可以是用于检测、纯化、分离等等。上 述功能性序列可任意组合使用。
本发明的另一个方面，是提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码上 述新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，发明人对所述三聚体蛋白的密码 子进行了优化，得到的所述核苷酸序列如SEQIDNo.2所示或与其具有95％以上 同源性的序列。
上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述核苷酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述核苷酸序列，通过化学合成或 PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进 行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知 文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子。
在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒 等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中 可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述载体为本发明中所述核酸分 子的表达载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述核 酸分子或上述载体。
作为优选，在本发明的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、 昆虫细胞或哺乳动物细胞；
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白 或上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤A)制备所述核酸分子，构建所述表达载体，将表达载体转化或转染 至所述宿主细胞内；
步骤B)利用步骤A)的产物进行蛋白质表达；
步骤C)纯化步骤B)中获得的表达产物，得到所述新型冠状病毒S-RBD 三聚体蛋白或融合蛋白。
其中，步骤A)所述核酸分子包含编码上述新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋 白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述核苷酸序列如SEQIDNo.2所 示或与其具有95％以上同源性的序列。
可使用任意合适的分子生物学方法根据本说明书中所述核苷酸序列制备所 述核酸分子。
其中，步骤A)所述构建表达载体可以使用任意合适的方法将上述核苷酸 序列构建在宿主细胞相应的表达载体中。
然后将表达载体转化或转染至所述宿主细胞内。作为优选，在本发明的一 个实施方式中，发明人在构建CHO细胞表达载体后将其转染至293FT细胞或 CHO细胞内构建重组细胞株。
其中，步骤B)所述蛋白质表达可以根据所使用的不同表达系统对重组蛋白 进行表达。进一步地，在本发明的一个实施方式中，发明人通过有限稀释法筛 选得到能够稳定分泌表达S-RBD三聚体蛋白或融合蛋白的细胞株。
其中，步骤C)所述纯化可以为任意合适的方法。例如，盐析法、沉淀法、 透析或超滤、分子筛层析法、离子交换层析、疏水层析法、亲和层析法，等等。 作为优选，在本发明的一个实施方式中，采用离子交换和疏水层析的方法纯化 上述S-RBD三聚体蛋白或融合蛋白。
当然，根据现有技术，在进行纯化步骤之前，还应包含对目标蛋白质的收 集过程，例如。对富含目标蛋白质的细胞培养液上清的收集；对已表达目标蛋 白质后的所述宿主细胞进行破碎的过程，可以使用例如，超声波破碎、反复冻 融破碎、化学处理法等任意合适的破碎方法。上述对宿主细胞的收集过程也应 理解为包含在所述纯化的范围之内。
本发明的另一个方面，是提供了所述新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、所 述融合蛋白、所述核酸分子、所述载体或所述宿主细胞在制备用于治疗和/或预 防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
所述新型冠状病毒引起的疾病优选为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
本发明的另一个方面，是提供了一种疫苗，所述疫苗包含所述新型冠状病 毒S-RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白，以及佐剂。
在本发明的实施方式中，所述疫苗为重组蛋白疫苗(或称基因工程亚单位 疫苗)。进一步地，在本发明的另外一些实施方式中，所述疫苗还可以为基因工 程载体疫苗，或者可以为核酸疫苗，上述疫苗包含本说明书中所述核苷酸序列。
在本发明所述疫苗中，可以包含任意合适的佐剂。但作为优选，在本发明 的实施方式中，所述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG。更优选地，所述 佐剂为氢氧化铝。
本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗的制备方法，将纯化所得的所述 新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白与所述佐剂混合。
本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗在治疗和/或预防新型冠状病毒感 染和/或新型冠状病毒引起的疾病中的用途。
所述新型冠状病毒引起的疾病优选为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所 述疫苗，以及药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以为任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐 水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、氨基酸以及它们的组合物、稳定 剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
本发明所述药物组合物也可以和其他治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/ 或新型冠状病毒引起的疾病的药物在有效安全的剂量下联合使用。
本发明的另一个方面，是提供了一种引发受试者针对新型冠状病毒的免疫 应答或治疗受试者的新型冠状病毒感染的方法，向所述受试者施用有效剂量的 所述疫苗或所述药物组合物。
所述受试者可以为人类或者其他动物。
所述施用可以为肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
本发明的有益效果：
本发明制备的疫苗以S-RBD三聚体蛋白为抗原，辅以佐剂后，免疫机体， 可产生针对新型冠状病毒的高滴度保护性中和抗体，可以用于治疗和/或预防新 型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/或新型冠状病毒疾病。
附图说明
图1为本发明实施例1中新型冠状病毒S蛋白结构分析图，其中，A为S 蛋白单体结构(基于PDB代码为6zgg的坐标文件，采用UCSF Chimera软件绘 制)，S1结构单元包括NTD、RBD、SD1和SD2结构域；B为RBD与ACE2 受体复合物结构(基于PDB代码为6m0j的坐标文件，采用UCSF Chimera软件 绘制)；
图2为本发明实施例1中S-RBD三聚体蛋白设计图，其中，A为S-RBD单 体蛋白结构；B为S-RBD三聚体蛋白结构；
图3为本发明实施例2中纯化所得S-RBD三聚体蛋白的SDS-PAGE图，其 中，泳道1-5为纯化获得的S-RBD三聚体蛋白；泳道M1为蛋白质marker(分 子量标准为：kDa：250、150、100、70、50、40、30、20、15、10、5)；泳道 M2为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、130、100、70、55、35、25、 15、10)；
图4为本发明实施例2中纯化所得S-RBD三聚体蛋白的Western-blot鉴定 图，其中，泳道1-5为纯化获得的S-RBD三聚体蛋白；泳道M2为蛋白质marker；
图5为本发明实施例2中纯化所得S-RBD三聚体蛋白的透射电镜图；
图6为本发明实施例3中纯化所得S-RBD三聚体蛋白与MM43中和性单克 隆抗体结合曲线图；
图7为本发明实施例3中纯化所得S-RBD三聚体蛋白与MM57中和性单克 隆抗体结合曲线图；
图8为本发明实施例4中纯化所得S-RBD三聚体蛋白与ACE2蛋白的SPR 检测结果图；
图9为本发明实施例6中重组新型冠状病毒疫苗不同剂量免疫Wistar大鼠 后血清特异性IgG滴度检测结果图；
图10为本发明实施例6中重组新型冠状病毒疫苗不同剂量免疫Wistar大鼠 后针对假病毒的血清中和抗体滴度检测结果图；
图11为本发明实施例6中重组新型冠状病毒疫苗不同剂量免疫Wistar大鼠 后针对野病毒的血清中和抗体滴度检测结果图。图12为本发明对比例1中二聚 体蛋白和三聚体蛋白的SDS-PAGE图，其中，泳道1为纯化获得的三聚体蛋白； 泳道2为纯化所得的二聚体蛋白；泳道M2蛋白质marker(分子量标准为：kDa： 250、130、100、70、55、35、25、15、10)；
图13为本发明对比例1中血清特异性IgG滴度检测结果图；
图14为本发明对比例1中针对假病毒的血清中和抗体滴度检测结果图；
图15为本发明对比例1中针对野病毒的血清中和抗体滴度检测结果图。
序列说明
SEQIDNo.1为本发明实施例中新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的氨基酸序 列；
SEQIDNo.2为本发明实施例中新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的核苷酸序 列；
SEQIDNo.3为本发明对比例中新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的氨基酸序 列；
SEQ ID No.4为本发明对比例中新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的核苷酸 序列。
具体实施方式
本发明公开了一种新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应 用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指 出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都 被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围 的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技 术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领 域技术人员所通常理解的含义。下面就本发明中出现的部分术语作以解释。
术语“新型冠状病毒”，即SARS-CoV-2，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状 病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、 类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大 部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白， 如：刺突蛋白(spike protein，S)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein)，此外还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b 和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引 起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa， 在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基 之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价 结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融 合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：NTD、RBD、CTD1和CTD2， 其中RBD是受体结合结构域，主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换 酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细 胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。
术语“三聚体形式”，是蛋白质四级结构中的一种类型。蛋白质四级结构是 指蛋白质亚基相对于彼此的数目和排列(Chou,Kuo-Chen；Cai,Yu-Dong. Predicting proteinquaternary structure by pseudo amino acid composition.Proteins: Structure,Function,and Bioinformatics.1November 2003,53(2):282–289.)。其中 含有三个蛋白质亚基即为三聚体形式。
术语“一级结构”，是肽或蛋白质中氨基酸的线性序列。按照惯例，蛋白质 的一级结构被报道从氨基末端(N)端到羧基末端(C)端。
术语“融合蛋白”，fusionprotein，是指通过DNA重组技术得到的一个、两 个或多个基因重组后的表达产物。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而 进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法，利用融合蛋白技术，可构建和表 达具有多种功能的新型目的蛋白。
术语“载体”，是可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使 插入的多核苷酸编码的蛋白质获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过 转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获 得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯 质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1 来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用 作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关 病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于， 启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体 还可含有复制起始位点。
术语“宿主细胞”，是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。， 这些技术包括转染病毒载体，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和 粒子枪加速引入裸DNA。
术语“治疗”，是指减少疾病病理的可能性，减少疾病症状的发生，例如在 一定程度上受试者具有更长的存活期或减少的不适。治疗可以是指当向受试者 给予疗法时该疗法减少疾病症状、体征或病因的能力。治疗还指缓和或减少至 少一种临床症状和/或抑制或延迟病症的进展和/或预防或延迟疾病或疾患的发 作。
术语“受试者”是指接受预防、治疗、诊断的任何人或其他动物，特别是 其他哺乳动物。其他哺乳动物可以包括，例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、 山羊、兔子、大鼠、豚鼠、小鼠等。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实 施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：基于结构生物学设计新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白
通过对天然S蛋白三聚体空间结构分析(如图1所示)、并对RBD结构域 的N端和C端的空间距离进行计算，发现在不引入外源载体或序列的情况下， 可以利用RBD自身的结构特征实现三聚化，同时不会存在较大的空间位障，受 体结合位点和主要中和抗体表位也不会被遮蔽。基于此，截取新型冠状病毒 (Genebank编号：MN908947.3)S蛋白RBD区序列片段(319～537位氨基酸)， N端和C端的间距为
将三个相同RBD区片段首尾串联，形成一个新的融 合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用多聚体结构预测软件(initiodomain assembly，AIDA)和分子动力学模拟(GROMACS)，显示该融合蛋白包 含有三个独立RBD结构域，形成抗原构象稳定的三聚体形式(如图2所示)， 即为新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白。
实施例2：新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的表达、纯化及鉴定
按照CHO细胞表达系统的密码子偏爱性，对SEQ ID NO.1氨基酸序列进行 密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示，构建CHO细胞表达载体 后转染至293FT细胞或CHO细胞内构建重组细胞株，通过有限稀释法筛选得到 能够稳定分泌表达S-RBD三聚体蛋白的细胞株。
经系列层析纯化后获得纯度≥95％的S-RBD三聚体蛋白。SDS-PAGE检测结 果如图3所示，蛋白分子量大小约为86kD，同时可见有部分产品相关物质，如 二聚体蛋白和单体蛋白。将纯化后蛋白SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜上， 利用RBD特异性抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40591-T62； 稀释度：2000倍)进行Western-blot鉴定(结果如图4所示)，纯化后的蛋白可 与RBD特异性抗体发生结合，具有良好的免疫原性。将纯化后蛋白滴加在铜网 膜上吸附1分钟，磷钨酸负染1分钟，透射电镜下观察蛋白形态(结果如图5 所示)，可见S-RBD三聚体蛋白均匀分布在铜网膜上，粒径较小。
实施例3：新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白与中和性单克隆抗体结合生物 学分析
将纯化后的S-RBD三聚体蛋白和RBD单体蛋白(厂家：北京义翘神州科 技有限公司；货号：40592-V08B)稀释至10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、 0.001μg/ml、0.0001μg/ml，100μl/孔，包被至96孔酶标板上，4℃，8～12h，以 空白孔为阴性对照；PBST溶液洗板后加入封闭液，37℃封闭3h；PBST溶液洗 板后分别加入稀释后的MM43单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司； 货号：40591-MM43，稀释度：2000倍)或MM57单克隆抗体(厂家：北京义 翘神州科技有限公司；货号：40592-MM57；稀释度：2000倍)，100μl/孔，37℃ 孵育1h；PBST溶液洗板后加入稀释后的HEP标记的羊抗鼠IgG(厂家：北京 中杉金桥生物技术有限公司；货号：ZB-2305；稀释度：10000倍)，100μl/孔， 37℃孵育1h；PBST溶液洗板后先后加入显色液(厂家：万泰生物)A和B，室 温下显色5～10min，加入终止液C；酶标仪上进行双波长(OD450nm和630nm) 读值，确定cutoff值，并绘制蛋白浓度-吸光度值曲线，结果如图6和图7所示， 可见S-RBD三聚体蛋白与MM43和MM57两种中和性单克隆抗体均具有良好 的结合活性。
实施例4：新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白与ACE2受体结合生物学分析
随着对新型冠状病毒结构和感染机制的深入研究，越来越多研究者发现血 管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE2)是新型冠状病毒的受体， 因此通过测定S-RBD三聚体蛋白与ACE2的结合情况，可用于分析该蛋白的生 物学活性。采用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术测定纯 化后的S-RBD三聚体蛋白与ACE2蛋白(厂家：北京义翘神州科技有限公司； 货号：10108-H08B)的亲和力，结果如图8所示，亲和力常熟(kD)值为3.90e-12M， S-RBD三聚体蛋白与ACE2呈现高亲和力结合，提示该蛋白具有良好的生物学 活性。
实施例5：重组新型冠状病毒疫苗制备
将纯化后的S-RBD三聚体蛋白稀释至2倍目标抗原浓度，与1.2mg/ml氢氧 化铝佐剂按1:1比例(w/w)混合吸附，并于磁力搅拌器上搅拌40～120min，转 速为200～300rpm，获得疫苗半成品，上清残留蛋白含量应低于总蛋白含量的10％， 半成品每瓶按0.5ml装量无菌分装后即为疫苗成品。
实施例6：重组新型冠状病毒疫苗免疫学效果评价
将制备的重组新型冠状病毒疫苗分别按照不同剂量经肌肉注射免疫Wistar 大鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，6-8周龄，动物合格证编号：No.110324201102113753)，0.5ml/只，具体动物试验方案如表1所示。用ELISA 方法检测免后血清中针对S-RBD蛋白的特异性IgG抗体滴度，利用假病毒和野 病毒微量中和试验检测中和抗体滴度。血清特异性IgG结果如图9所示，假病 毒微量中和试验结果如图10所示，野病毒微量中和如图11所示，血清抗体GMT 值如表2所示。可见重组新型冠状病毒疫苗可刺激大鼠产生较高滴度的抗体水 平，随着免疫针次或免疫剂量增加，特异性IgG抗体和中和抗体水平逐渐升高， 具有明显的剂量关系。
血清特异性IgG抗体检测：采用ELISA方法检测免后血清中针对S-RBD蛋 白的特异性IgG抗体水平，将市售RBD蛋白(购自北京义翘神州科技股份有限 公司，货号为40592-V08B)稀释至1μg/ml，并以100μl/孔包被于酶标板中，封 闭后，加入经系列稀释的血清，利用酶标记抗体(鼠源)检测信号，确定cut-off 值，阳性血清最高稀释倍数即为该血清样品的特异性IgG抗体滴度。
假病毒微量中和试验：假病毒中S蛋白基因序列来源于Wuhan-Hu-1毒株 (GenBank序列编号：MN908947)，报告基因为萤火虫荧光素酶，中和试验中 假病毒工作浓度为(1～2)×104TCID50/ml，使用Reed-Muench法计算50％感染 抑制率时血清稀释倍数，即为该血清样品的中和抗体滴度。
野病毒微量中和试验：该试验于BSL3级实验室完成，病毒株为2020XN4276 株，将系列稀释后的血清与病毒(100TCID50)等体积混合孵育，37℃温箱中和 2小时，加入到含有Vero-E6细胞(2×105/ml)的细胞培养板中，同时设置细胞 对照和病毒对照，37℃温箱中培养3～5天，观察细胞病变情况，采用 Reed-Muench法计算50％感染抑制率时血清稀释倍数，即为该血清样品的中和 抗体滴度。
表1.重组新型冠状病毒疫苗Wistar大鼠试验方案
表2.重组新型冠状病毒疫苗免疫大鼠血清GMT值
对比例1：S-RBD三聚体蛋白和二聚体蛋白比较
截取新型冠状病毒(Genebank编号：MN908947.3)S蛋白RBD区序列片 段(319～537位氨基酸)，将两个相同RBD区片段首尾串联，形成一个二聚体融 合蛋白，氨基酸序列如SEQID NO.3所示，按照CHO细胞表达系统的密码子偏 爱性，对SEQ ID NO.3氨基酸序列进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.4所示，构建CHO细胞表达载体后转染至293FT细胞后，获得能够表达二 聚体蛋白的细胞株，经系列层析纯化后获得纯度≥95％的S-RBD二聚体蛋白(如 图12所示)，与1.2mg/ml氢氧化铝佐剂按1:1比例(w/w)混合吸附后制备二聚体蛋白免疫物，与相同工艺制备的三聚体蛋白免疫物，经腹腔注射免疫BALB/c 小鼠，抗原含量为2.0μg/剂，铝佐剂含量为0.30mg/剂，按照0w，1w和2w免 疫3针次，全程免后2w采集并分离血清，利用ELISA方法检测免后血清中针 对S-RBD蛋白的特异性IgG抗体滴度，利用假病毒和野病毒微量中和试验检测 中和抗体滴度，检测结果如图13、图14和图15所示，GMT检测结果如表3所 示，可见三聚体蛋白产生的抗体水平均高于二聚体蛋白，其中特异性IgG抗体 滴度差异无统计学差异，假病毒中和抗体滴度虽然高约2倍，但统计学无差异， 野病毒中和抗体滴度高约3倍，差异具有统计学意义。
表3.三聚体蛋白和二聚体蛋白免疫血清GMT值
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 国药中生生物技术研究院有限公司
<120> 一种新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
<130> None
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 658
<212> PRT
<213> Virus
<400> 1
Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
1 5 10 15
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
20 25 30
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
50 55 60
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
85 90 95
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
100 105 110
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
115 120 125
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
130 135 140
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
145 150 155 160
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
165 170 175
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
180 185 190
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
195 200 205
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro
210 215 220
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
225 230 235 240
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
245 250 255
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
260 265 270
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
275 280 285
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile
290 295 300
Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile
305 310 315 320
Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
325 330 335
Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn
340 345 350
Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
355 360 365
Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly
370 375 380
Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
385 390 395 400
Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
405 410 415
Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser
420 425 430
Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
435 440 445
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
450 455 460
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
465 470 475 480
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
485 490 495
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
500 505 510
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
515 520 525
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
530 535 540
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
545 550 555 560
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
565 570 575
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
580 585 590
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
595 600 605
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
610 615 620
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
625 630 635 640
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
645 650 655
Asn Lys
<210> 2
<211> 1977
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
atgagagtgc agcccacaga gtcaattgtg agattcccca atatcactaa cctgtgcccc 60
tttggggagg tgttcaatgc cacaagattt gcttctgtgt atgcctggaa tagaaagaga 120
atcagtaact gtgttgctga ctactctgtg ctgtacaatt ctgcctcttt cagcacattc 180
aaatgttatg gggttagccc caccaaacta aatgacctgt gcttcaccaa tgtgtatgct 240
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atagctgact acaattacaa gctgcctgat gactttactg gctgtgtgat tgcctggaat 360
agcaataacc tggacagcaa ggtggggggc aactataact acctatacag attgtttaga 420
aagtccaatt tgaaaccctt tgagagagat atcagcactg agatctatca agctggcagc 480
accccctgta atggggtgga ggggttcaac tgctatttcc ccttacagag ctatggcttt 540
cagcccacca atggggtggg ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgtc ttttgaacta 600
cttcatgccc ctgccacagt gtgtggcccc aaaaaaagca caaacctggt gaaaaacaag 660
agagtgcagc caacagagag cattgtgaga ttccctaaca taaccaatct gtgtcccttt 720
ggtgaggttt ttaatgctac tagatttgcc tctgtgtatg cctggaacag aaaaagaatc 780
tcaaactgtg tggctgacta ttcagtcctc tacaactcag ctagctttag caccttcaaa 840
tgctatggtg tcagtcccac caaactgaat gacctttgtt tcaccaatgt ctatgctgac 900
agctttgtga tcagagggga tgaagtgaga caaatagccc ctgggcagac tggcaagata 960
gctgattaca actataaact gcctgatgat ttcactggct gtgtcattgc ctggaactca 1020
aataatctag acagcaaggt aggtggcaat tataactacc tctataggct gtttaggaaa 1080
agtaacctga aaccctttga gagagacatt agcacagaga tttatcaagc tggctcaaca 1140
ccctgtaatg gtgtggaggg ctttaactgc tacttccccc tgcagagcta tggctttcag 1200
ccaaccaatg gagtgggcta tcagccctat agagtagttg tgctgagctt tgagctgctg 1260
catgcccctg ccacagtgtg tggccctaag aaaagcacca acttggtcaa aaataagaga 1320
gtacaaccca cagagtccat tgtgagattt cccaacatca ctaatttgtg tccttttggg 1380
gaggtcttca atgccacaag atttgcctct gtgtatgcct ggaacagaaa gagaatcagc 1440
aactgtgtgg ctgactactc tgtgctgtac aactctgcct ccttcagcac cttcaagtgc 1500
tatggggtga gccccaccaa gctcaatgac ttatgcttca ccaatgtgta tgctgacagc 1560
tttgtgatta gaggggatga ggtcagacag attgcccctg gccaaactgg aaaaattgct 1620
gactacaact acaaactgcc tgatgacttt actggctgtg tgattgcctg gaactccaac 1680
aaccttgata gcaaggttgg ggggaattat aactatctgt acagactatt cagaaagagc 1740
aacctgaaac cctttgagag agacatctca acagaaatat atcaagctgg ctccactcca 1800
tgcaatgggg tggagggatt caattgttac ttccccctgc agtcatatgg ctttcaaccc 1860
accaatgggg tgggctacca accttacaga gtggtagtac tttcctttga gctacttcat 1920
gcccctgcca cagtgtgtgg ccccaagaaa agcaccaatc tggtaaagaa taagtga 1977
<210> 3
<211> 439
<212> PRT
<213> Virus
<400> 3
Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
1 5 10 15
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
20 25 30
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
50 55 60
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
85 90 95
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
100 105 110
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
115 120 125
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
130 135 140
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
145 150 155 160
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
165 170 175
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
180 185 190
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
195 200 205
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro
210 215 220
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
225 230 235 240
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
245 250 255
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
260 265 270
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
275 280 285
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile
290 295 300
Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile
305 310 315 320
Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
325 330 335
Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn
340 345 350
Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
355 360 365
Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly
370 375 380
Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
385 390 395 400
Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
405 410 415
Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser
420 425 430
Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
435
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
atgagagtgc agcccacaga gtcaattgtg agattcccca atatcactaa cctgtgcccc 60
tttggggagg tgttcaatgc cacaagattt gcttctgtgt atgcctggaa tagaaagaga 120
atcagtaact gtgttgctga ctactctgtg ctgtacaatt ctgcctcttt cagcacattc 180
aaatgttatg gggttagccc caccaaacta aatgacctgt gcttcaccaa tgtgtatgct 240
gacagctttg tgatcagagg tgatgaagtg agacaaattg cccctgggca gactggcaag 300
atagctgact acaattacaa gctgcctgat gactttactg gctgtgtgat tgcctggaat 360
agcaataacc tggacagcaa ggtggggggc aactataact acctatacag attgtttaga 420
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agagtgcagc caacagagag cattgtgaga ttccctaaca taaccaatct gtgtcccttt 720
ggtgaggttt ttaatgctac tagatttgcc tctgtgtatg cctggaacag aaaaagaatc 780
tcaaactgtg tggctgacta ttcagtcctc tacaactcag ctagctttag caccttcaaa 840
tgctatggtg tcagtcccac caaactgaat gacctttgtt tcaccaatgt ctatgctgac 900
agctttgtga tcagagggga tgaagtgaga caaatagccc ctgggcagac tggcaagata 960
gctgattaca actataaact gcctgatgat ttcactggct gtgtcattgc ctggaactca 1020
aataatctag acagcaaggt aggtggcaat tataactacc tctataggct gtttaggaaa 1080
agtaacctga aaccctttga gagagacatt agcacagaga tttatcaagc tggctcaaca 1140
ccctgtaatg gtgtggaggg ctttaactgc tacttccccc tgcagagcta tggctttcag 1200
ccaaccaatg gagtgggcta tcagccctat agagtagttg tgctgagctt tgagctgctg 1260
catgcccctg ccacagtgtg tggccctaag aaaagcacca acttggtcaa aaataagtga 1320
Claims (15)
1.一种新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，其特征在于，所述三聚体蛋白由三聚体形式的新型冠状病毒S蛋白RBD区第319～537位氨基酸片段构成。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，其特征在于，所述三聚体蛋白的一级结构为三个所述氨基酸片段按照N末端至C末端的顺序连接；
优选地，所述新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示或与其具有95％以上同源性的序列。
3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含如权利要求1或2中所述的新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含选自信号肽、标签或免疫增强肽中的一种或几种。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码如权利要求1或2所述的新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，或编码如权利要求3或4所述的融合蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示或与其具有95％以上同源性的序列。
6.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求5所述的核酸分子或如权利要求6所述的载体；
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
更优选地，所述宿主细胞为CHO细胞。
8.如权利要求1或2所述的新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或如权利要求3或4所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A)制备如权利要求5所述的核酸分子，构建如权利要求6所述的表达载体，将表达载体转化或转染至如权利要求7所述的宿主细胞内；
步骤B)利用步骤A)的产物进行蛋白质表达；
步骤C)纯化步骤B)中获得的表达产物，得到所述新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或融合蛋白。
9.如权利要求1或2所述的新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、如权利要求3或4所述的融合蛋白、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
10.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含如权利要求1或2所述的新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或如权利要求3或4所述的融合蛋白，以及佐剂。
11.根据权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG；
优选地，所述佐剂为氢氧化铝。
12.如权利要求10或11所述的疫苗的制备方法，其特征在于，将纯化所得的所述新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白与所述佐剂混合。
13.如权利要求10或11所述的疫苗在治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病中的用途。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求10所述的疫苗，以及药学上可接受的载体。
15.一种引发受试者针对新型冠状病毒的免疫应答或治疗受试者的新型冠状病毒感染的方法，其特征在于，向所述受试者施用有效剂量的如权利要求10所述的疫苗或如权利要求14所述的药物组合物。
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