CN116023511B - 一种融合蛋白及其在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用 - Google Patents
一种融合蛋白及其在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种融合蛋白及其在制备SARS‑CoV‑2疫苗中的应用。融合蛋白即氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的SARS‑CoV‑2‑CTD‑Fc融合蛋白。SARS‑CoV‑2‑CTD‑Fc融合蛋白可用于制备SARS‑CoV‑2疫苗，为SARS‑CoV‑2引起的新型冠状病毒的预防和/或治疗提供了可能性。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种融合蛋白及其在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用。
背景技术
截止2021年4月，全球已经研发并上市了多个SARS-CoV-2疫苗，包括灭活疫苗、mRNA疫苗、重组腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗。其中mRNA疫苗、重组腺病毒载体疫苗和重组蛋白疫苗均以SARS-CoV-2的结构蛋白包括S蛋白(刺突蛋白)为免疫原。综合分析全球的SARS-CoV-2疫苗与基础研究，基本可以确定SARS-CoV-2S蛋白是最有潜力的疫苗靶点。SARS-CoV-2S蛋白位于SARS-CoV-2外膜上，是病毒识别宿主细胞上的ACE2受体并侵入细胞的关键分子。完整的S蛋白由1273个氨基酸构成，结合宿主细胞ACE2受体后被酶切为S1和S2两个亚基，S1亚基由NTD和CTD两个部分组成，其中CTD包含受体结合结构域(ReceptorBinding Domain，RBD)，负责与ACE2受体分子结合；S2亚基负责介导病毒与宿主细胞的膜融合，引导病毒颗粒进入细胞。
目前已上市的SARS-CoV-2疫苗在控制SARS-CoV-2方面大多数并不理想。现有疫苗不理想的主要原因在于它们诱导人体产生的平均中和抗体滴度仅为100左右，仅勉强达到恢复期病人血清的抗体平均水平，如此低的抗体滴度不足以完全防止SARS-CoV-2感染。只要SARS-CoV-2的刺突蛋白突变几个氨基酸，或者因个体差异抗体效价稍微降低几倍，就可能导致SARS-CoV-2逃逸免疫系统的攻击。因此，需要继续研发更高效安全的疫苗。
重组蛋白疫苗是目前疫苗开发最成熟、最先进、使用最安全的疫苗。利用该技术研发上市的疫苗有重组乙肝疫苗、带状疱疹病毒疫苗及HPV宫颈癌疫苗等。该类疫苗有如下突出优势：(1)使用安全性好；因为注射入人体的是纯的蛋白质，辅助免疫的是同样安全的传统佐剂，因此非常安全。从某种意义来说，mRNA疫苗和重组腺病毒疫苗也是亚单位疫苗，区别在于它们二者是将编码疫苗蛋白的基因注射至人体中，让人体细胞生产疫苗蛋白。由于编码疫苗蛋白的核酸载体是否全部进入预期的生产细胞？疫苗蛋白的合成量是多还是少？免疫完成后如何停止合成？这些问题都没有答案，所以该疫苗风险重重。(2)生产安全、便于大规模生产，质量可控。重组蛋白疫苗具有工业化生产潜力。利用现代生物制药的大规模细胞培养技术，可以实现疫苗的工业规模生产，一台细胞生物反应器的培养规模就能够达到10000L以上，每个批次可以稳定地获得公斤级甚至吨级规模的疫苗蛋白，按照疫苗剂量一般在25μg/人/次计算，25kg重组蛋白疫苗就可以分装成10亿支，可以非常轻松地满足市场的巨大需求。生产工艺相近的吨级规模的抗体药物生产已是非常常规的大分子生物药生产规模，重组蛋白疫苗不涉及活病毒的扩增，非常易于规模化生产。(3)重组蛋白疫苗产品无毒无害，生产环境友好。(4)重组蛋白疫苗运输储存条件方便，仅需要2-8℃，常规的冷链运输和4℃冰箱就可以达到要求。
在SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的研发中，S蛋白是公认最有潜力的疫苗靶点，但是具体哪种形式的S蛋白免疫效果最好，却未有定论，莫衷一是。现有研究成果中，充满了相互矛盾的结论，比如，有的研究表明S1免疫产生的中和抗体水平远高于RBD；而有的研究却说RBD才是产生中和抗体的主要免疫原，S1里的NTD对中和抗体几乎没有贡献。
发明内容
本发明的目的是制备SARS-CoV-2疫苗。
本发明首先保护一种融合蛋白，其自N端至C端依次可包括SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域和免疫球蛋白Fc区；
所述免疫球蛋白Fc区为人或动物的免疫球蛋白或者它们的亚型重链恒定区的羧基端或其中的一部分。
上述融合蛋白中，所述免疫球蛋白可为人免疫球蛋白IgG。所述人免疫球蛋白IgG可优选为人免疫球蛋白IgG2。
上述融合蛋白中，所述SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域的氨基酸序列可如SEQIDNO:2自N末端起第18-388位所示。
上述融合蛋白中，所述人免疫球蛋白IgG2 Fc片段的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2自N末端起第396-621位所示。
上述任一所述融合蛋白还可包括5-30个(如5-7个、7-15个、15-30个、5个、7个或30个)氨基酸残基组成的连接肽；连接肽位于SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域的下游、免疫球蛋白Fc区的上游。
所述连接肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2自N末端起389-395位所示。
所述SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域与人免疫球蛋白IgG2 Fc片段融合，可选择多种连接序列。例如可以选择长度约为20个氨基酸残基，也可选择SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域与人免疫球蛋白IgG2 Fc片段的铰链区直接融合，制备的融合蛋白Fc序列位于SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域的氨基端。
上述任一所述融合蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2所示。
本申请中将SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域与人免疫球蛋白IgG2 Fc片段进行融合，主要考虑到以下几点：首先，Fc片段能够特异性结合到Protein A亲和柱，可直接纯化得到较高纯度的目的蛋白，简化融合蛋白的纯化步骤；其次，融合Fc片段可以增大蛋白分子量，从而降低肾清除率，并且在FcRn的保护下，融合蛋白可以延长其血浆半衰期；再次，融合蛋白可以通过二硫键形成稳定的二聚体，能够提高蛋白分子的稳定性；最后，融合Fc片段能够提高其在哺乳动物细胞内的表达。
本发明还保护一种DNA分子，其编码上述任一所述的融合蛋白。
所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述DNA分子的应用，可为A1)或A2)或A3)：
A1)中和SARS-CoV-2；
A2)预防SARS-CoV-2感染；
A3)治疗SARS-CoV-2感染导致的疾病；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述DNA分子在制备用于中和SARS-CoV-2的产品中的应用。
本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述DNA分子在制备用于预防SARS-CoV-2感染的产品中的应用。
本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述DNA分子在制备用于治疗SARS-CoV-2感染导致的疾病的产品中的应用。
本发明还保护一种SARS-CoV-2疫苗，其包括上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述DNA分子；
所述疫苗可为重组蛋白疫苗、mRNA疫苗或腺病毒载体疫苗。
所述SARS-CoV-2疫苗具体可由上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述DNA分子组成。
所述SARS-CoV-2疫苗还可包括佐剂。
所述SARS-CoV-2疫苗具体可由上述任一所述的融合蛋白和佐剂组成。
所述SARS-CoV-2疫苗具体可由上述任一所述DNA分子和佐剂组成。
上述任一所述佐剂具体可为铝佐剂。
本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述DNA分子在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用；
所述疫苗可为重组蛋白疫苗、mRNA疫苗或腺病毒载体疫苗。
本申请的发明人根据SARS-CoV-2S蛋白的结构与功能特性，将其拆分为NTD、CTD结构域和S2亚基，用CHO细胞表达并制备得到SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白，进而制备二聚体蛋白疫苗，单独或者各种组合使用，免疫动物，测定中和抗体滴度。研究表明，S2亚基免疫产生的抗体完全没有中和病毒的能力，NTD免疫产生的抗体有一定的中和能力，包含完整RBD序列且空间结构良好的CTD产生的中和抗体滴度最高。与NTD和S2组合免疫，不仅没有提高CTD的免疫原性，反而降低了中和抗体滴度；这很可能是因为无效免疫原，占用了免疫系统的潜能。将本发明制备的疫苗免疫小鼠，取小鼠血清，用假病毒细胞中和实验测定的抗体滴度平均值超过5万，比现有疫苗的中和抗体滴度高几十至几百倍。本发明制备疫苗之所以免疫效果这么高，是因为考虑到如下几点，从而保证疫苗有完整而且良好的空间构象：(1)序列设计上，包含完整的RBD结构域，而且含偶数个半胱氨酸，保证其能形成正确的二硫键配对；(2)疫苗属于Fc融合蛋白，是一种成熟使用的长效生物药技术，能延长疫苗在人体内的半衰期，对免疫系统造成更持久的激活；(3)使用的CHO表达系统属于哺乳动物细胞，能够对疫苗蛋白进行正确的糖基化等修饰。
本申请研究表明，S2亚基免疫产生的抗体，跟对照组铝佐剂一样，完全没有病毒中和能力；S1亚基的NTD和NTD结构域都能刺激产生具备病毒中和能力的抗体，但是效价差异非常大。NTD免疫产生抗体的中和滴度平均值为663，CTD免疫产生抗体的中和滴度平均值为75924，是NTD的114倍；CTD与NTD联合免疫产生抗体的中和滴度平均值为18130，约为单独CTD的1/4；CTD与NTD+S2联合免疫产生抗体的中和滴度平均值为13905，约为单独CTD的1/6。
CTD是刺激产生有效中和抗体的主要成分；联合免疫NTD和S2不仅没有增强、反而降低了免疫血清的病毒中和抗体效价。
本发明制备的疫苗可以诱导身体激发针对SARS-CoV-2病毒的中和抗体，抑制病毒感染与扩散。此外，本发明提供的用于制备疫苗的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白具有以下有益效果：(1)构建SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域与人免疫球蛋白IgG2 Fc片段融合的真核表达载体，表达的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白具备天然的空间结构，免疫产生的抗体能特异性识别SARS-CoV-2病毒，并激活免疫系统清除病毒；(2)人免疫球蛋白IgG2 Fc片段增大了目的蛋白分子量，从而降低肾清除率，并且在新生免疫球蛋白Fc受体(FcRn)的保护下，延长了SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白的血浆半衰期，更持久地刺激免疫系统，提高血清中和抗体水平；(3)SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白可以通过Fc的链间二硫键形成稳定的二聚体，提高蛋白分子的稳定性；(4)SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白疫苗免疫原性高。SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白可用于制备SARS-CoV-2疫苗，为SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒的预防和/或治疗提供了可能性。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的纯化色谱图。
图2为SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果。
图3为SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的免疫印迹检测结果。
图4为SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白免疫小鼠的抗体滴度检测。
图5为SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白免疫小鼠的病理变化。
图6为SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白免疫小鼠血清的假病毒中和实验。
图7为SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白与ACE2蛋白的结合力检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白的表达和纯化
一、重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-CTD-Fc的构建
1、SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白是新冠病毒Spike蛋白S1亚基的C端结构域(CTD)与人免疫球蛋白IgG2的Fc融合形成的蛋白。CTD是新冠病毒Spike蛋白(SARS-CoV-2S，uniprot.org/uniport/P0DTC2)aa311-681，Fc为人IgG2的重链恒定区(IGHG2，https://www.uniprot.org/uniprot/P01859)中的Hinge-CH2-CH3。根据SARS-CoV-2-CTD基因序列和人IgG2的Fc片段基因序列，设计并委托擎科生物科技有限公司合成SEQ ID NO:1所示的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白的编码基因。SEQ ID NO:1中，自5’末端起第52-1164位编码SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域，第1165-1185位编码连接肽，第1186-1863位编码免疫球蛋白Fc片段。
2、将步骤1合成的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白的编码基因连接至pUC57载体，得到克隆载体pUC57-SARS-CoV-2-CTD-Fc。
3、用限制性内切酶EcoR V和Hind III双酶切载体pcDNA3.1，回收约5kb的载体骨架。
4、用限制性内切酶EcoR V和Hind III双酶切克隆载体pUC57-SARS-CoV-2-CTD-Fc，回收约1.9kb的酶切产物。
5、将步骤3回收的载体骨架和步骤4回收的酶切产物进行连接，得到重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-CTD-Fc。
将重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-CTD-Fc进行测序。测序结果表明，重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-CTD-Fc中含有SEQ ID NO:1所示的DNA分子。
重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-CTD-Fc表达SEQ ID NO:2所示SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白。SEQ ID NO:2中，自N末端起第18-388位为SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域，第389-395位为连接肽，第396-621位为免疫球蛋白Fc片段。
二、SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白的表达和纯化
1、采用Lipofectamine3000脂质体转染试剂盒(ThermoFisher公司的产品，产品目录号为L3000-015)将重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-CTD-Fc转染CHO-DG44细胞(ThermoFisher公司的产品，产品目录号为A1100001)，得到若干重组细胞株。
2、完成步骤1后，用ELISA法挑选SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白表达量最高的细胞株，命名为高表达细胞株。
3、将步骤2获得的高表达细胞株接种于装有DMEM/F-12培养基(ThermoFisher公司的产品，产品目录号为C11330500BT)的摇瓶，37℃培养72h，得到培养液。
4、取步骤3得到的培养液，10000rpm离心10min，收集上清液1；然后将上清液1与硅藻土混合(硅藻土用于吸附上清液中的细胞碎片和其他杂质)，用0.22μm滤膜过滤，得到上清液2。
5、完成步骤4后，用5倍柱体积的平衡缓冲液(含17.5mmol/L Na2HPO4、2.5mmol/LNaH2PO4和0.15mol/L NaCl的水溶液，pH值为7.6)处理Protein A亲和柱(Cytiva公司的产品，产品目录号为17547403)，然后上样上清液2，用平衡缓冲液冲洗杂蛋白至基线，用洗脱液(含0.5mol/L L-Arginine-HCl、0.15mol/L NaCl和0.5％Tween-80的溶液，pH值为pH3.0)洗脱蛋白，收集过柱后溶液(即纯化的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白溶液)。
洗脱液洗脱峰见图1中左图。
6、用饱和精氨酸调节过柱后溶液的pH值至7.0，保存于4℃。之后用Nanodrop超微量分光光度计测定蛋白浓度。
三、纯化的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白溶液的SDS-PAGE凝胶电泳检测
1、取纯化的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白溶液(含5μg SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白)，加入5×还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0027S)或5×非还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0028S)，95℃变性5min，之后进行10％SDS-PAGE凝胶电泳。
2、完成步骤1后，使用考马斯亮蓝G250快速染色试剂进行染色，凝胶成像仪拍照。
实验结果见图2中左图(M为蛋白Marker，CTD-R为还原，CTD-NR为非还原)：还原状态显示1条约80kDa的条带，与SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白理论分子量相符；非还原状态显示1条约160kDa的条带，是理论分子量的二倍，表明SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白是通过Fc链间二硫键形成的二聚体。
四、纯化的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白溶液的免疫印迹检测
1、取纯化的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白溶液(含5μg SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白)，加入5×还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0027S)或5×非还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0028S)，95℃变性5min，之后进行10％SDS-PAGE凝胶电泳。
2、完成步骤1后，取凝胶并将蛋白质转印到PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的PBST溶液封闭1h，PBST溶液洗膜3次，用山羊抗人IgG/HRP(1：5000稀释)作为一抗室温孵育1h，PBST洗膜3次，化学发光试剂进行显影，UVP凝胶成像系统进行成像拍照。
山羊抗人IgG/HRP为中杉金桥公司的产品，产品目录号为ZB2304。
显影结果见图3中左图(M为蛋白Marker，CTD-R为还原，CTD-NR为非还原)：还原状态显示1条约80kDa的条带，与SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白理论分子量相符；非还原状态显示1条约160kDa的条带，是理论分子量的二倍，表明SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白是通过Fc链间二硫键形成的二聚体。
免疫印迹检测结果与SDS-PAGE凝胶电泳结果完全一致。
实施例2、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白的表达和纯化
一、重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-NTD-Fc的构建
1、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白是新冠病毒Spike蛋白S1亚基的N端结构域(NTD)与人免疫球蛋白IgG2的Fc融合形成的蛋白。NTD是新冠病毒Spike蛋白(uniprot.org/uniport/P0DTC2)aa13-315，Fc为人IgG2的重链恒定区(IGHG2，https://www.uniprot.org/uniprot/P01859)中的Hinge-CH2-CH3。根据SARS-CoV-2-NTD基因序列和人IgG2的Fc片段基因序列，设计并委托擎科生物科技有限公司合成SEQ ID NO:3所示的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白的编码基因。SEQ ID NO:3中，自5’末端起第52-960位编码SARS-CoV-2S蛋白的NTD结构域，第961-981位编码连接肽，第982-1659位编码免疫球蛋白Fc片段。
2、将步骤1合成的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白的编码基因连接至pUC57载体，得到克隆载体pUC57-SARS-CoV-2-NTD-Fc。
3、用限制性内切酶EcoR V和Hind III双酶切载体pcDNA3.1，回收约5kb的载体骨架。
4、用限制性内切酶EcoR V和Hind III双酶切克隆载体pUC57-SARS-CoV-2-NTD-Fc，回收约1.6kb的酶切产物。
5、将步骤3回收的载体骨架和步骤4回收的酶切产物进行连接，得到重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-NTD-Fc。
将重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-NTD-Fc进行测序。测序结果表明，重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-NTD-Fc中含有SEQ ID NO:3所示的DNA分子。
重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-NTD-Fc表达SEQ ID NO:4所示SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白。SEQ ID NO:4中，自N末端起第18-320位为SARS-CoV-2S蛋白的NTD结构域，第321-327位为连接肽，第328-553位为免疫球蛋白Fc片段。
二、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白的表达和纯化
1、采用Lipofectamine3000脂质体转染试剂盒(ThermoFisher公司的产品，产品目录号为L3000-015)将重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-NTD-Fc转染CHO-DG44细胞(ThermoFisher公司的产品，产品目录号为A1100001)，得到若干重组细胞株。
2、完成步骤1后，用ELISA法挑选SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白表达量最高的细胞株，命名为高表达细胞株。
3、将步骤2获得的高表达细胞株接种于装有DMEM/F-12培养基(ThermoFisher公司的产品，产品目录号为C11330500BT)的摇瓶，37℃培养72h，得到培养液。
4、取步骤3得到的培养液，10000rpm离心10min，收集上清液1；然后将上清液1与硅藻土混合(硅藻土用于吸附上清液中的细胞碎片和其他杂质)，用0.22μm滤膜过滤，得到上清液2。
5、完成步骤4后，用5倍柱体积的平衡缓冲液(含17.5mmol/L Na2HPO4、2.5mmol/LNaH2PO4和0.15mol/L NaCl的水溶液，pH值为7.6)处理Protein A亲和柱(Cytiva公司的产品，产品目录号为17547403)，然后上样上清液2，用平衡缓冲液冲洗杂蛋白至基线，用洗脱液(含0.5mol/L L-Arginine-HCl、0.15mol/L NaCl和0.5％Tween-80的溶液，pH值为pH3.0)洗脱蛋白，收集过柱后溶液(即纯化的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白溶液)。
洗脱液洗脱峰见图1中中图。
6、用饱和精氨酸调节过柱后溶液的pH值至7.0，保存于4℃。之后用Nanodrop超微量分光光度计测定蛋白浓度。
三、纯化的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白溶液的SDS-PAGE凝胶电泳检测
1、取纯化的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白溶液(含5μg SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白)，加入5×还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0027S)或5×非还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0028S)，95℃变性5min，之后进行10％SDS-PAGE凝胶电泳。
2、完成步骤1后，使用考马斯亮蓝G250快速染色试剂进行染色，凝胶成像仪拍照。
实验结果见图2中中图(M为蛋白Marker，NTD-R为还原，NTD-NR为非还原)：还原状态显示1条约100kDa的条带，与SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白理论分子量相符；非还原状态显示1条约200kDa的条带，是理论分子量的二倍，表明SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白是通过Fc链间二硫键形成的二聚体。
四、纯化的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白溶液的免疫印迹检测
1、取纯化的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白溶液(含5μg SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白)，加入5×还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0027S)或5×非还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0028S)，95℃变性5min，之后进行10％SDS-PAGE凝胶电泳。
2、完成步骤1后，取凝胶并将蛋白质转印到PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的PBST溶液封闭1h，PBST溶液洗膜3次，用山羊抗人IgG/HRP(1：5000稀释)作为一抗室温孵育1h，PBST洗膜3次，化学发光试剂进行显影，UVP凝胶成像系统进行成像拍照。
山羊抗人IgG/HRP为中杉金桥公司的产品，产品目录号为ZB2304。
显影结果见图3中中图(M为蛋白Marker，NTD-R为还原，NTD-NR为非还原)：还原状态显示1条约100kDa的条带，与SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白理论分子量相符；非还原状态显示1条约200kDa的条带，是理论分子量的二倍，表明SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白是通过Fc链间二硫键形成的二聚体。
免疫印迹检测结果与SDS-PAGE凝胶电泳结果完全一致。
实施例3、SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的表达和纯化
一、重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S2-Fc的构建
1、SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白是新冠病毒Spike蛋白S2亚基与人免疫球蛋白IgG2的Fc融合形成的蛋白。S2是新冠病毒Spike蛋白(uniprot.org/uniport/P0DTC2)aa686-1133，Fc为人IgG2的重链恒定区(IGHG2，https://www.uniprot.org/uniprot/P01859)中的Hinge-CH2-CH3。根据SARS-CoV-2-S2基因序列和人IgG2的Fc片段基因序列，设计并委托擎科生物科技有限公司合成SEQ ID NO:5所示的SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的编码基因。SEQID NO:5中，自5’末端起第52-1395位编码SARS-CoV-2S蛋白的S2亚基，第1396-1416位编码连接肽，第1417-2094位编码免疫球蛋白Fc片段。
2、将步骤1合成的SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的编码基因连接至pUC57载体，得到克隆载体pUC57-SARS-CoV-2-S2-Fc。
3、用限制性内切酶EcoR V和Hind III双酶切载体pcDNA3.1，回收约5kb的载体骨架。
4、用限制性内切酶EcoR V和Hind III双酶切克隆载体pUC57-SARS-CoV-2-S2-Fc，回收约2.1kb的酶切产物。
5、将步骤3回收的载体骨架和步骤4回收的酶切产物进行连接，得到重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S2-Fc。
将重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S2-Fc进行测序。测序结果表明，重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S2-Fc中含有SEQ ID NO:5所示的DNA分子。
重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S2-Fc表达SEQ ID NO:6所示SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白。SEQ ID NO:6中，自N末端起第18-465位为SARS-CoV-2S蛋白的CTD结构域，第466-472位为连接肽，第473-698位为免疫球蛋白Fc片段。
二、SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的表达和纯化
1、采用Lipofectamine3000脂质体转染试剂盒(ThermoFisher公司的产品，产品目录号为L3000-015)将重组质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S2-Fc转染CHO-DG44细胞(ThermoFisher公司的产品，产品目录号为A1100001)，得到若干重组细胞株。
2、完成步骤1后，用ELISA法挑选SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白表达量最高的细胞株，命名为高表达细胞株。
3、将步骤2获得的高表达细胞株接种于装有DMEM/F-12培养基(ThermoFisher公司的产品，产品目录号为C11330500BT)的摇瓶，37℃培养72h，得到培养液。
4、取步骤3得到的培养液，10000rpm离心10min，收集上清液1；然后将上清液1与硅藻土混合(硅藻土用于吸附上清液中的细胞碎片和其他杂质)，用0.22μm滤膜过滤，得到上清液2。
5、完成步骤4后，用5倍柱体积的平衡缓冲液(含17.5mmol/L Na2HPO4、2.5mmol/LNaH2PO4和0.15mol/L NaCl的水溶液，pH值为7.6)处理Protein A亲和柱(Cytiva公司的产品，产品目录号为17547403)，然后上样上清液2，用平衡缓冲液冲洗杂蛋白至基线，用洗脱液(含0.5mol/L L-Arginine-HCl、0.15mol/L NaCl和0.5％Tween-80的溶液，pH值为pH3.0)洗脱蛋白，收集过柱后溶液(即纯化的SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白溶液)。
洗脱液洗脱峰见图1中右图。
6、用饱和精氨酸调节过柱后溶液的pH值至7.0，保存于4℃。之后用Nanodrop超微量分光光度计测定蛋白浓度。
三、纯化的SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白溶液的SDS-PAGE凝胶电泳检测
1、取纯化的SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白溶液(含5μg SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白)，加入5×还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0027S)或5×非还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0028S)，95℃变性5min，之后进行10％SDS-PAGE凝胶电泳。
2、完成步骤1后，使用考马斯亮蓝G250快速染色试剂进行染色，凝胶成像仪拍照。
实验结果见图2中右图(M为蛋白Marker，S2-R为还原，S2-NR为非还原)：还原状态显示1条约100kDa的条带，与SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白理论分子量相符；非还原状态显示1条约200kDa的条带，是理论分子量的二倍，表明SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白是通过Fc链间二硫键形成的二聚体。
四、纯化的SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白溶液的免疫印迹检测
1、取纯化的SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白溶液(含5μg SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白)，加入5×还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0027S)或5×非还原上样缓冲液(康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0028S)，95℃变性5min，之后进行10％SDS-PAGE凝胶电泳。
2、完成步骤1后，取凝胶并将蛋白质转印到PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的PBST溶液封闭1h，PBST溶液洗膜3次，用山羊抗人IgG/HRP(1：5000稀释)作为一抗室温孵育1h，PBST洗膜3次，化学发光试剂进行显影，UVP凝胶成像系统进行成像拍照。
山羊抗人IgG/HRP为中杉金桥公司的产品，产品目录号为ZB2304。
显影结果见图3中右图(M为蛋白Marker，S2-R为还原，S2-NR为非还原)：还原状态显示1条约100kDa的条带，与SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白理论分子量相符；非还原状态显示1条约200kDa的条带，，是理论分子量的二倍，表明SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白是通过Fc链间二硫键形成的二聚体。
免疫印迹检测结果与SDS-PAGE凝胶电泳结果完全一致。
实施例4、融合蛋白免疫小鼠的抗体滴度检测和病理变化
1、疫苗的制备
(1)将纯化的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白和铝佐剂(华尔盾生物技术有限公司)混合，得到NTD疫苗。NTD疫苗中，SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白的浓度为0.2mg/ml，铝佐剂的浓度为0.8mg/ml。
(2)将纯化的SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白和铝佐剂混合，得到S2疫苗。S2疫苗中，SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的浓度为0.2mg/ml，铝佐剂的浓度为0.8mg/ml。
(3)将纯化的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白和铝佐剂混合，得到CTD疫苗。CTD疫苗中，SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白的浓度为0.2mg/ml，铝佐剂的浓度为0.8mg/ml。
(4)将纯化的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白、纯化的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白和铝佐剂混合，得到CTD+NTD疫苗。CTD+NTD疫苗中，SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白的浓度为0.2mg/ml，SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白的浓度为0.2mg/ml，铝佐剂的浓度为0.8mg/ml。
(5)将纯化的SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白、纯化的SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白、纯化的SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白和铝佐剂混合，得到CTD+NTD+S2疫苗。CTD+NTD+S2疫苗中，SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白的浓度为0.2mg/ml，SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白的浓度为0.2mg/ml，SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的浓度为0.2mg/ml，铝佐剂的浓度为0.8mg/ml。
2、取60只4-6周龄的雌性BABL/c小鼠，随机分为NTD组、S2组、CTD组、CTD+NTD组、CTD+NTD+S2组和对照组，每组10只，每只小鼠进行如下处理：
NTD组：分别于实验第1天、实验第15天和实验第29天注射NTD疫苗；每只小鼠每次注射的剂量为0.1ml。
S2组：分别于实验第1天、实验第15天和实验第29天注射S2疫苗；每只小鼠每次注射的剂量为0.1ml。
CTD组：分别于实验第1天、实验第15天和实验第29天注射CTD疫苗；每只小鼠每次注射的剂量为0.1ml。
CTD+NTD组：分别于实验第1天、实验第15天和实验第29天注射CTD+NTD疫苗；每只小鼠每次注射的剂量为0.1ml。
CTD+NTD+S2组：分别于实验第1天、实验第15天和实验第29天注射CTD+NTD+S2疫苗；每只小鼠每次注射的剂量为0.1ml。
对照组：分别于实验第1天、实验第15天和实验第29天注射浓度为0.8mg/ml的铝佐剂水溶液；每只小鼠每次注射的剂量为0.1ml。
3、完成3次免疫后两周(即实验第43天)，从每只小鼠眼眶静脉丛中取血并进一步获得血清；采用ELISA法测定血清中特异性抗体滴度；其中NTD组、CTD+NTD+S2组、对照组和CTD+NTD组测定NTD抗体滴度，S2组、对照组和CTD+NTD+S2组测定S2抗体滴度，CTD组、CTD+NTD组、CTD+NTD+S2组和对照组测定CTD抗体滴度。每组结果取平均值。
实验结果见图4(Adjuvant为对照组)。结果表明，采用5种疫苗免疫小鼠都能产生高水平的特异性抗体，以CTD疫苗免疫小鼠的抗体水平最高。
4、完成3次免疫后两周(即实验第43天)，对每只小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胃和小肠组织进行病理检查，观察病理变化。
部分实验结果见图5。结果表明，CTD组和对照组的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胃和小肠组织无显著差异，即SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白免疫小鼠后，未发生病理变化。
实施例5、融合蛋白免疫小鼠血清的假病毒中和实验
1、SARS-CoV-2(D614G)假病毒的制备
将表达SARS-CoV-2(D614G)S蛋白的质粒与HIV骨架质粒pNL4-3.luc.RE(美国国立卫生研究院艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号为3418)共转染293T细胞，孵育后能够得到具有感染性但没有复制能力的SARS-CoV-2(D614G)假病毒，其感染性同活病毒相似。
具体制备步骤如下：将表达SARS-CoV-2(D614G)S蛋白的质粒与HIV骨架质粒pNL4-3.luc.RE按照1:1的比例共转染293T细胞，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h，收集的细胞培养上清即为含有SARS-CoV-2(D614G)假病毒的病毒液。
2、SARS-CoV-2(D614G)假病毒的滴度(TCID50)测定
(1)取96孔细胞培养板，加入步骤1获得的SARS-CoV-2(D614G)假病毒的病毒液，用DMEM培养基进行3倍倍比稀释，最终获得9个稀释度，每个稀释度4个复孔，每个孔中含有100μL不同浓度SARS-CoV-2(D614G)假病毒的稀释液。同时设置含有100μL DMEM培养基的对照孔。
(2)完成步骤(1)后，先将预先培养的供试细胞293T/ACE2细胞溶液调整为浓度为10×104个细胞/mL的细胞悬液，之后加入DEAE-dextran并使其在体系中的浓度为15μg/mL，最后加入完成步骤(1)的96孔板中(100μL/孔)，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h。
(3)完成步骤(2)后，弃上清；按30μL/孔加入细胞裂解液(Promega公司的产品，产品目录号为E1531)，室温裂解15min；之后加入荧光素酶底物(Promega公司)，用微孔板化学发光检测仪测定相对荧光单位(RLU)，计算SARS-CoV-2(D614G)假病毒的滴度(TCID50)。
3、检测血清的中和抗体滴度
(1)取96孔细胞培养板，加入实施例4中步骤3获得的血清，用DMEM培养基进行3倍梯度稀释，最终获得9个梯度，每个梯度设置3个复孔(用于结果求平均值)，每个孔为50μL血清稀释液。
(2)完成步骤(1)后，首先每孔加入50μl步骤1制备的SARS-CoV-2(D614G)假重组的病毒液，37℃放置60min；之后每孔加入100μl 293T-ACE2细胞液(约1×104个293T-ACE2细胞)；之后加入DEAE-dextran并使其在体系中的浓度为15μg/ml，37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育48h；最后小心弃掉培养液后，每孔加入30μl细胞裂解液，室温裂解细胞15min，之后每孔加入100μl Luciferaese Assay试剂(Promega公司产品，货号E1501)，充分混匀后取100μl转移到新的96孔细胞培养板中，使用化学发光检测仪测定RLU，使用GraphPad Prism软件计算血清的中和抗体滴度，每组结果取平均值。
实验结果见图6(Adjuvant为对照组)。结果表明，CTD组的中和抗体滴度最高，比NTD组的中和抗体滴度高114倍左右；S2组和对照组的中和抗体滴度都低于检测下限；与CTD组相比，CTD+NTD组和CTD+NTD+S2组的中和抗体滴度都显著降低。
实施例6、检测融合蛋白与ACE2的结合力
1、用重组人ACE2蛋白(His tag)(Abcam，货号ab276202)包被酶标板(每孔100ng)，4℃过夜。
2、完成步骤1后，加入封闭液(含5％skim milk的PBST溶液)，封闭1.5-2h。
3、用PBST将封闭液稀释至skim milk终浓度为1％，作为抗体稀释液。之后用抗体稀释液对待测蛋白(SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白或IgG)进行3倍梯度稀释，得到待测蛋白稀释液。
4、完成步骤2后，充分洗涤，之后每孔加入100μl待测蛋白稀释液，37℃孵育1h；充分洗涤后，再加入1：2500稀释的山羊抗人IgG/辣根酶标记(中杉金桥，货号ZB2304)100μl，37℃孵育1h；充分洗涤后，采用TMB溶液显色15min，酸终止，于450nm处读取光吸收值。测定结果采用GraphPad Prism Software 6.0软件分析，选择非线性回归分析中“剂量效应——刺激”来计算半最大结合效应浓度(EC50)。
实验结果见图7(CTD-Fc为SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白，NTD-Fc为SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白，S2-Fc为SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白)。结果表明，SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白与ACE2的结合有良好的量效关系，EC50为57pM；而SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白和IgG与ACE2基本没有结合。由此可见，ACE2可以与SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白特异性结合。
SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白具备良好的结构。
实施例7、SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的优选
分析实施例4ELISA测定的特异性抗体滴度结果和实施例5测定的SARS-CoV-2(D614G)假病毒中和抗体实验结果。结果表明，SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白都能激活很高的特异性抗体，但是不同融合蛋白免疫产生抗体的假病毒中和能力相差巨大：S2组免疫产生抗体的中和滴度是40，跟对照组一样，完全没有SARS-CoV-2(D614G)假病毒中和能力；NTD组免疫产生抗体的中和滴度平均值为663，只有微弱的SARS-CoV-2(D614G)假病毒中和能力；CTD组免疫产生抗体的中和滴度平均值为75924，是NTD组的114倍、对照组的1898倍，具备最强的SARS-CoV-2(D614G)假病毒中和能力；CTD+NTD组免疫产生抗体的中和滴度平均值为18130，约为CTD组的1/4；CTD+NTD+S2组免疫产生抗体的中和滴度平均值为13905，约为CTD组的1/6。
SARS-CoV-2-NTD-Fc融合蛋白、SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-S2-Fc融合蛋白的C端都是完全相同的Fc片段，差别仅在于N端分别是SARS-CoV-2病毒S蛋白的NTD、CTD和S2结构域。上述数据分析表明，SARS-CoV-2病毒S蛋白的NTD、CTD和S2结构域都具备很好的免疫原性，都能刺激产生高浓度的特异性抗体；但是，只有CTD结构域免疫产生的抗体才具备较强的病毒中和能力。添加NTD和S2结构域共同免疫，不仅没有提高，反而大幅度降低了中和抗体滴度。同时，实施例4中实验证明，SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白免疫小鼠未发生病理变化。因此，单独使用SARS-CoV-2-CTD-Fc融合蛋白是优选的SARS-CoV-2重组蛋白疫苗方案。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (7)
1.一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种DNA分子，其编码权利要求1所述融合蛋白；所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
3.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述DNA分子在制备用于中和SARS-CoV-2的药物中的应用。
4.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述DNA分子在制备用于预防SARS-CoV-2感染的药物中的应用。
5.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述DNA分子在制备用于治疗SARS-CoV-2感染导致的疾病的药物中的应用。
6.一种SARS-CoV-2疫苗，其包括权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述DNA分子；
所述疫苗为重组蛋白疫苗、mRNA疫苗或腺病毒载体疫苗。
7.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述DNA分子在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用；
所述疫苗为重组蛋白疫苗、mRNA疫苗或腺病毒载体疫苗。
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