TW202415769A - 流感病毒神經胺酸酶突變體、編碼流感病毒神經胺酸酶突變體的核酸分子、包含流感病毒神經胺酸酶突變體的疫苗組成物及流感病毒神經胺酸酶突變體用於製備流感病毒疫苗組成物的用途 - Google Patents
流感病毒神經胺酸酶突變體、編碼流感病毒神經胺酸酶突變體的核酸分子、包含流感病毒神經胺酸酶突變體的疫苗組成物及流感病毒神經胺酸酶突變體用於製備流感病毒疫苗組成物的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提供一種流感病毒神經胺酸酶突變體、編碼流感病毒神經胺酸酶突變體的核酸分子、包含流感病毒神經胺酸酶突變體的疫苗組成物及流感病毒神經胺酸酶突變體用於製備流感病毒疫苗組成物的用途。本發明疫苗組成物藉由多種功效實驗，達到預防流感病毒感染的效果。
Description
本發明是有關於一種流感病毒神經胺酸酶突變體、編碼流感病毒神經胺酸酶突變體的核酸分子、包含流感病毒神經胺酸酶突變體的疫苗組成物及流感病毒神經胺酸酶突變體用於製備流感病毒疫苗組成物的用途。
流感引起的大流行發病率和死亡率很高，尤其是對兒童和老年人。流感病毒的抗原性易發生變異並且可跨種傳播，其中以A型流感病毒最為重要。由於病毒株快速變異，一旦有新的流感病毒亞型出現，人群普遍對其缺乏免疫力，容易引起大流行。
目前唯一可行的預防措施是疫苗接種，市場上應用的疫苗主要是去活性流感病毒、減毒流感病毒、類病毒顆粒(VLPs)及重組次單元蛋白，上述疫苗主要針對血球凝集素(hemagglutinin, HA)和神經胺酸酶(neuraminidase, NA)產生特異性抗體。但是流感病毒血清型眾多，現有疫苗在各個血清型之間的交叉保護能力較差，致使流感疫苗缺乏對新型流感病毒的交叉保護功能，因此發展廣效性流感疫苗是目前所需努力的部分。
為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出新穎的流感病毒神經胺酸酶突變體及包含流感病毒神經胺酸酶突變體的疫苗組成物以造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種流感病毒神經胺酸酶突變體，具有遮蔽流感病毒的神經胺酸酶的一N-醣基化。
在本發明的一實施例中，該流感病毒神經胺酸酶突變體是在人類流感病毒神經胺酸酶的N1的一胺基酸殘基位具有一突變，其中該胺基酸殘基位是選自於下列所組成的群組：第221個胺基酸殘基位、第223個胺基酸殘基位、第270個胺基酸殘基位、第272個胺基酸殘基位、第273個胺基酸殘基位、第275個胺基酸殘基位、第329個胺基酸殘基位、第331個胺基酸殘基位、第332個胺基酸殘基位、第335個胺基酸殘基位、第337個胺基酸殘基位、第341個胺基酸殘基位，及第343個胺基酸殘基位。
在本發明的一實施例中，該流感病毒神經胺酸酶突變體是在人類流感病毒神經胺酸酶的N2的一胺基酸殘基位具有一突變，其中該胺基酸殘基位是選自於下列所組成的群組：第93個胺基酸殘基位、第245個胺基酸殘基位、第247個胺基酸殘基位、第267個胺基酸殘基位、第269個胺基酸殘基位、第331個胺基酸殘基位、第336個胺基酸殘基位、第338個胺基酸殘基位、第348個胺基酸殘基位、第368個胺基酸殘基位、第370個胺基酸殘基位、第401個胺基酸殘基位、第403個胺基酸殘基位、第463個胺基酸殘基位，及第465個胺基酸殘基位。
在本發明的一實施例中，該突變是將胺基酸殘基位取代為一天冬醯胺(asparagine, N)或一蘇胺酸(threonine, T)。
在本發明的一實施例中，在該人類流感病毒神經胺酸酶的N1的第221個胺基酸殘基位與第223個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第270個胺基酸殘基位與第272個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第273個胺基酸殘基位與第275個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第329個胺基酸殘基位與第331個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第332個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第335個胺基酸殘基位與第337個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代，或第341個胺基酸殘基位與第347個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代。
在本發明的一實施例中，在該人類流感病毒神經胺酸酶的N2的第93個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第245個胺基酸殘基位與第247個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第267個胺基酸殘基位與第269個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第331個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第336個胺基酸殘基位與第338個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第348個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第368個胺基酸殘基位與第370個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第401個胺基酸殘基位與第403個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代，或第463個胺基酸殘基位與第465個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代。
本發明之另一目的為提供一種核酸分子，包含編碼如前所述的流感病毒神經胺酸酶突變體的一核苷酸序列。
本發明之另一目的為提供一種如前所述的載體用於提高基因遞送效率的用途。
本發明之另一目的為提供一種疫苗組成物，包含如前所述的流感病毒神經胺酸酶突變體。
在本發明的一實施例中，該流感病毒神經胺酸酶突變體是表達在一重組病毒上。
在本發明的一實施例中，該重組病毒包含如前所述的核酸分子。
在本發明的一實施例中，該重組病毒是一重組腺病毒。
本發明之另一目的為提供一種如前所述的流感病毒神經胺酸酶突變體用於製備流感病毒疫苗組成物的用途。
在本發明的一實施例中，該流感病毒疫苗組成物在一個體中引發抗複數流感病毒變體的免疫反應。
在本發明的一實施例中，該流感病毒疫苗組成物引發高效價的抗原專一性抗體及/或神經胺酸酶抑制IC
50效價。
綜上所述，本發明流感病毒疫苗組成物的功效在於：使用過度醣化的流感病毒神經胺酸酶突變體，以醣遮蔽不重要的抗原決定位，使個體B細胞對流感病毒神經胺酸酶的抗體反應得以重新聚焦，且不會影響蛋白的整體折疊結構。本發明之流感病毒神經胺酸酶突變體可以有效引發個體針對流感病毒之H1N1、H5N1、H3N2、H7N9神經胺酸酶抑制作用，以有效提升個體抵抗流感病毒之不同變異株感染的能力。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在
20%的範圍內，較佳為在
10%的範圍內，最佳為在
5%的範圍內。
除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。
本文中在分析使用ELISA偵測抗流感病毒神經胺酸酶IgG抗體之效價的數據時，對所有的組別(除了使用PBS溶液的控制組)進行多重比較的統計測試。實驗數據以GraphPad Prism v6.01進行分析，使用非參數克-瓦檢測(Kruskal-Wallis test)，並以鄧恩多重比較檢測(Dunn’s multiple comparisons test)進行校正。統計學的顯著性表示如下：*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；以及 ***p ＜ 0.001。而在分析抑制神經胺酸酶抗體效價的實驗數據時，則是根據非線性迴歸對數(抑制劑)與標準化反應-變量斜率的方程，來擬合抑制病毒感染百分比的曲線，並從擬合曲線中獲得IC
50的數值。所有的實驗皆至少進行三次，數據以平均值
標準差表示。
在本文中，用語“N-醣基化”是指以一N-醣苷鍵 (N-glycosidic bond)共價連接一蛋白質的天冬醯胺的醣鏈，包含約至少十個不同種類的單醣單元。更具體地，該醣鏈是連接至一胺基酸殘基中的天冬醯胺(N)，該胺基酸殘基為天冬醯胺(N)-任意胺基酸(X)-蘇胺酸(T)，以N-X-T表示。N-醣基化依單醣組成具有不同的分子量與結構。
在本文中，除非特別指明，用語“過度醣化”意指在野生型蛋白質上的“天然醣遮蔽”胺基酸殘基外，具有額外的“突變醣遮蔽”胺基酸殘基。
在本文中，除非特別指明，用語“突變株”等同於用語“變體”。
在本文中，N221/I223T、N270/P272T、N273/H275T、N329/K331T、T332N、C335N/P337T、N341/A343T表示以天冬醯胺及/或蘇胺酸取代H1N1流感病毒之神經胺酸酶的特定胺基酸殘基位，以顯示本發明流感病毒棘蛋白突變體。K93N、S245N/S247T、P267N/S269T、N329/R331T、Y336N/R338T、N346/G348T、E368N/S370T、D401N/R403、D463N/N465T表示以天冬醯胺及/或蘇胺酸取代H3N2流感病毒之神經胺酸酶的特定胺基酸殘基位，以顯示本發明流感病毒棘蛋白突變體。
在本文中，Ad-N1-WT、Ad-N1-N221/I223T、Ad-N1- N270/P272T、Ad-N1-N273/H275T、Ad-N1-N329/K331T、Ad-N1-T332N、Ad-N1-C335N/P337T或Ad-N1-N341/A343T；Ad-N2-K93N、Ad-N2-S245N/S247T、Ad-N2-P267N/S269T Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-Y336N/R338T、Ad-N2-N346/G348T、Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-D401N/R403T、Ad-N2-D463N/N465T表示表達不同之本發明流感病毒神經胺酸酶蛋白突變體的重組腺病毒。
依據本發明，有關基因選殖(gene cloning)的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關定點突變(site-directed mutagenesis)的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關於蛋白質的胺基酸殘基添加N-醣基化(N-linked glycosylation)的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關於以腺病毒表達抗原的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內，且在本文中以“腺病毒載體”表示表達不同之本發明流感病毒棘蛋白突變體的重組腺病毒。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
材料及方法 實驗細胞及培養方法
在本發明之實施例中，使用人類胚胎腎細胞株293A (HEK293A)與人類胚胎腎細胞株293T (HEK293T)進行細胞實驗。HEK293A細胞與HEK293T細胞皆取自生物資源保存及研究中心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC)，並使用添加有10%之胎牛血清(fetal bovine sera, FBS) (Gibco)及100 units/mL之青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin, P/S)的良伊格爾氏培養基 (Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM) (Thermo Scienific)作為細胞培養液，於37
oC、含有5%之CO
2的培養箱進行培養。
腺病毒載體的製備
在本發明之實施例中，使用表達流感病毒之神經胺酸酶或具醣遮蔽突變之流感病毒之神經胺酸酶突變體的腺病毒作為免疫實驗動物的載體。先將編碼流感病毒之神經胺酸酶或神經胺酸酶突變體的基因分別選殖至pENTR1A載體(Invitrogen)中，再使用LR ClonaseTM II Enzyme Mix (Invitrogen)將該二基因分別選殖至腺病毒質體pAd/CMV/V5-DEST (Invitrogen)中，以產生流感病毒之神經胺酸酶或神經胺酸酶突變體的腺病毒質體(adenoviral plasmid)。
為了得到表達流感病毒之神經胺酸酶或神經胺酸酶突變體的腺病毒載體，使用Pac I限制酶切割該腺病毒質體，以使倒轉終端重複(inverted terminal repeats, ITR)暴露出來，接著使用TurboFect轉染試劑(Fermentas)將該二腺病毒質體分別轉染至293A細胞中。於轉染10至15天後，待細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)出現，便收集經轉染的細胞與其培養基。以三次冷凍解凍循環破壞細胞以釋放細胞內的病毒顆粒，並在4
oC下使用3,000 rpm離心15分鐘，以收集細胞裂解物的上清液而獲取表達流感病毒之神經胺酸酶或神經胺酸酶突變體的腺病毒載體。此外，為了製備具有更高滴度(titer)的腺病毒載體，可以使用30-kDa Amicon Ultra-15離心過濾器(Millipore)進行濃縮。腺病毒載體原液可以儲存於-80
oC。
為了進一步確定腺病毒載體的滴度，將HEK293A細胞以10
6個細胞/孔的密度接種至6孔培養盤中，並在37
oC下培養過夜後，在37
oC下將10倍序列稀釋的腺病毒載體原液添加至每孔中作用24小時。接著移除含有稀釋腺病毒載體的培養基，並將含有0.4%洋菜膠及100 U/mL青黴素/鏈黴素的3 mL/孔DMEM添加至該6培養盤中感染細胞。在以腺病毒載體感染HEK293A細胞7至10天後，對噬菌斑進行可見定量，並記錄噬菌斑形成單位 (plaque-forming unit, PFU)的計數。
十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 的操作
SDS-PAGE的操作簡述如下。首先，依3:1的比例將蛋白質樣品與還原樣品緩衝溶液(reducing sample buffer)(包含有50 mM的三氫甲基胺基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)，pH 6.8；100 mM的二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)；2%的SDS；0.1%的溴酚藍(bromophenol blue)；以及10%的甘油)混合後於95
oC加熱5分鐘。
與此同時，製備包含分離膠體(以12%的分離膠體為例：包含有2.5 mL之1 M的Tris， pH 8.8；3.3 mL的去離子水；4 mL之30%的丙烯醯胺預混液(acrylamide mix)；0.1 mL之10%的SDS；0.1 ml之10%的過硫酸銨(ammonium persulfate, APS)；以及0.01 mL的四甲基乙二胺(TEMED))，及焦集膠體(以5%的焦集膠體為例：包含有0.63 mL之1 M的Tris， pH 6.8；3.4 mL的去離子水；0.83 mL之30%的丙烯醯胺預混液；0.05 mL之10%的SDS；0.05 mL之10%的APS；以及0.005 mL的TEMED)的電泳膠體。
蛋白質電泳在電壓80V下進行焦集，並且在140V下進行分離，其中電泳的時間依待測蛋白質的分子量而定。其後，將膠體以考馬斯亮藍染劑溶液(包含有0.1%的coomassie R250；10%的醋酸；以及50%的甲醇)染色1小時，再以脫色溶液(包含有10%的醋酸；以及50%的甲醇)進行脫色。
西方墨點法的操作
西方墨點法(Western blot)的操作簡述如下。在轉漬槽中，將經SDS-PAGE分離之蛋白質樣品的膠體，以電壓135V轉印至硝化纖維膜(nitrocellulose membrane，以下簡稱NC膜)，再將該含有轉印蛋白質的NC膜浸泡於20 mL的阻斷溶液中，並震盪至少1小時以阻斷非專一性結合；其中，該阻斷溶液為添加有5%之脫脂奶的含Tween-20之三羥甲基胺基緩衝食鹽水(以下簡稱TBST溶液，包含有50 mM的Tris；150 mM的氯化鈉；以及0.05%的Tween-20)。
接著使用TBST溶液清洗該NC膜3次後，加入經TBST溶液進行特定倍數稀釋的一級抗體，於4
oC震盪處理約16小時，隔天再使用TBST溶液清洗3次後，以連結山葵過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)之經TBST溶液進行特定倍數稀釋的二級抗體，於室溫下震盪處理1小時，而後使用TBST溶液清洗3次。將增強的化學冷光試劑(HRP-catalyzed enhanced chemiluminescence，Millipore)添加至該膜作用1分鐘以產生冷光訊號，並顯影至X光膠片上，例如醫用感藍X射線膠片(Medical X-ray Film, Fujifilm)。
實驗小鼠的免疫方法
在本發明之一實施例中，使用6至8週齡的BALB/c雌性小鼠進行疫苗接種的實驗，其中BALB/c雌性小鼠是取自財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)。在第一組免疫實驗中，使用每劑含有1×10
8pfu的Ad-N1、Ad-N1-N221/I223T、Ad-N1-N270/P272T、Ad-N1-N273/H275T、Ad-N1-N329/K331T、Ad-N1-T332N、Ad-N1-C335N/P337T、或Ad-N1-N341/A343T載體的PBS (Phosphate buffered saline)溶液(pH 7.4)進行肌肉注射；而在第二組免疫實驗中，則使用每劑含有1×10
8pfu的Ad-N2、Ad-N2-K93N、Ad-N2-S245N/S247T、Ad-N2- P267N/S269T、Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-Y336N/ R338T、Ad-N2- N346/G348T、Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-D401N/R403T或Ad-N2- D463N/N465T載體的PBS溶液進行噴鼻免疫。每隻小鼠皆分別於第0週與第3週予以免疫注射，並於第二次免疫注射的2週後收集血清。
實驗小鼠血清樣品的採集
以前述方法對小鼠進行免疫鼻噴，並於第二次免疫鼻噴的2週後收集各小鼠的血清樣品。在取樣前透過超紅燈及熱毯加熱小鼠10分鐘，並使用70%乙醇消毒後，用手術刀切開小鼠側尾靜脈，採集約500
L的血液。接著，將全血在室溫下靜置2小時，使血液凝結後，以800 g轉速離心15分鐘共兩次以去除血液凝塊，並立即將血清轉移到新的離心管中，並在56
oC加熱處理30分鐘以減活補體，而待冷卻至室溫後，再將血清分配並儲存在-20
oC。
實施例 1. 本發明之流感病毒神經胺酸酶突變體的製備
在本發明之一實施例中，基於流感病毒神經胺酸酶的三維結構，挑選適合額外添加醣遮蔽的目標位點，以遮蔽不重要的抗原決定位(epitope)，使B細胞對神經胺酸酶的抗體反應得以重新聚焦，且不會影響神經胺酸酶的整體折疊結構，接著使用腺病毒載體表達在目標位點具有醣遮蔽突變的神經胺酸酶抗原，以作為本發明之疫苗組成物中的主要成分。
在本發明之實施例中，使用PyMol (The PyMol Molecular Graphics System, version 4.0; Schrödinger, LLC)確認在神經胺酸酶的三維結構(PDB ID: 4B7R, 3TIA)中暴露環(loop)或暴露環中突出的位點，以作為醣遮蔽的添加目標位點，其中排除與天然醣遮蔽與NA距離小於5 Å的位點。最終篩選出16組胺基酸殘基位添加額外的醣遮蔽修飾，以製備16種本發明之流感病毒神經胺酸酶突變體，其N-醣基化位置如圖1A與圖3A。
相較於流感病毒神經胺酸酶的N1 (序列識別號：1)或N2 (序列識別號：2)的胺基酸序列，該16種神經胺酸酶突變體具有一或二個胺基酸取代以實現N-醣基化(參見表1)，具體來說，N1神經胺酸酶蛋白的第221個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺與第223個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第270個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺與第272個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第273個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺與第275個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第329個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺與第331個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第332個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第335個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代與第337個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第341個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺與第343個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代。
具體來說，N2神經胺酸酶蛋白的第93個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第245個胺基酸殘基位與第247個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第267個胺基酸殘基位與第269個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第331個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第336個胺基酸殘基位與第338個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第348個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第368個胺基酸殘基位與第370個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第401個胺基酸殘基位與第403個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第463個胺基酸殘基位與第465個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代。
表1
| 編號 | 神經胺酸酶突變體 | N- 醣基化殘基位的胺基酸序列 | |
| #1 | N221/I223T | 221NNT 223 | |
| #2 | N270/P272T | 270NAT 272 | |
| #3 | N273/H275T | 273NYT 275 | |
| #4 | N329/K331T | 329NDT 331 | |
| #5 | T332N | 332NGS 334 | |
| #6 | C335N/P337T | 335NGT 337 | |
| #7 | N341/A343T | 341NGT 343 | |
| #8 | K93N | 93NIT 95 | |
| #9 | S245N/S247T | 245NAT 247 | |
| #10 | P267N/S269T | 354NLT 269 | |
| #11 | N329/R331T | NDT 331 | |
| #12 | Y336N/R338T | 336NCT 338 | |
| #13 | N346/G348T | NHT 348 | |
| #14 | E368N/S370T | NAT 370 | |
| #15 | D401N/S403T | 401NDT 403 | |
| #16 | D463N/N465T | 463NIT 465 |
為建構包含該等神經胺酸酶突變體基因的腺病毒表現載體，將取自GenScript公司流感病毒的神經胺酸酶基因(H1N1及H3N2分離株，皆經人類密碼子優化(codon-optimized) (N1的核苷酸序列為序列識別號：3；N2的核苷酸序列為序列識別號：4)，再利用如下表2所示的引子(序列識別號：5至序列識別號：38)進行基於聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)的定點突變(site-directed mutagenesis)，以獲得包含9種神經胺酸酶突變體基因的DNA片段，並以前述腺病毒載體的製備方法，製備表達該等神經胺酸酶突變體的腺病毒載體，分別標示為Ad-N1-N221/I223T、Ad-N1-N270/P272T、Ad-N1-N273/H275T、Ad-N1-N329/K331T、Ad-N1-T332N、Ad-N1-C335N/P337T或Ad-N1-N341/A343T；Ad-N2-K93N、Ad-N2-S245N/S247T、Ad-N2-P267N/S269T Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-Y336N/R338T、Ad-N2-N346/G348T、Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-D401N/R403T、Ad-N2-D463N/N465T，同時製備野生型流感病毒神經胺酸酶的腺病毒載體作為比較組。
表2
| 編號 | 神經胺酸酶突變體 | PCR 引子序列 | 序列識別號 |
| #1 | N221/I223T | F: gaaacaataccctgcggact R: agtccgcagggtattgtttc | 5 6 |
| #2 | N270/P272T | F: atgaacgccacaaattacca R: tggtaatttgtggcgttcat | 7 8 |
| #3 | N273/H275T | F: cccctaattacacctatgagg R: cctcataggtgtaattagggg | 9 10 |
| #4 | N329/K331T | F: cccaatgatacgactggaag R: cttccagtcgtatcattggg | 11 12 |
| #5 | T332N | F: ccaatgataagaatggaagctg R: cagcttccattcttatcattgg | 13 14 |
| #6 | C335N | F: actggaagcaatggccccg R: cggggccattgcttccagt | 15 16 |
| #7 | P337T | F: agcaatggcaccgtgagca R: tgctcacggtgccattgct | 17 18 |
| #8 | N341/A343T | F: agcaacgggactaatggagt R: actccattagtcccgttgct | 19 20 |
| #9 | K93N | F：Gccccagtgtaacatcactggct R：Agccagtgatgttacactggggc | 21 22 |
| #10 | S245N/S247T | F：Gacggaaacgcaaccggacgagcagatacaaaga R：Cgtccggttgcgtttccgtcggtcatgaccact | 23 24 |
| #11 | P267N/S269T | F：Catcagtaacctgactgggagtgctcagcatgtc R：Tcccagtcaggttactgatgtgcacaattttgcctt | 25 26 |
| #12 | N329/R331T | F：gaaacaatgatacctcctctaactcctactgtcgg R：Gtaggagttagaggaggtatcattgtttctaggtgtg | 27 28 |
| #13 | Y336N/R338T | F：Actccaactgtaccaatccaaacaatgagaaggggaac R：Tggattggtacagttggagttagaggacctatcattgt | 29 30 |
| #14 | N346/G348T | F：Agaaggggaaccatacagtgaaaggctgg R：Ccagcctttcactgtatggttccccttct | 31 32 |
| #15 | E368N/S370T | F：Catctctaacgatacacgaagcggctatgagacc R：Ttcgtgtatcgttagagatggtgcgccccatc | 33 34 |
| #16 | D401N/S403T | F: Gactccaataacacaagtgggtactcaggaattttcag R：Ccacttgtgttattggagtcgacgatgacctgc | 35 36 |
| #17 | D463N/N465T | F：gagcaaacattatcctgatgcctatcGCGGC R：Ccacttgtgttattggagtcgacgatgacctgc | 37 38 |
為了確認表達在腺病毒載體中的神經胺酸酶，使用SDS-PAGE與西方墨點法分析經腺病毒載體感染的細胞裂解物中，是否具有神經胺酸酶。首先，將病毒感染劑量(multiplicity of infection, MOI)為1的Ad-N1 (表達野生型神經胺酸酶的腺病毒載體)、Ad-N1-N221/I223T、Ad-N1-N270/P272T、Ad-N1-N273/H275T、Ad-N1-N329/K331T、Ad-N1-T332N、Ad-N1-C335N/P337T或Ad-N1-N341/A343T；Ad-N2 (表達野生型神經胺酸酶的腺病毒載體)、Ad-N2-K93N、Ad-N2-S245N/S247T、Ad-N2-P267N/S269T Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-Y336N/R338T、Ad-N2-N346/G348T、Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-D401N/R403T、Ad-N2-D463N/N465T感染HEK293A細胞48小時。接著以Glo Lysis緩衝溶液(Promega)裂解HEK293A細胞，並在4
oC下以12,000 xg離心5分鐘以去除細胞碎片。將細胞裂解物與還原樣品緩衝溶液混合後在95
oC加熱5分鐘，且可以在37
oC下經PNGase F (BioLabs)處理2小時，也可以不經PNGase F處理，接著使用7%或8%的分離凝膠，以SDS-PAGE分離樣本中的蛋白質。將SDS-PAGE的膠體轉印至NC膜(Millipore)後，在室溫下以阻斷溶液作用1小時，再使用TBST溶液清洗3次。加入一級抗體：抗流感病毒神經胺酸酶(H1N1及H3N2)抗體(anti-N1 antibody, ab21304, Abcam；anti-N2 antibody，40017-T62，SINO biology)反應過夜，並加入二級抗體：連結HRP的山羊抗兔IgG 抗體(HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG, KPL)在室溫下作用1小時。使用化學冷光試劑偵測抗體的訊號，並顯影至X光膠片，結果如圖1B及3B所示。
由圖1B可以看出，在感染Ad-N1、Ad-N1-N221/I223T(#1)、Ad-N1-N270/P272T(#2)、Ad-N1-N273/H275T(#3)、Ad-N1-N329/K331T(#4)、Ad-N1-T332N(#5)、Ad-N1-C335N/P337T(#6)或Ad-N1-N341/A343T(#7)腺病毒載體的細胞中，確實存在流感病毒的N1 神經胺酸酶蛋白。
圖3B可以看出，在感染Ad-N2、Ad-N2-K93N(#1)、Ad-N2-S245N/S247T(#2)、Ad-N2-P267N/S269T(#3) Ad-N2-N329/R331T(#4)、Ad-N2-Y336N/R338T(#5)、Ad-N2-N346/G348T(#6)、Ad-N2-E368N/S370T(#7)、Ad-N2-D401N/R403T(#8)、Ad-N2-D463N/N465T(#9)載體的細胞中，確實存在流感病毒的N2神經胺酸酶蛋白。
實施例 2. 本發明之流感病毒神經胺酸酶突變體提高針對其他流感病毒株之抗體的效價
在本發明之一實施例中，為證實本發明之流感病毒神經胺酸酶突變體確實能有效地誘發哺乳動物產生對抗流感病毒的抗體反應，以表達本發明之醣遮蔽神經胺酸酶的腺病毒載體製備疫苗組成物，並肌肉注射或鼻噴至實驗小鼠體內，且以表達原生型神經胺酸酶的腺病毒載體作為比較組，在經過一段時間後收取小鼠的血清，以分析其中抗流感病毒之抗體效價。
首先，使用PBS溶液將表達野生型神經胺酸酶或神經胺酸酶突變體的腺病毒載體稀釋，以分別配製成50
L的疫苗組成物，並將BALB/c小鼠( n = 5)分成以下組別進行免疫實驗：(1)控制組(PBS)：小鼠僅鼻噴或肌肉注射免疫PBS溶液；(2)比較組(Ad-N1)：小鼠肌肉注射含有1
10
8pfu表達野生型神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(3)實驗組(Ad-N1-N221/I223T)：小鼠肌肉注射免疫含有1
10
8pfu表達Ad-N1-N221/I223T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(4)實驗組(Ad-N1-N270/P272T)：小鼠肌肉注射免疫含有1
10
8pfu表達Ad-N1-N270/P272T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(5) 實驗組(Ad-N1-N273/H275T)：小鼠肌肉注射免疫含有1
10
8pfu表達Ad-N1- N273/H275T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(6)實驗組(Ad-N1-N329/K331T)：小鼠肌肉注射免疫含有1
10
8pfu表達Ad-N1- N329/K331T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(7)實驗組(Ad-N1- T332N)：小鼠肌肉注射免疫含有1
10
8pfu表達Ad-N1- T332N醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(8)實驗組 (Ad-N1-C335N/P337T)：小鼠肌肉注射免疫含有1
10
8pfu表達Ad-N1-C335N/P337T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(9)實驗組(Ad-N1-N341/A343T)：小鼠肌肉注射免疫含有1
10
8pfu表達Ad-N1-N341/A343T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物。(10)比較組(Ad-N2)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8pfu表達野生型神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(11)實驗組(Ad-N2-K93N)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8pfu表達Ad-N2-K93N醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(12)實驗組 (Ad-N2-S245N/S247T)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8表達245N/S247T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(13)實驗組(Ad-N2-P267N/S269T)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8pfu表達P267N/S269T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(14)實驗組(Ad-N2-N329/R331T)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8pfu表達N329/R331T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(15)實驗組 (Ad-N2-Y336N/R338T)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8pfu表達Y336N/R338T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(16)實驗組 (Ad-N2-N346/G348T)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8pfu表達N346/G348T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(17)實驗組 (Ad-N2-E368N/S370T)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8pfu表達E368N/S370T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(18)實驗組 (Ad-N2-D401N/R403T)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8pfu表達D401N/R403T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物；(19)實驗組 (Ad-N2-D463N/N465T)：小鼠鼻噴免疫含有1
10
8pfu表達D463N/N465T醣遮蔽神經胺酸酶之腺病毒載體的疫苗組成物。以上各組小鼠皆免疫鼻噴共二劑且每劑間隔3週。
在肌肉注射或鼻噴第二劑的2週後，採集並收集各組小鼠的血清，用以分析其中針對流感病毒(H1N1(A/Texas/05/2009)；H3N2(A/Udorn/307/1972))抗神經胺酸酶IgG抗體、及神經胺酸酶抑制抗體的含量。
使用酵素結合免疫吸附分析 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)偵測血清樣本中抗神經胺酸酶IgG抗體效價，詳細方法如下。首先，將流感病毒H1N1(A/Texas/05/2009)或H3N2(A/Udorn/307/1972)之重組神經胺酸酶以每孔2
g/ml的濃度，在塗層緩衝溶液(coating buffer，每孔10
L)中，分別在4
oC下隔夜固定於二個96孔培養盤。吸出培養盤中的塗層緩衝溶液，並以300
L含有0.05% Tween-20的PBS溶液(以下簡稱PBST溶液)清洗三次，以移除多餘的重組蛋白。在各孔中加入200
L的阻斷緩衝溶液(blocking buffer，含1%胎牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 的PBS溶液)，在室溫下阻斷2小時，以避免非專一性結合。以300
L的PBST溶液清洗三次。將經熱減活的各組血清樣本以1:1000進行預稀釋，接著以稀釋緩衝溶液(dilution buffer，含1% BSA、0.05% Tween 20的PBST溶液)進行2倍連續稀釋。將連續稀釋的血清樣本分別加入96孔培養盤中，於室溫作用1小時，使其中的抗體與固定在96孔培養盤的神經胺酸酶或RBD結合。以300
L的PBST溶液清洗三次。在96孔培養盤中加入100
L連結HRP的抗小鼠IgG抗體 (HRP conjugated anti-mouse IgG antibody，使用稀釋緩衝溶液以1:30000比例稀釋)，於室溫下避光作用1小時。以300
L的PBST溶液清洗三次。將HRP的受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine, TMB， BioLegend)以100
L加入96孔培養盤中，並於暗處進行呈色反應15分鐘。加入100
L為2 N的硫酸(H
2SO
4)以終止反應。使用TECAN分光光度計測定各孔在450 nm的光密度。根據高於0.2之光密度值的最終連續稀釋程度計算終點滴定值。
使用神經胺酸酶抑制試驗(NA inhibition assay)檢測血清樣本中，針對流感病毒神經胺酸酶抑制抗體效價，詳細方法如下。在96孔盤底部貼附一層胎兒蛋白(Fetuin)，16小時後使用PBST溶液清洗三次，接著加入阻斷劑震盪至少2小時以阻斷非專一性結合。PBST溶液清洗三次後，加入含有已稀釋的小鼠血清與特定稀釋倍率的病毒混合物100
l。37度培養1小時後，再以PBST溶液清洗三次。加入100
l lectin室溫震盪培養1小時。PBST溶液清洗三次後每孔加入100
l TMB反應15分鐘，最終加入硫酸終止反應。使用GraphPad Prism v6.01軟體分析中和曲線與IC
50數值。
在經肌肉注射含有Ad-N1、Ad-N1-N221/I223T、Ad-N1-N270/P272T、Ad-N1-N273/H275T、Ad-N1-N329/K331T、Ad-N1-T332N、Ad-N1-C335N/P337T、或Ad-N1-N341/A343T之疫苗組成物後，小鼠血清中抗神經胺酸酶IgG抗體的效價如圖2A所示，*表示p ＜ 0.05、N.D.表示未檢出；小鼠血清中H1N1 (A/California/07/2009)神經胺酸酶抑制抗體的效價如圖2B所示，N.D.表示未檢出；小鼠血清H5N1 (A/Vietnam/1203/2004)神經胺酸酶抑制抗體的效價如圖2C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清H3N2 (A/Udorn/307/1972 )神經胺酸酶抑制抗體的效價如圖2D所示，小鼠血清H7N9(A/Shanghai/02/2013)神經胺酸酶抑制抗體的效價如圖2E所示並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數，N.D.表示未檢出。
由圖2A可以看出，小鼠經肌肉注射Ad-N1-N273/H275T後，所引發針對H1N1流感病毒(A/Texas/05/2009)之神經胺酸酶蛋白IgG抗體效價，顯著低於經肌肉注射Ad-N1、Ad-N1-N221/I223T或Ad-N1-N329/K331T的小鼠。
由圖2B可以看出，小鼠肌肉注射Ad-N1-N273/H275T或Ad-N1-C335N/P337T所誘發的神經胺酸酶抗體中，含有較少抑制H1N1(A/California/07/2009)神經胺酸酶的抑制抗體，其餘組別誘發的神經胺酸酶抑制抗體效價與野生型相近。
由圖2C可以看出，針對抑制H5N1(A/Vietnam/1203/2004)神經胺酸酶活性中，大部分的免疫組別誘發的抑制能力與野生型接近，但其中免疫Ad-N1-N329/K331T的組別所引發針對H5N1(A/Vietnam/1203/2004)的神經胺酸酶抑制抗體高於野生型3.74倍
由圖2D可以看出，免疫Ad-N1-N221/I223T、Ad-N1-N270/P272T、Ad-N1-N273/H275T及Ad-N1-N329/K331T後，針對流感病毒H3N2 (A/Udorn/307/1972)神經胺酸酶的抑制能力與野生型相近。而與野生型相比，免疫Ad-N1-T332N、Ad-N1-C335N/P337T及Ad-N1-N341/A343T的小鼠血清產生較強的H3N2 (A/Udorn/307/1972)神經胺酸酶抑制能力。
由圖2E可以看出，免疫Ad-N1-N221/I223T、Ad-N1-N270/P272T、Ad-N1-N273/H275T及Ad-N1-N329/K331T後，針對流感病毒H7N9 (A/ Shanghai/02/2013)神經胺酸酶的抑制能力與野生型相近。而Ad-N1-T332N、Ad-N1-C335N/P37T及Ad-N1-N341/A343T的小鼠血清針對H7N9 (A/ Shanghai/02/2013)有較佳的抑制能力。
在經免疫鼻噴含有Ad-N2、Ad-N2-K93N、Ad-N2-S245N/S247T、Ad-N2-P267N/S269T、Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-Y336N/R338T、Ad-N2-N346/G348T、Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-D401N/R403T、Ad-N2-D463N/N465T之疫苗組成物後，小鼠血清中抗神經胺酸酶IgG抗體的效價如圖4A所示，*表示p ＜ 0.05、N.D.表示未檢出；小鼠血清中H3N2 (A/Udorn/307/1972)神經胺酸酶抑制抗體的效價如圖4B所示，N.D.表示未檢出；小鼠血清H7N9(A/Shanghai/02/2013)神經胺酸酶抑制抗體的效價如圖4C所示，以抑制病毒感染的百分比表示；小鼠血清H1N1 (A/California/07/2009)神經胺酸酶抑制抗體的效價如圖4D所示，小鼠血清H5N1 (A/Vietnam/1203/2004)神經胺酸酶抑制抗體的效價如圖4E所示並以線性標度表示實驗組相較於比較組的數值倍數，N.D.表示未檢出。
由圖4A可以看出，小鼠經免疫鼻噴Ad-N2-P267N/S269T、Ad-N2-N346/G348T、Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-D463N/N465T後，所引發針對流感病毒H3N2 (A/Udorn/307/1972)抗神經胺酸酶IgG抗體效價亦較為低(但無統計學上的意義)。免疫鼻噴Ad-N2、Ad-N2-K93N、Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-D401N/R403T後，所引發針對流感病毒H3N2 (A/Udorn/307/1972)抗神經胺酸酶IgG抗體效價與經免疫鼻噴Ad-N2相近，而僅鼻噴PBS溶液的控制組小鼠則無此現象。小鼠經免疫鼻噴Ad-N2-S245N/S247T、Ad-N2-Y336N/R338T後，其血清的抗神經胺酸酶IgG抗體效價較Ad-N2為高(但無統計學上的意義)。
由圖4B可以看出，小鼠經免疫Ad-N2-S245N/S247T、Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-N346/G348T、Ad-N2-D463N/N465T後，所引發針對流感病毒H3N2 (A/Udorn/307/1972)神經胺酸酶抑制IC
50效價亦較為低。免疫鼻噴Ad-N2、Ad-N2-K93N、Ad-N2-P267N/S269T、Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-D401N/R403T、Ad-N2-Y336N/R338T後，所引發針對流感病毒H3N2 (A/Udorn/307/1972)神經胺酸酶抑制IC
50效價與經免疫鼻噴Ad-N2 相近，而僅鼻噴PBS溶液的控制組小鼠則無此現象。
由圖4C可以看出，免疫鼻噴Ad-N2、Ad-N2-K93N、Ad-N2-P267N/S269T、Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-Y336N/R338T、Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-D401N/R403T、Ad-N2-D463N/N465T後，所引發針對流感病毒H7N9(A/Shanghai/02/2013)神經胺酸酶抑制IC
50效價與經免疫鼻噴Ad-N2相近，而僅鼻噴PBS溶液以及鼻噴Ad-N2-N346/G348T的組別小鼠則無此現象。小鼠經免疫鼻噴Ad-N2-S245N/S247T後，其血清的所引發針對流感病毒H7N9(A/Shanghai/02/2013)神經胺酸酶抑制IC
50效價較Ad-N2為高。神經胺酸酶抑制IC
50效價為1.51倍
由圖4D可以看出，免疫鼻噴Ad-N2-D463N/N465T後，所引發針對流感病毒H1N1 (A/California/07/2009)神經胺酸酶抑制IC
50效價較經免疫鼻噴Ad-N2低，而免疫鼻噴Ad-N2、Ad-N2-K93N、Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-N346/G348T後，所引發針對流感病毒H1N1 (A/California/07/2009)神經胺酸酶抑制IC
50效價與經免疫鼻噴Ad-N2相近，而僅鼻噴PBS溶液以及鼻噴Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-D401N/R403T的組別小鼠則無此現象。小鼠經免疫鼻噴Ad-N2-S245N/S247T以及Ad-N2-Y336N/R338T後，其血清的神經胺酸酶抑制IC
50效價較Ad-N2為高。神經胺酸酶抑制IC
50效價分別為7.85倍和7.49倍。
由圖4E可以看出，免疫鼻噴Ad-N2-P267N/S269T、Ad-N2-E368N/S370T後，所引發針對流感病毒H5N1 (A/Vietnam/1203/2004)神經胺酸酶抑制IC
50效價較經免疫鼻噴Ad-N2低，而免疫鼻噴Ad-N2、Ad-N2-K93N、Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-N346/G348T 、Ad-N2-D401N/R403T後、Ad-N2-D463N/N465T，所引發針對流感病毒H5N1 (A/Vietnam/1203/2004)神經胺酸酶抑制IC
50效價與經免疫鼻噴Ad-N2相近，而僅鼻噴PBS溶液的組別小鼠則無此現象。小鼠經免疫鼻噴Ad-N2-S245N/S247T以及Ad-N2-Y336N/R338T後，其血清的神經胺酸酶抑制IC
50效價較Ad-N2為高 。神經胺酸酶抑制IC
50效價分別為2.21倍和2.74倍。
綜上所述，本發明流感病毒疫苗組成物使用過度醣化的流感病毒神經胺酸酶突變體，以醣遮蔽不重要的抗原決定位，使個體B細胞對流感病毒神經胺酸酶的抗體反應得以重新聚焦，且不會影響蛋白的整體折疊結構。本發明之流感病毒神經胺酸酶突變體可以有效引發個體針對流感病毒之H1N1、H5N1、H3N2、H7N9神經胺酸酶抑制作用，以有效提升個體抵抗流感病毒之不同變異株感染的能力。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
無
圖1A顯示流感病毒之神經胺酸酶蛋白N1的完整四聚體結構的示意圖。其中#1表示N221/I223T殘基位、#2表示N270/P272T殘基位、#3表示N273/H275T殘基位、#4表示N329/K331T殘基位、#5表示T332N殘基位、#6表示C335N/P337T殘基位、#7表示N341/A343T殘基位具有額外添加的醣遮蔽(glycan-masking sites)。
圖1B顯示以西方墨點法偵測表達在被腺病毒感染之宿主細胞之H1N1流感病毒(A/Texas/5/2009)神經胺酸酶蛋白的結果。其中，NA表示神經胺酸酶蛋白。
圖2A顯示經免疫注射本發明之疫苗組成物的小鼠血清中針對流感病毒H1N1之抗神經胺酸酶蛋白IgG抗體的效價 (anti-N1 IgG titer)。在圖2A至圖2E中，小鼠經肌肉注射含有Ad-N1-WT、Ad-N1- N221/I223T、Ad-N1-N270/P272T、Ad-N1-N273/H275T、Ad-N1-N329/K331T、Ad-N1-T332N、Ad-N1-C335N/P337T或Ad-N1-N341/A343T的本發明之疫苗組成物。
圖2B顯示經肌肉注射H1N1流感病毒(A/Texas/5/2009)疫苗組成物的小鼠血清中針對H1N1流感病毒(A/California/07/2009)的神經胺酸酶抑制IC
50效價(NA-inhibition IC
50titer)。
圖2C顯示經肌肉注射H1N1流感病毒(A/Texas/5/2009)疫苗組成物的小鼠血清中針對H5N1流感病毒(A/Vietnam/1203/2004)的神經胺酸酶抑制IC
50效價(NA-inhibition IC
50titer)。
圖2D顯示經肌肉注射H1N1流感病毒(A/Texas/5/2009)疫苗組成物的小鼠血清中針對H3N2流感病毒 (A/Udorn/307/1972)的神經胺酸酶抑制IC
50效價 (NA-inhibition IC
50titer)。
圖2E顯示經肌肉注射H1N1流感病毒(A/Texas/5/2009)疫苗組成物的小鼠血清中針對H7N9流感病毒 (A/Shanghai/02/2013)的神經胺酸酶抑制IC
50效價 (NA-inhibition IC
50titer)。
圖3A顯示流感病毒神經胺酸酶蛋白N2的完整四聚體結構的示意圖。其中#1表示K93N殘基位、#2表示S245N/S247T殘基位、#3表示P267N/S269T殘基位、#4表示N329/R331T殘基位、#5表示Y336N/R338T殘基位、#6表示N346/G348T殘基位、#7表示E368N/S370T殘基位、#8表示D401N/R403T殘基位、#9表示D463N/N465T殘基位具有額外添加的醣遮蔽(glycan-masking sites)。
圖3B顯示以西方墨點法偵測表達在被腺病毒感染之宿主細胞之H3N2流感病毒H3N2 (A/Udorn/307/1972)神經胺酸酶蛋白的結果。其中，NA表示神經胺酸酶蛋白，其中#1表示K93N殘基位、#2表示S245N/S247T殘基位、#3表示P267N/S269T殘基位、#4表示N329/R331T殘基位、#5表示Y336N/R338T殘基位、#6表示N346/G348T殘基位、#7表示E368N/S370T殘基位、#8表示D401N/R403T殘基位、#9表示D463N/N465T殘基位具有額外添加的醣遮蔽(glycan-masking sites)。
圖4A顯示經免疫鼻噴H3N2流感病毒(A/Udorn/307/1972)疫苗組成物的小鼠血清中針對H3N2流感病毒神經胺酸酶IgG抗體的效價 (anti-N2 IgG titer)。在圖4B至4E中，小鼠經分別免疫鼻噴含有Ad-N2-K93N、Ad-N2-S245N/S247T、Ad-N2-P267N/S269T Ad-N2-N329/R331T、Ad-N2-Y336N/R338T、Ad-N2-N346/G348T、Ad-N2-E368N/S370T、Ad-N2-D401N/R403T、Ad-N2-D463N/N465T的本發明之疫苗組成物。
圖4B顯示經免疫鼻噴H3N2流感病毒(A/Udorn/307/1972)疫苗組成物的小鼠血清中針對H3N2流感病毒(A/Udorn/307/1972)的神經胺酸酶抑制IC
50效價 (NA-inhibition IC
50titer)。
圖4C顯示經免疫鼻噴H3N2流感病毒(A/Udorn/307/1972)疫苗組成物的小鼠血清中針對H7N9流感病毒(A/Shanghai/02/2013)的神經胺酸酶抑制IC
50效價 (NA-inhibition IC
50titer)。
圖4D顯示經免疫鼻噴H3N2流感病毒(A/Udorn/307/1972)疫苗組成物的小鼠血清中針對H1N1流感病毒(A/California/07/2009)的神經胺酸酶抑制IC
50效價(NA-inhibition IC
50titer)。
圖4E顯示經免疫鼻噴H3N2流感病毒(A/Udorn/307/1972)疫苗組成物的小鼠血清中針對H5N1流感病毒(A/Vietnam/1203/2004)的神經胺酸酶抑制IC
50效價(NA-inhibition IC
50titer)。
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Claims (14)
- 一種流感病毒神經胺酸酶突變體，具有遮蔽流感病毒的神經胺酸酶的一N-醣基化。
- 如請求項1所述的流感病毒神經胺酸酶突變體，其中該流感病毒神經胺酸酶突變體是在人類流感病毒神經胺酸酶的N1的一胺基酸殘基位具有一突變，其中該胺基酸殘基位是選自於下列所組成的群組：第221個胺基酸殘基位、第223個胺基酸殘基位、第270個胺基酸殘基位、第272個胺基酸殘基位、第273個胺基酸殘基位、第275個胺基酸殘基位、第329個胺基酸殘基位、第331個胺基酸殘基位、第332個胺基酸殘基位、第335個胺基酸殘基位、第337個胺基酸殘基位、第341個胺基酸殘基位，及第343個胺基酸殘基位。
- 如請求項1所述的流感病毒神經胺酸酶突變體，其中該流感病毒神經胺酸酶突變體是在人類流感病毒神經胺酸酶的N2的一胺基酸殘基位具有一突變，其中該胺基酸殘基位是選自於下列所組成的群組：第93個胺基酸殘基位、第245個胺基酸殘基位、第247個胺基酸殘基位、第267個胺基酸殘基位、第269個胺基酸殘基位、第331個胺基酸殘基位、第336個胺基酸殘基位、第338個胺基酸殘基位、第348個胺基酸殘基位、第368個胺基酸殘基位、第370個胺基酸殘基位、第401個胺基酸殘基位、第403個胺基酸殘基位、第463個胺基酸殘基位，及第465個胺基酸殘基位。
- 如請求項2或3所述的流感病毒神經胺酸酶突變體，其中該突變是將胺基酸殘基位取代為一天冬醯胺(asparagine, N)或一蘇胺酸(threonine, T)。
- 如請求項4所述的流感病毒神經胺酸酶突變體，其中在該人類流感病毒神經胺酸酶的N1的第221個胺基酸殘基位與第223個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第270個胺基酸殘基位與第272個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第273個胺基酸殘基位與第275個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第329個胺基酸殘基位與第331個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第332個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第335個胺基酸殘基位與第337個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代，或第341個胺基酸殘基位與第347個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代。
- 如請求項4所述的流感病毒神經胺酸酶突變體，其中在該人類流感病毒神經胺酸酶的N2的第93個胺基酸殘基位具有一天冬醯胺取代、第245個胺基酸殘基位與第247個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第267個胺基酸殘基位與第269個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第331個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第336個胺基酸殘基位與第338個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第348個胺基酸殘基位具有一蘇胺酸取代、第368個胺基酸殘基位與第370個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代、第401個胺基酸殘基位與第403個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代，或第463個胺基酸殘基位與第465個胺基酸殘基位分別具有一天冬醯胺與一蘇胺酸取代。
- 一種核酸分子，包含編碼如請求項5或6所述的流感病毒神經胺酸酶突變體的一核苷酸序列。
- 一種疫苗組成物，包含如請求項1至6中任一項所述的流感病毒神經胺酸酶突變體。
- 如請求項8所述的疫苗組成物，其中該流感病毒神經胺酸酶突變體是表達在一重組病毒上。
- 如請求項9所述的疫苗組成物，其中該重組病毒包含如請求項7所述的核酸分子。
- 如請求項9所述的疫苗組成物，其中該重組病毒是一重組腺病毒。
- 一種如請求項1至6中任一項所述的流感病毒神經胺酸酶突變體用於製備流感病毒疫苗組成物的用途。
- 如請求項12所述的用途，其中該流感病毒疫苗組成物在一個體中引發抗複數流感病毒變體的免疫反應。
- 如請求項12所述的用途，其中該流感病毒疫苗組成物引發高效價的抗原專一性抗體及/或神經胺酸酶抑制IC 50效價。
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