BR112013026150B1 - Composição imunogênica, peptídeo antigênico, método para detectar e/ou quantificar anticorpos e kit para detectar e/ou quantificar anticorpos - Google Patents

Composição imunogênica, peptídeo antigênico, método para detectar e/ou quantificar anticorpos e kit para detectar e/ou quantificar anticorpos Download PDF

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Abstract

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA COMPREENDENDO UM PEPTÍDEO ANTIGÊNICO DA FÓRMULA (I), PEPTÍDEO ANTIGÊNICO DA FÓRMULA (I), MÉTODO PARA DETECTAR E/OU QUANTIFICAR ANTICORPOS E KIT PARA DETECTAR E/OU QUANTIFICAR ANTICORPOS A presente invenção diz respeito a uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I) abaixo: Nt-S-X1-X2-X3-K-X4-Ct (I) [SEQ ID Nº 1], em que - Nt consiste de um peptídeo tendo de 0 a 50 aminoácidos em comprimento, - Ct consiste de um peptídeo tendo de 0 a 50 aminoácidos em comprimento, - cada um dentre X1 A X4 consiste de um resíduo de aminoácido, em que: - (i) X1 significa o aminoácido específico W ou (ii) X1 significa qualquer resíduo aminoácido exceto W, - (i) X2 significa o aminoácido específico S ou (ii) X2 significa qualquer resíduo de aminoácido exceto S, - (i) X3 significa o aminoácido específico N ou (ii) X3 significa qualquer resíduo de aminoácido exceto N, - (I) X4 significa o aminoácido específico S ou (ii) X4 significa qualquer resíduo de aminoácido exceto S, contanto que três dos quatro resíduos de aminoácido X1,X2, X3 e X4 significam o aminoácido específico definido em seu respectivo (i) acima, e - o resíduo de aminoácido remanescente entre X1 a X4 significa qualquer resíduo de aminoácido, exceto o resíduo de aminoácido específico definido em seu significado (i), para prevenir e/ou tratar uma infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito à prevenção e ao tratamento de uma infecção de indivíduos com um vírus HIV-1.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Cerca de 90% das infecções humanas por HIV são causadas por um vírus HIV-1. Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) é caracterizado por uma variabilidade genética impressionante causada por acúmulo de mutações, surgindo durante replicação viral e também causadas pelos eventos de recombinação. Falha de longo prazo dos métodos de quimioterapia de tratamento do HIV é notavelmente explicada pela alta atividade mutagênica das cepas virais de HIV-1. Mostrou-se anteriormente que variantes de resistência viral surgiram rapidamente em pacientes após cursos diferentes de terapia antirretroviral e mesmo após terapia com várias drogas (HAART). Esses vírus resistentes sofrem alterações específicas em suas conformações de proteína e estrutura. Normalmente tais mutações responsáveis por escape de HIV-1 dos tratamentos atuais são mantidas através da geração e acúmulo sucessivo de vírus, como um resultado da seleção mediante condições de tratamento.
Tratamento com medicamentos anti-HIV-1 não bloqueiam totalmente a replicação do vírus, o que permite uma seleção e acúmulo de mutações de resistência pré-existentes, assim como de mutações ocorridas recentemente, trazendo, assim, novas oportunidades para que o vírus se espalhe. Os medicamentos antirretrovirais existentes (NRTI, NNRTI, inibidores da protease, inibidores de fusão e misturas destes, tais como HAART) podem apenas retardar a replicação do HIV-1 por um período de tempo mais ou menos prolongado, até o surgimento e propagação de cepas virais resistentes. A ampla propagação das variantes resistentes ao HIV-1 faz surgir várias preocupações e requer a disponibilidade por ferramentas terapêuticas anti-HIV-1 adicionais. Várias estratégias terapêuticas anti-HIV diferentes daquelas que fazem uso de substâncias químicas antirretrovirais vem sendo consideradas, as quais incluem (i) o uso de anticorpos anti-HIV, (ii) vacinas à base de rompimento de partículas HIV, (iii) vacinas à base de peptídeos HIV e (iv) vacinas à base de vetor viral ou plasmídeo DNA, cada um tendo suas desvantagens específicas.
Visto que a pandemia do HIV continua a infectar milhares de pessoas a cada ano, aumenta a necessidade por uma vacina efetiva. O desenvolvimento de vacinas anti-HIV tem sido profundamente comprometido devido à dificuldade em desenvolver um produto imunogênico capaz de extrair anticorpos anti-HIV amplamente neutralizantes.
Indução de anticorpos amplamente neutralizantes (bNAb) contra primários isolados de vírus da imunodeficiência humana (HIV) permanecem sendo o alvo principal e ainda não atingindo para a pesquisa acerca da vacina contra a AIDS. Tentativas anteriores usando vacinas à base de envelope desenvolveram anticorpos que são eficazes somente contra isolados adaptados em laboratório. Nesses casos, a proteção tem sido relatada com bNAn de alto título direcionado à região hipervariável V3 de gp120. Contudo, atividades neutralizantes geradas são amplamente específicas e isoladas e são minimamente efetivas contra isolados mais primários de HIV-1. A falha das vacinas de subunidade gp120 em proteger contra a aquisição de HIV-1 em testes clínicos de Fase III destaca a dificuldade da tarefa.
Apesar disso, bNAb pode ser frequentemente encontrado em indivíduos infectados por HIV. Respostas geradas precocemente na infecção são normalmente restritas em especificidade, neutralizando os vírus transmitidos no hospedeiro, porém não aquele contemporâneo. Tais respostas se ampliam durante o curso da infecção em alguns sobreviventes de longo prazo que são capazes de controlar sua infecção na ausência do tratamento antiviral. No entanto, a natureza da resposta do anticorpo neutralizante cruzado e o mecanismo levando à sua gênese não são compreendidos.
Naturalmente, NAbs contra Env são gerados dentro de semanas após infecção, contudo essa resposta precoce só é eficiente contra um subtipo viral específico; todavia, bNAbs (Abs neutralizante reativo cruzado) pode se desenvolver durante o curso do HIV. Recentemente, vários estudos principais têm mostrado que aproximadamente 25% dos indivíduos infectados com HIV (infectados há pelo menos 1 ano) têm resposta ao bNAb, e 1% dos “Neutralizadores de Elite” com atividade bastante forte contra uma grande maioria de clados. O importante é que esses resultados demonstram a habilidade do sistema de imunidade de pessoas infectadas aos NAbs gerados in vivo contra HIV-1 durante o curso da doença. Eles também sugerem que as atividades de
Nab amplamente reativas parecem se desenvolver ao longo do tempo e são nutridas pela exposição ao antígeno crônico, na falta de conhecimento a respeito do seu título de bNAbs, os quais seriam protetores.
Replicação de vírus persistente em baixa propagação, leva a uma evolução contínua de Env a evadir NAbs. Tal evolução antigênica pode focar nova estratégia de vacina na região mais conservada da proteína Env e sugere que imunogênicos de vacina poderiam ser desenvolvidos para epítopos altamente conservados de chave mímica.
Um dos maiores obstáculos para o desenvolvimento de vacinas eficientes anti-HIV tem sido aquele em que o alvo de bNAbs é a proteína de envelope viral (Env), a qual é altamente variável, considerando que os elementos conservados parecem ser pobremente imunogênicos. Isso significa que restrições cinéticas e especiais impedem bNAbs de acessar locais potencialmente vulneráveis durante ligação de receptor e processos de fusão. Atualmente, pequena quantidade de NAbs tem sido descrita. Por exemplo, a primeira bNAb identificada foi b12, a qual obstrui o local de ligação CD4 no gp120 e impede a anexação de CD4. A subunidade gp41 é muito mais conservada do que são os rearranjos conformacionais envolvendo gp120, sendo comuns a todas as nódoas comuns. Atividades muito pequenas de bNAb são extraídas contra elementos estruturais conservados da gp41, os quais são abrigados, sendo difícil acessar ou transitar; aquelas bNAbs, incluindo 2F5 e 4E10, objetiva a região de ectodomínio de membrana proximal (MPER) de gp41. Contudo, imunização com esses epítopos chave não resultaram na geração de atividade bNAb. Essa dicotomia entre as características antigênicas e imunológicas ainda não é compreendida.
Ainda existe uma necessidade na técnica por ferramentas terapêuticas destinadas a prevenir ou tratar uma infecção causada por um vírus HIV-1.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito a uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I) abaixo: Nt-S-X1-X2-X3-K-X4-Ct (I) [Nt-SEQ ID N° 1-Ct], em que - Nt consiste de um peptídeo tendo de 0 a 50 aminoácidos em comprimento, - Ct consiste de um peptídeo tendo de 0 a 50 aminoácidos em comprimento, - cada um dentre X1 a X4 consiste de um resíduo de aminoácido, em que: - (i) X1 significa o aminoácido específico W ou (ii) X1 significa qualquer resíduo de aminoácido, exceto W, - (ii) X2 significa o aminoácido específico S ou (ii) X2 significa qualquer resíduo de aminoácido exceto S, - (i) X3 significa o aminoácido específico N ou (ii) X3 significa qualquer resíduo de aminoácido exceto N, - (i) X4 significa o aminoácido específico S ou (ii) X4 significa qualquer resíduo de aminoácido exceto S, contanto que - três dos quatro resíduos de aminoácido X1, X2, X3 e X4 significam o aminoácido específico definido em seu respectivo significado (i) acima, e - o resíduo de aminoácido remanescente entre X1 a X4 significa qualquer resíduo de aminoácido, exceto o resíduo de aminoácido específico definido em seu significado (i), contanto que o peptídeo da fórmula (I) não signifique o peptídeo da SEQ ID N° 18 divulgada no pedido PCT depositado em 22 de Junho de 2010 sob o n° PCT/US2010/001784 e publicado em 13 de Janeiro de 2011 sob o n° WO 2011/005289 em nome do Presidente e dos Colegas do Harvard College.
Esta invenção também diz respeito a uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I), conforme descrito acima, para uso como um medicamento.
A presente invenção também se volta para uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I), conforme descrito acima, para uso num método de prevenção e/ou tratamento de uma infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1.
Esta invenção pertence ao uso de uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I), conforme descrito acima, para fabricação de um medicamento para prevenção e/ou tratamento de uma infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1.
Em certas modalidades, o significado (ii) de um ou mais dentre X1, X2, X3 e X4 é selecionado, independentemente entre si, do grupo de resíduos de aminoácido consistindo de Cisteína (Cys ou C), Alanina (Ala ou A), Glicina (Gly ou G) e Valina (Val ou V), Prolina (Pro ou P) e mais preferencialmente Alanina.
Em certas modalidades, somente um dentre X1 a X4 significa um resíduo de aminoácido diferente de W (para X1), S (para X2), N (para X3) e S (para X4), respectivamente.
Em certas modalidades, o peptídeo antigênico da fórmula (I) é selecionado a partir dos grupos consistindo de: - PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12), - PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13), - PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), e - PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15), Essa invenção também pertence a uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I).
Em certas modalidades, o peptídeo antigênico da fórmula (I) é ligado de modo covalente a uma molécula carreadora.
Em certas modalidades da referida composição imunogênica, o peptídeo antigênico da fórmula (I), opcionalmente ligado a uma molécula carreadora, é combinado com um ou mais agentes imunoadjuvantes.
A presente invenção também diz respeito a um peptídeo da fórmula (I), conforme descrito na presente especificação.
A invenção também se ocupa com o uso de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) para fabricação de um medicamento para prevenção e/ou tratamento de um indivíduo infectado com um vírus HIV-1.
Esta invenção também diz respeito a anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) acima.
Essa invenção também se ocupa com os métodos de diagnóstico de HIV-1, assim como kits de diagnóstico de HIV-1, os quais fazem uso de um peptídeo da fórmula (I).
Esta invenção também diz respeito a métodos de prognóstico de HIV-1, assim como a kits de prognóstico de HIV-1, os quais fazem uso de um peptídeo da fórmula (I).
Também diz respeito a métodos para monitorar o status de uma infecção por HIV-1 que faz uso de um peptídeo da fórmula (I), especialmente em pacientes recebendo um tratamento médico anti-HIV-1, assim como kits para realizar tais métodos de monitoramento.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Alinhamento de sequência de aminoácido de vários peptídeos da fórmula (I). Tipo selvagem: sequência de aminoácido contida na proteína gp41 da cepa HIV-1 HXB2, a qual também pode ter o termo “3S”. S613A (M1) e K617A (M5): sequências de aminoácido tendo forte identidade de aminoácido com o “Tipo selvagem” acima. W614A, S615A, N616A e S618A: modalidades específicas de um peptídeo da fórmula (I).
Figura 2. Infectividade de vírus HIV-1 NL4.3 contendo substituição por Alanina no motivo 3S/gp41. Células MT-2 foram infectadas com 100 ng/mL de antígeno equivalente p24 do tipo selvagem (WT, barras abertas), ou 3S/gp41 mutante de alanina (barras pretas) de vírus NL4.3. (A) antígeno p24 foi quantificado no dia 6 após infecção. Os resultados, expressos em unidades relativas ao tipo selvagem, representam o ±SD principal a partir de três a sete preparações independentes de clone de plasmídeo, dependendo dos mutantes. (B) formação de sincício foi quantificada 4 dias após infecção por microscopia de contraste de fase padrão. Os resultados, expressos em unidades relativas ao tipo selvagem, representam o ±SD principal a partir de duas a quatro preparações separadas de clone de plasmídeo, dependendo dos mutantes. (C) Estudo cinético de produção de antígeno p24 na célula sobrenadante de células CD4+ T infectadas pelo tipo selvagem (WT, X) ou vírus 3S/gp41 NL4.3 de mutante de alanina incluindo S613A (■), W614A (Δ), S615A (O), N616A (O), K617A (•) e S618A (□). Esse experimento é representativo de 2 experimentos independentes gerenciados com preparações separadas de clone de plasmídeo nas células CD4+ T purificadas a partir de dois doadores saudáveis e independentes. (D) Infectividade de células Hela P4C5 por tipo selvagem (WT, barra aberta) ou vírus 3S/gp41 (barras pretas) NL4.3 de mutante de alanina. Células foram infectadas em triplicata com 4 ng/15,000 células de antígeno equivalente p24 por 48h e a atividade da β-galactosidase foi determinada nos extratos de célula. Os resultados, expressos em unidades relativas ao tipo selvagem, representam o ±SD principal a partir de três a quatro preparações independentes de clone de plasmídeo. Vírus NL4.3 mutados por alanina são referidos como: S613A, W614A, S615A, N616A, K617A e S618A.
Figura 3. Expressão de NKp44L em células CD4+ T e degranulação de célula NK mediada por mutantes de alanina 3S/gp41. (A) Células purificadas CD4+ T não estavam infectadas (linhas tracejadas), foram infectadas ao longo da noite (linhas pretas) com tipo selvagem (WT) ou vários vírus NL4.3 mutados por alanina. Células foram coradas com ligantes para o NCRs (proteínas de fusão NKp30-Ig, NKp44-Ig NKp46-Ig). Histogramas foram fechados nas células CD4+. Sobreposição mostrou expressão de ligantes de NCR em células infectadas com HIV comparada a células não infectadas. Os números correspondem à proporção de células CD4+ T expressando positivamente ligantes de NCR. (B) Expressão de NKp44L em células CD4+ T purificadas estavam não tratadas (UT) ou tratadas com peptídeos do tipo selvagem (WT) ou peptídeos sintéticos 3S/gp41 mutados por alanina do motivo 3S/gp41. Células foram ou coradas com anti-NKp44L mAb, ou controle de isotipo IgM (linhas pontilhadas). Histogramas foram fechados no subconjunto CD4+. Sobreposição mostrou expressão de NKp44L, quando comparada ao controle de isotipo. Números correspondem à proporção de células CD4+ T expressando NKp44L. (C) Atividade de degranulação foi acessada nas células NK ativadas por IL2 contra células CD4+ T autólogas, a uma proporção de E/T: 1/1, na presença de anti-CD107a mAb. Células CD4+ T purificadas não estavam infectadas (NI), ou foram infectadas ao longo da noite com vírus do tipo selvagem (WT) ou vírus 3S/gp41 NL4.3 mutados por alanina. Gráficos pontilhados são fechados em células CD3-CD56+ NK em função da expressão de NKp44 e CD107a. Número em cada painel corresponde à produção de células NK positivas. (D) Eficácia de degranulação de células NK contra células CD4+ T purificadas autólogas a uma proporção de E/T: 1/1, na presença de anti-CD107a mAb. Células CD4+ T estavam não tratadas (UT) ou tratadas com peptídeos do tipo selvagem (WT) ou peptídeos sintéticos mutados por alanina do motivo 3S/gp41. Células CD4+ T foram incubadas com células NK ativadas por IL2- autólogos. Histogramas foram fechados nas células CD3-CD56+ NK expressando NKp44. Sobreposição mostrou expressão de CD107a em células NK testadas na presença de células CD4+ T autólogas tratadas ou com tipo selvagem (WT) ou com peptídeos sintéticos 3S/gp41 mutados por alanina, quando comparadas com células não tratadas. Números correspondem à proporção de células NK expressando CD107a. Vírus NL4.3 mutados por alanina ou peptídeos 3S/gp41 são referidos como S613A, W614A, S615A, N616A, K617A e S618A.
Figura 4. Neutralização de infecção viral e inibição de NKp44L em células CD4+ T e degranulação de célula NK por murina Ig gerada a partir de mutantes específicos de alanina 3S/gp41. Células CD4+ T purificadas foram infectadas com vírus competentes NL4.3 (painel à esquerda) ou NDK (painel à direita) pré-incubados por 30 minutos com Ig purificado provendo a partir de camundongo imunizado com adjuvante sozinho (Ig-Adj,+), do tipo selvagem (WT, X) ou com vírus mutados por alanina 3S/gp41 NL4.3, incluindo S613A (■), W614A (Δ), S615A (O), N616A (O), K617A (•) e S618A (□). (A) Vírus competentes (200TCID50) foram incubados com várias concentrações variando de 0 e 20 μg/ml de Ig purificado por 30 minutos, seguido por adição de células CD4+ T purificadas ativadas por PHA. No dia 6 pós- infecção, antígeno p24 foi quantificado no sobrenadante de célula. (B) Efeito dependente do tempo. Vírus competentes (200TCID50) foram incubados com 10 μg/ml de Ig por 30 minutos, seguidos por adição de células CD4+ T purificadas ativadas por PHA. Nível da p24 foi testado no sobrenadante de célula a cada 2 dias a 10 dia pós-infecção. (C) Expressão de NKp44L em células CD4+ T foi determinada 17h pós- infecção. Histogramas foram fechados no subconjunto de célula CD4+. Sobreposição mostrou expressão de NKp44L, quando comparada ao controle de isotipo IgM. Números correspondem à proporção de células positivas. (D) Degranulação de células NK autólogas NK. Células CD4+ T foram incubadas com células NK autólogas a uma proporção de E/T: 1/1, na presença de anti-CD107a mAb. Gráfico pontilhado foi fechado em células CD3-CD56+ NK em função da expressão de NKp44 e CD107a. Número em cada painel corresponde à proporção de células positivas. Vírus mutados por alanina NL4.3 ou peptídeos 3S/gp41 são referidos como S613A, W614A, S615A, N616A, K617A e S618A.
Figura 5. Neutralização de infecção viral e inibição de NKp44L em células CD4+ e degranulação de célula NK por Ab anti-W614A imuno- precipitado purificado a partir de pacientes infectados por HIV. Células CD4+ T ativadas por PHA foram infectadas com vírus competentes NL4.3 (painel à esquerda) ou NDK (painel à direita) pré-incubados por 30 minutos com anti-3S-WT mAb (Anti-3S, O), anti-3S-WT-imuno-purificado Ab provendo a partir de um paciente infectado com 1 HIV (#117, □), ou anti-3S-W614A-imuno- purificado Ab provendo a partir de pacientes infectados com 5 HIV: #24 (•), #44 (■), #65 (A), #71 (▼) e #109 (♦). (A) Vírus competentes (200TCID50) foram incubados com várias concentrações variando entre 0 e 2 μg/ml Ab imuno-purificado por 30 minutos, seguidas por adição de células CD4+ T. No dia 6 pós-infecção, antígeno p24 foi quantificado no sobrenadante de célula. (B) Efeito dependente de tempo. Vírus competentes (200TCID50) foram incubados com 1 μg/ml de Ab imuno-purificado Ab por 30 minutos, seguidos por adição de células CD4+ T purificadas ativadas por PHA. Nível de p24 foi testado no sobrenadante de célula a cada 2 dias por 10 dias pós-infecção. (C) Expressão de NKp44L em células CD4+ T foi determinada 17h pós- infecção. Histogramas foram fechados no subconjunto de célula CD4+ T. Sobreposição mostrou expressão de NKp44L, quando comparada ao controle isotipo IgM. Números correspondem à proporção de células positivas. (D) Degranulação de células NK autólogas. Células CD4+ T foram incubadas com células NK autólogas a uma proporção de E/T: 1/1, na presença de anti-CD107a mAb. Gráfico pontilhado foi fechado nas células CD3-CD56+ NK em função da expressão de NKp44 e CD107a. Número em cada painel corresponde à proporção de células NK positivas. Vírus mutados por alanina NL4.3 ou peptídeos 3S/gp41 são referidos como S613A, W614A, S615A, N616A, K617A e S618A.
Figura 6. Expressão de NKp44L e degranulação de células NK autólogas, mediada por mutantes de alanina ativados por calor de 3S/gp41 em células CD4+ T. Células CD4+ T purificadas estavam não tratadas ou foram tratadas ao longo da noite com 100 ng de antígeno p24 equivalente por mL de vírus tipo selvagem inativado por calor (WT), vírus NL4.3 ou com os vários mutantes de alanina de vírus 3S/gp41. (A) Expressão de NKp44L em células CD4+ T foi determinada 17h pós- infecção. Histogramas foram fechados no subconjunto de célula CD4+. Sobreposição mostrou expressão de NKp44L, quando comparada ao controle de isotipo IgM. Números correspondem à proporção de células positivas. (B) Degranulação de células NK autólogas. Células CD4+ T foram incubadas com células NK autólogas a uma proporção de E/T: 1/1, na presença de anti-CD107a mAb. Gráficos pontilhados foram fechados em células CD3- CD56+ NK em função da expressão de NKp44 e CD107a. Número de cada painel corresponde à proporção de células NK positivas. Vírus mutados por alanina NL4.3 ou peptídeos 3S/gp41 são referidos como S613A, W614A, S615A, N616A, K617A e S618A.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção provê, predominantemente, composições de vacina ou imunogênicas anti-HIV-1, composições imunogênicas ou vacinas estas que compreendem peptídeos antigênicos específicos que permitem, notadamente, a indução de anticorpos anti-HIV-1 amplamente neutralizantes.
Idealmente, uma vacina contra HIV-1 eficiente interromperia completamente a infecção. Atualmente, pode ser realístico desenvolver uma vacina de segurança sub-ideal e eficiente que tanto reduz significativamente infecção como previne diminuição de células CD4+ T. O objetivo principal dessa estratégia é ligado à capacidade de gerar anticorpos (bNAb) amplamente neutralizantes tendo também a capacidade de atuar na diminuição de célula CD4+ T, o que parece ser intransponível no estado da técnica.
A presente invenção provê, portanto, novas substâncias e composições para prevenir e/ou tratar a infecção de um organismo mamífero, preferencialmente de um organismo humano, por um vírus HIV-1.
Descobriu-se, de acordo com a invenção, que uma família de peptídeos específicos, os quais compartilham uma forte identidade em sequência com um peptídeo derivado de gp41 conhecido, chamado “3S”, induz in vivo a produção de anti-HIV-1 bNAb.
Mostra-se no presente documento que esses peptídeos específicos fazem surgir uma atividade amplamente neutralizante e robusta contra vários vírus HIV-1 clinicamente isolados, em contraste com peptídeos conhecidos derivados de proteína gp41 HIV-1, incluindo peptídeo “3S” conhecido citado acima.
Muito importante, também se descobriu, de acordo com a invenção, que esses peptídeos específicos não promovem sensibilidade de células CD4+ T a lise por células NK, embora todas as funcionalidades das células NK, incluindo degranulação, permaneçam intactas.
Adicionalmente, os inventores mostraram que anticorpos direcionados contra esses peptídeos específicos bloqueiam a sensibilidade da célula CD4+ T à lise de célula NK, a qual é estimulada no curso de uma infecção com um vírus HIV-1.
A presente invenção diz respeito a uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I) abaixo: Nt-S-X1-X2-X3-K-X4-Ct (I) [Nt-SEQ ID N° 1-Ct], em que - Nt consiste de um peptídeo tendo de 0 à 100 aminoácidos em comprimento, - Ct consiste de um peptídeo tendo de 0 à 100 aminoácidos em comprimento, - cada um dentre X1 a X4 consiste de um resíduo de aminoácido, em que: - (i) X1 significa o aminoácido específico W ou (ii) X1 significa qualquer resíduo de aminoácido, exceto W, - (i) X2 significa o aminoácido específico S ou (ii) X2 significa qualquer resíduo de aminoácido, exceto S, - (i) X3 significa o aminoácido específico N ou (ii) X3 significa qualquer resíduo de aminoácido, exceto N, - (i) X4 significa o aminoácido específico S ou (ii) X4 significa qualquer resíduo de aminoácido, exceto S, contanto que - três dos quatro resíduos de aminoácido X1, X2, X3 e X4 signifiquem o aminoácido específico definido no seu respectivo significado (i) acima, e - resíduo remanescente de aminoácido entre X1 a X4 signifique qualquer resíduo de aminoácido, exceto o resíduo de aminoácido específico definido em seu significado (i), contanto que o peptídeo da fórmula (I) não signifique o peptídeo da SEQ ID N° 18 divulgada no pedido PCT publicado como WO 2011/005289. - peptídeo de SEQ ID N° 18 divulgado no pedido PCT publicado como WO 2011/005289 tem a seguinte sequência de aminoácido: “Ac- NHNHRIRTNPAIVK(Ac)TENSWSNKAKSICQQQ-NH2” (SEQ ID N° 16 do presente pedido de patente)
Um peptídeo Nt tendo de 0 à 100 resíduos de aminoácido em comprimento abrange peptídeos tendo 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100 resíduos de aminoácido em comprimento.
Um peptídeo Ct tendo de 0 à 100 resíduos de aminoácido em comprimento abrange peptídeos tendo 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100 resíduos de aminoácido em comprimento. Conforme já mencionado acima, um peptídeo da fórmula (I), quando usado numa composição imunogênica, preferencialmente em combinação com um ou mais agentes imuno-adjuvantes, induz à produção de anticorpos que bloqueiam a infecção de células CD4+ T com vírus HIV-1 e/ou bloqueia a dispersão do vírus HIV-1 para as células CD4+ T infectadas, conforme mostrado pela produção quase indetectável de p24 pelas células CD4+ T colocando em contato com o vírus HIV-1 como com anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I).
Além disso, em contraste a outros peptídeos derivados do HIV que vem sendo usados na técnica como antígenos HIV, incluindo o peptídeo “3S” (mostrado na figura 1), um peptídeo da fórmula (I) não libera expressão de NKp44L na superfície das células CD4+ T e, assim, não libera destruição de células CD4+ T por células NK.
Adicionalmente, anticorpos produzidos num indivíduo imunizado com um peptídeo da fórmula (I) são capazes de bloquear a lise mediada por NKp44L das células CD4+ T por células NK, prejudicando qualquer outra função das células NK, o que inclui degranulação. Portanto, a presente invenção provê uma ferramenta terapêutica altamente eficiente que pode ser usada para a profilaxia e tratamento de uma infecção com um vírus HIV-1.
Uma composição imunogênica que é usada de acordo com a invenção compreende um peptídeo antigênico da fórmula (I), o qual, quando a referida composição imunogênica é administrada a um indivíduo, eleva a produção de anticorpos direcionados contra o referido peptídeo da fórmula (I), os quais são dotados de propriedades neutralizantes no sentido de uma pluralidade de isolados clínicos de HIV-1, conforme mostrado nos exemplos no presente documento. Conforme ilustrado adicionalmente na presente especificação, um peptídeo antigênico da fórmula (I) pode ser processado como imunogênico ao se conjugar a uma molécula carreadora e/ou por combinação com um ou mais agentes imuno- adjuvantes.
Uma composição imunogênica compreendendo o polipeptídeo da fórmula (I) pode ser usado de modo profilático contra uma infecção por um vírus HIV-1 ao induzir anticorpos que reduzem drasticamente ou mesmo bloqueiam a infecção de células CD4 com o referido vírus HIV-1.
Uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo da fórmula (I) pode ser usada para fins de tratamento, num indivíduo infectado com HIV-1, ao induzir anticorpos que reduzem drasticamente ou mesmo bloqueiam a infecção de células CD4+ T por vírus HIV-1 que já se replicaram no indivíduo infectado.
Conforme mostrado nos exemplos aqui, anticorpos anti-HIV-1 que são obtidos após imunização de um mamífero com uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I) consiste em neutralizar anticorpos que podem possuir um IC50 de menos que 20 μg/ml, num ensaio de células CD4+ T-p24.
Normalmente, um ensaio de células CD4+ T-p24 compreende as etapas de: a) preparar uma mistura teste ao colocar em contato um vírus HIV-1 capaz de replicação com uma quantidade conhecida de anticorpos a ser testados, b) incubar células CD4+ T ativadas por PHA com a mistura teste obtida no final da etapa a), na presença de IL-2, e c) determinar a atividade p24 nas culturas de célula CD4+ T obtidas no final da etapa b), e d) determinar o valor IC50 dos anticorpos testados ao comparar a atividade p24 determinada na etapa c) para a quantidade conhecida de anticorpos adicionados na a) com a atividade p24 encontrada no mesmo teste, onde a etapa a) é realizada na ausência de anticorpos anti-HIV.
Geralmente, para realizar o ensaio de neutralização descrito acima, uma série de testes é realizada, onde quantidades crescentes conhecidas dos anticorpos testados são usadas na etapa a). Uma descrição completamente detalhada do ensaio de neutralização é dada nos exemplos no presente documento.
Os resultados obtidos pelos inventores mostram que uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I) pode ser usada com um alto grau de segurança para o indivíduo que precisa dela, uma vez que a referida composição imunogênica não causa efeitos colaterais e, notadamente, não afeta a funcionalidade de células CD4+ T, em contraste com peptídeos antigênicos anti-HIV conhecidos (por exemplo, o peptídeo “3S” mostrado na figura 1).
Adicionalmente, uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I) é uma ferramenta terapêutica altamente poderosa anti-HIV, devido às suas atividades pleiotrópicas contra uma infecção HIV-1, incluindo (i) a geração de anticorpos dotados de uma atividade amplamente neutralizante contra um número de isolados clínicos HIV-1 e (ii) o bloqueio da lise de células de CD4+ T por células NK.
Além disso, uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I) é dotada de ação de alta seletividade, uma vez que, ilustrativamente, impede exclusivamente a atividade anti-CD4 das células NK, afetando simultaneamente uma importante função de resistência imune antimicrobiana das células NK, tal como degranulação.
Portanto, uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo antigênico da fórmula (I) (i) tem uma atividade anti-HIV-1 ao induzir anticorpos anti-HIV-1 amplamente neutralizantes e (ii) protege a funcionalidade do sistema imunológico de um indivíduo infectado com HIV-1 ao (a) proteger as células CD4+ T de destruição e (b) garantir que funções antimicrobianas não-específicas do sistema imunológico permaneçam plenamente funcionais.
Modalidades ilustrativas dos peptídeos da fórmula (I) são divulgadas na figura 1, as quais incluem (i) “W614A” ou “M2” (SEQ ID N° 12 aqui), (ii) “S615A” ou “M3” (SEQ ID N° 13 aqui), (iii) “N616A” ou “M4” (SEQ ID N° 14 aqui) e (iv) “S618A” ou “M6” (SEQ ID N° 15 aqui).
Importante notar que, conforme mostrado nos exemplos no presente documento, outros peptídeos específicos tendo uma forte identidade de aminoácido com os peptídeos da fórmula (I), como aqueles chamados S613A (ou “M1”) e K617A (ou “M5”), representados na figura 1 não são dotados de qualquer uma das propriedades anti-HIV dos peptídeos da fórmula (I). Ilustrativamente, os peptídeos S613A e K617A (i) não induz anticorpos neutralizantes anti-HIV, (ii) libera expressão de NKp44L por células CD4 e, assim, também células CD4+ T sensíveis às lises de células NK (iii) não induzem à produção de anticorpos capazes de reduzir ou bloquear as células CD4+ T sensíveis à lise por células NK.
De forma altamente surpreendente, os inventores mostraram que os peptídeos S613A e K617A discutidos acima induzem anticorpos que reconhecem bem as sequências do tipo selvagem expressas por vírus HIV-1, embora esses peptídeos sejam incapazes de induzir anticorpos de neutralização contra vírus HIV-1.
Também de forma altamente surpreendente, isso mostrou nos exemplos no presente documento que os peptídeos da fórmula (I) induzem anticorpos que não reagem com sequências do tipo selvagem expressas por vírus HIV-1, conforme mostrado na tabela 4. Esses resultados surpreendentes sugerem que peptídeos da fórmula (I) são estruturalmente distintos das sequências correspondentes do tipo selvagem HIV-1, embora eles induzam anticorpos anti-HIV-1 amplamente neutralizantes. Esses resultados estão claramente em contraste com aquilo que uma pessoa versada na técnica esperaria ao procurar por compostos antigênicos para induzir uma resposta imunológica eficiente contra uma infecção por vírus HIV-1.
Por outro lado, peptídeos tendo sequências próximas a um peptídeo da fórmula (I), como os peptídeos citados acima S613A e K617A, parecem estar relacionados estruturalmente próximos às sequências HIV-1 do tipo selvagem e são capazes de induzir anticorpos reconhecendo aquelas sequências do tipo selvagem, embora esses anticorpos não possuam qualquer propriedade anti-HIV- 1.
Os resultados reportados aqui mostram que nem (i) a segurança de um peptídeo da fórmula (I) nem (ii) as várias propriedades anti-HIV dos anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) podem ser antecipadas por uma pessoa versada na técnica.
Além disso, espera-se que um peptídeo da fórmula (I) possua estrutura espacial linear.
Os inventores também mostraram que anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) podem ser encontrados num número pequeno de indivíduos infectados com um vírus HIV-1. Uma forte correlação foi encontrada entre (i) a presença de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) nesses indivíduos infectados com HIV-1 e (ii) uma baixa carga vira de HIV-1 assim como um alto número células CD4+ T. Esses resultados indicam claramente a alta eficiência in vivo de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) para prevenir e/ou tratar a infecção de um indivíduo por um vírus HIV-1.
Os exemplos no presente documento também ilustram que vírus HIV-1 mutados codificando uma proteína gp41 mutada transportando uma das mutações W614A e S618A, as quais estão presentes nas modalidades de peptídeos da fórmula (I), têm uma habilidade altamente reduzida para infectar uma linha de célula linfoblastóide humana e não libera expressão de NKp44L por células CD4+ T. Esses resultados sugerem que a incapacidade de um peptídeo da fórmula (I) em induzir expressão de NKp44L por células CD4+ T também é encontrada em todos os vírus HIV-1 expressando proteínas gp41 de variante específica.
Conforme usado aqui, prevenir ou tratar uma infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1 abrange (i) prevenir ou tratar uma doença associada a uma infecção do referido indivíduo com um vírus HIV-1, incluindo AIDS e (ii) previnir progressão de doença por HIV-1.
Conforme usado no presente documento, o termo "infecção por HIV" compreende, de modo geral, infecção de um animal hospedeiro, particularmente um hospedeiro humano, pelo tipo 1 de vírus da imunodeficiência humana (HIV-1). "HIV-1" pode ser usado no presente documento para se referir a quaisquer cepas, formas, subtipos, clados e variações na família HIV-1. Assim, tratar uma infecção por HIV-1 englobará o tratamento de uma pessoa que é uma portadora de qualquer uma das famílias de retrovírus do HIV-1 ou uma pessoa que é diagnosticada com AIDS ativa, assim como o tratamento ou profilaxia das condições relacionadas com a AIDS em tais pessoas. Um carreador de HIV-1 pode ser identificado por meio de quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma pessoa pode ser identificada como um carreador de HIV-1 com base no fato de que a pessoa é positiva quanto ao anticorpo anti-HIV-1 ou é HIV- 1-positiva, ou têm sintomas da AIDS. Isto é, "tratar infecção por HIV-1" deve ser entendido como tratar um paciente que está em qualquer um dos vários estágios da progressão da infecção por HIV-1, os quais incluem, por exemplo, síndrome de infecção primária aguda (a qual pode ser assintomática ou associada a uma debilitação do tipo “influenza”, tais como febres, indisposição, diarreia e sintomas neurológicos, tal como dor de cabeça), infecção assintomática (a qual é o longo período latente com um declínio gradual no número de células CD4+ T circulantes), e AIDS (a qual é definida por doenças mais sérias definidas por AIDS e/ou um declínio na contagem de células CD4 circulante abaixo de um nível que é compatível com função imune efetiva). Adicionalmente, "tratar ou prevenir infecção por HIV-1" também englobará tratar infecção suspeita de ser por HIV-1 após suposta exposição anterior ao HIV-1, por exemplo, por meio do contato com sangue contaminado com HIV-1, transfusão de sangue, troca de fluidos corporais, sexo "não seguro" com uma pessoa infectada, picada acidental com agulha ao se fazer uma tatuagem ou acupuntura com instrumentos contaminados, ou transmissão do vírus a partir de uma mãe ao bebê durante gravidez, passada durante ou logo após a concepção.
O termo “tratar infecção por HIV-1” também deveria ser entendido, no contexto de terapias anti-retrovirais, que os pacientes ou respondem totalmente ou respondem parcialmente a tais terapias em termos de carga viral e/ou contagens de célula CD4 T.
O termo "prevenir infecção por HIV-1" pode compreender tratar uma pessoa que está livre de infecção por HIV-1, mas em que se acredita que a pessoa está sob risco de infecção por HIV-1, mais cedo ou mais tarde.
O termo "tratar AIDS" significa tratar um paciente que exibe doenças mais sérias que definem a AIDS e/ou um declínio na contagem de célula CD4+ T circulante abaixo de um nível que é compatível com função imune efetiva. O termo "tratar AIDS" também engloba tratar condições relacionadas à AIDS, as quais significam desordens e doenças incidentais ou associadas à AIDS ou à infecção por HIV-1, tal como complexo relacionado à AIDS (ARC), linfadenopatia generalizada progressiva (PGL), condições positivas ao anticorpo anti-HIV e condições positivas ao HIV, condições neurológicas relacionadas à AIDS (tais como demência ou paraparesia tropical), sarcoma Kaposi's, púrpura trombocitopênica e infecções oportunas associadas, tais como pneumonia Pneumocystis carinii, tuberculose micobacteriana, candidíase esofagiana, toxoplasmose do cérebro, retinite CMV, encefalopatia relacionada ao HIV, síndrome de perda relacionada ao HIV-1 etc.
Portanto, o termo "prevenir AIDS", conforme usado no presente documento, significa prevenir, num paciente que tem infecção por HIV-1 ou se supõe que tenha infecção por HIV-1 ou que esteja sob risco de infecção por HIV-1 a partir do desenvolvimento da AIDS (o que é caracterizado por doenças mais sérias definidas por AIDS e/ou um declínio na contagem de célula CD4+ T circulantes abaixo de um nível que é compatível com função imune efetiva) e/ou condições relacionadas à AIDS.
Assim, o termo “prevenir progressão de HIV-1”, conforme usado no presente documento, significa prevenir, num paciente que tem uma infecção por HIV-1, a diminuição de sua contagem de célula CD4+ T e/ou prevenir o aumento de sua carga viral, os dois marcadores ligados à complicação da doença e a um aumento da severidade da doença. Conforme usado no presente documento, resíduos de aminoácido englobam alanina (também chamada de “A” ou “Ala”), arginina (também chamada (“R” ou “Arg”), asparagina (também chamada “N” ou “Asn”), ácido aspártico (também chamado “D” ou “Asp”), cisteína (também chamada “C” ou “Cys”), glutamina (também chamada “Q” ou Gln”), ácido glutâmico (também chamado (“E” ou “Glu), glicina (também chamada “G” ou “Gly”), histidina (também chamada “H” ou “His”), isoleucina (também chamada “I” ou “Ile”), leucina (também chamada “L” ou “Leu”), lisina (também chamada “K” ou “Lys”), metionina (também chamada “M” ou “Met”), fenilalanina (também chamada (“F” ou “Phe”), prolina (também chamada “P” ou “Pro”), serina (também chamada “S” ou “Ser”), treonina (também chamada “T” ou “Thr”), triptofano (também chamada “W” ou “Trp”), tirosina (também chamada “Y” ou “Tyr”) e valina (também chamada “V” ou “Val”).
Todos os aminoácidos nos peptídeos da invenção podem estar em ambas as formas, forma D ou forma L, embora a forma L ocorrendo naturalmente seja preferencial.
Portanto, num peptídeo da fórmula (I) acima, quando o resíduo de aminoácido X1 significa (ii) qualquer resíduo de aminoácido, exceto W, então o resíduo de aminoácido X1 pode significar qualquer um dos resíduos de aminoácido A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, S, Y ou V. A mesma razão é usada para os significados de quaisquer um dentre resíduos de aminoácido X1, X2, X3 e X4 do peptídeo antigênico da fórmula (I). Sem desejar estar ligado a qualquer teoria particular, os inventores acreditam que um peptídeo da fórmula (I) é espacialmente linear quando suspenso numa solução salina fisiologicamente compatível (por exemplo, uma solução de 0.15 M de NaCl).
Assim, em algumas modalidades de um peptídeo da fórmula (I), significado (ii) de cada um dos resíduos de aminoácido X1, X2, X3 e X4 consiste de um resíduo de aminoácido que não gera uma alteração de conformação espacial, quando comparado com o resíduo de aminoácido de significado (i) de X1, X2, X3 e X4, respectivamente.
Em algumas modalidades de um peptídeo da fórmula (I), significado (ii) de cada um dos resíduos de aminoácido X1, X2, X3 e X4 consiste de um tamanho pequeno, não carregado, de resíduo de aminoácido.
Em algumas modalidades de um peptídeo da fórmula (I), significado (ii) de cada um dos resíduos de aminoácido X1, X2, X3 e X4 é selecionado a partir do grupo consistindo de alanina (Ala ou A), cisteína (Cys ou C), glicina (Gly ou G) e valina (Val ou V).
Em algumas modalidades de um peptídeo da fórmula (I), significado (ii) de cada um dos resíduos de aminoácido X1, X2, X3 e X4 é selecionado a partir do grupo consistindo de alanina (Ala ou A), cisteína (Cys ou C), glicina (Gly ou G), valina (Val ou V) e prolina (Pro ou P).
Em algumas modalidades preferenciais de um peptídeo da fórmula (I), significado (ii) de cada um dos resíduos de aminoácido X1, X2, X3 e X4 consiste de um resíduo de aminoácido não carregado e de tamanho reduzido, tendo uma cadeia lateral não polar. Em algumas modalidades preferenciais de um peptídeo da fórmula (I), significado (ii), cada um dos resíduos de aminoácidos X1, X2, X3 e X4 é composto de um tamanho pequeno resíduo sem carga, aminoácido com uma cadeia lateral não polar. Algumas pequenas dimensões, não carregadas, os resíduos de aminoácidos preferidos são seleccionados de entre o grupo constituído por glicina (Gly ou G), alanina (Ala ou A), valina (Val ou V), leucina (Leu ou L), isoleucina (Ile ou I), metionina (Met ou M), fenilalanina (Phe ou F), prolina (Pro ou P) e triptofano (Trp ou W). Mais preferencialmente, o tamanho pequeno, não carregadas, resíduos de aminoácidos possuindo uma cadeia lateral não polar são seleccionados a partir do grupo constituído por glicina (Gly ou G), alanina (Ala ou A), valina (Val ou V), leucina (Leu ou L), isoleucina (Ile ou I), prolina (Pro ou P) e metionina (Met ou M). Em outras modalidades preferenciais, o tamanho pequeno, não carregadas, resíduos de aminoácidos possuindo uma cadeia lateral não polar é seleccionado de entre o grupo constituído por glicina (Gly ou G), alanina (Ala ou A), valina (Val ou V), leucina (Leu ou L), isoleucina (Ile ou I) e metionina (Met ou M).
Em algumas dessas modalidades preferenciais, o significado (ii) de cada um dos resíduos de aminoácidos X1, X2, X3 e X4 é selecionado dentre o grupo constituído por alanina (Ala ou A), glicina (Gly ou G) e valina (Val ou V).
Em algumas modalidades preferenciais de um peptídeo de fórmula (I), ou seja (ii) a cada um dos resíduos de aminoácidos X1, X2, X3 e X4 é constituído por um resíduo de alanina ( Ala ou A).
Em algumas modalidades de um peptídeo de fórmula (I), cada um dos quatro resíduos de aminoácidos X1, X2, X3 e X4 denotar o seu significado (ii).
Em algumas modalidades de um peptídeo de fórmula (I), três resíduos de aminoácidos entre X1, X2, X3 e X4 denotam, independentemente um dos outros dois, o seu significado (ii), e o quarto resíduo de aminoácido entre X1, X2, X3 e X4 indica o seu significado (i).
Em algumas modalidades de um peptídeo de fórmula (I), dois resíduos de aminoácidos entre X1, X2, X3 e X4 denotam, independentemente um do outro, o significado (ii), e os outros dois resíduos de aminoácidos entre X1, X2, X3 e X4 denotam, independentemente um outro significado (i).
Em algumas modalidades preferenciais de um peptídeo de fórmula (I), apenas um resíduo de aminoácido entre X1, X2, X3 e X4 denota significado (ii), e cada um dos outros resíduos de aminoácidos entre X1, X2, X3 e X4 indica o seu significado (i).
Assim, em algumas modalidades preferenciais de um peptídeo de fórmula (I) acima, - X1 denota significado (ii) acima e cada um dos X2, X3 e X4 indica o respectivo significado (i) acima, ou - X2 denota significado (ii) acima, e cada um de X1, X3 e X4 indica o respectivo significado (i) acima, ou - X3 denota significado (ii) acima, e cada um de X1, X2 e X4 indica o respectivo significado (i) acima, ou - X4 denota significado (ii) acima, e cada um de X1, X2 e X3 indica o respectivo significado (i) acima.
As modalidades acima são os mais preferidos, uma vez que se acredita que uma única alteração de aminoácido (isto é, um único ácido aminado resíduo denotando significado (ii)) entre X1, X2, X3 e X4 é minimizar o risco de uma alteração de conformação espacial, em comparação com um peptídeo, em que todos os X1, X2, X3 e X4 resíduos denotar respectivo significado (i), e, assim, pode aumentar as chances de induzir boas propriedades anti-HIV, isto é, induzem a produção de anticorpos neutralizantes anti-HIV.
Noutras modalidades adicionais de um peptídeo antigênico da fórmula (I), o referido peptídeo antigênico tem um comprimento de aminoácido de não mais que 200 resíduos de aminoácido. Essas modalidades compreendem peptídeos da fórmula (I) tendo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106,107, 108, 109, 110,111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157,158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 e 200 resíduos de aminoácido em comprimento. Em algumas dessas modalidades preferenciais, um peptídeo da fórmula (I) tem de 10 a 26 resíduos de aminoácido em comprimento, os quais incluem de 15 a 20 resíduos de aminoácido em comprimento.
Um peptídeo de fórmula (I) como aqui descritos podem ser produzidos por uma tecnologia de clonagem conhecido ou por síntese química.
Por exemplo, o ADN que codifica para um peptídeo de fórmula (I) é preparado por utilização de uma tecnologia de clonagem e inserida num vetor replicável autonomamente para preparar um ADN recombinante. O DNA recombinante é introduzido num hospedeiro apropriado, tais como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyces, leveduras, fungos filamentosos, uma célula de planta, uma célula de inseto e células de um animal, para obter um transformante. A partir do produto de cultura do transformante, um peptídeo que contém um peptídeo de fórmula (I) podem ser obtidos. Alternativamente, o ADN que codifica para um peptídeo de fórmula (I) é preparada e submetida a um sistema de síntese de proteína acelular usando gérmen de trigo e um extracto celular a partir de Escherichia coli, para sintetizar o peptídeo da invenção. Em algumas modalidades em que o peptídeo de fórmula (I) está ligado a uma proteína carreadora, em seguida, um produto imunogênico constituído por uma proteína de fusão contendo tanto um peptídeo de fórmula (I) e a proteína carreadora desejada pode ser sintetizado por uma técnica de DNA recombinante.
Além disso, utilizando-se um método de síntese química habitual para um peptídeo de fórmula (I), tal como um "método em fase sólida" ou "um método de fase líquida", os aminoácidos são sucessivamente ligados e alargados por desidratação/condensação.
Além disso, quando um peptídeo de fórmula (I) está ligado a um peptídeo ou polipeptídeo desejado, por exemplo, uma molécula de proteína carreadora, um produto imunogênico compreendendo o peptídeo antigênico da fórmula (I) pode ser sintetizado.
Um peptídeo da fórmula (I) compreendem os seguintes peptídeos antigênicos: - Nt-S-X-S-N-K-S- Ct (Ia) - (Nt-SEQ ID N°2-Ct), - Nt-S-W-X-N-K-S- Ct (Ib) - (Nt-SEQ ID N° 3-Ct), - Nt-S-W-S-X-K-S- Ct (Ic) - (Nt-SEQ ID N° 4-Ct), e - Nt-S-W-S-N-K-X- Ct (Id) - (Nt-SEQ ID N° 5-Ct), no presente documento: - Nt e Ct têm o mesmo significado que o do peptídeo da fórmula (I) definida acima, e - X é qualquer resíduo de aminoácido exceto: W para (Ia), S para (Ib), N para (Ic) e S para (Id).
Em certas modalidades de um peptídeo da fórmula (I), o referido “qualquer resíduo de aminoácido” é um resíduo de alanina (também chamado de “A”). Nessas modalidades, o resíduo de aminoácido “X” de cada um dos peptídeos da fórmula (Ia) a (Id) significa “A”.
Em modalidades preferenciais, o peptídeo da fórmula (I) é selecionado a partir do grupo consistindo de: - Nt-SASNKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 6-Ct), - Nt-SWANKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 7-Ct), - Nt-SWSAKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 8-Ct), e - Nt-SWSNKA-Ct (Nt-SEQ ID N° 9-Ct).
Em certas modalidades de um peptídeo antigênico da fórmula (I), Nt (para região de “terminal N”) consiste de um peptídeo tendo de 1 a 10 resíduos de aminoácido em comprimento, os quais incluem de 1 a 5 resíduos de aminoácido em comprimento. Assim, de acordo com estas modalidades, NT é um peptídeo possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, Nt tem 5 ou 6 resíduos de aminoácidos de comprimento.
Em certas modalidades de um peptídeo de fórmula (I), Nt compreende ou, alternativamente, consiste de uma sequência de aminoácidos NH2 - PWNA - COOH [ SEQ ID N ° 10].
Em certas modalidades de um peptídeo antigênico da fórmula (I), CT (para a região de terminal C") consiste de um peptídeo contendo de 1 a 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, que inclui entre 1 e 5 resíduos de aminoácidos de comprimento. Assim, de acordo com estas modalidades, Ct é um peptídeo com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, Ct tem 5 ou 6 resíduos de aminoácidos de comprimento.
Em certas modalidades de um peptídeo de fórmula (I), Ct compreende, ou, alternativamente, consiste de uma sequência de aminoácidos NH2 - LDDIW - COOH [ SEQ ID N ° 11].
Cada um dos peptídeos Nt e Ct estão diretamente ligados por uma ligação covalente à extremidade correspondente do peptídeo S- X1 -X2 -X3 -X4 -K, de preferência por uma ligação de peptídeo convencional.
Em uma composição imunogênica de acordo com a invenção, um dos peptídeos NT ou Ct, ou de ambos, pode compreender ou consistir de um polímero de um monómero único aminoácido. Ilustrativamente, o referido polímero de aminoácidos pode ser constituída por um poli -alanina, um poli -glutamina, ou um polímero de poli-lisina.
O peptídeo de terminal C e/ou N da fórmula (I) pode desviar-se das sequências naturais expressamente aqui especificados, por modificação do grupo de terminal - NH2 e / ou o grupo - COOH e/ou por modificação de um grupo NH2 e/ou um grupo COOH, de uma cadeia lateral de um resíduo de aminoácido nele contido. Estes grupos podem, por exemplo, ser acilados, acetilados, amidados ou modificados para proporcionar um local de ligação para uma molécula carreadora.
Em certas modalidades, o peptídeo antigênico é selecionado a partir do grupo consistindo de: - PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12), - PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13), - PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), e - PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15).
Em certas modalidades de uma composição imunogênica de acordo com a invenção, o peptídeo antigênico da fórmula (I) é ligado covalentemente a uma molécula carreadora.
Os tipos de moléculas carreadoras utilizados para a geração de um produto imunogénico compreendendo um polipeptídeo de fórmula (I), ligado a uma molécula carreadora são bem do conhecimento geral de um perito na arte. A função da molécula carreadora é fornecer uma ajuda de citoquinas (ou de ajuda de células T), a fim de aumentar a resposta imunitária contra o HIV-1.
A molécula carreadora à qual o peptídeo está opcionalmente ligado pode ser selecionado a partir de uma variedade de carreadores conhecidos. Exemplos de moléculas carreadoras, para fins de vacina englobam proteínas tais como a albumina de soro ácidos e hemocianina de lapa (KLH) e gordurosos humanos ou bovinos. Outras modalidades de moléculas carreadoras às quais um peptídeo antigênico da fórmula (I) podem ser ligados de forma covalente incluem toxinas ou toxóides bacterianos, tais como difteria, cólera, E. coli lábil ao calor ou do tétano, a proteína de membrana externa de N. meninigitidis (pedido de patente europeu n° EP0372501), peptídeos sintéticos (pedidos de patente europeu n° EP0378881 e n° EP0427347), proteínas de choque térmico (PCT n° WO93/17712), proteínas coqueluche (PCT n° WO98/58668), proteína D de H. influenzae (PCT n ° WO00/56360) e toxina A ou B de C. difficile (pedido de patente internacional WO00/61761).
Qualquer reação de conjugação adequada pode ser usada, com qualquer ligante adequado, quando necessário. Exemplos aqui ilustram modalidades de uma composição em que os peptídeos imunogênicos de fórmula (I) estão covalentemente ligados a uma molécula carreadora de KLH.
A presente invenção também se refere a um peptídeo antigênico da fórmula (I) tal como aqui descrito, opcionalmente ligado de forma covalente a uma molécula carreadora, para utilização como um medicamento, nomeadamente para o uso como um ingrediente ativo de um medicamento imunogênico.
A presente invenção também trata com um peptídeo antigênico da fórmula (I) tal como aqui descrito, opcionalmente ligado de forma covalente a uma molécula carreadora, para utilização num método para a prevenção e/ou tratamento de uma infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1.
A presente invenção refere-se também à utilização de um polipeptídeo antigênico da fórmula (I), opcionalmente ligado de forma covalente a uma molécula carreadora, para a fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de um indivíduo infectado com VIH-1, ou seja, para prevenir e/ou o tratamento de uma infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1.
A presente invenção também pertence ao uso de um polipeptídeo antigênico da fórmula (I), opcionalmente ligado de modo covalente a uma molécula carreadora, para fabricação de uma droga para prevenir e/ou tratar um indivíduo infectado com HIV-1, isto é, para prevenir e/ou tratar uma infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1.
A presente invenção também diz respeito a um método para prevenir e/ou tratar um indivíduo infectado com um vírus HIV-1, isto é, para prevenir e/ou tratar uma infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1, compreendendo uma etapa de administração de uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo antigênico da fórmula (I), preferencialmente ligado a uma molécula carreadora, ao referido indivíduo.
Em certas modalidades, uma composição imunogênica usada de acordo com a invenção compreende um peptídeo antigênico da fórmula (I) numa quantidade que é adaptada para administração de cerca de 10 ng a 1 mg de um peptídeo da fórmula (I) a um indivíduo com necessidade disso, para profilaxia de fins terapêuticos.
Uma quantidade de um peptídeo antigênico da fórmula (I) a partir de 10 ng a 10 mg engloba uma quantidade de peptídeo da fórmula (I) de cerca de 20 ng, 30 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 300 ng, 350 ng, 400 ng, 450 ng, 500 ng, 550 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg, 5 μg, 6 μg, 7 μg, 8 μg, 9 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μG, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 90 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 130 μg, 140 μg, 150 μg, 160 μg, 170 μg, 180 μg, 190 μg, 200 μg, 250 μg, 300 μg, 350 μg, 400 μg, 450 μg, 500 μg, 550 μg, 600 μg, 650 μg, 700 μg, 750 μg, 800 μg, 850 μg, 900 μg, 950 μg e 1 mg.
A quantidade de um peptídeo da fórmula (I) selecionado a partir do grupo de peptídeos de SEQ ID N° 12, 13, 14 ou 15 pode ser notadamente de cerca de 200 μg, 500 μg ou 1 mg.
A pessoa versada na técnica pode adaptar uma quantidade de um peptídeo da fórmula (I) facilmente ao realizar ensaios de rotina e determinar a média de quantidade de peptídeo, o qual, quando administrado in vivo, induz à resposta de anticorpo que bloqueia a infecção de células CD4+ T com um vírus HIV-1 e/ou bloqueia o espalhamento de um vírus HIV-1 para células CD4+ T não infectadas, usando ensaios conhecidos, incluindo um ou mais dos ensaios divulgados nos exemplos no presente documento.
Notadamente, uma quantidade de peptídeo da fórmula (I) pode variar dependendo de seu comprimento de aminoácido e, assim, dependendo de sua massa molecular, sendo esta levada em conta o fato de que a proporção do número de sequências “S-X1-X2-X3-K-X4” por peso de um peptídeo da fórmula (I) varia com o comprimento dos peptídeos Ct e Nt contidos no referido peptídeo da fórmula (I), e, assim, varia com a massa molecular do referido peptídeo.
Portanto, nas modalidades preferenciais em que o peptídeo antigênico da fórmula (I) é ligado a uma molécula carreadora e em que o paciente é administrado com um composto imunogênico compreendendo ou consistindo do referido peptídeo da fórmula (I) ligada à referida molécula carreadora, a quantidade de peptídeo imunogênico a ser administrada pode variar tanto com (i) a massa molecular do peptídeo da fórmula (I) e (ii) a massa molecular da molécula carreadora que é usada.
Uma quantidade de um composto imunogênico a ser administrado a um indivíduo é facilmente determinada ou adaptada por uma pessoa versada na técnica, a qual é primeiramente guiada pela faixa de quantidade efetiva de um peptídeo da fórmula (I), a qual inclui a faixa de quantidade efetiva de um peptídeo da fórmula (I) selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID N° 12-15), e então pela massa molecular do composto imunogênico que ele pretende administrar.
Em algumas modalidades, a quantidade de peptídeo imunogênico a ser administrado pode ser de cerca de 0,1 μg, 0,5 μg, 1 μg, 5 μg 10 μg ou 20 μg do referido composto imunogênico.
A quantidade de um peptídeo da fórmula (I) pode ser de mais do que 10,000 mg de peptídeo da fórmula (I).
A quantidade de um peptídeo da fórmula (I) especificada acima também se aplica quando o peptídeo da fórmula (I) é conjugado a uma molécula carreadora, numa composição imunogênica de acordo com a invenção. Ilustrativamente, quando usada em indivíduos humanos, uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo da fórmula (I) conjugado à molécula carreadora KLH pode conter de 0,1 μg a 50 μg do produto imunogênico peptídeo KLH do conjugado da fórmula (I).
Em certas modalidades, uma composição imunogênica é administrado pelo menos duas vezes a um individuo com essa necessidade. Nestas modalidades, a segunda etapa de administração de uma composição imunogênica de acordo com a invenção é realizada num período de tempo de 2 semanas a 6 meses após a primeira etapa de administração.
Em certas modalidades, uma composição imunogênica é administrada pelo menos três vezes a um individuo com essa necessidade. Nestas modalidades, a segunda etapa de administração da referida composição imunogênica de acordo com a invenção é realizada num período de tempo de 2 semanas a 6 meses após a primeira etapa de administração. Nestas modalidades, a terceira etapa de administração da referida composição imunogênica é realizada num período de tempo de mais do que 6 meses até cerca de um ano após a primeira etapa de administração.
Em algumas modalidades, a referida composição imunogênica é então novamente administrada a um indivíduo imunizado, por exemplo, a cada período de tempo de 5 anos ou a cada período de tempo de 10 anos.
A presente invenção também diz respeito a uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo antigênico da fórmula (I) conforme descrito no presente documento.
Em certas modalidades, o peptídeo antigênico da fórmula (I) é ligado de modo covalente a uma molécula carreadora.
Em certas modalidades, uma composição imunogênica de acordo com a invenção compreende, adicionalmente, um ou mais agentes imuno-adjuvantes.
Uma composição imunogênica, conforme definida no presente documento, a qual compreende um produto imunogênico compreendendo a peptídeo da fórmula (I), preferencialmente um produto imunogênico consistindo de um conjugado entre o referido peptídeo da fórmula (I) e a molécula carreadora, e que compreende, adicionalmente, um ou mais compostos imuno-adjuvantes, também pode ser chamada de “composição de vacina” na presente especificação.
Em algumas modalidades, não há distinção específica a ser feita entre uma composição imunogênica de acordo com a invenção e a composição de vacina de acordo com a invenção, além dos termos empregados para designar tais composições.
Mais precisamente, uma composição imunogênica é destinada a gerar anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I), quando é administrada a um organismo mamífero, por exemplo, de um rato, coelho, ovelha, cavalo ou a cabra, em situações no presente documento, não se espera que os anticorpos gerados exerçam um efeito preventivo ou terapêutico no organismo de mamífero imunizado. Composição imunogênica de acordo com a invenção pode ser usada para produzir anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I), para um uso adicional não terapêutico desses anticorpos, por exemplo, como um reagente de detecção de vírus HIV-1 ou um reagente de detecção de peptídeo derivado de HIV-1.
Por outro lado, uma composição de vacina de acordo com a invenção é destinada a gerar anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) no organismo de mamíferos para os quais a referida composição de vacina é administrada, em situações no presente documento, não se espera que os anticorpos gerados exerçam um efeito preventivo ou terapêutico no organismo de mamífero imunizado.
Agentes imuno-adjuvantes compreendem, sem que estejam limitados a isso, Stimulon™, QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.); MPL™ (3-O-lipídeo A de monofosforil decladado; Corixa, Hamilton, Mont.), 529 (um composto de fosfato de glucosamina de amino alquila, Corixa, Hamilton, Mont.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.); GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Wash.); N-acetil-muramil-L-teronil-D-isoglutamina (thr-MDP); N-acetil-nor- muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referida como não-MDP); N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3- hidroxifosforiloxi-etilamina) (CGP 19835A, referida como MTP-PE); e toxina cólera. Outros compostos de agentes imuno-adjuvantes UO que podem ser utilizados englobam derivados não-tóxicos da toxina da cólera, incluíndo as suas subunidades A, e/ou conjugados UO de fusões geneticamente modificadas de N. Polipeptídeo de meningite com a sua toxina da cólera UO de subunidade B ("CTB"), plocloroagenóide, polissacáridos fúngicos, incluíndo schizophyllan, dipeptídeo muramilo, muramil dipeptídeo ("MDP"), derivados de ésteres de forbol, toxina lábil ao calor de E. coli, polímeros saponinas em bloco UO.
Ilustrativamente, os exemplos no presente documento ilustram uma composição de vacina compreendendo (i) um conjugado de KLH entre o peptídeo da fórmula (I) com o produto imunogênico e (ii) o adjuvante incompleto de Freund como agente imuno-adjuvante.
A formulação de tais composições imunogênicas são bem conhecidos das pessoas peritas na arte. As composições imunogênicas da invenção incluem de preferência um carreador farmaceuticamente aceitável. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados e/ou diluentes incluem alguns e todos os solventes convencionais, meios de dispersão, enchimentos, carreadores sólidos, soluções aquosas, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, e semelhantes. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, por exemplo, um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações dos mesmos. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida de prateleira ou a eficácia do anticorpo. A preparação e utilização de carreadores farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida na arte. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, a sua utilização nas composições imunogênicas da presente invenção está contemplada.
Tais composições imunogênicas podem ser administradas de modo parenteral, por exemplo, por injeção, ou de forma subcutânea ou intramuscular, assim como oralmente ou de maneira intranasal. Outros modos de administração empregam formulações orais, formulações pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas, por exemplo, sem limitação. Formulações orais, por exemplo, incluem tais excipientes normalmente empregados, como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes, sem limitação.
A presente invenção também pertence a uma composição de vacina compreendendo um polipeptídeo antigênico da fórmula (I) descrito no presente documento em combinação com um ou mais compostos imuno-adjuvantes.
A presente invenção também diz respeito a uma composição de vacina compreendendo (i) um produto imunogênico compreendendo um peptídeo da fórmula (I), o qual é combinado com (ii) um ou mais compostos imuno-adjuvantes.
De modo geral, uma composição imunogênica ou de vacina de acordo com a invenção compreende 1, 2, 3, 4 ou no máximo 5 compostos imuno-adjuvantes distintos.
Em modalidades preferenciais, uma composição imunogênica ou de vacina de acordo com a invenção compreende 1 ou 2 compostos imuno-adjuvantes distintos.
Em algumas modalidades preferenciais de uma composição imunogênica ou de vacina, o peptídeo da fórmula (I) é selecionado a partir do grupo consistindo de: - Nt-SASNKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 6-Ct), - Nt-SWANKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 7-Ct), - Nt-SWSAKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 8-Ct), e - Nt-SWSNKA-Ct (Nt-SEQ ID N° 9-Ct).
Em algumas modalidades preferenciais de uma composição imunogênica ou uma composição de vacina, o peptídeo antigênico da fórmula (I) é selecionado a partir do grupo consistindo de: - PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12), - PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13), - PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), e - PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15),
Em algumas modalidades preferenciais, o polipeptídeo antigênico da fórmula (I) é ligado de modo covalente a uma molécula carreadora.
A presente invenção também diz respeito a um peptídeo antigênico da fórmula (I), conforme descrito extensivamente na presente especificação, como o agente de uma composição de vacina destinado a prevenir e/ou tratar um indivíduo infectado com HIV-1.
De modo mais geral, a presente invenção também relata um peptídeo da fórmula (I) per se, conforme descrito extensivamente na presente especificação.
Anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I)
Conforme vem sendo extensivamente discutido e ilustrado experimentalmente no presente documento, a imunização de um indivíduo com uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo da fórmula (I) induz à produção de anticorpos anti-HIV-1 amplamente neutralizantes. Esses anticorpos anti-HIV-1 amplamente neutralizantes podem ser usados por si só como agentes ativos anti-HIV-1.
Os anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) podem ser usados para prevenção do HIV-1 ou para fins terapêuticos contra HIV-1, assim como para fins de diagnóstico de HIV-1.
Em algumas modalidades, anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) consistem de anticorpos produzidos após imunização de um mamífero, incluindo um humano, com uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo da fórmula (I), conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades, anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) são obtidos a partir de indivíduos infectados com HIV-1, os quais liberaram uma resposta imune contra HIV-1.
Em ambas as modalidades acima, os referidos anticorpos podem ser obtidos por purificação a partir de uma amostra, especialmente uma amostra de sangue, coletada a partir do referido mamífero, incluindo o referido humano.
Em ambas as modalidades acima, os referidos anticorpos também podem ser obtidos por clonagem do material de DNA relevante que os codifica, partindo, por exemplo, das células B obtidas a partir do referido mamífero, incluindo o do referido humano.
Em ambas as modalidades acima, os referidos anticorpos também podem ser obtidos por sequenciamento das sequências de aminoácido dos referidos anticorpos coletados a partir do referido mamífero, incluindo os do referido humano, e então sintetiza uma molécula de DNA que codifica o referido anticorpo ou uma porção dele compreendendo o seu CDR, para produzir anticorpos recombinantes relevantes direcionados contra um peptídeo da fórmula (I).
A presente invenção também trata de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) conforme descrito no presente documento.
Em algumas modalidades preferenciais, os referidos anticorpos são direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) selecionado a partir do grupo consistindo de: - Nt-SASNKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 6-Ct), - Nt-SWANKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 7-Ct), - Nt-SWSAKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 8-Ct), e - Nt-SWSNKA-Ct (Nt-SEQ ID N° 9-Ct
Em algumas outras modalidades preferenciais, os referidos anticorpos são direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) selecionados a partir do grupo consistindo de: - PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12), - PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13), - PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), e - PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15), Preparar anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) por imunização com uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo da fórmula (I) é divulgado notadamente nos exemplos no presente documento. Alternativamente, os anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) podem ser coletados a partir de pacientes infectados com HIV-1 já abrigando naturalmente tais anticorpos; eles também podem ser obtidos após imortalização dos linfócitos B humanos que os produzem; seu cDNA também pode ser clonado e usado adicionalmente para produzi-los ou seus derivados através de tecnologia de DAN recombinante.
A presente invenção também trata do uso de anticorpos anti-HIV-1 obtidos a partir de um indivíduo imunizado com uma composição imunogênica descrita no presente documento, para fabricar um medicamento para prevenir e/ou tratar um indivíduo infectado com HIV-1.
O termo “anticorpo”, no presente documento, é usado para se referir a uma molécula tendo uma especificidade útil de ligação ao antígeno. Aquelas pessoas versadas na técnica perceberão prontamente que este termo também pode abranger polipeptídeos que são fragmentos de ou derivados de anticorpos ainda, os quais podem mostrar a mesma funcionalidade ou uma muito similar. Tais fragmentos de anticorpo ou derivados se destinam a ser compreendidos pelo termo anticorpo como no presente documento. Por "anticorpo" ou "molécula de anticorpo" para o fim de imunoterapia passiva, destina-se, no presente documento, não apenas a todas as moléculas de imunoglobulina, mas também a fragmentos destes, tais como Fab, F(ab')2, Fv e outros fragmentos destes que retêm atividade neutralizante contra vírus HIV-1. Similarmente, o termo anticorpo inclui derivados geneticamente desenvolvidos de anticorpos, tais como uma cadeia simples de moléculas Fv (scFv) e anticorpos de domínio (dAbs).
A fabricação de composições compreendendo anticorpos purificados direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) é divulgada nos exemplos no presente documento.
Em algumas modalidades, um anticorpo direcionado contra um peptídeo da fórmula (I) consiste de um anticorpo policlonal. Produção da composição compreendendo anticorpos policlonais purificados direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) é divulgada nos exemplos no presente documento.
O termo "anticorpo monoclonal" é usado no presente documento para compreender qualquer Ab's isolado, tais como hibridomas de anticorpo monoclonal convencional, mas também para compreender anticorpos monoespecíficos isolados produzidos por qualquer célula, tal como, por exemplo, uma amostra de imunoglobulinas humanas idênticas expressadas numa linha celular de mamífero.
Os domínios pesados variáveis (VH) leves variáveis (VL) do anticorpo estão envolvidos em reconhecimento de antígeno, um fato reconhecido primeiramente por experimentos de digestão de protease precoce. Confirmação adicional foi encontrada por "humanização" de anticorpos de roedores. Domínios variáveis de origem em roedores podem ser fundidos a domínios constantes de origem humana, de modo que o anticorpo resultante retém a especificidade antigênica do anticorpo de roedor com parentesco (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855). Que essa especificidade antigênica é conferida por meio de domínios variáveis e é independente dos domínios constantes é conhecido a partir de experimentos envolvendo a expressão bacteriana de fragmentos de anticorpo, todos contendo um ou mais domínios variáveis. Essas moléculas incluem moléculas do tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas de cadeia única Fv (ScFv), onde os domínios parceiros V.sub.H e V.sub.L são ligados via oligopeptídeos flexíveis (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) e anticorpos de domínios simples (dabs) compreendendo domínios V isolados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Uma revisão geral das técnicas envolvidas na síntese de fragmentos de anticorpo, os quais retêm seus locais específicos de ligação, pode ser encontrada em Winter & Milstein (1991, Nature 349, 293-299). Por "moléculas ScFv" imaginamos moléculas em que os domínios parceiros VH e VL são ligados via oligopeptídeo flexível. Anticorpos desenvolvidos, tais como anticorpos ScFv, podem ser feitos usando as técnicas e abordagens descritas em J. Huston et al, (1988) "Protein engineering of anticorpo binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883, e in A. Pluckthun, (1991) "Anticorpo engineering; Advances from use of E. coli expression systems", Bio/technology 9 (6): 545-51, incorporados ao presente documento por referência.
Anticorpos monoclonais adequados que são reativos, conforme descrito no presente documento, podem ser preparados por meio de técnicas conhecidas, por exemplo, aquelas divulgadas em "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) e em "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", S G R Hurrell (CRC Press, 1982).
Uma modalidade adicional compreende anticorpos humanizados, onde as regiões do anticorpo murina ficam em contato com o antígeno, as Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) foram transferidas para uma estrutura de anticorpo humano. Tais anticorpos são praticamente completamente humanos e raramente causam qualquer reposta nociva ao anticorpo quando administrados aos pacientes. Vários anticorpos quiméricos ou humanizados vêm sendo registrados como drogas terapêuticas e atualmente são amplamente usados com várias indicações (Borrebaeck & Carlsson, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 1: 404-408).
É preferencial se o é um anticorpo humanizado. Anticorpos não humanos preparados adequadamente podem ser "humanizados" de maneiras conhecidas, por exemplo, ao inserir as regiões CDR de anticorpos de rato na estrutura de anticorpos humanos. Anticorpos humanizados podem ser feitos usando as técnicas e abordagens descritas em Verhoeyen et al (1988) Science, 239, 15341536, e in Kettleborough et al, (1991) Protein Engineering, 14 (7), 773-783.
Outras modalidades de anticorpo compreendem anticorpos completamente humanos, os quais podem ser produzidos usando tecnologias recombinantes. Normalmente grandes bibliotecas compreendendo bilhões de anticorpos diferentes são usadas. Em contraste às tecnologias anteriores empregando quimerização ou humanização de, por exemplo, anticorpos murina, essa tecnologia não depende da imunização de animais para gerar o anticorpo específico. Em vez disso, as bibliotecas recombinantes compreendem um grande número de variantes de anticorpo pré-produzidas, em que é provável que a biblioteca terá pelo menos um anticorpo específico para qualquer antígeno.
Nos tratamentos passivos de uma infecção com HIV-1, conforme provido no presente documento, os anticorpos da presente invenção serão administrados preferencialmente de modo intravenoso aos pacientes com necessidade disso. A frequência de administração pode ser determinada clinicamente ao se seguir o declínio de títulos de anticorpo no soro de pacientes ao longo do tempo, porém, em qualquer evento pode ser a uma frequência de 1 a 52 vezes por ano, e mais preferencialmente entre 1 e 12 vezes por ano. Quantidades de anticorpo podem variar de acordo com a severidade da doença, ou meia-vida do anticorpo no soro, mas preferencialmente estará na faixa de 1 a 10 mg/kg de paciente, e preferencialmente na faixa de 1 a 5 mg/kg de paciente, e mais preferencialmente 1 a 2 mg/kg de paciente.
Diagnósticos de HIV-1, prognósticos, métodos de monitoramento e kits
Tal como divulgado nos exemplos no presente documento, anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) podem ser encontrados em pacientes infectados com HIV-1.
Consequentemente, um peptídeo da fórmula (I) pode ser usado como um reagente de detecção para determinar o processo de, e, opcionalmente, a quantidade de, anticorpos direcionados contra o referido peptídeo num indivíduo testado.
Esta invenção diz respeito a um método para detectar e/ou quantificar anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) numa amostra, compreendendo as seguintes etapas: a) colocar em contato uma amostra a ser testada com um ou mais peptídeos da fórmula (I), e b) detectar e/ou quantificar a formação de complexos entre os referidos peptídeos da fórmula (I) e anticorpos presentes na referida amostra.
A presente invenção também se refere a um kit para detectar e/ou quantificar anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) numa amostra, compreendendo: a) um ou mais peptídeos da fórmula (I) nisso, e b) um ou mais reagentes para detectar complexos formados entre os referidos peptídeos e anticorpos presentes na referida amostra.
Em algumas modalidades, a amostra a ser testada consiste de uma amostra previamente coletada a partir de um indivíduo, o que inclui (i) um indivíduo suspeito de estar infectado por um vírus HIV-1 e (ii) um indivíduo que tenha sido infectado por um vírus HIV-1.
Em algumas modalidades, a referida amostra consiste de uma preparação da qual se espera conter anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I), tais como (i) uma preparação de anticorpos purificados a partir de amostras coletadas a partir de um mamífero imunizado com uma composição imunogênica compreendendo um peptídeo da fórmula (I) e (ii) uma preparação de anticorpos monoclonais de anticorpos recombinantes direcionados contra um peptídeo da fórmula (I).
Em algumas modalidades do método de detecção acima, o(s) peptídeo(s) da fórmula (I) é (são) imobilizados num substrato.
Em algumas modalidades, um peptídeo da fórmula (I) pode ser usado como um reagente para diagnosticar a infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1. Portanto, a presente invenção também diz respeito a um método para o diagnóstico de uma infecção com um vírus HIV-1 num indivíduo, compreendendo as seguintes etapas: a) colocar em contato uma amostra a partir do referido indivíduo com um ou mais peptídeos da fórmula (I), e b) detectar formação de complexos entre os referidos peptídeos da fórmula (I) e anticorpos presentes na referida amostra.
Em algumas modalidades da etapa b) do método, os complexos entre os referidos peptídeos da fórmula (I) e os anticorpos, quando presentes, são quantificados.
Esta invenção também diz respeito a um kit para o diagnóstico de uma infecção com um vírus HIV-1 num indivíduo, compreendendo: a) um ou mais peptídeos da fórmula (I), e b) um ou mais reagentes para detectar complexos formados entre os referidos peptídeos da fórmula (I) e anticorpos presentes numa amostra coletada a partir do referido indivíduo.
Em algumas modalidades do método de diagnóstico ou do kit de diagnóstico acima, o(s) referido(s) peptídeo(s) da fórmula (I) é (são) imobilizados num substrato, conforme isso é divulgado adicionalmente na presente especificação.
De acordo com o método acima, uma infecção por HIV-1 é determinada se a formação de complexos entre o(s) peptídeo(s) da fórmula (I) e anticorpos contidos na amostra previamente coletada a partir de indivíduos testados for detectado.
De acordo com o método de diagnóstico acima, o nível da resposta imune de um indivíduo infectado com HIV-1 contra um vírus HIV-1 é determinado pela quantificação de complexos formados entre os peptídeo(s) da fórmula (I) e anticorpos contidas na amostra previamente coletada a partir de indivíduos testados.
Em algumas modalidades, um peptídeo da fórmula (I) pode ser usado como um reagente para realizar um prognóstico de progressão da infecção de um indivíduo com um vírus HIV-1. Portanto, a presente invenção também diz respeito a um método para um prognóstico de progressão de uma infecção com um vírus HIV-1 num indivíduo, compreendendo as seguintes etapas: a) colocar em contato uma amostra a partir do referido indivíduo com um ou mais peptídeos da fórmula (I), e b) detectar e quantificar a formação de complexos entre os referidos peptídeos da fórmula (I) e anticorpos presentes na referida amostra.
Essa invenção também diz respeito a um kit para o prognóstico da progressão de uma infecção com um vírus HIV-1 num indivíduo, compreendendo: a) um ou mais peptídeos da fórmula (I), e b) um ou mais reagentes para detectar complexos formados entre os referidos peptídeos da fórmula (I) e anticorpos presentes numa amostra coletada a partir do referido indivíduo.
De acordo com o método acima, uma infecção por HIV-1 é determinada se a formação de complexos entre o(s) peptídeo(s) da fórmula (I) e anticorpos contidos na amostra previamente coletada a partir do indivíduo testado for detectado.
De acordo com o método de prognóstico acima, o nível da resposta imune de um indivíduo infectado com HIV-1 contra um vírus HIV-1 é determinado na etapa b).
Ao realizar o método de prognóstico acima, um resultado favorável é esperado quando um alto nível de anticorpos direcionados a um polipeptídeo da fórmula (I) é medido na etapa b). Reciprocamente, um resultado pobre é esperado quando um baixo nível de anticorpos direcionados a um polipeptídeo da fórmula (I) é medido na etapa b). Conforme usado no presente documento, um “alto” nível de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) é determinado por comparação com um ou mais valores de referência.
Em algumas modalidades do método de prognóstico acima, um resultado favorável pode ser determinado se a presença de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) é detectada numa amostra previamente coletada a partir do referido indivíduo infectado com HIV-1, uma vez que, conforme mostrado nos exemplos no presente documento, descobriu-se que indivíduos tendo anticorpos em soro direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) têm bons parâmetros clínicos, tais como baixa carga viral e alta contagem de célula CD4+ T.
O método de diagnóstico acima, o método de prognóstico acima, assim como os kits para realizar os referidos métodos, podem ser usados para monitorar a eficiência de um tratamento médico anti-HIV-1 num indivíduo infectado com HIV-1.
Esta invenção também diz respeito a um método para monitorar um tratamento médico anti-HIV-1 num indivíduo infectado com HIV-1, compreendendo as etapas de: a) administrar um tratamento anti-HIV-1 ao referido indivíduo infectado com HIV-1, e b) determinar o nível de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) numa amostra coletada a partir do referido paciente.
Em algumas modalidades do método de monitoramento, nível de anticorpos direcionados contra um peptídeo da fórmula (I) é determinado antes de se administrar um tratamento anti-HIV-1 ao referido indivíduo, portanto, antes da etapa a) do método.
Em algumas modalidades do método de monitoramento, especialmente quando o tratamento anti-HIV-1 compreende uma pluralidade de etapas de administração de uma composição farmacêutica anti-HIV-1 ao referido indivíduo, o método de monitoramento acima é realizado em cada etapa de administração, ou somente em uma ou mais etapas de administração ou após a última etapa de administração.
É especificado no presente documento que modalidades do tratamento médico anti-HIV-1 que podem ser monitoradas de acordo com o método acima engloba imunização do indivíduo infectado com HIV-1 com a composição de vacina compreendendo um peptídeo da fórmula (I) conforme descrito no presente documento.
Frases como "amostra contendo um anticorpo" ou "detectar um anticorpo numa amostra" não pretendem excluir amostras ou determinações (tentativas de detecção) onde nenhum anticorpo está contido ou é detectado. Num senso geral, esta invenção envolve ensaios para determinar se um anticorpo produzido em resposta à infecção e durante o curso da doença com um vírus HIV-1 está presente numa amostra, independentemente se detectado ou não.
Condições para reagir peptídeos e anticorpos de modo que eles reajam especificamente são bem conhecidas por pessoas versadas na técnica. Vide, por exemplo, Current Protocols in Immunology (Coligan et al., editors, John Wiley & Sons, Inc) ou os exemplos no presente documento.
O método de diagnóstico compreende pegar uma amostra de fluido corporal ou de tecido, os quais possivelmente contêm anticorpos. Os anticorpos podem ser, por exemplo, do tipo IgG, IgE, IgD, IgM ou IgA. De modo geral, anticorpos IgM e/ou IgA são detectados, por exemplo, para detecção de infecção precoce. Anticorpos IgG podem ser detectados quando alguns dos peptídeos adicionais discutidos acima são usados no método (por exemplo, peptídeos para a detecção de proteínas de flagelo). A amostra é preferencialmente fácil de se obter e pode ser soro ou plasma derivados de uma amostra de sangue venoso ou mesmo a partir de uma picada no dedo. Tecido a partir de outras partes do corpo ou outros fluidos corporais, tais como fluido cérebro-espinhal (CSF), saliva, secreções gástricas, mucosa etc. são conhecidos por conter anticorpos e podem ser usados como uma fonte da amostra.
Uma vez que se permite que o antígeno de peptídeo e a amostra de anticorpo reajam num meio adequado, um ensaio é realizado na presença ou ausência de uma reação peptídeo-anticorpo. Entre os vários tipos de ensaios adequados, os quais se tornarão evidentes para uma pessoa versada na técnica, estão ensaios de imunoprecipitação e aglutinação.
Em modalidades da invenção, o ensaio pode compreender (1) imobilizar o(s) anticorpo(s) na amostra, adicionar um peptídeo da invenção e então detectar o grau de anticorpo ligado ao peptídeo, por exemplo, com o peptídeo sendo rotulado ou ao se adicionar uma substância rotulada (conjugado, parceiro de ligação), tal como um anticorpo rotulado, o qual reconhece especificamente o peptídeo; (2) imobilizar um peptídeo da invenção, adicionar a amostra contendo um anticorpo(s) e então direcionar a quantidade de anticorpo ligado ao peptídeo, por exemplo, ao adicionar uma substância rotulada (conjugado, parceiro de ligação), tal como um anticorpo rotulado, o qual reconhece especificamente o anticorpo; ou (3) reagir o peptídeo e a amostra contendo anticorpo(s) sem qualquer um dos reagentes sendo imobilizado e então detectar a quantidade de complexos de anticorpo e peptídeo, por exemplo, com o peptídeo sendo rotulado ou ao se adicionar uma substância rotulada (conjugado, parceiro de ligação), tal como um anticorpo rotulado, o qual reconhece especificamente o peptídeo.
Imobilização de um peptídeo da invenção pode ser tanto covalente como não covalente, e a imobilização não covalente pode ser não específica (por exemplo, ligação não específica a uma superfície de poliestireno num poço de micro-titulação, por exemplo). Ligação específica ou semi-específica a um carreador sólido ou semissólido, suporte ou superfície, pode ser alcançada com o peptídeo tendo, associado a isso, uma fração que permite que sua ligação covalente ou não covalente se ligue ao carreador sólido ou semissólido, suporte ou superfície. Por exemplo, a fração pode ter afinidade com um componente anexado ao carreador, suporte ou superfície. Nesse caso, a fração pode ser, por exemplo, uma biotina ou grupo biotinila ou um análogo destes, ligada a um grupo de aminoácido do peptídeo, tal como ácido 6-aminohexanóico, e o componente é então avidina, streptavidina ou um análogo destes. Uma alternativa é uma situação na qual a fração tem a sequência de aminoácido His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO:17) e o carreador compreende um derivado de derivado de Ácido N Nitrilotriacetico (NTA) carregado com íons Ni++. Dentre carreadores adequados, suportes ou superfícies estão, por exemplo, esferas magnéticas ou latex de copolímeros, tais como benzeno divinil-estireno, benzeno divinil-estireno hidroxilado, poliestireno, poliestireno carboxilado, esferas de carbono negro, vidro ativado por cloreto polivinílico, poliestireno ou não ativado, evidro magnético poroso ativado por epóxi, gelatina partículas de polissacarídeo ou outras partículas de proteína, células vermelhas do sangue, anticorpos mono ou policlonais ou fragmentos Fab de tais anticorpos.
Os protocolos para imuno-ensaios usando antígenos para detecção de anticorpos específicos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um ensaio sanduíche convencional pode ser usado, ou um formato de ensaio competitivo convencional pode ser usado. Para uma discussão de alguns tipos adequados de ensaios, vide Protocolos Atuais em Imunologia (supra). Num ensaio preferencial, um peptídeo da invenção é imobilizado em relação à superfície sólida ou semissólida ou carreador por meio de ligação covalente ou não covalente, tanto ou como após adição da amostra contendo anticorpo.
Dispositivos para realizar ensaios específicos, especialmente imuno ensaios, são conhecidos e podem ser prontamente adaptados para uso nos métodos presentes. Ensaios de fase de sólida, em geral, são mais fáceis de realizar do que métodos de ensaio heterogêneo que requerem uma etapa de separação, tais como precipitação, centrifugação, filtragem, cromatografia ou magnetismo, pelo fato de que a separação de reagentes é mais rápida e simples. Dispositivos de ensaio de fase sólida incluem lâmina de microtitulação, dispositivos de ensaio de fluxo passante, dipsticks e dispositivos de imuno ensaio de imunocapilaridade ou immunocromatografia.
Em modalidades da invenção, a superfície sólida ou semissólida ou carreador é o fundo ou parede num poço de microtitulação; uma superfície de filtro ou membrana (por exemplo, uma membrana de nitrocelulose ou uma membrana PVDF (fluoreto de polivinilideno), tal como uma membrana immobilon); uma fibra oca; um meio cromatográfico esférico (por exemplo, um gel de agarose ou poliacrilamida gel); uma esfera magnética; uma matriz de celulose fibrosa; uma matriz HPLC; uma matriz FPLC; uma substância tendo moléculas de tal tamanho que as moléculas com o peptídeo ligado a elas, quando dissolvidas ou dispersas numa fase líquida, podem ser retidas por meio de um filtro; uma substância capaz de formar micelas ou participar na formação de micelas permitindo que uma fase líquida seja alterada ou trocada sem entrar nas micelas; um polímero solúvel em água; ou qualquer outro carreador adequado, suporte ou superfície.
Em algumas modalidades da invenção, o peptídeo é provido com um rótulo adequado que permite detecção. Rótulos convencionais podem ser usados, os quais são capazes de, sozinhos ou em conjunto com outras composições ou compostos, prover um sinal detectável. Métodos adequados de detecção incluem, por exemplo, detecção de um agente que é etiquetado, direta ou indiretamente, com um rótulo fluorescente por meio de microscopia de imunofluorescência, incluindo microscopia focal, ou por citometria de fluxo (FACscan); detecção de um agente radioativamente rotulado por autoradiografia; microscopia eletrônica; imunocoloração; fracionamento subcelular ou algo semelhante. Numa modalidade, um elemento radioativo (por exemplo, um aminoácido radioativo) é incorporado diretamente numa cadeia de peptídeo; noutra modalidade, um rótulo fluorescente é associado a um peptídeo via interação biotina/avidina, associação com um anticorpo conjugado por fluoresceína ou algo semelhante. Numa modalidade, um parceiro de ligação específica detectável para o anticorpo é adicionado à mistura. Por exemplo, o parceiro de ligação pode ser um anticorpo secundário detectável que se liga ao primeiro anticorpo. Esse anticorpo secundário pode ser rotulado, por exemplo, com um rótulo radioativo, enzimático, fluorescente, luminescente ou por outro rótulo detectável, tal como um sistema avidina/biotina.
Em modalidades da invenção, o procedimento de detecção compreende inspecionar visualmente o complexo anticorpo-peptídeo para uma alteração de cor ou inspecionar o complexo anticorpo-peptídeo para uma alteração químico- física. Alterações químico-físicas podem ocorrer com reações de oxidação ou outras reações químicas. Elas podem ser detectadas pelo olho, usando um espectrofotômetro ou algo semelhante.
Numa modalidade do método, o peptídeo ou uma mistura de peptídeos, é eletro- ou obscurecida por ponto num papel de nitrocelulose. Subsequentemente, o fluido biológico (por exemplo, soro ou plasma) é incubado com o antígeno obscurecido, e se permite que o anticorpo no fluido biológico se ligue ao(s) antígeno(s). O anticorpo ligado pode então ser detectado, por exemplo, por meio de métodos imunoenzimáticos padrão.
Noutra modalidade do método, esferas de látex são conjugadas ao(s) antígeno(s) da invenção. Subsequentemente, o fluido biológico é incubado com o conjugado de esfera/peptídeo, formando, com isso, uma mistura de reação. A mistura de reação é então analisada para se determinar a presença dos anticorpos.
Um ensaio preferencial para o rastreamento de produtos do sangue ou de outros fluidos fisiológicos ou biológicos é um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima, isto é, um ELISA. Normalmente, num ELISA o(s) antígeno(s) isolado(s) da invenção é(são) absorvidos à superfície de um poço de microtitulação, diretamente ou através de uma matriz de captura (isto é, anticorpo). Locais de ligação à proteína não específica, residual na superfície são então bloqueados com um agente apropriado, tal como albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra normal inativado por calor (NGS) ou BLOTTO (solução tamponada de leite seco não gorduroso também contém um preservativo, sais e um agente antiespumante). O poço é então incubado com uma amostra biológica suspeita de conter anticorpos anti-HIV-1. A amostra pode ser aplicada pura, ou, mais frequentemente, pode ser diluída, normalmente numa solução tamponada que contém uma pequena quantidade (0.1-5.0% por peso) de proteína, tais como BSA, NGS ou BLOTTO. Após incubação por um período de tempo suficiente para permitir que ligação específica ocorra, o poço é lavado para que se remova proteína não ligada e então é incubado com uma concentração ideal de um anticorpo apropriado anti-imunoglobulina (por exemplo, para alvos humanos, uma imunoglobulina anti-humana de outro animal, tal como cão, rato, vaca, etc.) a qual é conjugada a uma enzima ou a outro rótulo por meio de procedimentos padrão e é dissolvida em tampão de bloqueio. O rótulo pode ser escolhido a partir de uma variedade de enzimas, incluindo peroxidase de raiz forte (HRP), betagalactosidase, fosfatase alcalina, oxidase glucose, etc. Tempo suficiente é permitido para que ligação específica ocorra novamente, então o poço é lavado novamente para que se remova conjugado não ligado, e um substrato adequado à enzima é adicionado. Permite-se que cor se desenvolva, e a densidade óptica dos conteúdos do poço é determinada visualmente ou por meio de instrumentos (medida num comprimento de onda adequado). O valor OD de corte pode ser definido como os desvios padrão (SDs) de OD principal de pelo menos 50 amostras de soro coletada a partir de indivíduos que não estão infectados por um vírus HIV-1, ou por outras definições convencionais. No caso de um ensaio muito específico, OD+2 SD pode ser usado como um valor de corte.
Numa modalidade de um ELISA, um peptídeo da invenção é imobilizado numa superfície, tal como uma lâmina para ELISA de noventa e seis poços ou fase sólida equivalente que é revestida com streptavidina ou um composto de ligação à biotina equivalente a uma concentração ideal num tampão de revestimento alcalino e incubado a 4°C ao longo da noite. Após um número adequado de lavagens com tampões de lavagem padrão, uma concentração ideal de uma forma de biotinilado de uma composição/de um antígeno desta invenção, dissolvido num tampão de bloqueio convencional, é aplicado a cada poço; uma amostra é adicionada; e o ensaio continua conforme explicado acima.
Outro formato de ensaio útil é um formato de fluxo lateral. Anticorpo humano ou anticorpo animal ou anticorpos com proteína A ou G estafilococo são rotulados com um gerador de sinal ou repórter (isto é, dourado coloidal), o qual é seco e colocado numa almofada de fibra de vidro (almofada de aplicação de amostra). O peptídeo de diagnóstico é imobilizado na membrana, tal como uma membrana PVDF (fluoreto de polivinilideno) (por exemplo, uma membrana Imobilon (Miliporos)) ou uma membrana de nitrocelulose. Quando uma solução de amostra (sangue, soro, etc.) é aplicada à almofada de aplicação de amostra, ela dissolve o repórter rotulado com dourado coloidal e este se liga a todos os anticorpos na amostra. Esta mistura é transportada para a próxima membrana (PVDF ou nitrocelulose contendo o peptídeo de diagnóstico) por ação capilar. Se anticorpos contra o peptídeo de diagnóstico estiverem presentes, eles se ligam ao peptídeo de diagnóstico listrado na membrana, gerando um sinal. Um anticorpo adicional específico para o anticorpo rotulado com dourado coloidal (tal como lgG anti-rato de cabra) é usado para produzir um sinal de controle.
Uma pessoa versada na técnica deve entender que qualquer número de formatos de ensaio de proteína convencional, particularmente, formatos de imunoensaio, pode ser projetado para utilizar os peptídeos isolados desta invenção para a detecção de uma infecção por HIV-1 num sujeito. Esta invenção, portanto, não está limitada pela seleção do formato de ensaio particular, com o que se acredita abranger formatos de ensaio que são conhecidos por pessoas versadas na técnica.
Reagentes para ELISA ou para outros ensaios de acordo com esta invenção podem ser providos na forma de kits. Tais kits são úteis para diagnosticar infecção por um vírus HIV-1 usando a amostra a partir de um sujeito (por exemplo, um humano ou outro animal). Tal kit de diagnóstico pode conter um peptídeo da invenção (e, se desejado, peptídeos adicionais, conforme discutido acima) e, opcionalmente, um sistema para (significa permitir) detecção de um peptídeo da invenção ligado a um anticorpo direcionado contra um peptídeo da fórmula (I), e/ou uma superfície à qual o peptídeo pode estar ligado. Numa modalidade, um kit contém uma mistura de peptídeos adequados ou meios para preparar tais misturas, e/ou reagentes para detectar complexos peptídeo- anticorpo.
O kit pode incluir lâminas de microtitulação nas quais o(s) peptídeo(s) da invenção foram pré-absorvidos, outro dispositivo apropriado de ensaio, vários diluentes e tampões, conjugados rotulados ou outros agentes para a detecção de antígenos ligados especificamente ou anticorpos, e outros reagentes geradores de sinal, tais como substratos de enzima, cofatores e cromogenes. Outros componentes de um kit podem ser facilmente determinados por uma pessoa versada na técnica. Tais componentes podem incluir reagentes de revestimento, anticorpos de captura monoclonais e policlonais, específicos para um peptídeo da invenção, ou um coquetel de dois ou mais dos anticorpos, extratos purificados ou semi-purificados desses antígenos como padrões, anticorpos detectores de MAb, um anticorpo anti-rato ou anti-humano com molécula indicadora conjugada a eles, uma lâmina para ELISA preparada para absorção, tabelas indicadoras para comparações colorimétricas, luvas descartáveis, instruções de descontaminação, bastões de aplicação ou recipientes, um copo para preparação de amostra etc. Numa modalidade, um kit compreende tampões ou outros reagentes apropriados para constituir um meio de reação que permite a formação de um complexo peptídeo-anticorpo. Tais kits provêm uma maneira conveniente e eficiente para que laboratório clínico faça diagnóstico da infecção por um vírus HIV-1.
Em algumas modalidades, os métodos de diagnóstico e kits descritos no presente documento podem ser usados para geralmente detectar a presença de anticorpos anti-HIV numa amostra previamente coletada a partir de um indivíduo.
Em algumas outras modalidades, os métodos de diagnóstico e os kits descritos no presente documento podem ser usados para determinar a identidade da subfamília de vírus HIV-1 que infectou o indivíduo que está sendo testado.
Em algumas modalidades, métodos de diagnóstico e kits descritos no presente documento fazem uso somente de um peptídeo selecionado a partir de peptídeos pertencendo à família de peptídeos da fórmula (I).
Noutras modalidades, métodos de diagnóstico e kits descritos no presente documento fazem uso de uma pluralidade de peptídeos selecionados a partir dos peptídeos pertencendo à família dos peptídeos da fórmula (I). Ilustrativamente, modalidades de métodos de diagnóstico e kits descritos aqui fazem uso de uma pluralidade de peptídeos da fórmula (I) selecionados a partir do grupo consistindo de: - PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12), - PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13), - PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14) e - PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15),
A presente invenção é adicionalmente ilustrada, sem que esteja limitada às ilustrações, como base nos exemplos a seguir.
EXEMPLOS Materiais e Métodos dos exemplos 1. Preparação de vírus
Mutantes foram preparados a partir de plasmídeo pNL4.3 usando o kit de mutagênese direcionado ao local QuickChange II XL (Stratagene) com verificação subsequente por sequenciamento de DNA. Plasmídeos do tipo selvagem e mutados por alanina 3S/gp41 pNL4.3 foram transfectados por lipofectamina (Invitrogen) em células 293T em meio ideal. 48 horas pós-transfecção, sobrenadante livre de célula foi cultivado e a concentração da proteína p24 de núcleo principal HIV usando o kit Vidas Ag p24 II (Biomerieux). Sobrenadantes de vírus são preservados a -80°C.
2. Peptídeos e anticorpos.
Peptídeos sintéticos 3S/gp41 mutados por alanina e do tipo selvagem conjugado KLH e purificado não conjugado (Figura 1) foram adquiridos por Covalabs (Villeurbanne, França). Camundongos foram injetados duas vezes com cerca de 2 semanas de intervalo entra cada injeção de 20 mg de peptídeo ligado por KLH, na presença de adjuvantes amigos incompletos. Os soros foram titulados por ensaio imunoadsorvente ligado por enzima (ELISA) ao se usar placas Maxisorp (Nunc) revestidas ao longo da noite a 4°C com 100 ng de peptídeos do tipo selvagem ou 3S/gp41 mutados por alanina, conforme descrito (Vieillard et al AIDS 2006).
3. Purificação de células CD4+ T primárias saudáveis
Leucócitos de amostras de todo o sangue oriundas de doadores saudáveis foram obtidas por centrifugação de amostra de sangue a partir de ‘‘Etablissement Français du sang’’ (Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris, France). Células CD4+ T foram purificadas com microleitos magnéticos CD4 (Miltenyi). Análise citométrica de fluxo demonstrou uma pureza maior do que 95% de células CD4. Células foram ativadas por 3 dias com 1 μg/ml PHA-L (Murex) em meio Glutamax RPMI-1640 (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de novilho (FCS), e então cultivadas com 100 IU/ml Proleukin-2 (Chiron), adicionados a cada 3 dias.
4. Ensaio de infecção
Células CD4+ T, MT2 e Jurkat ativadas e purificadas (células a 107) foram incubadas com 100 ng de equivalentes de antígeno p24, por 17 h e 2 h a 37°C, respectivamente. Células foram lavadas duas vezes em PBS/EDTA e ressuspensas a 106/mL. Produção de vírus foi monitorada a cada 2 dias pós- infecção por meio de ELISA para medir a concentração de p24 com o kit Vidas Ag p24 II (Biomerieux). Formação de sincício nas células MT2 infectadas foi acessada após 96 h por meio de microscopia de contraste de fase padrão.
5. Ensaio de infectividade HIV-1 de um turno
Hela P4C5, gentilmente cedida por A. Morris e O. Schwartz (Pasteur Institute Paris, França) foram co-transfectadas por CD4+ e CCR5+, contendo uma cópia integrada de repetição de terminal longo HIV-1 (LTR) ligada a um gene luciferase e β-galactosidase (Amara et al J. Exp. Med. 1997). Células foram semeadas um dia antes e infectadas com 4 ng p24/ml do tipo selvagem ou vírus 3S/gp41 NL4.3 mutados por alanina. 48 h pós-infecção, a atividade da β- galactosidase foi medida em lisados de célula Hela-P4C5 usando o kit CPRG Beta-Galactosidase Kit (OZ biosciences).
6. Ensaios de neutralização
Frações IgG policlonais de antissoro de camundongo foram isoladas usando kit Spin A/G proteína Nab e então dessalinizadas usando colunas de dessalinização Zeba spin, ambas da Thermo Scientific, de acordo com as instruções do fabricante. Frações de imunoglobulina foram concentradas com Unidades de Filtro de Centrifugação Centricon (Millipore) e então quantificadas usando kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific). Abs purificadas foram testadas a concentrações de partida de 20 μg/ml, seguidas por 5 diluições duplicadas.
Abs humana anti-WT ou anti-W614A 3S/gp41 foram purificadas por imuno- precipitação a partir de plasma inativado por calor de paciente infectado com HIV usando o kit Pierce Direct IP por peptídeo sintético de imunobilização direta num suporte de agarose reativo à amina. Abs purificadas foram então dialisadas contra PBS (Silde-A-Lyser Dialysis cassette, Pierce) e quantificadas. As Abs purificadas foram testadas em concentrações de partida de 2 μg/ml, seguidas por cinco diluições duplas.
Dois ensaios usando vírus de infecção foram realizados para testar neutralização das Abs purificadas (Fenyo et la PLoS one 2009): (1) Para comparar a potência (concentrações necessárias para alcançar inibição de 50% [IC50] e 90% [IC90]) de Abs, primeiramente usamos um ensaio de células p24 CD4+ T. Vírus de replicação competente de infecção (200TCID50) foram incubados com várias concentrações de Ig por 30 minutos, seguidas por adição de células CD4+ ativadas por T PHA purificadas, na presença de IL2. Sete dias após iniciação das amostras duplicadas de infecção foram cultivadas por medição de p24 (Vidas Ag p24 II kit, Biomerieux). (2) Para avaliar a possibilidade de atividade de neutralização diferencial das várias Ab purificadas, medimos a sua capacidade de inibir entrada de HIV-1 a partir de cepas diferentes X4 (NL4.3, BRU, NDK) e R5 (JR-CSF, YU-2) ou ROD HIV-2, usando células Hela-P4C5 e/ou células TZM-bl (NIH AIDS Research e Reference Reagent Program), gentilmente fornecidas por Clarisse Berlioz-Torrent (Institut Cochin, Paris, França). Vírus de replicação competente de infecção (200TCID50) foram incubados com várias concentrações de Ig por 30 minutos, seguidas por adição de células Hela P4C5. 48 h pós-infecção, a atividade de β- galactosidase é medida em lisados Hela-P4C5 usando o kit CPRG BetaGalactosidase Kit (OZ biosciences), e atividade de luciferase é medida em lisados TZM-bl usando o Reagente Britelite Plus (Perkin Elmer). Um valor de corte de 2.5 vezes de fundo foi aplicado para determinar valores positivos em ensaios TCID. Dados foram expressos em TCID50 e TCID95.
7. Citometria de fluxo
Análise FACS foi realizada em células CD4+ T purificadas na presença de vírus viáveis ou inativados por calor por 17 h, ou tratadas com peptídeos 3S/gp41 por 4 h a 37°C. Amostras foram incubadas com 1 μg de cada anticorpo: anti- NKp44L, ou com proteínas de fusão (NKp30-Ig, NKp44-Ig ou NKp46-Ig) por 2 h a 4°C na presença de PBS/BSA1%. Células foram então lavadas em PBS/BSA1% e incubadas por 30 minutos a 4°C com anticorpos secundários específicos (diluídos 1:100 em PBS/BSA1%), e finalmente corados diretamente com anti-CD4 mAb e fixados usando solução BD CellFix solution (BD Bioscience), conforme descrito em (Vieillard et al PNAS 2005). Pelo menos 10.000 eventos de células CD4+ foram detectados em FACSCanto (BD Biosciences) ou Navios (Coulter).
8. Ensaio de degranulação
Células não infectadas ou CD4+ T infectadas com os vírus 3S/gp41 NL4.3 do tipo selvagem ou mutados por alanina foram ressuspensos a uma proporção de 1:1 na presença de PBMC autólogos ativados por IL2 autólogos e anti-CD107a mAb (H4A3; Becton Dickinson). Após 1 h de incubação, 3 mM de monensina foi adicionada a 3 horas adicionais de incubação, conforme descrito anteriormente (Béziat et al PLoS One 2010). Células NK foram coradas com anti-CD3, anti- CD56 e anti-NKp44 mAb, e analisadas num FACSCanto (BD Biosciences) ou Navios (Coulter). Pelo menos 5.000 eventos CD3-CD56+ foram analisados.
Exemplo 1: Integridade do 3S/gp41 de CD4 para infecção de células CD4+ T.
Para delinear o papel do motivo 3S/gp41 no ciclo de vida do vírus, substituições de local pontual foram introduzidas individualmente em resíduos na faixa entre a posição S613 e S618 dentro do motivo 3S da proteína gp41 a partir da cepa NL4.3 HIV-1. Para examinar se essas substituições individuais exercem u efeito na infectividade do vírus, células MT-2 foram provocadas com 100 ng de antígeno equivalente p24 a partir de cada preparação de vírus. Figura 2A mostra que os efeitos de substituições do motivo 3S/gp41 ficaram margeados pela abolição praticamente completa da produção viral para não efeito com respeito ao motivo de tipo selvagem expressando vírus. De fato, vírus mutado S613A preservou sua capacidade completa para MT-2 infectado, enquanto K617A em 66±10% do nível observado do tipo selvagem, e os outros mutantes preservaram menos do que 22%. Parece que mutantes W614A e S618A são incapazes de estabelecer uma infecção em células MT-2 (Figura 2A). Esses dados foram confirmados com a capacidade desses mutantes em realizar formação de sincício, com a completa ausência dessas estruturas celulares gigantes em células MT-2 infectadas com vírus mutados W614A e S618A, quando comparados com o tipo selvagem (Figura 2B). Esses dados sugerem que ambas as posições, W614 e S618, do motivo 3S/gp41, podem exercer um papel crítico durante infecção viral.
Estudos cinéticos de infecção células CD4+ T purificadas revelou que mutantes do tipo selvagem S613A e K617A mostraram replicação viral muito produtiva (acima de 187 pg/ml p24) com um pico de produção de p24 8 dias após infecção (Figura 2C). Em contraste, independentemente do período de tempo, o nível de infecção de vírus mutantes S615A e N616A permaneceu bastante baixo, com 13.5 e 17.3 pg/ml, no pico de carga viral, respectivamente, e permanece indetectável com W614A e S618A (Figura 2C). Resultados similares foram observados na presença de células Jurkat infectadas (dados não mostrados).
Procuramos, em seguida, determinar qual etapa do ciclo viral foi afetada por mutação no motivo 3S/gp41. A fim avaliar a infectividade dos mutantes 3S/gp41, sobrenadantes virais das células 293T transfectadas foram testados em células indicadoras Hela P4C5, uma linha de célula derivativa Hela transportando um cassete HIV-LTR Lac-Z ativado por Tat mediante infecção por HIV-1 (Amara et al J Exp Med 1997). Como mostra a Figura 2D, ambos os mutantes S613A e K617A preservaram a capacidade de células infectadas, similar ao tipo selvagem. Por contraste, na presença de mutantes S615A, N616A e S618A, o nível de infectividade é pelo menos 10 vezes menor do que com o tipo selvagem, e completamente não detectável com o mutante W614A. Isso sugere que substituições peculiares em posições específicas no motivo 3S/gp41 inibem entrada de vírus em células T CD4+.
Exemplo 2: Mutações em ponto no motivo 3S/gp41 abole expressão de NKp44L
Conforme mostrado previamente por outros e por nós, infecção por HIV-1 induz expressão de certos ligantes NKR, incluindo NKp44L (Vieillard et al 2005; Ward et al 2007). Nós queríamos determinar se substituições de 3S/gp41 contendo vírus também são capazes de induzir expressão de NKp44L em células CD4+ T purificadas. Após infecção com vírus tipo selvagem, alta frequência de células expressou NKp44L (56.2%). Resultados similares foram obtidos com células CD4+ T infectadas com os mutantes S613A ou K617A, com 61.0 e 67.6% de células expressando NKp44L, respectivamente. Mais intrigante, nenhuma expressão foi detectada com os outros mutantes; W614A, S615A, N616A e S618A. Consistentemente com dados prévios (Vieillard et al 2005; Ward et al 2007), expressões de ligantes NKp30 e NKp46 não foram induzidas em células infectadas ou pelos vírus do tipo selvagem, ou pelos vírus 3S/gp41 mutados por alanina, independentemente da posição da substituição (Figura 3A).
Em seguida, investigamos a possibilidade de que a expressão NKp44L é regulada diferentemente na ausência de partículas infecciosas. Assim, na presença de vírus inativado por calor (Figura 6A), ou após estimulação com peptídeos 3S sintéticos incluindo as várias substituições por alanina no motivo 3S/gp41 (Figura 3B), resultados similares àqueles obtidos com vírus competentes, na medida em que respeitam sua substituição específica de resíduo. De fato, expressão de NKp44L só é induzida na presença de elementos mutados S613A e K617A, a um nível próximo a este observado com o tipo selvagem, considerando que as outras partículas não infecciosas ou peptídeos mutantes não são capazes de induzir NKp44L.
Exemplo 3: Modulação da degranulação de células NK na presença de células CD4+ T autólogas infectadas por mutantes virais 3S/gp41 viral.
Pelo fato de termos encontrado NKp44L em células CD4+ T infectadas com vírus NL4.3 contendo certas mutações 3S/gp41 (Figura 2A), investigamos a possibilidade de que células alvo expressando esse ligante são mais sensíveis à citotoxicidade NK. Células CD4+ T purificadas infectadas ou com tipo selvagem ou com vários vírus mutados foram incubadas com células NK ativadas por IL2 autólogo para determinar suas capacidades de degranulação. Figura 3C mostra que alta expressão de CD107a em células NKp44+ NK, foi detectada na presença de vírus do tipo selvagem (28.8%), ou mutantes tS613A (29.5%) e K617A (29.9%), quando comparadas com células na infectadas (4.2%), em linha com dados mostrando alta expressão de NKp44L nas células T alvo CD4+ (Figura 3A). Por contraste com os outros mutantes, para os quais nós não observamos indução de NKp44L em células CD4+ T, o nível de degranulação permanece próximo do fechado para este obtido com células não infectadas (Figura 3C). Resultados similares foram observados na presença de partículas virais inativadas por calor (Figura 6B) e peptídeos sintéticos (Figura 4D).
Ao todo, esses resultados sugerem fortemente que substituições de resíduos peculiares fazem com que o motivo 3S/gp41 altamente conservado induza consequências maiores relativas à modulação da sensibilidade de célula NK das células alvo CD4+.
Exemplo 4: Elicitação de anticorpos amplamente neutralizantes do tipo 3S em camundongos
Portanto, nós realizamos imunização de camundongo com peptídeos 3S/gp41 do tipo selvagem e mutados por alanina para gerar anticorpos específicos. Para todos eles respostas imunes robustas foram vistas contra sua sequência 3S/gp41 específica no ELISA capturado livre de peptídeo (dados não mostrados). A magnitude da reatividade cruzada de soro depende do componente de peptídeo; o anti-soro interage com cada peptídeo sintético numa maneira diretamente proporcional às suas capacidades para induzir expressão de NKp44L. Assim, forte reatividade cruzada ao soro foi observada entre mutantes do tipo selvagem e mutantes S613A e K617A, tendo em vista que este efeito é profundamente diminuído com outros mutantes, consistentemente com modificações conformacionais induzidas por substituições peculiares.
Mais importante, todas as imunoglobulinas foram eluidas a partir de cada soro para acessar sua potência e espaço de neutralização num clado transverso de cepas R5 e X4 HIV-1. Usando diferentes ensaios de neutralização clássica usando células TZM-bl e Hela-P4C5, confirmamos a ausência de atividade neutralizante significante dos anticorpos anti-3S do tipo selvagem contra HIV-1 (Tabelas 2 e 3), conforme descrito anteriormente (Vieillard AIDS 2006). Resultados similares foram observados na presença de Ig purificado a partir de camundongo mutante imunizado S613A e K617A. Atividade neutralizante robusta e ampla foi detectada para mutantes W614A, S615A, N616A e S618A. De fato, respostas significativas foram descobertas por cada um desses mutantes contra várias cepas X4 (NL4.3, BRU e NDK), e R5 (JR-CSF e YU-2) HIV-1 com IC50 com valor variando entre 3.3 e 17.7 mg Ig/ml (Tabela 2). lg mais importante da W614A é capaz de neutralizar todas as cepas X4 e R5 HIV-1 testadas com um IC95 variando entre 6.7 e 19.5 μg/mL em células Hela-P4C5 (Tabela 2), e entre 3.9 e 10.3 μg/mL em células TZM-bls (Tabela 3), dependendo dos vírus. Conforme esperado, na presença de uma cepa HIV-2 (ROD), nenhuma atividade neutralizante foi detectada, independentemente da condição (Tabela 3), em linha com a deleção específica do motivo 3S/gp41 em sequências de cepa HIV-2 (Vieillard PNAS 2005).
Para confirmar definitivamente esses dados, determinamos, na sequência, a eficácia da neutralização viral por meio da detecção da produção p24 de células CD4+ T purificadas, infectadas com cepas NL4.3 ou NDK HIV-1. Figura 4A confirma a ausência de atividade neutralizante contra NL4.3 por Ig a partir de WT, ou de mutantes S613A e K617A, independentemente de suas concentrações. Contrariamente, diminuição significativa de produção p24 foi observada na presença de Ig oriunda de mutantes W614A, S615A, N616A e S618A. A uma concentração superior a 10 μg/ml Ig de antígenos W614A, p24 permanece indetectável. Resultados similares foram observados após infecção com NDK (Figura 4A). Além disso, estudo cinético revelou que produção de p24 é completamente abolida com 10 μg/ml Ig de mutante W614A, independentemente do tempo pós-infecção, e atrasaram significativamente com Ig de mutantes S615A, N616A e S618A, comparados ao tipo selvagem e de mutantes S613A e K617A (Figura 4B). Ao todo, esses dados sustentam fortemente que a substituição em posições específicas no motivo 3S/gp41 altamente conservado suscitou produção de atividade amplamente neutralizante em camundongos.
A fim de ainda acessar a eficácia de inibição de NKp44L por Ig purificada a partir de mutantes 3S/gp41 de alanina, células CD4+ T purificadas de doadores saudáveis foram incubadas com peptídeos 3S/gp41 do tipo selvagem pré-tratados com a Ig purificada a partir de camundongo imunizado. Figura 4C mostra que 3S- induziu de expressão NKp44L diminuiu significativamente na presença de Ig a partir de 3S-WT (9.4%), quando comparado às células controle (35.5%), consistentemente com dados prévios com mAb anti-3S do tipo selvagem (Vieillard et al PNAS 2005). Mais importante, forte inibição de expressão de NKp44L também foi observada na presença de mutantes 3S/gp41 de alanina, porém suavemente mais destacada com Ig de S613A e K617A, do que com mutantes W614A, S615A, N616A e S618A (Figura 4C). Esses resultados se sustentam com dados de degranulação de células NK ativadas por IL-2 contra células CD4+ T autólogas tratadas com peptídeo 3S na presença de Ab a partir de WT ou de mutantes 3S/gp41 de alanina. Portanto, degranulação foi inibida a 91,4% em WT e 78.3±4.8% em mutantes 3S/gp41 de alanina, independentemente da substituição (Figura 4D). Isso indicou que Ig gerada a partir de peptídeo 3S/gp41 com substituições específicas adquire ampla capacidade neutralizante à medida em que protege a permissão para inibição de expressão NKp44L em células CD4+ T.
Exemplo 5 NAbs ampla de mutante anti-W614A 3S em plasma oriundas de pacientes com HIV-1
Foi demonstrado recentemente que atividades de Nab amplamente reativas parecem se desenvolver ao longo do tempo em pacientes infectados por HIV. A fim de obter informação acerca da frequência na qual bNAb para motivo 3S/gp41 substituído é descoberta, analisamos atividade de neutralização em 106 amostras de plasma derivadas de pacientes infectados por HIV-1 com uma variedade de características clínicas. Das 106 amostras avaliadas, 55/106 (52%) tiveram nível detectável de anti-3S-WT Ab, com valores na faixa entre 15 e 325 AU/ml. Um teste de Spearman revela relação significativamente alta entre a quantidade de anti-3S Ab e a conta CD4 (p<0.0001) (dados não mostrados), conforme descrito (Vieillard et al AIDS 2006). Anticorpos especificamente direcionados contra o motivo 3S/gp41 mutado em W614A foram detectados em 5 a 106 plasmas (4.7%) por meio de ELISA. Para cada um deles, alto nível de Ab foi detectável (na faixa entre 120 e 250 AU/ml). Esses anticorpos específicos eram isotipos IgG (dados não mostrados) e detectados exclusivamente em pacientes com alta contagem de CD4 (822±89 CD4/mm3), e carga viral indetectável (abaixo das 20 cópias/ml) (Tabela 3). Digno de nota acerca desse Ab é que direcionou especificamente contra o motivo 3S/gp41 mutado por W614A, não sendo detectável no plasma de doadores saudáveis (dados não mostrados), assim como Ab para o motivo de tipo selvagem (Vieillard et al AIDS 2006).
Amostras de plasma oriundas desses 5 pacientes em particular foram investigadas, e níveis de neutralização, expressos como a diluição recíproca de plasma, revelou atividade neutralizante anti-HIV de clado transverso para todos esses plasmas, com IC50>100 para todos eles, na presença de vírus X4 NL4.3 e R5 YU-2. O plasma de 1 desses pacientes (#109) neutralizou pelo menos 95% das partículas de HIV (Tabela 3). A fim de confirmar que atividade neutralizante está associada a Ab especificamente direcionada contra o motivo mutado W614A 3S/gp41, Abs a partir de soros dos 5 pacientes infectados com HIV foram imunopurificados com o peptídeo sintético correspondente. Esse Abs eluido mostra atividade neutralizante significativa com valores IC50 na faixa entre <0.2 e 1.9 μg/ml, ou <0.2 e 1.9 μg/ml, em células Hela-P4C5 e células TZM-bl, respectivamente, para pelo menos duas cepas diferentes de HIV-1 (Tabela 3). Anticorpos purificados de 1 desses 5 pacientes (#109) mostrou espaço de atividade neutralizante contra todas as cepas X4 e R5 de HIV-1 com IC95 na faixa entre 0.6 e 1.9 μg/ml, independentemente do ensaio de neutralização (Tabela 3). Esses dados foram confirmados por produção de p24 em células CD4+ T purificadas mostrando uma atividade neutralizante robusta na faixa entre 0.2 e 1.0 μg/ml e 0.11 e 1.8 μg/ml após infecção com NL4.3 e NDK, respectivamente (Figura 5A). Além disso, um estudo cinético mostra que a produção de p24 em sobrenadante livre de célula é diminuída significativamente com 1 μg/ml de Abs imuno-purificada a partir de pacientes infectados com HIV-1, independentemente do tempo pós-infecção, comparado a controles (Figura 5B).
Em seguida, queríamos determinar o efeito de inibição de NKp44L por meio desses bNAb neutralizantes, os quais reconheceram especificamente o motivo mutado W614A 3S/gp41, purificados a partir de pacientes infectados com HIV-1. Figura 5C mostra que todos os Nabs anti-W614A preservaram suas capacidades de inibir NKp44L, quando comparados com células controle 3S sensibilizadas; contudo, quando comparados ao Ab anti-3S/gp41 do tipo selvagem, a partir de camundongo ou purificado a partir de paciente com HIV-1 (#117), a eficácia é suavemente modulada para baixo. De fato, 21.9% das células expressaram NKp44L na presença de Ab purificada anti 3S-WT, considerando que 21.9 a 34.6% das células permanecem NKp44L+ após tratamento com 3S/gp41 bNAbs mutados por anti-W614A a partir de pacientes com HIV-1. Importante notar, co-cultivos de células CD4+ T autólogas, tratadas com Ab purificada 3S/gp41 do tipo selvagem ou anti-W614A, com células NK ativadas por IL2 autólogos revelaram que a expressão de CD107a é significativamente diminuída ou abolida, com valores na faixa entre 1.8 e 7.8% de células NK CD107a+NKp44+, comparadas a 28.6% em células NK co-cultivadas com células T alvo CD4+ sensibilizadas com 3S na ausência de Ab (Figura 5D). Conjuntamente, esses dados revelam que elicitação de bNAb natural contra uma forma específica mutada do motivo 3S/gp41 estão presentes em algumas pessoas infectadas com HIV-1, possuindo efeitos dicotômicos, unindo tanto neutralização viral e inibição de esgotamento de CD4.

Claims (8)

1. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo antigênico selecionado a partir do grupo consistindo em: - PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12), - PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13), - PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14) e - PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15).
2. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo antigênico é ligado de modo covalente a uma molécula carreadora.
3. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o peptídeo antigênico é combinado com pelo menos um adjuvante de imunidade.
4. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a composição imunogênica consiste em uma composição de vacina, em que o peptídeo antigênico é combinado com pelo menos um adjuvante de imunidade.
5. Peptídeo antigênico, caracterizado pelo fato de ser definido conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Peptídeo antigênico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo antigênico é ligado de modo covalente a uma molécula carreadora.
7. Método para detectar e/ou quantificar anticorpos direcionados contra um peptídeo em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) colocar uma amostra a ser testada em contato com um ou mais peptídeos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e b) detectar e/ou quantificar a formação de complexos entre os referidos peptídeos e anticorpos presentes na referida amostra.
8. Kit para detectar e/ou quantificar anticorpos direcionados contra um peptídeo em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: a) um ou mais peptídeos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e b) um ou mais reagentes para detectar complexos formados entre os referidos peptídeos e anticorpos presentes na referida amostra.
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