CN112661865A

CN112661865A - 针对新型冠状病毒的疫苗以及其应用

Info

Publication number: CN112661865A
Application number: CN202011632809.8A
Authority: CN
Inventors: 接振旺; 林高坤; 林钰庭
Original assignee: Shenzhen Magnolia Biotechnology Co ltd; Hope Biological Technology Suzhou Co ltd
Current assignee: Shenzhen Magnolia Biotechnology Co ltd; Hope Biological Technology Suzhou Co ltd
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明提供了一种针对新型冠状病毒的疫苗以及其应用。本发明首次揭示一种新的改造冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基以提高其免疫原性的方法，包括：将冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基与定点突变的IgG Fc连接；本发明也揭示了两者融合后获得的融合多肽以及以之与铝佐剂混合后获得的疫苗。本发明的融合多肽能够被有效地表达，表达后能够形成正确的蛋白空间结构，其与铝佐剂混合而获得的疫苗具有良好的免疫原性。

Description

针对新型冠状病毒的疫苗以及其应用

技术领域

本发明属于生物技术以及病毒学领域，更具体地，本发明涉及针对新型冠状病毒的疫苗以及其应用。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的肺炎，临床表现与病毒性肺炎极为相似；主要临床表现为发热、疲乏、干咳等，严重者可发生休克、脓毒血症、呼吸衰竭而死亡。其具有隐蔽性和高传染性，可导致一部分重症或死亡病理。目前，该病毒引起的肺炎尚缺乏有效的药物，为临床诊治和控制疫情带来极大困难。除了导致人体的疾病，根据世卫组织最新的披露，全球有数以亿计的人受到不同程度的精神健康问题影响，只有少数人能享受高质量的治疗。

冠状病毒粒子形状并不规则，直径约60-220nm。冠状病毒的核酸为正链单链RNA，其特点是可以以自身为模板，指导合成病毒相关蛋白质。病毒进入宿主细胞后，首先以病毒RNA为模板表达出RNA聚合酶，随后RNA聚合酶完成负链RNA的转录合成、各种结构蛋白mRNA的合成，以及病毒基因组RNA的复制。

冠状病毒具有包膜结构，上面有三种蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein)、小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein)和膜糖蛋白(M，Membrane Protein)，少数种类还有血凝素糖蛋白(HE蛋白，Haemaglutinin-esterase)。Spike蛋白在识别并结合宿主细胞表面受体，并介导病毒包膜与细胞膜融合的过程中起到关键性作用；M蛋白则参与了病毒包膜的形成与出芽过程；HE蛋白则是构成包膜的短凸起，可能与冠状病毒早期吸附有关，某些冠状病毒的HE蛋白可引起红细胞的凝集以及对红细胞的吸附。S蛋白位于病毒表面，形成棒状结构；N蛋白包裹病毒基因组。

目前，人类仍缺乏有效的抗2019-nCoV的疫苗，在这种严峻的形势下，尽快开发安全、有效的针对2019-nCoV的疫苗用以保护易感人群，对于保护人民健康与国家安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供针对新型冠状病毒的疫苗以及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种改造冠状病毒刺突糖蛋白(Spike)S1亚基以提高其免疫原性(或免疫效果或免疫活性)的方法，包括：将冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基与定点突变的IgG Fc连接。

在本发明的第一方面，提供一种融合多肽，包含相互连接的以下的蛋白：冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基，以及定点突变的IgG Fc。

在一个优选例中，所述定点突变的IgG Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第686～917位所示。

在另一优选例中，所述冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第16～685位或第1～685位所示；或如SEQ ID NO:5中第16～685位或第1～685位所示。

在另一优选例中，其从氨基端到羧基端依次包含：冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基，定点突变的IgG Fc。

在另一优选例中，所述的冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基以及定点突变的IgG Fc之间，含有或不含有连接子。

在本发明的另一方面，提供一种核酸，所述的核酸编码前面所述的融合多肽。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的载体或其基因组中整合有所述的核酸。

在一个优选例中，所述的细胞为真核细胞。

在另一优选例中，所述细胞包括：293细胞，CHO细胞。

在本发明的另一方面，提供所述的融合多肽的用途，用于制备2019-nCoV(COVID)病毒的疫苗。

在本发明的另一方面，提供一种针对2019-nCoV(COVID)病毒的疫苗，其包括：所述的融合多肽；以及铝佐剂(明矾)。

在本发明的另一方面，提供一种制备针对2019-nCoV(COVID)病毒的疫苗的方法，包括将所述的融合多肽与铝佐剂混合。

在一个优选例中，所述的融合多肽与铝佐剂按照重量比例为1～20:1000(例如2:1000，3:1000，5:1000，8:1000，15:1000)；较佳地为1～10:1000。

在本发明的另一方面，提供一种用于免疫以产生抗2019-nCoV(COVID)病毒的抗体的药盒，其中包括：容器，以及装于容器中的所述的疫苗；容器，以及装于容器中的铝佐剂。

在本发明的另一方面，提供一种用于免疫以产生抗2019-nCoV(COVID)病毒的抗体的药盒，其中包括：容器，以及装于容器中的所述的融合多肽；容器，以及装于容器中的铝佐剂。

在本发明的另一方面，提供一种定点突变的IgG Fc或编码其的核酸，所述定点突变的IgG Fc具有如SEQ ID NO:1中第686～917位所示的氨基酸序列。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、293细胞瞬时转染细胞的代表性的图片。

图2、Expi293F细胞表达S1-Fc蛋白的表达量(DAY6)，DAY代表天数。

图3、Expi293F细胞表达S1-Fc蛋白表达量与细胞活率随培养时间变化图。VCD：Expi293F活细胞数量；DAY1-6：转染质粒后收集培养基上清时间。VCD：活细胞密度。

图4、小鼠免疫实验流程图。

图5、免疫小鼠IgM检测结果；佐剂对照：免疫时只注射佐剂；RBD-Fc+佐剂：注射重组蛋白RBD-Fc+佐剂；S1-Fc+佐剂：注射重组蛋白S1-Fc+佐剂；HOPE-V+佐剂：注射重组蛋白HOPE-V+佐剂；纵坐标为IgM检测A450 OD读数；横坐标为小鼠血清稀释浓度(n＝3-4，取平均值作图)。

图6、免疫小鼠IgG检测结果；佐剂对照：免疫时只注射佐剂；RBD-Fc+佐剂：注射重组蛋白RBD-Fc+佐剂；S1-Fc+佐剂：注射重组蛋白S1-Fc+佐剂；HOPE-V+佐剂：注射重组蛋白HOPE-V+佐剂；纵坐标为IgM检测A450 OD读书；横坐标为小鼠血清稀释浓度(n＝3-4，取平均值作图)。

图7、免疫小鼠血清假病毒中和实验结果，包括RLU读值(上图)和中和活性(下图)；佐剂对照：免疫时只注射佐剂；RBD-Fc+佐剂：注射重组蛋白RBD-Fc+佐剂；RBD+佐剂：注射重组蛋白RBD+佐剂；S1-Fc+佐剂：注射重组蛋白S1-Fc+佐剂；S1-D614-Fc+佐剂：注射重组蛋白S1-D614-Fc+佐剂；HOPE-V+佐剂：注射重组蛋白HOPE-V+佐剂；纵坐标为IgM检测A450 OD读数；横坐标为小鼠血清稀释浓度。

图8、免疫小鼠血清SARS-COV-2真病毒中和实验结果。上图：中和活性；下图：中和百分比。

图9、免疫小鼠血清SARS-COV-2真病毒中和实验佐剂工艺对比结果；佐剂对照：免疫时只注射佐剂；S1+佐剂：注射重组蛋白S1+佐剂；S1-Fc+佐剂：注射重组蛋白S1-Fc+佐剂(n＝4)。

图10、免疫小鼠血清SARS-COV-2真病毒中和实验Fc工艺对比结果。阳性对照：P3实验室阳性对照血清；佐剂对照：免疫时只注射佐剂；S1+佐剂：注射重组蛋白S1(不含Fc片段)+佐剂；S1-Fc+佐剂：注射重组蛋白S1-Fc+佐剂(每组n＝4)。

多个图中，Fc可以选自两种变体形式之一，具体以表1中序列定义的蛋白序列中Fc的序列为准。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种新的改造冠状病毒刺突糖蛋白(Spike)S1亚基以提高其免疫原性的方法，包括：将冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基与定点突变的IgGFc连接；本发明也揭示了两者融合后获得的融合多肽以及以之与铝佐剂混合后获得的疫苗。本发明的融合多肽能够被有效地表达，表达后能够形成正确的蛋白空间结构，其与铝佐剂混合而获得的疫苗具有良好的免疫原性。

术语

如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”，“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“药学上或免疫学上可接受的”的成分是适用于人无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上或免疫学上可接受的载体”指用于免疫治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。优选地，本发明的佐剂作为药学上或免疫学上可接受的载体的一种。

如本文所用，“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

融合多肽

本发明提供一种融合多肽，其包含冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基和IgG Fc段突变体，两者操作性连接。较佳的，所述的融合多肽是一种分离的蛋白，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物；所述的融合多肽也可存在于混合物中，如存在于一种细胞裂解物或粗提物中。

本发明包括所述冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基或IgG Fc段突变体的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基或IgG Fc段突变体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。应理解，所述的IgG Fc段突变体的衍生物和类似物中，其一些特定位置应是是保守的，包括相应于SEQ ID NO:1的第690位的“C”，第826～828位的“EEM”。

Spike蛋白是一种三聚体跨膜糖蛋白，其在病毒表面形成特殊的花冠结构。它首先结合细胞表面的受体，然后发生“变形”，顺势将病毒包膜与细胞膜融为一体，从而将病毒内的遗传物质注入细胞，达到感染细胞的目的。Spike蛋白含有两个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体；S2含有膜融合过程所需的基本元件。Spike蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能。

在本发明中，术语“冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基”是包括SEQ ID NO:1中第16～685位或第1～685位所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基相同功能的、SEQ ID NO:1中第16～685位或第1～685位所示氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，常常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸常常不会改变多肽的功能。因此该术语还包括所述冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基的活性片段和活性衍生物。

在本发明中，术语“IgG Fc段突变体”是包括SEQ ID NO:1中第686～917位所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述IgG Fc段突变体相同功能的、SEQ ID NO:1中第686～917位所示氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，常常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸常常不会改变多肽的功能。应理解，所述的IgG Fc段突变体的变异形式中，其一些特定位置应是是保守的，包括相应于SEQ ID NO:1的第690位的“C”，第826～828位的“EEM”。

应理解，本发明也包括与所述冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基或IgG Fc段突变体的具有较高同源性的蛋白，如具有90％以上，如95％、98％、99％序列相同性。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。应理解，与所述的IgG Fc段突变体高同源性的蛋白中，其一些特定位置应是是保守的，包括相应于SEQ ID NO:1的第690位的“C”，第826～828位的“EEM”。

本发明所述的冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基与IgG Fc段突变体之间，通过化学键相连或相互偶联；所述的化学键是共价键或非共价键。作为本发明的优选方式，所述的冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基、IgG Fc段突变体之间通过化学键相连；更佳的，所述的化学键是肽键。

作为本发明的优选方式，所述的融合多肽从氨基端到羧基端依次包含：冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基、IgG Fc段突变体。

所述的冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基与IgG Fc段突变体之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-50个氨基酸；较佳地包括1-30个或包括2～20个氨基酸。作为本发明的优选方式，所述的冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基、IgGFc段突变体之间进行直接相连接。本发明人发现，即使不使用一些柔性连接肽的辅助，所述的冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基、IgG Fc段突变体之间也能实现兼容且发挥良好的生物活性。

另一方面，本发明还提供了编码所述的融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。任何编码所述的融合多肽的核酸都适用于本发明。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。

编码本发明融合多肽的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基、IgG Fc段突变体氨基酸的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明融合多肽的DNA序列。

本发明还提供了包含编码所述融合多肽的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合多肽的表达。

多种合适的载体可被应用于本发明中，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，例如可参考Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。较佳地，所述的表达载体为酵母细胞适用的表达载体。

此外，含有编码所述融合多肽的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，优选地为真核细胞，常用的真核宿主细胞包括哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞，优选地为哺乳动物细胞。在本发明的优选方式中，采用真核细胞为293细胞，CHO细胞；更优选地为Expi293F细胞。

生产本发明的融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有融合多肽编码核酸的重组细胞。所述方法还可包括融合多肽的分离和/或纯化。

可将上述制备获得的融合多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

疫苗组合物/制剂/试剂盒

本发明获得的融合多肽，当与适当的佐剂(如铝佐剂)混合时，免疫原性理想。

因此，本发明提供了一种具有免疫原性的疫苗组合物，其是预防性或治疗性疫苗，所述的组合物包含：有效量的本发明所述的融合多肽，和药学上或免疫学上可接受的载体。本发明中，所述的疫苗组合物也可称为免疫原性组合物。

作为本发明的优选方式，所述的疫苗组合物中，以铝佐剂作为佐剂，本发明人发现，该铝佐剂与所述融合多肽配伍后，该融合多肽的免疫效果是非常优异的。

作为本发明的优选方式，所述的疫苗组合物中，所述的融合多肽与铝佐剂按照重量比例为1～20:1000；较佳地为1～10:1000。

可将所述的组合物制成多种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：溶剂、乳剂、悬浮剂、冻干剂。优选地，所述的剂型是适于注射的剂型。

本发明的融合多肽或疫苗组合物在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中检测。这种动物模型系统包括但不限于小鼠、兔和猴。

本发明的疫苗组合物可用于保护或治疗易感染的哺乳动物，尤其是人，较佳地经由全身或粘膜途径给予所述疫苗。所述的给药可包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射。因此本发明其中一个方面是使人类宿主免疫而抵抗2019-nCoV(COVID)病毒导致的疾病，该方法包括给予所述宿主免疫保护剂量(有效量)的本发明的疫苗组合物。

可以调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0.00001-100mg/kg体重。特定疫苗的最佳用量可通过标准研究确定，该标准研究包括观察受试者中的适宜免疫反应。初次接种后，受试者可接受一次或若干次适当间隔的加强免疫。

此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的融合多肽或疫苗组合物优选是无菌的。使得这些融合多肽或疫苗组合物无菌的方法为本领域所熟知。对于给药对象的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。

本发明的疫苗组合物具有免疫保护性且无毒性，并适于各个年龄层的人使用。

本发明还提供了一种药盒，所述的药盒中含有所述的疫苗组合物；或者所述的药盒中同时含有所述的融合多肽与佐剂，在使用时，将它们按照一定的配比进行混合。较佳地，所述的药盒中还可包含说明所述的重疫苗组合物的使用方法的使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、蛋白序列改造以及质粒构建

1、蛋白序列改造

为了获得可以高效表达且适用于制备疫苗的蛋白，本发明人针对新型冠状病毒2019-nCoV进行了深入的研究和比较，进行蛋白的序列改造，并通过重组表达来选择。在本发明人反复实验分析的基础上，建立了一系列重组蛋白改造方案，表1中为部分重组蛋白序列信息。

表1、重组蛋白序列信息

表1中，1-15位氨基酸MFVFLVLLPLVSSQC为信号肽，加粗黑氨基酸序列为S1功能蛋白区域，下划线氨基酸为Fc蛋白区域。

2、重组质粒构建

(1)实验材料及试剂

Taq酶&pBO酶，dNTP，感受态细胞，实验用水，T4 DNA连接酶，重组酶(Clone EZEnzyme)，内切酶(NEB)，pcDNA3.4质粒，均获自金斯瑞(Genscript)。

(2)质粒构建

上述蛋白序列的编码基因，根据人源表达宿主进行了密码子优化，优化宿主为Human，优化序列中过滤了EcoRI，HindIII。

将上述经密码子优化的蛋白序列的编码基因，插入到pcDNA3.4质粒的多克隆位点中，构建重组质粒。

实施例2、重组蛋白的表达

1、Expi293F细胞的复苏

(1)生物安全柜紫外灭菌30min，培养基复温，准备15ml离心管；

(2)从液氮中取出Expi293F细胞，在37℃水浴锅中解冻；

(3)解冻完全后，用酒精擦拭冻存管，放入生物安全柜中；

(4)取10ml培养基于离心管内，将细胞放入离心管内，轻轻混匀；

(5)1000rpm，5min离心；

(6)离心完毕后，弃上清，加入新的培养基5ml，轻轻混匀；

(7)在125ml摇瓶中加入25ml培养基，将细胞重悬液加入其中，终体积30ml；

(8)将摇瓶放入摇床，37℃，125rpm，二氧化碳浓度8％，25mm直径轨道条件培养。

2、Expi293F细胞的培养

(1)Expi293F细胞接种密度为0.4～0.6×10⁶时，需培养3天至密度为3～5×10⁶；

(2)Expi293F细胞接种密度为0.2～0.4×10⁶时，需培养4天至密度为3～5×10⁶；

2.3当细胞密度为3～5×10⁶时，进行细胞计数，新鲜加入新培养基，将细胞密度调整为0.4～0.6×10⁶即可继续培养。

3、Expi293F细胞的冻存

(1)准备细胞冻存管，程序降温盒，90％培养基加10％DMSO配制冻存液；

(2)当细胞密度为3～5×10⁶时，活率大于95％时，可进行冻存；

(3)将细胞放入离心管中，1000rpm，5min离心；

(4)吸弃上清，加入冻存液将细胞密度调整至1.0×10⁷，分装至1ml冻存管内；

(5)放入程序降温盒中，放入-80℃冰箱过夜后，放入也液氮中长期保存。

4、转染条件

蛋白表达流程：

DAY-1(第-1天，第0天的前1日)调整细胞密度为2.5～3.0×10⁶；

DAY0(第0天)细胞密度为4.5～5.5×10⁶，活率大于95％，调整细胞密度为3.0×10⁶，将稀释的转染试剂加入到稀释的DNA中，孵育10～20min，加入到细胞；

DAY4～7(第4～7天)收获分泌蛋白

以125ml摇瓶，30ml培养体系为例，进行转染试剂的选择，DNA用量，转染试剂用量的优化：

(1)当用Thermo Expi293F表达系统时，过程和实验条件如下：

(2)DAY-1天，调整细胞密度为2.5～3.0×10⁶，培养过夜；

(3)DAY 0天，去少量细胞计数，活率要大于95％，补新鲜培养基，调整细胞密度为3.0×10⁶，体积25ml，放入125ml摇瓶中；

(4)取1.5ml Opti-MEM稀释质粒DNA，DNA的用量分别为3ug/ml，当DNA浓度为1ug/ul时，总量分别为30ul，加入后轻轻混匀；

(5)取1.4ml Opti-MEM稀释转染试剂，转染试剂的用量为9ul/ml，总量90ul，加入后轻轻混匀；

(6)将稀释好的转染试剂加入到稀释好的DNA中，轻轻混匀，室温静置10min；

(7)将混合液加入到培养瓶中，放于摇床上培养；

(8)DAY6(第6天)收获蛋白。

5、蛋白摇瓶表达的结果

为了实现蛋白的良好表达，本发明人首先如前述进行了序列优化；进一步地，还进行了适用的宿主细胞的选择，确定以Expi293F作为重组表达的宿主细胞。

Expi293F细胞瞬时转染细胞的细胞图如图1所示。根据图1可见，Expi293F细胞转染后，细胞状态非常好，能够有效地表达重组蛋白。

在转染后第6天Expi293F蛋白表达质粒转染Expi293F细胞收集的细胞培养基上清中。S1-Fc重组蛋白表达的表达量(DAY6)如图2；其中，空白对照为未转染质粒的空白Expi293F细胞培养基上清。根据图2可见，应用Expi293F细胞，重组蛋白最高表达量能过够达到2000ug/L，即2mg/L。

S1-Fc重组表达起始后的不同时间，Expi293F细胞蛋白表达量与细胞活率随培养时间变化图如图3所示。该结果显示，Expi293F细胞转染后，随着培养时间的延长，重组蛋白的表达量逐渐增高，收集到DAY6天的细胞培养基上清，蛋白表达量已经达到2mg/L。

通过规模化表达工艺优化(转染质粒量、PEI含量，质粒与PEI比例、转染时细胞密度、补料工艺等)，Expi293F细胞在表达量上可有大幅度提升，能够达到20mg/L以上。

实施例4、蛋白层析纯化

1、实验材料及试剂

层析柱(GE)，Tris(sigma)，Nacl(sigma)，咪唑(MACKLIN)，AKTA pure(GE)，CaptoQ(GE)，SP-HP(GE)，Superdex 200(GE)，

2、实验步骤

A.His亲和纯化的方法(适用于不带Fc的蛋白)包括：

(1)样品的澄清过滤：使用50ml注射器以及0.22μm滤膜将准备好的细胞悬液上清进行澄清；

(2)采用蛋白层析柱，在AKTA上进行捕获、纯化；

(3)进行系统冲洗，再用平衡液冲洗AKTA的A1泵，洗脱液冲洗B1泵；

(4)设置好系统流速1ml/min，选择相应的柱位1号位连接蛋白层析柱，用平衡液对AKTA及柱子进行平衡，平衡结束后紫外调零；

(5)开始上样，将A1泵转移至上样离心管内上样；

(6)上样结束后，将A1泵转移至平衡缓冲液中，冲洗平衡液至检测波长稳定后分布洗脱，收集洗脱液；

(7)再用平衡液A冲洗，最后冲20％的乙醇，保存。

结果，获得高纯度的蛋白；上述纯化过程适用于表1中的各个蛋白序列。

B.Fc纯化步骤(Protein A纯化工艺)

平衡缓冲液A：20mM PB，150mM NaCl，pH7.0；

洗脱缓冲液B：100mM Gly，pH3.0；

洗脱缓冲液C：100mM Gly，pH2.7；

(1)样品的澄清过滤浓缩：使用切向流将细胞上清体积浓缩10倍；

(2)采用蛋白层析柱，在AKTA上进行捕获、纯化；

(3)进行系统冲洗，先用平衡液A冲洗AKTA的A1泵，洗脱液B冲洗B1泵，洗脱液C冲洗B2泵；

(4)设置好系统流速1ml/min，选择相应的柱位2号位连接蛋白层析柱，用平衡液对AKTA及柱子进行平衡，平衡结束后紫外调零；

(5)开始上样，将A1泵转移至上样离心管内上样；

(6)上样结束后，将A1泵转移至平衡缓冲液A中，冲洗平衡液至检测波长稳定后，分别用洗脱液B和洗脱液C一步洗脱，收集洗脱液；

(7)最后用平衡液A清洗，使用结束后，用纯水替换平衡缓冲液A，然后用20％乙醇保存。

实施例5、动物免疫实验流程以及实验方法

利用前述表达的蛋白，进行动物免疫实验。免疫实验流程图如图4所示；免疫策略如下：

d-5：第一次免疫前5天；

d-0：第一次免疫时间；

d13、d15、d22、d25、d32：分别第一次免疫后的天数，对应箭头为当天进行的实验操作，“采血”指活体采血操作，“免疫”为注射本发明前述表达的重组蛋白免疫原。第15天(d15)进行第二次免疫；第25天(d25)进行第三次免疫。

动物免疫实验具体步骤包括：

1、将体重、周龄均值一致的C57小鼠随机分为10组。

2、实验开始前，小鼠各收集免疫前血清(DAY-5收集免疫前血清，通过眼球取血，适量取血，保证小鼠正常状态)，收集好的血清存于-80℃。

3、加铝佐剂(氢氧化铝佐剂)组配制方式：免疫前，每一抗原在75μL PBS中分别稀释至对应剂量(5ug/只小鼠)，并与明矾佐剂(1mg/只小鼠)混合，按照体积抗原:佐剂＝3:1(即75ul免疫原稀释液中加入25ul佐剂)；佐剂使用前摇匀，将注射佐剂(25ul)缓慢滴加至免疫原溶液中；佐剂与免疫原稀释液充分混合后，两者充分混合30分钟。使佐剂有效吸附抗原；后续根据免疫动物实验操作进行。

4、不加铝佐剂组：抗原在100μL PBS中分别稀释至上述表中的对应剂量，100μL的免疫原，后续根据免疫动物实验操作进行。

5、以2周的间隔皮下注射：实验设计为3次免疫方式，但分别在每一次免疫注射7天后眼球取血，离心法获得部分小鼠上清，先进行血清滴度检测，最后一次免疫结束7天后，心脏取血取最大血量，离心获得上清，存于-80℃；

6、整个实验过程，从d-5开始观察小鼠，每天1次，持续到试验终点。

7、观察内容：笼旁观察动物的死亡或濒死、精神状态、行为活动、粪便性状、饲料和饮水的供应情况等。

8、外观体征：观测包括眼、鼻、口、尿道口、肛周、生殖器外周有无异常，动物是否消瘦等的观察；注射部位红、肿、结痂等异常变化；行为活动：有无活动减少、运动失调、精神萎靡或过度兴奋、躁动惊跳、肌肉麻痹或震颤、步态异常等。

9、呼吸：观测有无呼吸困难。

10、排泄：观测有无血尿、稀便、血便，是否排便异常等。

11、死亡率：如有濒死或死亡，记录死亡数，及时解剖；其中濒死动物尽快安乐死，采集最大量血清。

实例例6、酶联反应检测动物抗体滴度

1、IgM抗体滴度检测方式

(1)底板包被：将所用抗原用包被稀释液稀释到3ug/ml，每孔各加入配好的包被液100μl，置4℃冰箱，放置24h。

(2)24h后，从冰箱取出后置于37℃平衡30min，之后弃去孔中液体；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(3)封闭酶标反应孔：每孔加入200ul 5％小牛血清后置37℃封闭90min.封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(4)加入待检测样品：将样本按照需要的比例进行稀释，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100μl，置于37℃，90min；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(5)加入酶标抗体：按照说明书加入适宜浓度的二抗；37℃，90min之间，每孔加100μl洗涤同前。

(6)加入底物液：底物加入量每孔100μl，置37℃避光放置15～30min。

(7)终止反应：每孔加入终止液50μl终止反应，于20min内测定实验结果。

2、IgM抗体滴度检测结果

免疫小鼠后，IgM检测数据如表2和图5。

表2

表2和图5结果说明，三组疫苗+佐剂组能够产生一定的抗体滴度；其中以“S1-Fc+佐剂”组的抗体滴度最高：常规免疫1次后即能检测IgM抗体滴度高达到1:12800(与PBS对照比较)；常规加强免疫2-3次，该重组蛋白疫苗后续能产生非常高的免疫抗体。

3、IgG抗体滴度检测方式

试验流程

包被→洗涤→封闭→洗涤→加样→孵育→洗涤→二抗→孵育→洗涤→显色液→终止液→读数。

试剂配制

样品稀释液(PBS，pH7.4)：NaCl 0.8g，KHPO₄ 0.02g，Na₂HPO₄.12H₂O 0.29g，KCl0.02g，叠氮钠0.01g，加双蒸水至1000mL，调pH至7.4。

清洗液(0.5％PBST)：吐温-20 2.5mL，1×PBS(pH7.4)500mL。

包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH＝9.6)：碳酸钠0.15g，碳酸氢钠0.29g，叠氮钠0.02g，加双蒸水至100mL，调pH至9.6。

封闭液(5％小牛血清/PBS溶液)：小牛血清5mL，1*PBS(pH7.4)95mL。

详细步骤如下：

(1)底板包被

将所用抗原用包被稀释液稀释至0.5ug/ml，每孔抗原加入100μl，置4℃，24h；弃去孔中液体。

(2)封闭酶标反应孔

5％小牛血清置室温封闭90min，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍1min。

(3)加入待检测样品

将样本按照下表中进行稀释，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100μl，置于室温孵育，90min。用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍1min。

(4)加入酶标抗体

按照说明书加入适宜浓度的二抗1:4000稀释，室温孵育60min之间，每孔加100μl，洗涤同前。

(5)加入底物液

(6)底物加入量：每孔100μl，置室温避光放置20分钟以内，根据颜色判断孵育时间，加入终止液显色。

(7)终止反应

每孔加入终止液50μl终止反应，于20min内测定实验结果，测定结果时间不宜太久。

4、IgG抗体滴度检测结果

免疫小鼠后，IgG检测数据如表3和图6所示。

表3

稀释倍数	1∶200	1∶400	1∶800	1∶1600	1∶3200	1∶6400	1∶12800	1∶25600	1∶51200
										佐剂	0.144	0.100	0.075	0.066	0.055	0.066	0.065	0.059	0.066
RBD-FC-佐剂	2.841	1.822	1.069	0.602	0.328	0.198	0.124	0.096	0.124
										RBD+佐剂	0.397	0.242	0.161	0.116	0.127	0.084	0.072	0.055	0.088
HOPE-V+佐剂	1.441	0.905	0.576	0.295	0.160	0.118	0.104	0.081	0.075
										S1-FC+佐剂	3.741	3.665	3.214	2.263	1.323	0.763	0.422	0.205	0.156

表3和图6结果说明，有的组能够产生较高的抗体滴度，加强免疫1次后IgG抗体滴度最高达到1∶12800。其中以“S1-Fc+佐剂”组的抗体滴度显著最高，大大高于其它组。

实施例7、假病毒中和实验方法

假病毒中和实验的操作步骤如下：

1、细胞铺96孔板

细胞：293T-ACE2细胞；

培养基：DMEM+10％FBS，DMEM培养基母液；

铺板密度：30000细胞/孔；

铺板后细胞放入37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。

2、样品与假病毒中和过程

稀释：样品按以1∶5的浓度进行稀释。

3、孵育和加样

样品组：每种药物稀释到上述检测浓度，分别取25μL和假病毒混合，25μL加入到提前铺板的293T-ACE2细胞上，37℃孵育1小时，然后将药物和病毒加入细胞中，每个样品5个复孔。

阳性孔：假病毒和DMEM培养基母液取等体积混合后，37℃孵育1小时，加入到提前铺板的293T-ACE2细胞上，5个复孔。

阴性孔：DMEM培养基母液37℃孵育1小时，加入到提前铺板的293T-ACE2细胞上，5个复孔。

将样品和阴阳性对照添加到细胞上后，37℃，5％CO2培养箱中继续培养48-72小时。

4、结果观察

用化学发光仪对96孔板中的样品进行Luciferase发光值(RLU)检测；发光值(RLU读值)越低表明中和效果越好。

第一次免疫后22天(d22)，免疫小鼠血清假病毒中和实验结果如表4和图7，包括RLU读值(图7上图)和中和活性(图7下图)。其中S-ECD是全长的COVID-19S-ECD蛋白的同条件免疫的结果数值。

表4

从表4和图7的结果可以看出，相同的重组蛋白加佐剂与不加佐剂对比，不加佐剂并不能产生高效中和假病毒的能力，而佐剂的应用则使得中和能力大大提高。其中S-Fc组的中和百分比高达75.5％。

这一结果说明，本发明的疫苗制备方案中，佐剂的应用非常重要。

免疫第二次后(d32)进行假病毒实验，检测中和活性的结果如表5。

表5

从免疫第三次的假病毒检测结果可以看出，S1-Fc+佐剂组最佳中和假病毒的中和效果可以达到97.41％。

实施例8、P3实验室SARS-COV2真病毒挑战实验

真病毒中和实验的操作步骤如下：

1、该实验在P3实验室进行，利用SARS-CoV-2株2019n-CoV真病毒株(来自深圳P3实验室)。

2、病毒在指定的生产细胞中传代，将血清稀释液与10²个SARS-CoV-2在37℃下培养1小时。

3、将血清-病毒复合物添加到96孔板中的所示细胞单层中，并在37℃下培养1小时。随后，细胞在补充有2％FBS的MEM中覆盖1％(w/v)甲基纤维素。

4、30小时后取下覆盖物，用4％多聚甲醛固定。

5、室温下PBS中的多聚甲醛固定20分钟。清洗培养板，并依次用1μg/mL的CR3022抗S抗体和HRP结合的山羊抗人IgG在PBS中进行孵育。用真蓝过氧化物酶底物(KPL)观察SARS-CoV-2感染的细胞病灶，并在免疫斑点微分析仪(细胞)上进行定量分析。

第一次免疫后第22天(d22)，采血进行病毒中和活性的检测，结果如表6和图8。

表6

根据表6，第一次免疫后第22天，“S1-FC+佐剂”能产生大量中和抗体(n＝3)。

第一次免疫后第32天，采血进行病毒中和活性的检测，结果如表7(其中数字代表中和真病毒的能力，即中和抗体百分比(％))。

表7

第一次免疫后第32天，从真病毒中和实验的结果可以看出，S1-Fc+佐剂组相比较佐剂对照以及其他实验组，有更高的中和百分比，说明S1-Fc+佐剂组免疫小鼠后能产生更高的中和抗体来中和SARS-COV-2病毒。

上述体外SARS-COV2真病毒中和实验证明，本发明的S1-FC+佐剂有明显的中和真病毒的中和抗体产生(n＝4)。

总结

1、关于佐剂

根据上述的SARS-COV-2真病毒中和实验，关于应用或不应用佐剂的比较如表8和图9(数值来自于表6、图8上图)。

表8

结果显示，将加佐剂与不加佐剂组进行比较，本发明选出的S1-Fc重组蛋白序列相同条件进行小鼠免疫，进行体外真病毒中和实验，其中不加佐剂组与对照组结果一致，均呈阴性，没有中和抗体产生，而S1-Fc+佐剂组，组内所有小鼠全部产生中和抗体。这一结果说明，本发明的疫苗制备方案中，佐剂的应用不可或缺。

2.Fc片段工艺

Fc重组蛋白是具有生物活性的功能蛋白分子与Fc片段融合，本发明人发现其需要进行一定的改造以获得更好的效果。

根据上述的SARS-COV-2真病毒中和实验，关于Fc不同突变体的结果总结如表9和图10。

表9

这一结果说明，本发明的疫苗制备方案中，Fc与本发明的蛋白的融合具有重要的作用。

不同的Fc突变体在效果上有显著性不同，“S1-Fc+佐剂”组与“S1-D614-FC”组相比，除了1个aa的随机突变(病毒自然突变，本发明人未发现其构成免疫性方面的实质上大的不同)外，主要区别在于Fc运用了不同的Fc突变体。

根据图7的假病毒中和实验结果可见，“S1-Fc+佐剂”组显然具有更好的效果；根据图8的真病毒中和实验结果也可见“S1-Fc+佐剂”组显然具有更好的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 厚朴生物科技（苏州）有限公司

<120> 针对新型冠状病毒的疫苗以及其应用

<130> 207011

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 917

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(917)

<223> 融合多肽

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

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420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

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Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

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Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

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500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

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530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

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565 570 575

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Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

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610 615 620

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Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

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915

<210> 2

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(476)

<223> 融合多肽

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg

1 5 10 15

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

20 25 30

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

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165 170 175

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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

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290 295 300

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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

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<210> 3

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(685)

<223> 融合多肽

<400> 3

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

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355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg

675 680 685

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(238)

<223> RBD结构域

<400> 4

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Arg

1 5 10 15

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

20 25 30

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

35 40 45

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

50 55 60

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

65 70 75 80

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

85 90 95

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

100 105 110

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

115 120 125

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

130 135 140

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

165 170 175

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

180 185 190

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

195 200 205

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

210 215 220

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

225 230 235

<210> 5

<211> 923

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(923)

<223> 融合多肽

<400> 5

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ala Asp Asp

675 680 685

Asp Asp Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

690 695 700

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

705 710 715 720

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

725 730 735

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740 745 750

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755 760 765

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770 775 780

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785 790 795 800

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

805 810 815

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820 825 830

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

835 840 845

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

850 855 860

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

865 870 875 880

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

885 890 895

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

900 905 910

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

915 920

Claims

1.一种改造冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基以提高其免疫原性的方法，包括：将冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基与定点突变的IgG Fc连接。

2.一种融合多肽，包含相互连接的以下的蛋白：冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基，以及定点突变的IgG Fc。

3.如权利要求1或2所述，其特征在于，所述定点突变的IgG Fc的氨基酸序列如SEQ IDNO:1中第686～917位所示；或

所述冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第16～685位或第1～685位所示；或如SEQ ID NO:5中第16～685位或第1～685位所示；或

其从氨基端到羧基端依次包含：冠状病毒刺突糖蛋白S1亚基，定点突变的IgG Fc。

4.一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求2～3任一所述的融合多肽。

5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求4所述的核酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求5所述的载体或其基因组中整合有权利要求4所述的核酸；较佳地，所述的细胞为真核细胞；更佳地，所述细胞包括：293细胞，CHO细胞。

7.权利要求2～3任一所述的融合多肽的用途，用于制备2019-nCoV(COVID)病毒的疫苗。

8.一种针对2019-nCoV(COVID)病毒的疫苗，其包括：

权利要求2～3任一所述的融合多肽；以及

铝佐剂。

9.一种制备针对2019-nCoV(COVID)病毒的疫苗的方法，包括将权利要求2～3任一所述的融合多肽与铝佐剂混合；较佳地，所述的融合多肽与铝佐剂按照重量比例为1～20:1000；较佳地为1～10:1000。

10.一种定点突变的IgG Fc或编码其的核酸，其特征在于，所述定点突变的IgG Fc具有如SEQ ID NO:1中第686～917位所示的氨基酸序列。

11.一种用于免疫以产生抗2019-nCoV(COVID)病毒的抗体的药盒，其特征在于，所述药盒中包括：

容器，以及装于容器中的权利要求8所述的疫苗；或

容器以及装于容器中的权利要求2～3任一所述的融合多肽，及容器以及装于容器中的铝佐剂。