CN112321688A - 稳定的冠状病毒重组蛋白二聚体及其表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了稳定的冠状病毒重组蛋白二聚体及其表达载体，冠状病毒重组蛋白，由冠状病毒S蛋白S‑RBD、冠状病毒N蛋白的CTD区N‑CTD和将二者偶联的连接子构成。本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白，可以形成并维持稳定的二聚体结构，避免单体S‑RBD降解，有利于提高冠状病毒重组蛋白的免疫原性，有望用于制备检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白二聚体，具有很好的免疫原性。在疫苗开发领域具有广阔的应用前景。本发明一些实例的表达载体，易于表达冠状病毒重组蛋白二聚体且表达量高。

Description

稳定的冠状病毒重组蛋白二聚体及其表达载体
技术领域
本发明涉及一种重组蛋白，特别涉及稳定的冠状病毒重组蛋白二聚体及其表达载体。
背景技术
冠状病毒属于套式病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus），是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原，引起多种急慢性疾病。根据系统发育树，冠状病毒可分为四个属：α、β、γ、δ，其中β属冠状病毒又可分为四个独立的亚群A、B、C和D群。
冠状病毒感染在世界各地极为普遍。到目前为止，大约有15种不同冠状病毒株被发现，能够感染多种哺乳动物和鸟类，有些可使人发病。除了近期爆发的新型冠状病毒SARS-CoV-2，还有HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV等六种冠状病毒可以感染人类，其中SARS-CoV和MERS-CoV感染后比较严重，分别引发重症急性呼吸综合征和中东呼吸综合征。
冠状病毒是最大单股正链 RNA 病毒，基因组大小约为30 kbp，其主要结构蛋白包含核衣壳蛋白（N）、纤突糖Spike蛋白（S）、跨膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）。其中S蛋白参与病毒与细胞受体结合、介导病毒与宿主膜融合，同时S蛋白及其受体结构域S-RBD主要负责诱导宿主免疫反应和病毒中和抗体，是疫苗设计的关键抗原位点。然而将S-RBD单体作为抗原时，免疫原性偏弱且蛋白稳定性较差。如何提高S-RBD的稳定性，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一种不足，提供一种稳定的冠状病毒重组蛋白二聚体及其表达载体。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
冠状病毒重组蛋白，由冠状病毒S蛋白S-RBD、冠状病毒N蛋白的CTD区N-CTD和将二者偶联的连接子构成。
在一些实例中，S-RBD的另一端偶联有冠状病毒S蛋白的信号肽SP。
在一些实例中，所述S-RBD的氨基酸序列独立如SEQ ID NO.：1所示。
在一些实例中，所述N-CTD的氨基酸序列独立如SEQ ID NO.：2所示。
两个蛋白融合，一般选用glycine 做连接子(linker)，因为它是所有氨基酸中最小的，没有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之间一般不会影响两边蛋白的构象和功能发挥。本研究选用常用的glycine linker 序列中的GSGSG作为linker，降低两个融合蛋白的空间位阻，有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。在一些实例中，所述连接子的氨基酸序列独立为GSGSG。
在一些实例中，所述SP的氨基酸序列独立为MFVFLVLLPLVSS。通过引入SP序列，可以使重组蛋白大量分泌到胞外。同时SP氨基酸序列会被切掉。
在一些实例中，所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等。
在一些实例中，冠状病毒重组蛋白的序列如SEQ ID NO.：5所示。
本发明的第二个方面，提供：
一种核苷酸序列，其可编码本发明第一个方面所述的冠状病毒重组蛋白。
在一些实例中，SP的核苷酸序列为ATGTTCGTGTTCTTGGTGTTGTTGCCTTTGGTGTCTTCT（SEQ ID NO.：6）。
在一些实例中，S-RBD的核苷酸序列为TTCACCGTGGAGAAGGGTATCTACCAGACCTCCAACTTCAGGGTGCAGCCTACCGAGTCCATCGTGCGCTTCCCTAACATCACCAACCTCTGCCCTTTCGGTGAAGTCTTCAACGCTACCCGCTTCGCTTCCGTGTACGCTTGGAACCGCAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCTGACTACTCCGTGCTCTACAACAGCGCTTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGTGTGTCCCCTACTAAGTTGAACGATCTGTGCTTCACCAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGCGACGAGGTGCGCCAAATCGCTCCTGGTCAGACCGGTAAGATCGCCGATTACAACTACAAGCTGCCTGACGACTTCACCGGTTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCTAAGGTGGGTGGTAACTACAACTACCTCTACCGCCTGTTCCGCAAGAGCAACCTCAAGCCCTTCGAAAGGGACATCTCCACAGAGATCTACCAAGCTGGCTCCACACCTTGCAACGGTGTGGAAGGTTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAATCCTACGGTTTCCAGCCCACCAACGGTGTGGGATACCAGCCTTACCGCGTGGTCGTGCTCTCCTTCGAGCTGCTCCACGCTCCTGCTACCGTGTCCGGTCCTAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAGAACAAGACCGTGAACTTCAACTTCAACGGTCTCACCGGCACCGGTGTCCTCACCGAGTCCAACAAGAAGTTCCTCCCTTTCCAGCAGTTCGGTCGCGACATCGCTGATACCACCGACGCC（SEQ ID NO.：7）。
在一些实例中，连接子的核苷酸序列为GGTTCTGGTTCTGGT（SEQ ID NO.：8）。
在一些实例中，N-CTD的核苷酸序列为ACTAAGAAGTCTGCTGCCGAGGCTTCCAAGAAGCCTAGGCAGAAGCGCACCGCCACCAAGGCCTACAACGTGACCCAGGCCTTCGGACGCAGGGGTCCCGAGCAAACTCAAGGCAACTTCGGCGACCAGGAACTGATCCGTCAGGGTACAGACTACAAGCACTGGCCCCAGATCGCTCAATTCGCTCCTTCCGCTTCTGCTTTCTTCGGCATGTCCCGTATCGGCATGGAGGTGACTCCTTCCGGTACTTGGCTGACCTACACCGGCGCTATCAAGCTCGACGACAAGGACCCTAACTTCAAGGACCAGGTGATCCTGCTGAACAAGCACATCGACGCTTACAAGACCTTCCCCTGA（SEQ ID NO.：9）。
在一些实例中，核苷酸序列根据宿主细胞的不同而进行序列优化。
在一些实例中，核苷酸序列的序列包括由SEQ ID NO.：7～9依次连接而成的序列。
在一些实例中，核苷酸序列的序列依次由SEQ ID NO.：6～9组成。
本发明的第三个方面，提供：
一种表达冠状病毒重组蛋白的载体，包括骨架载体，所述骨架载体插入有本发明第二个方面所述的核苷酸序列。
在一些实例中，所述骨架载体选自pFastBacTM-SCUVI、pFastBacTM-Dual载体、pESCURA载体、pVIVO2-mcs载体、pCDNA3.1载体、pBudCE4.1载体或者pET系列载体
在一些实例中，载体的宿主细胞为Spodoptera frugiperda草地夜蛾细胞Sf9、粉纹夜蛾细胞High five、果蝇s2细胞、酿酒酵母、大肠杆菌或哺乳动物细胞。
本发明的第四个方面，提供：
冠状病毒重组蛋白二聚体，由本发明第一个方面所述的冠状病毒重组蛋白二聚得到。
本发明的第五个方面，提供：
冠状病毒重组蛋白及其二聚体的应用，所述冠状病毒重组蛋白如本发明第一个方面所述，所述应用包括制备检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白，可以形成并维持稳定的二聚体结构，避免单体S-RBD降解，有利于提高冠状病毒重组蛋白的免疫原性。
本发明一些实例的冠状病毒重组蛋白二聚体，具有很好的免疫原性。在疫苗开发领域具有广阔的应用前景。
本发明一些实例的表达载体，易于表达冠状病毒重组蛋白二聚体且表达量高。
发明一些实例的冠状病毒重组蛋白及其二聚体，有望用于制备检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。
附图说明
图1是一些实例冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白结构示意图；
图2是新型冠状病毒SARS-CoV-2表达样品细胞和上清Western blot分析；
图3是蛋白纯化过程WB和SDS-PAGE分析图；A：WB； B：SDS-PAGE；
图4是新型冠状病毒SARS-CoV-2 S-RBD-CTD重组蛋白晶体模拟图；A：S-RBD，B：S-RBD-CTD；
图5是新型冠状病毒SARS-CoV-2 S-RBD-CTD蛋白与康复者血清IgG结合分析图；
图6是新型冠状病毒SARS-CoV-2 S-RBD-CTD蛋白稳定性分析图；
图7是新型冠状病毒SARS-CoV-2 S-RBD-CTD重组蛋白诱导中和抗体分析图。
具体实施方式
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
材料和试剂：
1.1主要材料
病毒：假病毒（pCDNA3.1-M-S、和pHIV-Lucifeiace和psPAX2共转染293FT细胞，包装获得的假病毒）；
细胞：昆虫贴壁细胞Sf9、昆虫悬浮细胞Sf-ɑ（专利号：ZL201410259283.1）。
1.2 主要试剂
KOD FX高保真酶：东洋纺(上海)生物科技有限公司；
卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal、IPTG（北京鼎国）；
LB培养基（Sigma）；
Grace's培养基、FBS（Gibco)；
EXCELL-420培养基（Sigma）；
CellfectinⅡ脂质体（Thermo Fisher）；
S-RBD鼠多抗（利用293T细胞表达的S-RBD蛋白免疫的小鼠）；
HRP羊抗鼠二抗（北京鼎国）。
实施例1：一种表达新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的载体
SARS-CoV-2重组蛋白结构示意图如图1所示。
将新型冠状病毒SARS-CoV-2 S蛋白的N端信号肽MFVFLVLLPLVSS，连在SARS-CoV-2S-RBD的N端，N蛋白的CTD区（aa248-365）连在S-RBD的C端，中间利用linker连接。置于pFastBacTM SCUVI质粒的Ppolh启动子下。获得穿梭载体pFastBacTM SCUVI-SP-S-RBD-CTD，即表达新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的载体。
实施例2：
表达新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的载体的制备方法，包括以下步骤：
1）基因优化合成
将新型冠状病毒SARS-CoV-2 S蛋白N端信号肽SP、306-575区域（S-RBD）和N蛋白的CTD区（aa248-365）连接（S-RBD和CTD用Linker GSGSG连接），根据宿主细胞Spodoptera frugiperda草地夜蛾（Sf9）细胞系的偏爱性进行密码子虫源优化，PUC57为载体，以XhoI, KpnI为酶切位点合成SP-S-RBD-CTD，并将其克隆至PUC57载体中，得重组载体PUC57- SP-S-RBD-CTD。
实施例3
表达新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的载体的制备方法，包括以下步骤：
1）基因优化合成
将新型冠状病毒SARS-CoV-2 S蛋白N端信号肽SP、306-575区域（S-RBD）和N蛋白的CTD区（aa248-365）连接（S-RBD和CTD用Linker GSGSG连接），根据宿主细胞Spodopterafrugiperda草地夜蛾（Sf9）细胞系的偏爱性进行密码子虫源优化，PUC57为载体，以Xho I,Kpn I为酶切位点合成SP-S-RBD-CTD，并将其克隆至PUC57载体中，得重组载体PUC57- SP-S-RBD-CTD。
2）穿梭载体制备
利用Xho I, Kpn I，将载体PUC57- SP-S-RBD-CTD中的SP-S-RBD-CTD酶切、连接至置于pFastBacTM SCUVI质粒的Ppolh启动子下。获得穿梭载体pFastBacTM SCUVI-SP-S-RBD-CTD。
实施例4
重组杆状病毒的制备方法
1）将实施例3中所述的表达新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的载体pFastBacTMSCUVI-SP-S-RBD-CTD。分别通过Invitrogen的Bac-to-Bac 系统，转化大肠杆菌DH10 Bac，培养后，筛选提取阳性重组大肠杆菌DH10 Bac的质粒，获得重组杆状病毒载体；
2）将上一步获得的重组杆状病毒载体转染Sf9细胞获得相应的第一代重组杆状病毒，即重组杆状病毒，命名为Bac-SCUVI-SP-S-RBD-CTD。
对上述制得的重组杆状病毒进行以下相关检测。
一、重组杆状病毒蛋白表达Western blot分析
将上述制得的Bac-SCUVI-SP-S-RBD-CTD重组杆状病毒以1MOI感染Sf-ɑ悬浮细胞，以EXCELL-420悬浮培养基，培养72小时，分别收集细胞和上清，取细胞和上清样品进行12%的SDS-PAGE电泳（非还原胶，不加入β-巯基乙醇），转印PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭过夜，PBST漂洗5次，以1:4000稀释一抗S-RBD鼠多抗，室温孵育2h，PBST稀释5次，HRP标记的二抗羊抗鼠室温孵育1.5小时，PBST漂洗5次，利用超敏发光液（A液25ml、B液25ml）进行压片显色。检测结果如图2所示，表达3天后的细胞和上清中都能检测到90kDa左右的目的蛋白，而单体的S-RBD-CTD是45kDa左右，说明目的蛋白是以二聚体的形式存在，且有一半以上蛋白释放至上清中，推测SP-S-RBD-CTD可以大量分泌到胞外（SP氨基酸序列会被切掉）。
实施例5新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的制备方法
新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）表达新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的载体的构建：如实施例1～3所述；
2）重组杆状病毒的制备：如实施例4所述；
3）新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的表达和组装：将实施例4制得的重组杆状病毒分别以1 MOI感染Sf-ɑ悬浮细胞，每个样品表达2 L，培养3天收获病毒上清；
4）新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白的纯化：将收获的病毒上清装入250ml的离心杯中，配平。使用JA-14转子（Beckman）高速离心收集上清，，然后将上清经pellicon膜包浓缩10倍得到浓缩液，再经过强阳离子EMD SO3纯化、外源凝集素亲和介质Lentil LectinSepharose 4B和分子筛纯化，得到重组蛋白。
Western blot和SDS-PAGE（非还原胶，不加入β-巯基乙醇）分析检测结果如图3所示，目的蛋白大小为90kDa左右。
蛋白稳定性检测和3D结构模拟：
将纯化的重组蛋白分别置于常温25℃连续放置7天、14天、21天、28和35天。再将这些重组蛋白分别包被至96孔酶标板上，以康复者血清为一抗检测，再以带HRP的羊抗人血清为二抗，在450nm条件下检测其OD值。结果如图4所示，S-RBD-CTD蛋白非常稳定，其在25℃条件下放置35天，其活性稳定，与康复者血清结合能力保持不变，而单体S-RBD不稳定，其活性在常温下两周后明显下降。
利用CCP4MG软件模拟S-RBD和S-RBD-CTD的 3D结构图。如图5所示，S-RBD-CTD可以形成稳定的二聚体结构，S-RBD分布在二聚体CTD的两侧。
二、新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白疫苗效力分析
1）疫苗的制备和免疫程序
稀释实施例5中制备的新型冠状病毒重组蛋白S-RBD-CT和S-RBD，并分别加入1/10体积的Alhydrogel佐剂（1000mg/ml）混合，使得蛋白浓度为20µg/ml，利用以上10μg纯化的重组蛋白对6-8周龄的BALB/c母鼠分别在0，14天进行免疫两次，每次每只免疫10μg。同时设置经样处理的未感染病毒的Sf-ɑ细胞作为阴性对照。28天后小鼠眼球采血，收集血清，-80℃分装保存。
2）免疫小鼠血清中和抗体滴度
假病毒的制备和病毒滴定：按照转染试剂Lipofectamine 3000的操作说明，将带有pCDNA3.1 -Spike、和pWPXL-Lucifeiace和psPAX2三种质粒的OPTI-MEM培养基中，与含有适量lipofectamine 3000及P3000转染试剂的OPTI-MEM培养基混合，混匀后室温静置15分钟，将混合液逐滴加入239T细胞中，37℃、5%的CO2培养8小时候后将培养液弃去，换成新鲜DMEM培养基继续培养，48和72小时后收获含SARS-CoV-2假病毒的上清。1000rpm/min离心5 min，0.45 μm滤膜过滤后收集上清分装于-80℃保存，并进行病毒滴度测定。
血清抗体效价检测：取各组小鼠血清样品，56℃灭活30min，用DMEM培养基倍比稀释。将SARS-CoV-2假病毒用DMEM培养基稀释到200CCID50/100μL。稀释后的病毒液、样品各取100μl，混合均匀，室温孵育30 min。吸去293T-ACE2细胞培养上清，取200μl混合液加入到96孔板293T-ACE2细胞中，每个血清稀释度2个复孔。置于CO2培养箱中培养48 小时，取出96孔板，弃去上清，加入裂解液，裂解细胞后加入荧光素酶酶底物，检测荧光素酶活性值。计算血清样品的假病毒中和抑制率，得到中和抗体效价（EC50）。
实验结果如图6所示，阴性对照小鼠血清几乎无中和抗体效价， S-RBD可以诱导1：200左右的中和抗体效价，本发明制备的新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白 S-RBD-CT二聚体免疫小鼠两次后可以诱导1：1000以上的中和抗体效价(图7)，是S-RBD的5倍以上。上述结果说明，本发明制备的冠状病毒重组蛋白可以诱导产生的较强的中和抗体效价，表现出较好的免疫原性，因此本发明制备的新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白可作为预防新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的肺炎的候选疫苗。
发明一些实例的冠状病毒重组蛋白及其二聚体，有望用于制备检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。
其他冠状病毒如SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等具有与SARS-CoV-2相近似的蛋白结构，也可以参照上述实施例构建得到相应的冠状病毒重组蛋白。
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内，如将上述实施例中的宿主细胞改为酵母细胞、大肠杆菌或哺乳细胞等等，从而根据宿主细胞选择相应的骨架载体，进行同以上实验例类似的表达冠状病毒重组蛋白载体的构建，以及冠状病毒重组蛋白的制备等，均落在本发明要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东华南疫苗股份有限公司
<120> 稳定的冠状病毒重组蛋白二聚体及其表达载体
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 270
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
225 230 235 240
Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro
245 250 255
Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
260 265 270
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Thr Ala Thr Lys
1 5 10 15
Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr
20 25 30
Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr
35 40 45
Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe
50 55 60
Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp
65 70 75 80
Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe
85 90 95
Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr
100 105 110
Phe Pro
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 389
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
225 230 235 240
Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro
245 250 255
Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Gly Ser
260 265 270
Gly Ser Gly Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Thr
275 280 285
Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro
290 295 300
Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly
305 310 315 320
Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala
325 330 335
Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser
340 345 350
Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp
355 360 365
Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala
370 375 380
Tyr Lys Thr Phe Pro
385
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgttcgtgt tcttggtgtt gttgcctttg gtgtcttct 39
<210> 7
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttcaccgtgg agaagggtat ctaccagacc tccaacttca gggtgcagcc taccgagtcc 60
atcgtgcgct tccctaacat caccaacctc tgccctttcg gtgaagtctt caacgctacc 120
cgcttcgctt ccgtgtacgc ttggaaccgc aagcgcatct ccaactgcgt ggctgactac 180
tccgtgctct acaacagcgc ttccttctcc accttcaagt gctacggtgt gtcccctact 240
aagttgaacg atctgtgctt caccaacgtc tacgccgact ccttcgtgat ccgcggcgac 300
gaggtgcgcc aaatcgctcc tggtcagacc ggtaagatcg ccgattacaa ctacaagctg 360
cctgacgact tcaccggttg cgtgatcgcc tggaactcca acaacctgga ctctaaggtg 420
ggtggtaact acaactacct ctaccgcctg ttccgcaaga gcaacctcaa gcccttcgaa 480
agggacatct ccacagagat ctaccaagct ggctccacac cttgcaacgg tgtggaaggt 540
ttcaactgct acttccccct gcaatcctac ggtttccagc ccaccaacgg tgtgggatac 600
cagccttacc gcgtggtcgt gctctccttc gagctgctcc acgctcctgc taccgtgtcc 660
ggtcctaaga agtccaccaa cctcgtgaag aacaagaccg tgaacttcaa cttcaacggt 720
ctcaccggca ccggtgtcct caccgagtcc aacaagaagt tcctcccttt ccagcagttc 780
ggtcgcgaca tcgctgatac caccgacgcc 810
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggttctggtt ctggt 15
<210> 9
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
actaagaagt ctgctgccga ggcttccaag aagcctaggc agaagcgcac cgccaccaag 60
gcctacaacg tgacccaggc cttcggacgc aggggtcccg agcaaactca aggcaacttc 120
ggcgaccagg aactgatccg tcagggtaca gactacaagc actggcccca gatcgctcaa 180
ttcgctcctt ccgcttctgc tttcttcggc atgtcccgta tcggcatgga ggtgactcct 240
tccggtactt ggctgaccta caccggcgct atcaagctcg acgacaagga ccctaacttc 300
aaggaccagg tgatcctgct gaacaagcac atcgacgctt acaagacctt cccctga 357

Claims (10)

1.冠状病毒重组蛋白，由冠状病毒S蛋白S-RBD、冠状病毒N蛋白的CTD区N-CTD和将二者偶联的连接子构成；其中：
所述S-RBD的氨基酸序列为：FTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDA；
所述N-CTD的氨基酸序列TKKSAAEASKKPTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFP；
所述连接子为glycine linker。
2.根据权利要求1所述的冠状病毒重组蛋白，其特征在于：所述S-RBD的另一端偶联有冠状病毒S蛋白的信号肽SP。
3.根据权利要求2所述的冠状病毒重组蛋白，其特征在于：所述SP的氨基酸序列为MFVFLVLLPLVSS。
4.根据权利要求1所述的冠状病毒重组蛋白，其特征在于：所述连接子的氨基酸序列为GSGSG。
5.根据权利要求1所述的冠状病毒重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为FTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDA-GSGSG-TKKSAAEASKKPTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFP。
6.一种核苷酸序列，其可编码权利要求1～5任一项所述的冠状病毒重组蛋白。
7.根据权利要求6所述的核苷酸序列，其特征在于：其序列包括TTCACCGTGGAGAAGGGTATCTACCAGACCTCCAACTTCAGGGTGCAGCCTACCGAGTCCATCGTGCGCTTCCCTAACATCACCAACCTCTGCCCTTTCGGTGAAGTCTTCAACGCTACCCGCTTCGCTTCCGTGTACGCTTGGAACCGCAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCTGACTACTCCGTGCTCTACAACAGCGCTTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGTGTGTCCCCTACTAAGTTGAACGATCTGTGCTTCACCAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGCGACGAGGTGCGCCAAATCGCTCCTGGTCAGACCGGTAAGATCGCCGATTACAACTACAAGCTGCCTGACGACTTCACCGGTTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCTAAGGTGGGTGGTAACTACAACTACCTCTACCGCCTGTTCCGCAAGAGCAACCTCAAGCCCTTCGAAAGGGACATCTCCACAGAGATCTACCAAGCTGGCTCCACACCTTGCAACGGTGTGGAAGGTTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAATCCTACGGTTTCCAGCCCACCAACGGTGTGGGATACCAGCCTTACCGCGTGGTCGTGCTCTCCTTCGAGCTGCTCCACGCTCCTGCTACCGTGTCCGGTCCTAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAGAACAAGACCGTGAACTTCAACTTCAACGGTCTCACCGGCACCGGTGTCCTCACCGAGTCCAACAAGAAGTTCCTCCCTTTCCAGCAGTTCGGTCGCGACATCGCTGATACCACCGACGCC-GGTTCTGGTTCTGGT-ACTAAGAAGTCTGCTGCCGAGGCTTCCAAGAAGCCTAGGCAGAAGCGCACCGCCACCAAGGCCTACAACGTGACCCAGGCCTTCGGACGCAGGGGTCCCGAGCAAACTCAAGGCAACTTCGGCGACCAGGAACTGATCCGTCAGGGTACAGACTACAAGCACTGGCCCCAGATCGCTCAATTCGCTCCTTCCGCTTCTGCTTTCTTCGGCATGTCCCGTATCGGCATGGAGGTGACTCCTTCCGGTACTTGGCTGACCTACACCGGCGCTATCAAGCTCGACGACAAGGACCCTAACTTCAAGGACCAGGTGATCCTGCTGAACAAGCACATCGACGCTTACAAGACCTTCCCCTGA。
8.一种表达冠状病毒重组蛋白的载体，包括骨架载体，其特征在于：所述骨架载体插入有权利要求6或7所述的核苷酸序列。
9.冠状病毒重组蛋白二聚体，其特征在于：由权利要求1～5任一项所述的冠状病毒重组蛋白二聚得到。
10.冠状病毒重组蛋白或其二聚体的应用，其特征在于：所述冠状病毒重组蛋白如权利要求1～5任一项所述，所述应用包括制备检测试剂原料、预防或治疗性药物。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112979795A (zh) * 2021-02-26 2021-06-18 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抗体组合产品及其在新冠肺炎检测中应用
CN113480619A (zh) * 2021-08-26 2021-10-08 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用
CN113817029A (zh) * 2021-03-31 2021-12-21 国药中生生物技术研究院有限公司 一种新型冠状病毒s-rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
US11547673B1 (en) 2020-04-22 2023-01-10 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023051850A1 (zh) * 2021-10-01 2023-04-06 中国科学院昆明动物研究所 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用
CN116023511A (zh) * 2023-02-03 2023-04-28 上海易安飞玛生物技术有限公司 一种融合蛋白及其在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用
WO2023130096A3 (en) * 2021-12-31 2023-08-31 Boost Biopharma, Inc. Coronavirus vaccine compositions and uses thereof
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104292339A (zh) * 2013-07-18 2015-01-21 特菲(天津)生物医药科技有限公司 含sars病毒rbd抗原的重组蛋白及展示rbd蛋白的杆状病毒
WO2016116398A1 (en) * 2015-01-19 2016-07-28 Ludwig-Maximilians-Universität München A novel vaccine against the middle east respiratory syndrome coronavirus (mers-cov)
CN111303297A (zh) * 2020-02-14 2020-06-19 中国人民解放军总医院 一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白、试纸条及制备方法和应用
CN111499765A (zh) * 2020-04-08 2020-08-07 四川携光生物技术有限公司 一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用
CN111607003A (zh) * 2020-05-21 2020-09-01 泰州市百英生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104292339A (zh) * 2013-07-18 2015-01-21 特菲(天津)生物医药科技有限公司 含sars病毒rbd抗原的重组蛋白及展示rbd蛋白的杆状病毒
WO2016116398A1 (en) * 2015-01-19 2016-07-28 Ludwig-Maximilians-Universität München A novel vaccine against the middle east respiratory syndrome coronavirus (mers-cov)
CN111303297A (zh) * 2020-02-14 2020-06-19 中国人民解放军总医院 一种双抗原夹心法检测2019新型冠状病毒抗体的重组蛋白、试纸条及制备方法和应用
CN111499765A (zh) * 2020-04-08 2020-08-07 四川携光生物技术有限公司 一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用
CN111607003A (zh) * 2020-05-21 2020-09-01 泰州市百英生物科技有限公司 一种SARS-CoV-2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAN WU 等: "A new coronavirus associated with human respiratory disease in China", 《NATURE》 *
李越希 等: "SARS 病毒S 和N 蛋白抗原表位的基因合成、融合表达及纯化鉴定", 《生物工程学报》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11547673B1 (en) 2020-04-22 2023-01-10 BioNTech SE Coronavirus vaccine
US11925694B2 (en) 2020-04-22 2024-03-12 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CN112979795B (zh) * 2021-02-26 2022-07-08 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抗体组合产品及其在新冠肺炎检测中应用
CN112979795A (zh) * 2021-02-26 2021-06-18 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 抗体组合产品及其在新冠肺炎检测中应用
CN113817029B (zh) * 2021-03-31 2022-09-23 国药中生生物技术研究院有限公司 一种新型冠状病毒s-rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
WO2022206222A1 (zh) * 2021-03-31 2022-10-06 国药中生生物技术研究院有限公司 一种新型冠状病毒s-rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
CN113817029A (zh) * 2021-03-31 2021-12-21 国药中生生物技术研究院有限公司 一种新型冠状病毒s-rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
CN113480619A (zh) * 2021-08-26 2021-10-08 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用
WO2023051850A1 (zh) * 2021-10-01 2023-04-06 中国科学院昆明动物研究所 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用
WO2023130096A3 (en) * 2021-12-31 2023-08-31 Boost Biopharma, Inc. Coronavirus vaccine compositions and uses thereof
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CN116023511A (zh) * 2023-02-03 2023-04-28 上海易安飞玛生物技术有限公司 一种融合蛋白及其在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用
CN116023511B (zh) * 2023-02-03 2024-04-09 北京强本生物技术有限公司 一种融合蛋白及其在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用

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