TWI824468B

TWI824468B - 新型冠狀病毒疫苗組合物及其用途

Info

Publication number: TWI824468B
Application number: TW111112873A
Authority: TW
Inventors: 吳夙欽; 陳怡蓁; 林偉碩; 李宜謙; 洪浩展
Original assignee: 國立清華大學; 輔仁大學學校財團法人輔仁大學
Priority date: 2021-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2023-12-01
Also published as: WO2022206954A1; TW202239960A

Abstract

本發明提供一種新型冠狀病毒組合物及其用途。該新型冠狀病毒疫苗組合物包含在N端域或受體結合域具有N-醣基化遮蔽的新型冠狀病毒棘蛋白突變體，且可以有效引發個體產生針對不同新型冠狀病毒變體的免疫反應。

Description

新型冠狀病毒疫苗組合物及其用途

本發明係關於一種疫苗組合物及其用途，特別係關於一種利用在N端域或受體結合域具有N-醣基化遮蔽的新型冠狀病毒棘蛋白突變體作為抗原的新型冠狀病毒疫苗組合物及其用途。

嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，以下簡稱新型冠狀病毒)是一種具有包膜的正鏈單股RNA病毒，屬於冠狀病毒科乙型冠狀病毒屬嚴重急性呼吸道症候群相關冠狀病毒種，病毒顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約8054120奈米，病毒顆粒被宿主細胞所提供的雙層磷脂質所包裹，主要包含外套膜蛋白 (E蛋白質)、膜蛋白 (M蛋白質)、核衣殼蛋白 (nucleocapsid，N蛋白質)、以及棘蛋白 (spike protein，S蛋白質)四種結構蛋白；新型冠狀病毒造成於2019年底爆發的嚴重特殊傳染性肺炎 (COVID-19)，其可以透過人類上呼吸道入侵人體，以多種細胞表面所表現的血管收縮素轉換酶2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)為受體達到感染；主要感染器官則包含肺部、心臟、腎臟等多個主要器官。

為避免新型冠狀病毒所造成的重大健康及經濟損失，醫學相關研究人員著重於研發新型冠狀病毒疫苗，然而由於新型冠狀病毒屬於RNA病毒，具有較高的突變率，且目前也因此有多種新型冠狀病毒變體在全球傳播，其中又以英國變異株 (Alpha，B.1.1.7)、南非變異株 (Beta，B.1.351)、及印度變異株 (Delta，B.1.617.2)最為嚴重。

綜上所述，開發一種可以廣效引發針對不同新型冠狀病毒變體之免疫反應的疫苗組合物，以因應具高度變異性之新型冠狀病毒所造成的感染與傳播，著實有其必要性。

據此，本發明之一目的在提供一種新型冠狀病毒棘蛋白突變體，具有遮蔽新型冠狀病毒棘蛋白的N端域 (N‐terminal domain, NTD)及/或受體結合域 (receptor-binding domain, RBD)的一N-醣基化。

在本發明之一實施例中，如前所述的新型冠狀病毒棘蛋白突變體可以是在一野生型新型冠狀病毒棘蛋白的一胺基酸殘基位具有一突變，其中該胺基酸殘基位可以是選自由以下組成之群組：第21個胺基酸殘基位、第23個胺基酸殘基位、第85個胺基酸殘基位、第87個胺基酸殘基位、第89個胺基酸殘基位、第135個胺基酸殘基位、第137個胺基酸殘基位、第146個胺基酸殘基位、第148個胺基酸殘基位、第158個胺基酸殘基位、第160個胺基酸殘基位、第179個胺基酸殘基位、第181個胺基酸殘基位、第183個胺基酸殘基位、第185個胺基酸殘基位、第187個胺基酸殘基位、第213個胺基酸殘基位、第215個胺基酸殘基位、第219個胺基酸殘基位、第253個胺基酸殘基位、第354個胺基酸殘基位、第356個胺基酸殘基位、第370個胺基酸殘基位、第413個胺基酸殘基位、第428個胺基酸殘基位、第519個胺基酸殘基位、及第521個胺基酸殘基位。且該突變可以是將胺基酸殘基位取代為一天冬醯胺 (Asparagine, N)或一蘇胺酸 (Threonine, T)。

在本發明之又一實施例中，如前所述的新型冠狀病毒棘蛋白突變體可以是在該野生型新型冠狀病毒棘蛋白的第21個胺基酸殘基位與第23個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第85個胺基酸殘基位與第87個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第89個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第135個胺基酸殘基位與第137個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第146個胺基酸殘基位與第148個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第158個胺基酸殘基位與第160個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第179個胺基酸殘基位與第181個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第183個胺基酸殘基位與第185個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第187個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第213個胺基酸殘基位與第215個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第219個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第253個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第356個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第372個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第413個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第428個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、及/或第519個胺基酸殘基位與第521個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代。

本發明之又一目的在提供一種核酸分子，包含編碼如前所述的新型冠狀病毒棘蛋白突變體的一核苷酸序列。

本發明之又一目的在提供一種疫苗組合物，包含如前所述的新型冠狀病毒棘蛋白突變體。

在本發明之又一實施例中，該新型冠狀病毒棘蛋白突變體可以是表達在一重組病毒上，且該重組病毒可以包含如前所述的核酸分子。

在本發明之又一實施例中，該重組病毒可以是一重組腺病毒。

本發明之另一目的在提供一種如前所述的新型冠狀病毒棘蛋白突變體用於製備新型冠狀病毒疫苗組合物的用途。

在本發明之又一實施例中，該新型冠狀病毒疫苗組合物可以在一個體中引發抗複數新型冠狀病毒變體的免疫反應。

在本發明之另一實施例中，該新型冠狀病毒疫苗組合物可以引發高效價的抗原專一性抗體及/或中和抗體。

在本發明之新型冠狀病毒疫苗組合物中，使用在NTD或RBD過度醣化的新型冠狀病毒棘蛋白突變體，以醣遮蔽不重要的抗原決定位，使個體B細胞對新型冠狀病毒棘蛋白的抗體反應得以重新聚焦，且不會影響棘蛋白的整體折疊結構。本發明之新型冠狀病毒棘蛋白突變體可以有效引發個體針對新型冠狀病毒之原始武漢珠、英國變異株、南非變異株、及印度變異株的中和抗體效價，以有效提升個體抵抗新型冠狀病毒之不同變異株感染的能力。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

本文中在分析使用ELISA偵測抗棘蛋白IgG抗體、抗RBD IgG抗體之效價的數據時，對所有的組別 (除了使用PBS溶液的控制組)進行多重比較的統計測試。實驗數據以GraphPad Prism v6.01進行分析，使用非參數克-瓦檢測 (Kruskal-Wallis test)，並以鄧恩多重比較檢測 (Dunn’s multiple comparisons test)進行校正。統計學的顯著性表示如下：*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；以及 ***p ＜ 0.001。而在分析中和抗體效價的實驗數據時，則是根據非線性迴歸對數 (抑制劑)與標準化反應-變量斜率的方程，來擬合抑制病毒感染百分比的曲線，並從擬合曲線中獲得IC50的數值。所有的實驗皆至少進行三次，數據以平均值標準差表示。

在本文中，用語「N-醣基化」是指以一N-醣苷鍵 (N-glycosidic bond)共價連接一蛋白質的天冬醯胺酸的醣鏈，包含約至少十個不同種類的單醣單元。更具體地，該醣鏈是連接至一胺酸殘基中的天冬醯胺酸(N)，該胺基酸殘基為天冬醯胺(N)－任意胺基酸(X)－絲胺酸 (Serine, S)或蘇胺酸(T)，以N-X-S/T表示。N-醣基化依單醣組成具有不同的分子量與結構。

在本文中，除非特別指明，用語「過度醣化」意旨在野生型蛋白質上的「天然醣遮蔽」胺基酸殘基外，具有額外的「突變醣遮蔽」胺基酸殘基。

在本文中，除非特別指明，用語「突變株」等同於用語「變體」。

在本文中，R21N/Q23T、P85N/N87T、N87/G89T、F135N/N137T、H146N/N148T、R158N/Y160T、L179N/G181T、Q183N/N185T、N185/K187T、V213N/D215T、G219N、D253N、N354/K356T、N370/A372T、G413N、D428N、H519N/P521T表示以天冬醯胺及/或蘇胺酸取代野生型新型冠狀病毒棘蛋白的特定胺基酸殘基位，以顯示本發明新型冠狀病毒棘蛋白突變體。

在本文中， Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N354/K356T、Ad-S-N370/A372T、Ad-S-G413N、Ad-S-D428N、Ad-S-H519N/P521T、Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、Ad-S-D253N表示表達不同之本發明新型冠狀病毒棘蛋白突變體的重組腺病毒。

依據本發明，有關基因選殖 (Gene Cloning)的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，有關定點突變 (Site-directed mutagenesis)的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，有關於蛋白質的胺基酸殘基添加N-醣基化 (N-linked glycosylation)的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，有關於以腺病毒表達抗原的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內，且在本文中以「腺病毒載體」表示表達不同之本發明新型冠狀病毒棘蛋白突變體的重組腺病毒。 材料及方法 實驗細胞及培養方法

在本發明之實施例中，使用人類胚胎腎細胞株293A (HEK293A)與人類胚胎腎細胞株293T (HEK293T)進行細胞實驗。HEK293A細胞與HEK293T細胞皆取自生物資源保存及研究中心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC)，並使用添加有10%之胎牛血清 (Fetal Bovine Sera, FBS) (Gibco)及100 units/mL之青黴素/鏈黴素 (penicillin/streptomycin, P/S)的良伊格爾氏培養基 (Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM) (Thermo Scienific)作為細胞培養液，於37 ^oC、含有5%之CO ₂的培養箱進行培養。 腺病毒載體的製備

在本發明之實施例中，使用表達新型冠狀病毒之野生型棘蛋白、或具醣遮蔽突變之棘蛋白突變體的腺病毒作為免疫實驗動物的載體。先將編碼野生型棘蛋白、或棘蛋白突變體的基因分別選殖至pENTR1A載體 (Invitrogen) 中，再使用LR ClonaseTM II Enzyme Mix (Invitrogen)將該二基因分別選殖至腺病毒質體pAd/CMV/V5-DEST (Invitrogen)中，以產生表達野生型棘蛋白或棘蛋白突變體的腺病毒質體 (adenoviral plasmid)。

為了得到表達野生型或棘蛋白突變體的腺病毒載體，使用Pac I限制酶切割該腺病毒質體，以使倒轉終端重複 (inverted terminal repeats, ITR)暴露出來，接著使用TurboFect轉染試劑 (Fermentas)將該二腺病毒質體分別轉染至293A細胞中。於轉染10至15天後，待細胞病變效應 (cytopathic effect, CPE)出現，便收集經轉染的細胞與其培養基。以三次冷凍解凍循環破壞細胞以釋放細胞內的病毒顆粒，並在4 ^oC下使用3,000 rpm離心15分鐘，以收集細胞裂解物的上清液而獲取表達新型冠狀病毒棘蛋白的腺病毒載體。此外，為了製備具有更高滴度 (titer)的腺病毒載體，可以使用30-kDa Amicon Ultra-15離心過濾器 (Millipore)進行濃縮。腺病毒載體原液可以儲存於-80 ^oC。

為了進一步確定腺病毒載體的滴度，將HEK293A細胞以10 ⁶個細胞/孔的密度接種至6孔培養盤中，並在 37 ^oC下培養過夜後，在37 ^oC下將10倍序列稀釋的腺病毒載體原液添加至每孔中作用24小時。接著移除含有稀釋腺病毒載體的培養基，並將含有0.4%洋菜膠及100 U/mL青黴素/鏈黴素的3 mL/孔DMEM添加至該6培養盤中感染細胞。在以腺病毒載體感染HEK293A細胞7至10天後，對噬菌斑進行可見定量，並記錄噬菌斑形成單位 (plaque-forming unit, PFU)的計數。 SDS-PAGE 的操作

十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)的操作簡述如下。首先，依3:1的比例將蛋白質樣品與還原樣品緩衝溶液 (reducing sample buffer，包含有50 mM的三氫甲基胺基甲烷-氯化氫 (Tris-HCl)，pH 6.8；100 mM的二硫蘇糖醇 (dithiothreitol，DTT)；2%的SDS；0.1%的溴酚藍 (bromophenol blue)；以及10%的甘油)混合後於95 ^oC加熱5分鐘。

與此同時，製備包含分離膠體 (以12%的分離膠體為例：包含有2.5 mL之1 M的Tris， pH 8.8；3.3 mL的去離子水；4 mL之30%的丙烯醯胺預混液 (acrylamide mix)；0.1 mL之10%的SDS；0.1 ml之10%的過硫酸銨 (ammonium persulfate，APS)；以及0.01 mL的四甲基乙二胺 (TEMED))、及焦集膠體 (以5%的焦集膠體為例：包含有0.63 mL之1 M的Tris， pH 6.8；3.4 mL的去離子水；0.83 mL之30%的丙烯醯胺預混液；0.05 mL之10%的SDS；0.05 mL之10%的APS；以及0.005 mL的TEMED)的電泳膠體。

蛋白質電泳係在電壓80V下進行焦集，並且在140V下進行分離，其中電泳的時間依待測蛋白質的分子量而定。其後，將膠體以考馬斯亮藍染劑溶液 (包含有0.1%的coomassie R250；10%的醋酸；以及50%的甲醇)染色1小時，再以脫色溶液 (包含有10%的醋酸；以及50%的甲醇)進行脫色。 西方墨點法的操作

西方墨點法 (Western blot)的操作簡述如下。在轉漬槽中，將經SDS-PAGE分離之蛋白質樣品的膠體，以電壓135V轉印至硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane，以下簡稱NC膜)，再將該含有轉印蛋白質的NC膜浸泡於20 mL的阻斷溶液中，並震盪至少1小時以阻斷非專一性結合；其中，該阻斷溶液係為添加有5%之脫脂奶的含Tween-20之三羥甲基胺基緩衝食鹽水 (以下簡稱TBST溶液，包含有50 mM的Tris；150 mM的氯化鈉；以及0.05%的Tween-20)。

接著使用TBST溶液清洗該NC膜3次後，加入經TBST溶液進行特定倍數稀釋的一級抗體，於4 ^oC震盪處理約16小時，隔天再使用TBST溶液清洗3次後，以連結山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)之經TBST溶液進行特定倍數稀釋的二級抗體，於室溫下震盪處理1小時，而後使用TBST溶液清洗3次。將增強的化學冷光試劑 (HRP-catalyzed enhanced chemiluminescence，Millipore)添加至該膜作用1分鐘以產生冷光訊號，並顯影至X光膠片上，例如醫用感藍X射線膠片(Medical X-ray Film，Fujifilm)。 實驗小鼠的免疫方法

在本發明之一實施例中，使用6至8週齡的BALB/c雌性小鼠進行疫苗接種的實驗，其中BALB/c雌性小鼠是取自財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心 (National Laboratory Animal Center)。在第一組免疫實驗中，使用每劑含有5 10 ⁷pfu的Ad-S、Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T載體的PBS (Phosphate buffered saline)溶液 (pH 7.4)進行肌肉注射；而在第二組免疫實驗中，則使用每劑含有1 10 ⁸pfu的Ad-S、Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N載體的PBS溶液進行肌肉注射。每隻小鼠皆分別於第0週與第3週予以免疫注射，並於第二次免疫注射的2週後收集血清。 實驗小鼠血清樣品的採集

以前述方法對小鼠進行免疫注射，並於第二次免疫注射的2週後收集各小鼠的血清樣品。在取樣前透過超紅燈及熱毯加熱小鼠10分鐘，並使用70%乙醇消毒後，用手術刀切開小鼠側尾靜脈，採集約500 L的血液。接著，將全血在室溫下靜置2小時，使血液凝結後，以800 g轉速離心15分鐘共兩次以去除血液凝塊，並立即將血清轉移到新的離心管中，並在56 ^oC加熱處理30分鐘以減活補體，而待冷卻至室溫後，再將血清分配並儲存在-20 ^oC。 新型冠狀病毒假型慢病毒的製備

新型冠狀病毒的假型慢病毒 (pseudo-type virus)的製備方法簡言如下，使用TransIT-LT1轉染試劑 (Mirus Bio)，將表達新型冠狀病毒之全長棘蛋白 (Wuhan-Hu-1、B.1.1.7、或B.1.351)的pcDNA3.1-nCoV- d18質體、以及分別用於包裝與報導的pLAS2w.FLuc.Ppuro質體與pCMV R8.91質體 (RNAi Core, Academia Sinica)三者共轉染進HEK293T細胞中。在轉染後48小時收取並濃縮培養基。可以藉由檢測經新型冠狀病毒假型慢病毒感染之穩定表現ACE2之HEK293細胞中所轉錄的螢光素酶 (luciferase)活性，來評估該假型慢病毒的滴度。 實施例 1 本發明之新型冠狀病毒棘蛋白突變體的製備

在本發明之一實施例中，基於新型冠狀病毒之棘蛋白的三維結構，挑選適合額外添加醣遮蔽的目標位點，以遮蔽不重要的抗原決定位 (epitope)，使B細胞對棘蛋白的抗體反應得以重新聚焦，且不會影響棘蛋白的整體折疊結構，接著使用腺病毒載體表達在目標位點具有醣遮蔽突變的棘蛋白抗原，以作為本發明之疫苗組合物中的主要成分。

如圖1A、1B與2A、2B所示，新型冠狀病毒的棘蛋白為三聚體，且每個單體皆由S1次單元及S2次單元所組成，其中S1次單元包含N端域 (N‐terminal domain, NTD)與受體結合域 (receptor-binding domain, RBD)，且RBD主要的功能即為與宿主細胞表面之ACE2結合，使新型冠狀病毒得以進入宿主的細胞中，由於RBD與NTD在完整之三聚體棘蛋白的四級結構中會互相作用，因此在本發明之實施例中，除了以RBD為醣遮蔽修飾的目標，也挑選位於NTD的醣遮蔽位點。

在本發明之實施例中，使用PyMol (The PyMol Molecular Graphics System, version 4.0; Schrödinger, LLC)確認在棘蛋白的三維結構 (PDB ID: 7C2L)中，NTD與RBD的暴露環 (loop)、或暴露環中突出的位點，以作為醣遮蔽的添加目標位點，其中排除與天然醣遮蔽與RBD距離小於5 Å的位點。最終篩選出17組胺基酸殘基位添加額外的醣遮蔽修飾，以製備17種本發明之新型冠狀病毒棘蛋白突變體，其N-醣基化位置如圖1A、1B與圖2A、2B所示。

相較於野生型新型冠狀病毒棘蛋白的胺基酸序列 (SEQ ID NO:1)，該17種棘蛋白突變體具有一或二個胺基酸取代以實現N-醣基化，具體來說，使胺基酸序列呈現天冬醯胺－任意胺基酸－絲胺酸 (Serine, S)或蘇胺酸 (N-X-S/T)的順序，如表1所示，包含：將第135個胺基酸殘基位的苯丙胺酸 (Phenylalanine, F)與第137個胺基酸殘基位的天冬醯胺分別以天冬醯胺與蘇胺酸取代 (#1 F135N/N137T)；將第158個胺基酸殘基位的精胺酸 (Arginine, R)與第160個胺基酸殘基位的酪胺酸 (Tyrosine, Y)以天冬醯胺與蘇胺酸取代 (#2 R158N/Y160T)；將第356個胺基酸殘基位的賴胺酸 (Lysine, K)以蘇胺酸取代 (#3 N354/K356T)；將372個胺基酸殘基位的丙胺酸 (Alanine, A)以蘇胺酸取代 (#4 N370/A372T)；將第413個胺基酸殘基位的甘胺酸 (Glycine, G)以天冬醯胺取代 (#5 G413N)；將第428個胺基酸殘基位的天門冬胺酸 (Aspartic acid, D)以冬醯胺取代 (#6 D428N)；將第519個胺基酸殘基位的組胺酸 (Histidine, H)與第521個胺基酸殘基位的脯胺酸 (Proline, P)以天冬醯胺與蘇胺酸取代 (#7 H519N/P521T)；將第21個胺基酸殘基位的精胺酸與第23個胺基酸殘基位的穀氨醯胺 (Glutamine, Q)以天冬醯胺與蘇胺酸取代 (#8 R21N/Q23T)；將第85個胺基酸殘基位的脯胺酸與第87個胺基酸殘基位的天冬醯胺以天冬醯胺與蘇胺酸取代 (#9 P85N/N87T)；將第89個胺基酸殘基位的甘胺酸以蘇胺酸取代 (#10 N87/G89T)；將第146個胺基酸殘基位的組胺酸與第148個胺基酸殘基位的天冬醯胺以天冬醯胺與蘇胺酸取代 (#11 H146N/N148T)；將第179個胺基酸殘基位的白胺酸 (Leucine, L)與第181個胺基酸殘基位的甘胺酸以天冬醯胺與蘇胺酸取代 (#12 L179N/G181T)；將第183個胺基酸殘基位的穀氨醯胺與第185個胺基酸殘基位的天冬醯胺以天冬醯胺與蘇胺酸取代 (#13 Q183N/N185T)；將第187個胺基酸殘基位的賴胺酸以蘇胺酸取代 (#14 N185/K187T)；將第213個胺基酸殘基位的纈胺酸 (Valine, V)與第215個胺基酸殘基位的天門冬胺酸以天冬醯胺與蘇胺酸取代 (#15 V213N/D215T)；及將第219個胺基酸殘基位的甘胺酸以天冬醯胺取代 (#16 G219N)；將第253個胺基酸殘基位的天門冬胺酸以天冬醯胺取代 (#17 D253N)。表1

編號	棘蛋白突變體	N- 醣基化殘基位的胺基酸序列
#1	F135N/N137T	¹³⁵NCT ¹³⁷
#2	R158N/Y160T	¹⁵⁸NVT ¹⁶⁰
#3	N354/K356T	³⁵⁴NRT ³⁵⁶
#4	N370/A372T	³⁷⁰NST ³⁷²
#5	G413N	⁴¹³NQT ⁴¹⁵
#6	D428N	⁴²⁸NFT ⁴³⁰
#7	H519N/P521T	⁵¹⁹NAT ⁵²¹
#8	R21N/Q23T	²¹NTT ²³
#9	P85N/N87T	⁸⁵NFT ⁸⁷
#10	N87/G89T	⁸⁷NDT ⁸⁹
#11	H146N/N148T	¹⁴⁶NKT ¹⁴⁸
#12	L179N/G181T	¹⁷⁹NET ¹⁸¹
#13	Q183N/N185T	¹⁸³NGT ¹⁸⁵
#14	N185/K187T	¹⁸⁵NFT ¹⁸⁷
#15	V213N/D215T	²¹³NRT ²¹⁵
#16	G219N	²¹⁹NFS ²²¹
#17	D253N	²⁵³NSS ²⁵⁵

為建構包含該等棘蛋白突變體基因的腺病毒表現載體，將取自GenScript公司新型冠狀病毒的棘蛋白基因 (Wuhan-Hu-1分離株，登錄號MN908947.3)經人類密碼子優化 (codon-optimized) (SEQ ID NO:2)，再利用如下表2所示的引子 (SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:36)進行基於聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR)的定點突變 (site-directed mutagenesis)，以獲得包含17種棘蛋白突變體基因的DNA片段，並以前述腺病毒載體的製備方法，製備表達該等棘蛋白突變體的腺病毒載體，分別標示為Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、Ad-S-H519N/P521T、Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、Ad-S-D428N、Ad-S-H519N/P521T、Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、Ad-S-D253N。同時製備表達野生新型冠狀病毒棘蛋白的腺病毒載體作為比較組，標示為Ad-S。表2

編號	棘蛋白突變體	PCR 引子序列	SEQ ID NO.
#1	F135N/N137T	F：gttccagaactgcaccgaccct R：agggtcggtgcagttctggaac	3 4
#2	R158N/Y160T	F：cgagttcaacgtgacctcttcag R：ctgaagaggtcacgttgaactcg	5 6
#3	N354/K356T	F：catggaataggacgcgcatctc R：gagatgcgcgtcctattccatg	7 8
#4	N370/A372T	F：ctgtacaactcaacctccttcagc R：gctgaaggaggttgagttgtacag	9 10
#5	G413N	F：ctagccgatggaccgcaggag R：ctcctgcggtccatccgctag	11 12
#6	D428N	F：gctgccagacaatttcaccgcc R：gccggtgaaattgtctggcagc	13 14
#7	H519N/P521T	F：gagctgctgaacgccacagctactgtg R：cacagtagctgtggcgttcagcagctc	15 16
#8	R21N/Q23T	F：ctgactactcgaactcagctgcccccc R：ggggggcagctgagttcgagtagtcag	17 18
#9	P85N/N87T	F：cccgtgctgccttttaacgatggcgtg R：cacgccatcgttaaaaggcagcacggg	19 20
#10	N87/G89T	F：tttaacgatggcgtgtacttc R：gaagtacacgccatcgttaaa	21 22
#11	H146N/N148T	F：gtactacaacaagaccaacaag R：cttgttggtcttgttgtagtac	23 24
#12	L179N/G181T	F：ctgatggacctggagggcaagcagggc R：gccctgcttgccctccaggtccatcag	25 26
#13	Q183N/N185T	F：gagggcaagcagggcaatttcaagaac R：gttcttgaaattgccctgcttgccctc	27 28
#14	N185/K187T	F：ggcaatttcaagaacctgagg R：cctcaggttcttgaaattgcc	29 30
#15	V213N/D215T	F：atcaacctggtgcgcgacctgcctcag R：ctgaggcaggtcgcgcaccaggttgat	31 32
#16	G219N	F：ctgcctcagggcttcagcgcc R：ggcgctgaagccctgaggcag	33 34
#17	D253N	F：acacccggcgactcctctagc R：gctagaggagtcgccgggtgt	35 36

為了確認表達在腺病毒載體中的棘蛋白，使用SDS-PAGE與Western blot分析經腺病毒載體感染的細胞裂解物中，是否具有棘蛋白及其S1次單元。首先，將病毒感染劑量 (Multiplicity of infection, MOI)為5的Ad-S (表達野生型棘蛋白的腺病毒載體)、Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、Ad-S-H519N/P521T、Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、Ad-S-D428N、Ad-S-H519N/P521T、Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、及Ad-S-D253N感染HEK293A細胞48小時。接著以Glo Lysis緩衝溶液 (Promega)裂解HEK293A細胞，並在4 ^oC下以12,000 xg離心5分鐘以去除細胞碎片。將細胞裂解物與還原樣品緩衝溶液混合後在 95 ^oC加熱5分鐘，且可以在37 ^oC下經PNGase F (BioLabs)處理2小時，也可以不經PNGase F處理，接著使用7%或8%的分離凝膠，以SDS-PAGE分離樣本中的蛋白質。將SDS-PAGE的膠體轉印至NC膜 (Millipore)後，在室溫下以阻斷溶液作用1小時，再使用TBST溶液清洗3次。加入一級抗體：抗新型冠狀病毒棘蛋白抗體 (anti-SARS-CoV-2 antibodt，GTX135356，GeneTex)反應過夜，並加入二級抗體：連結HRP的山羊抗兔IgG 抗體 (HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG，KPL)在室溫下作用1小時。使用化學冷光試劑偵測抗體的訊號，並顯影至X光膠片，結果如圖3A與3B所示。

由圖3A與3B可以看出，在感染Ad-S、Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、Ad-S-H519N/P521T、Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、Ad-S-D428N、Ad-S-H519N/P521T、Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、及Ad-S-D253N的HEK293A細胞中，確實存在新型冠狀病毒的棘蛋白及其S1次單元。 實施例 2 本發明之新型冠狀病毒棘蛋白突變體提高針對原始武漢株之抗體的效價

在本發明之一實施例中，為證實本發明之新型冠狀病毒棘蛋白突變體確實能有效地誘發哺乳動物產生對抗新型冠狀病毒的抗體反應，以表達本發明之醣遮蔽棘蛋白的腺病毒載體製備疫苗組合物，並注射至實驗小鼠體內，且以表達野生型棘蛋白的腺病毒載體作為比較組，在經過一段時間後收取小鼠的血清，以分析其中抗新型冠狀病毒之原始武漢株 (Wuhan-Hu-1，Ancestral)的抗體效價。

首先，使用PBS溶液將表達野生型棘蛋白或棘蛋白突變體的腺病毒載體稀釋，以分別配製成100 L的疫苗組合物，並將BALB/c小鼠 ( n = 5)分成以下組別進行免疫注射：(1) 控制組 (PBS)：小鼠僅肌肉注射PBS溶液；(2) 比較組 (Ad-S)：小鼠肌肉注射含有5 10 ⁷pfu表達野生型棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(3) 實驗組 (Ad-S-F135N/N137T)：小鼠肌肉注射含有5 10 ⁷pfu表達F135N/N137T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(4) 實驗組 (Ad-S-R158N/Y160T)：小鼠肌肉注射含有5 10 ⁷pfu表達R158N/Y160T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(5) 實驗組 (Ad-S-N370/A372T)：小鼠肌肉注射含有5 10 ⁷pfu表達N370/A372T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(6) 實驗組 (Ad-S-H519N/P521T)：小鼠肌肉注射含有5 10 ⁷pfu表達H519N/P521T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(7) 實驗組 (Ad-S-N354/K356T)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達N354/K356T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(8) 實驗組 (Ad-S-G413N)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達G413N醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(9) 實驗組 (Ad-S-D428N)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達D428N醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(10) 實驗組 (Ad-S-R21N/Q23T)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達R21N/Q23T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(11) 實驗組 (Ad-S-P85N/N87T)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達P85N/N87T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(12) 實驗組 (Ad-S-N87/G89T)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達N87/G89T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(13) 實驗組 (Ad-S-H146N/N148T)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達H146N/N148T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(14) 實驗組 (Ad-S-L179N/G181T)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達L179N/G181T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(15) 實驗組 (Ad-S-Q183N/N185T)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達Q183N/N185T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(16) 實驗組 (Ad-S-N185/K187T)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達N185/K187T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(17) 實驗組 (Ad-S-V213N/D215T)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達V213N/D215T醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(18) 實驗組 (Ad-S-G219N)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達G219N醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物；(19) 實驗組 (Ad-S-D253N)：小鼠肌肉注射含有1 10 ⁸pfu表達D253N醣遮蔽棘蛋白之腺病毒載體的疫苗組合物。以上各組小鼠皆免疫注射共二劑且每劑間隔3週。

在免疫注射第二劑的2週後，採集並收集各組小鼠的血清，用以分析其中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗棘蛋白IgG抗體、抗RBD IgG抗體、及中和抗體的含量。

使用酵素結合免疫吸附分析 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)偵測血清樣本中抗棘蛋白IgG抗體、及抗RBD IgG抗體的效價，詳細方法如下。首先，將新型冠狀病毒原始武漢株 (Wuhan-Hu-1)之重組棘蛋白 (Sino Biological Inc.，目錄號 40589-V08H4)、及重組RBD (Sino Biological Inc.，目錄號40592-V08H)以每孔2 g的濃度，在塗層緩衝溶液 (coating buffer，每孔10 L)中，分別在4 ^oC下隔夜固定於二個96孔培養盤。吸出培養盤中的塗層緩衝溶液，並以300 L含有0.05% Tween-20的PBS溶液 (以下簡稱PBST溶液)清洗三次，以移除多餘的重組蛋白。在各孔中加入200 L的阻斷緩衝溶液 (Blocking buffer，含1%胎牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 的PBS溶液)，在室溫下阻斷2小時，以避免非專一性結合。以300 L的PBST溶液清洗三次。將經熱減活的各組血清樣本以1:1000進行預稀釋，接著以稀釋緩衝溶液 (dilution buffer，含1% BSA、0.05% Tween 20的PBST溶液)進行2倍連續稀釋。將連續稀釋的血清樣本分別加入96孔培養盤中，於室溫作用1小時，使其中的抗體與固定在96孔培養盤的棘蛋白或RBD結合。以300 L的P PBST溶液清洗三次。在96孔培養盤中加入100 L連結HRP的抗小鼠IgG抗體 (HRP conjugated anti-mouse IgG antibody，使用稀釋緩衝溶液以1:30000比例稀釋)，於室溫下避光作用1小時。以300 L的P PBST溶液清洗三次。將HRP的受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine, TMB， BioLegend)以100 L加入96孔培養盤中，並於暗處進行呈色反應15分鐘。加入100 L為2 N的硫酸 (H ₂SO ₄)以終止反應。使用TECAN分光光度計測定各孔在450 nm的光密度。根據高於0.2之光密度值的最終連續稀釋程度計算終點滴定值。

使用假病毒中和抗體試驗 (pseudo-virus micro neutralization assay)檢測血清樣本中，針對新型冠狀病毒之原始武漢株的中和抗體效價，詳細方法如下。於96孔培養盤的每孔中，種植10,000顆穩定表現ACE2的HEK-293T細胞在96孔培養盤的每一孔中，於37 ^oC的細胞培養箱中培養一天。將各組血清樣本以含有2%FBS的DMEM進行連續稀釋，並使用含有1% FBS、1%青黴素/鏈黴素的DMEM，將連續稀釋的血清樣本與1,000 TU (transducing units)新型冠狀病毒之原始武漢株的假型慢病毒，於37 ^oC下作用1小時。以相同體積將該作用溶液加入96孔培養盤中，以感染前述HEK-293T細胞。在感染後16小時將培養基更換為新鮮的完整 DMEM (含有10% FBS、100 U/mL青黴素/鏈黴素)，並將細胞繼續培養48小時。將細胞裂解並以螢光素酶試驗 (Luciferase assay，Promega Bright-GloTM螢光素酶測定系統)計算各組血清中和病毒 (pseudo-neutralization)的能力。抑制病毒感染百分比的計算方法為：存在血清時螢光素酶的讀值 (RLU)減少與無血清對照時減少的比率。用於計算的公式則為：(RLU 無血清 - RLU 血清) / RLU 無血清。中和抗體的效價 (IC50)是與只含有新型冠狀病毒棘蛋白之假型慢病毒的比較組相比，獲得50%的RLU減少所需的血清稀釋度的倒數。使用GraphPad Prism v6.01軟體分析中和曲線與 IC50數值。

在經免疫注射含有Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、及Ad-S-H519N/P521T之疫苗組合物後，小鼠血清中抗棘蛋白IgG抗體的效價如圖4A所示，*表示p ＜ 0.05、N.D.表示未檢出；小鼠血清中抗RBD IgG抗體的效價如圖4B所示，N.D.表示未檢出；小鼠血清中和病毒感染的能力如圖4C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖4D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數，N.D.表示未檢出。

由圖4A至4D可以看出，小鼠經免疫注射Ad-S-F135N/N137T後，所引發針對新型冠狀病毒之原始武漢株的抗棘蛋白IgG抗體的效價，顯著低於經免疫注射Ad-S或Ad-S-R158N/Y160T的小鼠。相較於Ad-S、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T，小鼠經免疫注射Ad-S-F135N/N137T後，所引發針對新型冠狀病毒之原始武漢株的抗RBD IgG抗體效價亦較為低 (但無統計學上的意義)。免疫注射Ad-S、Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T後，小鼠血清針對新型冠狀病毒之原始武漢株的中和感染能力具有劑量依賴性，而僅注射PBS溶液的控制組小鼠則無此現象。相較於免疫注射Ad-S或Ad-S-N370/A372T，小鼠經免疫注射Ad-S-R158N/Y160T後，其血清的中和抗體效價會提升，其IC50約為比較組的2.4倍，而經免疫注射Ad-S-F135N/N137T或Ad-S-H519N/P521T後，其血清的中和抗體效價則會降低。

在經免疫注射含有Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、及Ad-S-D428N之疫苗組合物後，小鼠血清中抗棘蛋白IgG抗體的效價如圖5A所示，N.D.表示未檢出；小鼠血清中抗RBD IgG抗體的效價如圖5B所示，N.D.表示未檢出；小鼠血清中和病毒感染的能力如圖5C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖5D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數，N.D.表示未檢出。

由圖5A至5D可以看出，小鼠經免疫注射Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N後，所引發針對新型冠狀病毒之原始武漢株的抗棘蛋白IgG抗體、及抗RBD IgG抗體的效價，皆相似於經免疫注射Ad-S的小鼠。免疫注射Ad-S、Ad-S-N370/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N後，小鼠血清針對新型冠狀病毒之原始武漢株的中和感染能力具有劑量依賴性，而僅注射PBS溶液的控制組小鼠則無此現象。相較於免疫注射Ad-S，小鼠經免疫注射Ad-S-N354/K356T或Ad-S-D428N後，其血清的中和抗體效價會提升，其IC50分別為比較組的2.5倍或2.8倍。

在經免疫注射含有Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、及Ad-S-D253N之疫苗組合物後，小鼠血清中抗棘蛋白IgG抗體的效價如圖6A所示，*表示p ＜ 0.05、**表示p ＜0.01、N.D.表示未檢出；小鼠血清中抗RBD IgG抗體的效價如圖6B所示，*表示p ＜ 0.05、N.D.表示未檢出；小鼠血清中和病毒感染的能力如圖6C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖6D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數，N.D.表示未檢出。

由圖6A至6D可以看出，小鼠經免疫注射Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N後，所引發針對新型冠狀病毒之原始武漢株的抗棘蛋白IgG抗體、及抗RBD IgG抗體的效價，皆相似於經免疫注射Ad-S的小鼠 (無統計學意義上的差異)。其中，小鼠經免疫注射Ad-S-Q183N/N185T後，所引發針對新型冠狀病毒之原始武漢株的抗棘蛋白IgG抗體的效價，顯著高於經免疫注射Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-N87/G89T或Ad-S-D253N的小鼠；而小鼠經免疫注射Ad-S-V213N/D215T後所引發針對新型冠狀病毒之原始武漢株的抗棘蛋白IgG抗體的效價，顯著高於經免疫注射Ad-S-D253N的小鼠。

免疫注射Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N後，小鼠血清針對新型冠狀病毒之原始武漢株的中和感染能力具有劑量依賴性，而僅注射PBS溶液的控制組小鼠則無此現象。相較於免疫注射Ad-S，小鼠經免疫注射Ad-S-N185/K187T或Ad-S-V213N/D215T後，其血清針對新型冠狀病毒之原始武漢株的中和感染能力無顯著差異，而經免疫注射Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N後，其血清針對新型冠狀病毒之原始武漢株的中和感染能力則會降低。

此些結果顯示，在新型冠狀病毒的棘蛋白NTD中醣掩蔽R158N/Y160T位點，以及於棘蛋白RBD中醣掩蔽N354/K356T或D428N位點，能夠有效使個體B細胞的抗體反應重新聚焦，以提升所產生之中和抗體的效價，而在用於免疫注射時，有效提升個體抵抗新型冠狀病毒之原始武漢株感染的能力。 實施例 3 本發明之新型冠狀病毒棘蛋白突變體提高針對變異株之抗體的效價

在本發明之一實施例中，為進一步證實本發明之新型冠狀病毒棘蛋白突變體確實能有效地誘發哺乳動物，產生對抗不同新型冠狀病毒之變異株的抗體反應，使用在實施例2中取得之各組小鼠血清，以ELISA偵測血清樣本中針對新型冠狀病毒之英國變異株 (Alpha，B.1.1.7)、南非變異株 (Beta，B.1.351)、及印度變異株 (Delta，B.1.617.2)的抗棘蛋白IgG抗體、抗RBD IgG抗體效價，並以假病毒中和抗體試驗偵測血清樣本中針對新型冠狀病毒之英國變異株 (Alpha，B.1.1.7)、南非變異株 (Beta，B.1.351)、及印度變異株 (Delta，B.1.617.2)的中和抗體效價。 3-1 英國變異株 (Alpha ， B.1.1.7)

使用ELISA偵測血清樣本中抗棘蛋白IgG抗體、及抗RBD IgG抗體效價的詳細方法如實施例2中所述，在此則不贅述，惟此處是以新型冠狀病毒英國變異株 (Alpha，B.1.1.7)之重組棘蛋白S1次單元 (Sino Biological Inc.，目錄號40591-VH12)、及重組RBD (Sino Biological Inc.，目錄號40592-V08H82)塗覆於96孔培養盤。

使用假病毒中和抗體試驗檢測血清樣本中，針對新型冠狀病毒之英國變異株的中和抗體效價的詳細方法如實施例2中所述，在此則不贅述，惟此處使用表達新型冠狀病毒之英國變異株全長棘蛋白的假型慢病毒。

在經免疫注射含有Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、及Ad-S-H519N/P521T之疫苗組合物後，小鼠血清中抗棘蛋白IgG抗體的效價如圖7A所示，*表示p ＜ 0.05、**表示p ＜0.01、N.D.表示未檢出；小鼠血清中抗RBD IgG抗體的效價如圖7B所示， N.D.表示未檢出；小鼠血清中和病毒感染的能力如圖7C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖7D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數， N.D.表示未檢出。

由圖7A至7D可以看出，小鼠經免疫注射Ad-S-F135N/N137T後，所引發針對新型冠狀病毒之英國變異株的抗棘蛋白IgG抗體的效價，顯著低於經免疫注射Ad-S或Ad-S-N370/A372T的小鼠。相較於Ad-S、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T，小鼠經免疫注射Ad-S-F135N/N137T後，所引發針對新型冠狀病毒之英國變異株的抗RBD IgG抗體效價亦較為低。相較於免疫注射Ad-S、Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T，小鼠經免疫注射Ad-S-R158N/Y160T後，其血清針對新型冠狀病毒之英國變異株的中和感染能力最佳，且其血清之中和抗體效價的IC50約為比較組的2.8倍。

在經免疫注射含有Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、及Ad-S-D428N之疫苗組合物後，小鼠血清中抗棘蛋白IgG抗體的效價如圖8A所示， N.D.表示未檢出；小鼠血清中抗RBD IgG抗體的效價如圖8B所示， N.D.表示未檢出；小鼠血清中和病毒感染的能力如圖8C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖8D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數， N.D.表示未檢出。

由圖8A至8D可以看出，小鼠經免疫注射Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N後，所引發針對新型冠狀病毒之英國變異株的抗棘蛋白IgG抗體、及抗RBD IgG抗體的效價，皆相似於經免疫注射Ad-S的小鼠。相較於免疫注射Ad-S、Ad-S-N354/K356T、或Ad-S-G413N，小鼠經免疫注射Ad-S-D428N後，其血清針對新型冠狀病毒之英國變異株的中和感染能力可以有效地提升，且其血清之中和抗體效價的IC50約為比較組的3.0倍。

在經免疫注射含有Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、及Ad-S-D253N之疫苗組合物後，小鼠血清中和病毒感染的能力如圖9A所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖9D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數，N.D.表示未檢出。

由圖9A至9B可以看出，相較於免疫注射Ad-S，小鼠經免疫注射Ad-S-H146N/N148T或Ad-S-V213N/D215T後，其血清針對新型冠狀病毒之英國變異株的中和感染能力會略為提升，且其血清之中和抗體效價的IC50分別為比較組的1.8倍和1.7倍。而經免疫注射Ad-S-N87/G89T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T或Ad-S-N185/K187T後，其血清的中和抗體效價則無顯著差異；經免疫注射Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T 、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N後，其血清針對新型冠狀病毒之英國變異株的中和感染能力則會降低。

此些結果顯示，在新型冠狀病毒的棘蛋白NTD中醣掩蔽R158N/Y160T位點，以及於棘蛋白RBD中醣掩蔽D428N位點，能夠有效使個體B細胞的抗體反應重新聚焦，以提升針對新型冠狀病毒之英國變異株的中和抗體效價，而在用於免疫注射時，有效提升個體抵抗新型冠狀病毒之英國變異株感染的能力。 3-2 南非變異株 (Beta ， B.1.351)

使用ELISA偵測血清樣本中抗棘蛋白IgG抗體、及抗RBD IgG抗體效價的詳細方法如實施例2中所述，在此則不贅述，惟此處是以新型冠狀病毒南非變異株 (Beta，B.1.351)之重組棘蛋白S1次單元 (Sino Biological Inc.，目錄號40591-V08H10)、及重組RBD (Sino Biological Inc.，目錄號40592-V08H85)塗覆於96孔培養盤。

使用假病毒中和抗體試驗檢測血清樣本中，針對新型冠狀病毒之英國變異株的中和抗體效價的詳細方法如實施例2中所述，在此則不贅述，惟此處使用表達新型冠狀病毒之南非變異株全長棘蛋白的假型慢病毒。

在經免疫注射含有Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、及Ad-S-H519N/P521T之疫苗組合物後，小鼠血清中抗棘蛋白IgG抗體的效價如圖10A所示，*表示p ＜ 0.05、**表示p ＜0.01、N.D.表示未檢出；小鼠血清中抗RBD IgG抗體的效價如圖10B所示，*表示p ＜ 0.05、 N.D.表示未檢出；小鼠血清中和病毒感染的能力如圖10C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖10D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數， N.D.表示未檢出。

由圖10A至10D可以看出，小鼠經免疫注射Ad-S-F135N/N137T後，所引發針對新型冠狀病毒之南非變異株的抗棘蛋白IgG抗體的效價，顯著低於經免疫注射Ad-S或Ad-S-N370/A372T的小鼠。相較於Ad-S-R158N/Y160T、或Ad-S-H519N/P521T，小鼠經免疫注射Ad-S-F135N/N137T後，所引發針對新型冠狀病毒之南非變異株的抗RBD IgG抗體效價亦較為低。相較於免疫注射Ad-S、Ad-S-F135N/N137T、或Ad-S-H519N/P521T，小鼠經免疫注射Ad-S-R158N/Y160T、或Ad-S-N370/A372T後，其血清針對新型冠狀病毒之南非變異株的中和感染能力會提升，且其血清之中和抗體效價的IC50分別約為比較組的6.5倍或2.8倍。

在經免疫注射含有Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、及Ad-S-D428N之疫苗組合物後，小鼠血清中抗棘蛋白IgG抗體的效價如圖11A所示， N.D.表示未檢出；小鼠血清中抗RBD IgG抗體的效價如圖11B所示， N.D.表示未檢出；小鼠血清中和病毒感染的能力如圖11C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖11D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數， N.D.表示未檢出。

由圖11A至11D可以看出，小鼠經免疫注射Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N後，所引發針對新型冠狀病毒之南非變異株的抗棘蛋白IgG抗體、及抗RBD IgG抗體的效價，皆相似於經免疫注射Ad-S的小鼠。相較於免疫注射Ad-S、Ad-S-N354/K356T、或Ad-S-G413N，小鼠經免疫注射Ad-S-D428N後，其血清針對新型冠狀病毒之南非變異株的中和感染能力可以有效地提升，且其血清之中和抗體效價的IC50約為比較組的2.0倍。

在經免疫注射含有Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、及Ad-S-D253N之疫苗組合物後，小鼠血清中和病毒感染的能力如圖12A所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖12D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數，N.D.表示未檢出。

由圖12A至12B可以看出，相較於免疫注射Ad-S，小鼠經免疫注射Ad-S-N87T/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-N185/K187T或Ad-S-V213N/D215T後，其血清針對新型冠狀病毒之南非變異株的中和感染能力無顯著差異；而經免疫注射Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N後，其血清針對新型冠狀病毒之南非變異株的中和感染能力則會降低。

此些結果顯示，在新型冠狀病毒的棘蛋白NTD中醣掩蔽R158N/Y160T位點，以及於棘蛋白RBD中醣掩蔽N370/A372T或D428N位點，能夠有效使個體B細胞的抗體反應重新聚焦，以提升針對新型冠狀病毒之南非變異株的中和抗體效價，而在用於免疫注射時，有效提升個體抵抗新型冠狀病毒之南非變異株感染的能力。 3-3 印度變異株 (Delta ， B.1.617.2)

使用ELISA偵測血清樣本中抗棘蛋白IgG抗體、及抗RBD IgG抗體效價的詳細方法如實施例2中所述，在此則不贅述，惟此處是以新型冠狀病毒南非變異株 (Beta，B.1.351)之重組棘蛋白S1次單元 (Sino Biological Inc.，目錄號40591-V49H2-B)、及重組RBD (Sino Biological Inc.，目錄號40592-V08H90)塗覆於96孔培養盤。

使用假病毒中和抗體試驗檢測血清樣本中，針對新型冠狀病毒之英國變異株的中和抗體效價的詳細方法如實施例2中所述，在此則不贅述，惟此處使用表達新型冠狀病毒之印度變異株全長棘蛋白的假型慢病毒。

在經免疫注射含有Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、及Ad-S-H519N/P521T之疫苗組合物後，小鼠血清中抗棘蛋白IgG抗體的效價如圖13A所示，*表示p ＜ 0.05、N.D.表示未檢出；小鼠血清中抗RBD IgG抗體的效價如圖13B所示， N.D.表示未檢出；小鼠血清中和病毒感染的能力如圖13C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖13D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數， N.D.表示未檢出。

由圖13A至13D可以看出，小鼠經免疫注射Ad-S-F135N/N137T後，所引發針對新型冠狀病毒之印度變異株的抗棘蛋白IgG抗體的效價，顯著低於經免疫注射Ad-S或Ad-S-R158N/Y160T的小鼠。小鼠經免疫注射Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T後，所引發針對新型冠狀病毒之印度變異株的抗RBD IgG抗體的效價，皆相似於經免疫注射Ad-S的小鼠。相較於免疫注射Ad-S、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T，小鼠經免疫注射Ad-S-F135N/N137T、或Ad-S-R158N/Y160T後，其血清針對新型冠狀病毒之印度變異株的中和感染能力會有效提升，且其血清之中和抗體效價的IC50分別約為比較組的3.7倍或4.6倍。

在經免疫注射含有Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、及Ad-S-D428N之疫苗組合物後，小鼠血清中抗棘蛋白IgG抗體的效價如圖14A所示， N.D.表示未檢出；小鼠血清中抗RBD IgG抗體的效價如圖14B所示， N.D.表示未檢出；小鼠血清中和病毒感染的能力如圖14C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖14D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數， N.D.表示未檢出。

由圖14A至14D可以看出，小鼠經免疫注射Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N後，所引發針對新型冠狀病毒之印度變異株的抗棘蛋白IgG抗體效價、抗RBD IgG抗體效價、及中和感染能力皆低於經免疫注射Ad-S的小鼠。

在經免疫注射含有Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、及Ad-S-D253N之疫苗組合物後，小鼠血清中和病毒感染的能力如圖15A所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清中抗體的IC50中和效價則如圖15D所示，並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數，N.D.表示未檢出。

由圖15A至15B可以看出，相較於免疫注射Ad-S，小鼠經免疫注射Ad-S-N87T/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-N185/K187T、或Ad-S-V213N/D215T後，其血清針對新型冠狀病毒之印度變異株的中和感染能力會明顯地提升，且其血清之中和抗體效價的IC50分別約為比較組的7.9倍、3.9倍、8.5倍、或10.0倍。而經免疫注射Ad-S-P85N/N87T或Ad-S-Q183N/N185T後，其血清針對新型冠狀病毒之印度變異株的中和感染能力會略為提升，且其血清之中和抗體效價的IC50分別為比較組的1.8倍或1.4倍。經免疫注射Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N後，其血清針對新型冠狀病毒之印度變異株的中和感染能力則無顯著差異。而經免疫注射Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N後，其血清針對新型冠狀病毒之印度變異株的中和感染能力則會降低。

此些結果顯示，在新型冠狀病毒的棘蛋白NTD中醣掩蔽F135N/N137T位點、R158N/Y160T位點、N87T/G89T位點、H146N/N148T位點、N185/K187T位點、或V213N/D215T位點，能夠有效使個體B細胞的抗體反應重新聚焦，以提升針對新型冠狀病毒之印度變異株的中和抗體效價，而在用於免疫注射時，有效提升個體抵抗新型冠狀病毒之印度變異株感染的能力。

在本發明之實施例中，為直接比較由新型冠狀病毒棘蛋白突變體所引發之對不同新型冠狀病毒變異株的中和抗體效價，將經免疫注射Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、Ad-S-H519N/P521T的小鼠血清中抗體的IC50中和效價同時呈現如圖16A所示，而經免疫注射Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、Ad-S-D428N的小鼠血清中抗體的IC50中和效價則同時呈現如16B所示；其中數據使用經免疫注射Ad-S的小鼠血清中抗體的IC50中和效價進行標準化。

由圖16A可以看出，醣掩蔽R158N/Y160T位點的棘蛋白具有最佳的功效，相較於野生型棘蛋白，其所引發之針對原始武漢株的中和抗體IC50效價增加為2.5倍，針對英國變異株的中和抗體IC50效價增加為1.8倍、針對南非變異株的中和抗體IC50效價增加為1.2倍，而雖然針對印度變異株的中和抗體IC50效價減少為0.6 倍，但仍明顯高於野生型棘蛋白針對印度變異株的中和抗體效價。此結果顯示，在新型冠狀病毒的棘蛋白NTD中醣掩蔽R158N/Y160T位點，可以更有效增加針對原始武漢株之中和抗體的效價，且可以增加針對英國變異株、南非變異株、及印度變異株之交叉中和抗體的效價。

由圖16B可以看出，醣掩蔽D428N位點的棘蛋白具有最佳的功效，相較於野生型棘蛋白，其所引發之針對原始武漢株的中和抗體IC50效價增加為2.7倍，針對英國變異株的中和抗體IC50效價增加為3.2倍、針對南非變異株的中和抗體IC50效價增加為2.0倍，然而針對印度變異株的中和抗體IC50效價減少為0.2 倍。此結果顯示，在新型冠狀病毒的棘蛋白RBD中醣掩蔽D428N 位點，可以更有效增加針對原始武漢株之中和抗體的效價，且可以增加針對英國變異株、及南非變異株之交叉中和抗體的效價。

綜上所述，在本發明之新型冠狀病毒疫苗組合物中，使用在NTD或RBD過度醣化的新型冠狀病毒棘蛋白突變體，以醣遮蔽不重要的抗原決定位，使個體B細胞對新型冠狀病毒棘蛋白的抗體反應得以重新聚焦，且不會影響棘蛋白的整體折疊結構。本發明之新型冠狀病毒棘蛋白突變體可以有效引發個體針對新型冠狀病毒之原始武漢珠、英國變異株、南非變異株、及印度變異株的中和抗體效價，以有效提升個體抵抗新型冠狀病毒之不同變異株感染的能力。

無

圖1A、1B顯示新型冠狀病毒之棘蛋白組成單元的示意圖。其中，S表示棘蛋白；N’表示N端；C’表示C端；S1表示S1次單元 (S1 subunit)；S2表示S2次單元(S2 subunit)；NTD表示N端域 (N‐terminal domain)；RBD表示受體結合域 (receptor-binding domain)；S1/S2表示弗林蛋白酶切割位 (furin cleavage site)；FP表示融合肽 (fusion peptide)；HR1表示七肽重複區1 (heptad repeat 1)；HR2表示七肽重複區2 (heptad repeat 2)；TM表示跨膜域 (transmembrane domain)；CT表示胞質尾 (cytoplasmic tail)；S2’ 表示蛋白酶切割位 (proteolytic cleavage site)；上方的Y字形表示原始N-醣基化修飾 (original N-linked glycans)；下方的Y字形表示額外添加的醣遮蔽 (engineered Glycan-masking)，且#1至#17分別表示不同殘基位。圖2A、2B顯示新型冠狀病毒之棘蛋白的完整三聚體結構的示意圖。其中，NTD表示N端域；RBD表示受體結合域；#1表示F135N/N137T殘基位、#2表示R158N/Y160T殘基位、#3表示N354/K356T殘基位、#4表示N370/A372T殘基位、#5表示G413N殘基位、#6表示D428N殘基位、#7表示H519N/P521T殘基位、#8表示R21N/Q23T殘基位、#9表示P85N/N87T殘基位、#10表示N87/G89T殘基位、#11表示H146N/N148T殘基位、#12表示L179N/G181T殘基位、#13表示Q183N/N185T殘基位、#14表示N185/K187T殘基位、#15表示V213N/D215T殘基位、#16表示G219N殘基位、#17表示D253N殘基位具有額外添加的醣遮蔽 (Glycan-masking sites)。圖3A、3B顯示以西方墨點法偵測表達在腺病毒載體中之棘蛋白的結果。其中，S表示棘蛋白；S1表示S1次單元。圖4A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗棘蛋白IgG抗體的效價 (anti-S IgG titer)。在圖4A至4D中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T的本發明之疫苗組合物。圖4B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗RBD IgG抗體的效價 (anti-RBD IgG titer)。圖4C顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒原始武漢株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。圖4D顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖5A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗棘蛋白IgG抗體的效價 (anti-S IgG titer)。在圖5A至5D中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N的本發明之疫苗組合物。圖5B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗RBD IgG抗體的效價 (anti-RBD IgG titer)。圖5C顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒原始武漢株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。圖5D顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖6A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗棘蛋白IgG抗體的效價 (anti-S IgG titer)。在圖6A至6D中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N的本發明之疫苗組合物。圖6B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗RBD IgG抗體的效價 (anti-RBD IgG titer)。圖6C顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒原始武漢株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。圖6D顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒原始武漢株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖7A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒英國變異株之抗棘蛋白IgG抗體的效價 (anti-S1 IgG titer)。在圖7A至7D中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T的本發明之疫苗組合物。圖7B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒英國變異株之抗RBD IgG抗體的效價 (anti-RBD IgG titer)。圖7C顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒英國變異株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。圖7D顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒英國變異株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖8A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒英國變異株之抗棘蛋白IgG抗體的效價 (anti-S1 IgG titer)。在圖8A至8D中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N的本發明之疫苗組合物。圖8B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒英國變異株之抗RBD IgG抗體的效價 (anti-RBD IgG titer)。圖8C顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒英國變異株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。圖8D顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒英國變異株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖9A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒英國變異株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。在圖9A、9B中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N的本發明之疫苗組合物。圖9B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒英國變異株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖10A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒南非變異株之抗棘蛋白IgG抗體的效價 (anti-S1IgG titer)。在圖10A至10D中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T的本發明之疫苗組合物。圖10B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒南非變異株之抗RBD IgG抗體的效價 (anti-RBD IgG titer)。圖10C顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒南非變異株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。圖10D顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒南非變異株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖11A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒南非變異株之抗棘蛋白IgG抗體的效價 (anti-S1 IgG titer)。在圖11A至11D中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N的本發明之疫苗組合物。圖11B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒南非變異株之抗RBD IgG抗體的效價 (anti-RBD IgG titer)。圖11C顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒南非變異株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。圖11D顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒南非變異株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖12A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒南非變異株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。在圖12A、12B中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N的本發明之疫苗組合物。圖12B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒南非變異株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖13A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒印度變異株之抗棘蛋白IgG抗體的效價 (anti-S1 IgG titer)。在圖13A至13D中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T的本發明之疫苗組合物。圖13B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒印度變異株之抗RBD IgG抗體的效價 (anti-RBD IgG titer)。圖13C顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒印度變異株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。圖13D顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒印度變異株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖14A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒印度變異株之抗棘蛋白IgG抗體的效價 (anti-S1 IgG titer)。在圖14A至14D中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N的本發明之疫苗組合物。圖14B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒印度變異株之抗RBD IgG抗體的效價 (anti-RBD IgG titer)。圖14C顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒印度變異株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。圖14D顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒印度變異株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖15A顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清針對新型冠狀病毒印度變異株之中和病毒感染的能力曲線 (pseudo-neutralization)。在圖15A、15B中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-R21N/Q23T、Ad-S-P85N/N87T、Ad-S-N87/G89T、Ad-S-H146N/N148T、Ad-S-L179N/G181T、Ad-S-Q183N/N185T、Ad-S-N185/K187T、Ad-S-V213N/D215T、Ad-S-G219N、或Ad-S-D253N的本發明之疫苗組合物。圖15B顯示經免疫注射本發明之疫苗組合物的小鼠血清中針對新型冠狀病毒印度變異株之抗體的IC50中和效價 (NT titer)。圖16A、16B顯示比較經免疫注射具有不同醣遮蔽棘蛋白的本發明疫苗組合物對不同新型冠狀病毒變異株的中和抗體效價。在圖16A中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-F135N/N137T、Ad-S-R158N/Y160T、Ad-S-N370/A372T、或Ad-S-H519N/P521T的本發明之疫苗組合物。在圖16B中，小鼠經免疫注射含有Ad-S-N354/K356T、Ad-S-G413N、或Ad-S-D428N的本發明之疫苗組合物。

                         序列表
          <![CDATA[<110>  國立清華大學、輔仁大學學校財團法人輔仁大學]]>
          <![CDATA[<120>  新型冠狀病毒疫苗組合物及其用途]]>
          <![CDATA[<130>  111B0049]]>
          <![CDATA[<150>  US63169268]]>
          <![CDATA[<151>  2021-04-01]]>
          <![CDATA[<160>  36    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  1273]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  新型冠狀病毒]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 
                      20                  25                  30          
          Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 
                  35                  40                  45              
          His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 
              50                  55                  60                  
          Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 
                  115                 120                 125             
          Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 
              130                 135                 140                 
          Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 
                          165                 170                 175     
          Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 
                          245                 250                 255     
          Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 
                      260                 265                 270         
          Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 
                  275                 280                 285             
          Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 
              290                 295                 300                 
          Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 
                          325                 330                 335     
          Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 
                      340                 345                 350         
          Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 
                          405                 410                 415     
          Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 
                      420                 425                 430         
          Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 
                  435                 440                 445             
          Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 
              450                 455                 460                 
          Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 
          465                 470                 475                 480 
          Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 
                          485                 490                 495     
          Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 
                      500                 505                 510         
          Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 
                  515                 520                 525             
          Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 
              530                 535                 540                 
          Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 
                          565                 570                 575     
          Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 
                      580                 585                 590         
          Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 
                  595                 600                 605             
          Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 
              610                 615                 620                 
          His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 
          625                 630                 635                 640 
          Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 
                          645                 650                 655     
          Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 
                      660                 665                 670         
          Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 
                  675                 680                 685             
          Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 
              690                 695                 700                 
          Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 
          705                 710                 715                 720 
          Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 
                          725                 730                 735     
          Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 
                      740                 745                 750         
          Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 
                  755                 760                 765             
          Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 
              770                 775                 780                 
          Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 
          785                 790                 795                 800 
          Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 
                          805                 810                 815     
          Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 
                      820                 825                 830         
          Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 
                  835                 840                 845             
          Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 
              850                 855                 860                 
          Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 
          865                 870                 875                 880 
          Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 
                          885                 890                 895     
          Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 
                      900                 905                 910         
          Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 
                  915                 920                 925             
          Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 
              930                 935                 940                 
          Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 
                          965                 970                 975     
          Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 
                      980                 985                 990         
          Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg  Leu Gln Ser Leu Gln  Thr Tyr Val 
                  995                 1000                 1005             
          Thr Gln  Gln Leu Ile Arg Ala  Ala Glu Ile Arg Ala  Ser Ala Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Leu Ala  Ala Thr Lys Met Ser  Glu Cys Val Leu Gly  Gln Ser Lys 
              1025                 1030                 1035             
          Arg Val  Asp Phe Cys Gly Lys  Gly Tyr His Leu Met  Ser Phe Pro 
              1040                 1045                 1050             
          Gln Ser  Ala Pro His Gly Val  Val Phe Leu His Val  Thr Tyr Val 
              1055                 1060                 1065             
          Pro Ala  Gln Glu Lys Asn Phe  Thr Thr Ala Pro Ala  Ile Cys His 
              1070                 1075                 1080             
          Asp Gly  Lys Ala His Phe Pro  Arg Glu Gly Val Phe  Val Ser Asn 
              1085                 1090                 1095             
          Gly Thr  His Trp Phe Val Thr  Gln Arg Asn Phe Tyr  Glu Pro Gln 
              1100                 1105                 1110             
          Ile Ile  Thr Thr Asp Asn Thr  Phe Val Ser Gly Asn  Cys Asp Val 
              1115                 1120                 1125             
          Val Ile  Gly Ile Val Asn Asn  Thr Val Tyr Asp Pro  Leu Gln Pro 
              1130                 1135                 1140             
          Glu Leu  Asp Ser Phe Lys Glu  Glu Leu Asp Lys Tyr  Phe Lys Asn 
              1145                 1150                 1155             
          His Thr  Ser Pro Asp Val Asp  Leu Gly Asp Ile Ser  Gly Ile Asn 
              1160                 1165                 1170             
          Ala Ser  Val Val Asn Ile Gln  Lys Glu Ile Asp Arg  Leu Asn Glu 
              1175                 1180                 1185             
          Val Ala  Lys Asn Leu Asn Glu  Ser Leu Ile Asp Leu  Gln Glu Leu 
              1190                 1195                 1200             
          Gly Lys  Tyr Glu Gln Tyr Ile  Lys Trp Pro Trp Tyr  Ile Trp Leu 
              1205                 1210                 1215             
          Gly Phe  Ile Ala Gly Leu Ile  Ala Ile Val Met Val  Thr Ile Met 
              1220                 1225                 1230             
          Leu Cys  Cys Met Thr Ser Cys  Cys Ser Cys Leu Lys  Gly Cys Cys 
              1235                 1240                 1245             
          Ser Cys  Gly Ser Cys Cys Lys  Phe Asp Glu Asp Asp  Ser Glu Pro 
              1250                 1255                 1260             
          Val Leu  Lys Gly Val Lys Leu  His Tyr Thr 
              1265                 1270             
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  3840]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  新型冠狀病毒]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          ggtaccgcca ccatgtttgt ctttctggtc ctgctgcccc tggtgtcctc acagtgcgtc       60
          aatctgacta ctcgaactca gctgcccccc gcttatacta attccttcac ccggggcgtg      120
          tactatcctg acaaggtgtt tagaagctcc gtgctgcact ctacacagga tctgtttctg      180
          ccattcttta gcaacgtgac ctggttccac gccatccacg tgagcggcac caatggcaca      240
          aagcggttcg acaatcccgt gctgcctttt aacgatggcg tgtacttcgc ctctaccgag      300
          aagagcaaca tcatcagagg ctggatcttt ggcaccacac tggactccaa gacacagtct      360
          ctgctgatcg tgaacaatgc caccaacgtg gtcatcaagg tgtgcgagtt ccagttttgt      420
          aatgatccct tcctgggcgt gtactatcac aagaacaata agagctggat ggagtccgag      480
          tttagagtgt attctagcgc caacaattgc acatttgagt acgtgtccca gcctttcctg      540
          atggacctgg agggcaagca gggcaatttc aagaacctga gggagttcgt gtttaagaat      600
          atcgatggct acttcaaaat ctacagcaag cacaccccca tcaacctggt gcgcgacctg      660
          cctcagggct tcagcgccct ggagcccctg gtggatctgc ctatcggcat caacatcacc      720
          cggtttcaga cactgctggc cctgcacaga agctacctga cacccggcga ctcctctagc      780
          ggatggaccg caggagctgc cgcctactat gtgggctatc tgcagccccg gaccttcctg      840
          ctgaagtaca acgagaatgg caccatcaca gacgcagtgg attgcgccct ggaccccctg      900
          agcgagacaa agtgtacact gaagtccttt accgtggaga agggcatcta tcagacatcc      960
          aatttcaggg tgcagccaac cgagtctatc gtgcgctttc ctaatatcac aaacctgtgc     1020
          ccatttggcg aggtgttcaa cgcaaccagg ttcgccagcg tgtacgcatg gaataggaag     1080
          cgcatctcta actgcgtggc cgactatagc gtgctgtaca actccgcctc tttcagcacc     1140
          tttaagtgct atggcgtgtc ccccacaaag ctgaatgacc tgtgctttac caacgtgtac     1200
          gccgattctt tcgtgatcag gggcgacgag gtgcgccaga tcgcacctgg acagacaggc     1260
          aagatcgccg actacaatta taagctgcca gacgatttca ccggctgcgt gatcgcctgg     1320
          aacagcaaca atctggattc caaggtcggc ggcaactaca attatctgta ccggctgttt     1380
          agaaagagca atctgaagcc cttcgagagg gacatctcta cagaaatcta ccaggccggc     1440
          agcacccctt gcaatggcgt ggagggcttt aactgttatt tcccactgca gtcctacggc     1500
          ttccagccca caaacggcgt gggctatcag ccttaccgcg tggtggtgct gagctttgag     1560
          ctgctgcacg caccagcaac agtgtgcgga cccaagaagt ccaccaatct ggtgaagaac     1620
          aagtgcgtga acttcaactt caacggcctg accggcacag gcgtgctgac cgagtccaac     1680
          aagaagttcc tgccatttca gcagttcggc agggacatcg cagataccac agacgccgtg     1740
          cgcgacccac agaccctgga gatcctggac atcacaccct gctctttcgg cggcgtgagc     1800
          gtgatcacac caggcaccaa tacaagcaac caggtggccg tgctgtatca ggacgtgaat     1860
          tgtaccgagg tgcctgtggc catccacgcc gatcagctga ccccaacatg gcgggtgtac     1920
          agcaccggct ccaacgtgtt ccagacaaga gccggatgcc tgatcggagc agagcacgtg     1980
          aacaattcct atgagtgcga catcccaatc ggcgccggca tctgtgcctc ttaccagacc     2040
          cagacaaact ctcccagaag agcccggagc gtggcctccc agtctatcat cgcctatacc     2100
          atgtccctgg gcgccgagaa cagcgtggcc tactctaaca atagcatcgc catcccaacc     2160
          aacttcacaa tctctgtgac cacagagatc ctgcccgtgt ccatgaccaa gacatctgtg     2220
          gactgcacaa tgtatatctg tggcgattct accgagtgca gcaacctgct gctgcagtac     2280
          ggcagctttt gtacccagct gaatagagcc ctgacaggca tcgccgtgga gcaggataag     2340
          aacacacagg aggtgttcgc ccaggtgaag caaatctaca agaccccccc tatcaaggac     2400
          tttggcggct tcaatttttc ccagatcctg cctgatccat ccaagccttc taagcggagc     2460
          tttatcgagg acctgctgtt caacaaggtg accctggccg atgccggctt catcaagcag     2520
          tatggcgatt gcctgggcga catcgcagcc cgggacctga tctgcgccca gaagtttaat     2580
          ggcctgaccg tgctgccacc cctgctgaca gatgagatga tcgcacagta cacaagcgcc     2640
          ctgctggccg gcaccatcac atccggatgg accttcggcg caggagccgc cctgcagatc     2700
          ccctttgcca tgcagatggc ctataggttc aacggcatcg gcgtgaccca gaatgtgctg     2760
          tacgagaacc agaagctgat cgccaatcag tttaactccg ccatcggcaa gatccaggac     2820
          agcctgtcct ctacagcctc cgccctgggc aagctgcagg atgtggtgaa tcagaacgcc     2880
          caggccctga ataccctggt gaagcagctg agcagcaact tcggcgccat ctctagcgtg     2940
          ctgaatgaca tcctgagccg gctggacaag gtggaggcag aggtgcagat cgaccggctg     3000
          atcacaggca gactgcagtc tctgcagacc tatgtgacac agcagctgat cagggcagca     3060
          gagatcaggg ccagcgccaa tctggcagca accaagatgt ccgagtgcgt gctgggccag     3120
          tctaagagag tggacttttg tggcaagggc tatcacctga tgtccttccc tcagtctgcc     3180
          ccacacggcg tggtgtttct gcacgtgacc tacgtgcccg cccaggagaa gaacttcacc     3240
          acagcccctg ccatctgcca cgatggcaag gcccactttc caagggaggg cgtgttcgtg     3300
          tccaacggca cccactggtt tgtgacacag cgcaatttct acgagcccca gatcatcacc     3360
          acagacaata ccttcgtgag cggcaactgt gacgtggtca tcggcatcgt gaacaatacc     3420
          gtgtatgatc cactgcagcc cgagctggac agctttaagg aggagctgga taagtacttc     3480
          aagaatcaca cctcccctga cgtggatctg ggcgacatca gcggcatcaa tgcctccgtg     3540
          gtgaacatcc agaaggagat cgaccgcctg aacgaggtgg ccaagaatct gaacgagagc     3600
          ctgatcgatc tgcaggagct gggcaagtat gagcagtaca tcaagtggcc ctggtacatc     3660
          tggctgggct tcatcgccgg cctgatcgcc atcgtgatgg tgaccatcat gctgtgctgt     3720
          atgacatcct gctgttcttg cctgaagggc tgctgtagct gtggctcctg ctgtaagttt     3780
          gatgaggacg actccgaacc cgtgctgaag ggcgtgaagc tgcattacac ctgactcgag     3840
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          gttccagaac tgcaccgacc ct                                                22
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          agggtcggtg cagttctgga ac                                                22
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          cgagttcaac gtgacctctt cag                                               23
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          ctgaagaggt cacgttgaac tcg                                               23
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          catggaatag gacgcgcatc tc                                                22
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          gagatgcgcg tcctattcca tg                                                22
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          ctgtacaact caacctcctt cagc                                              24
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          gctgaaggag gttgagttgt acag                                              24
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          ctagccgatg gaccgcagga g                                                 21
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          ctcctgcggt ccatccgcta g                                                 21
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          gctgccagac aatttcaccg cc                                                22
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          gccggtgaaa ttgtctggca gc                                                22
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          gagctgctga acgccacagc tactgtg                                           27
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          cacagtagct gtggcgttca gcagctc                                           27
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          ctgactactc gaactcagct gcccccc                                           27
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          ggggggcagc tgagttcgag tagtcag                                           27
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          cccgtgctgc cttttaacga tggcgtg                                           27
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          cacgccatcg ttaaaaggca gcacggg                                           27
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          tttaacgatg gcgtgtactt c                                                 21
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          gaagtacacg ccatcgttaa a                                                 21
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          gtactacaac aagaccaaca ag                                                22
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          cttgttggtc ttgttgtagt ac                                                22
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          ctgatggacc tggagggcaa gcagggc                                           27
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          gccctgcttg ccctccaggt ccatcag                                           27
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          gagggcaagc agggcaattt caagaac                                           27
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          gttcttgaaa ttgccctgct tgccctc                                           27
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          ggcaatttca agaacctgag g                                                 21
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          cctcaggttc ttgaaattgc c                                                 21
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          atcaacctgg tgcgcgacct gcctcag                                           27
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          ctgaggcagg tcgcgcacca ggttgat                                           27
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          ctgcctcagg gcttcagcgc c                                                 21
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          ggcgctgaag ccctgaggca g                                                 21
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          acacccggcg actcctctag c                                                 21
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成引子]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          gctagaggag tcgccgggtg t                                                 21

Claims

一種新型冠狀病毒棘蛋白突變體，具有遮蔽新型冠狀病毒棘蛋白的N端域及/或受體結合域的一N-醣基化，其中該新型冠狀病毒棘蛋白突變體係在一野生型新型冠狀病毒棘蛋白的一胺基酸殘基位具有一突變，其中該胺基酸殘基位係選自由以下組成之群組：第21個胺基酸殘基位、第23個胺基酸殘基位、第85個胺基酸殘基位、第87個胺基酸殘基位、第89個胺基酸殘基位、第135個胺基酸殘基位、第137個胺基酸殘基位、第146個胺基酸殘基位、第148個胺基酸殘基位、第158個胺基酸殘基位、第160個胺基酸殘基位、第179個胺基酸殘基位、第181個胺基酸殘基位、第183個胺基酸殘基位、第185個胺基酸殘基位、第187個胺基酸殘基位、第213個胺基酸殘基位、第215個胺基酸殘基位、第219個胺基酸殘基位、第253個胺基酸殘基位、第354個胺基酸殘基位、第356個胺基酸殘基位、第370個胺基酸殘基位、第413個胺基酸殘基位、第428個胺基酸殘基位、第519個胺基酸殘基位、及第521個胺基酸殘基位；該突變係將胺基酸殘基位取代為一天冬醯胺或一蘇胺酸。
如請求項1所述的新型冠狀病毒棘蛋白突變體，係在該野生型新型冠狀病毒棘蛋白的第21個胺基酸殘基位與第23個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第85個胺基酸殘基位與第87個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第89個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第135個胺基酸殘基位與第137個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第146個胺基酸殘基位與第148個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第158個胺基酸殘基位與第160個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第179個胺基酸殘基位與第181個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第183個胺基酸殘基位與第185個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第187個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第213個胺基酸殘基位與第215個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第219個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第253個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第356個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第372個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第413個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第428個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、或第519個胺基酸殘基位與第521個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代。
一種核酸分子，包含編碼如請求項2所述的新型冠狀病毒棘蛋白突變體的一核苷酸序列。
一種疫苗組合物，包含如請求項1或2所述的新型冠狀病毒棘蛋白突變體。
如請求項4所述的疫苗組合物，其中該新型冠狀病毒棘蛋白突變體係表達在一重組病毒上。
如請求項5所述的疫苗組合物，其中該重組病毒包含如請求項3所述的核酸分子。
如請求項5所述的疫苗組合物，其中該重組病毒係一重組腺病毒。
一種如請求項1所述的新型冠狀病毒棘蛋白突變體用於製備新型冠狀病毒疫苗組合物的用途。
如請求項8所述的用途，其中該新型冠狀病毒疫苗組合物在一個體中引發抗複數新型冠狀病毒變體的免疫反應。
如請求項8所述的用途，其中該新型冠狀病毒疫苗組合物引發高效價的抗原專一性抗體及/或中和抗體。