CN112480268A

CN112480268A - 一种新型冠状病毒的重组亚单位疫苗及其应用

Info

Publication number: CN112480268A
Application number: CN202011454175.1A
Authority: CN
Inventors: 贠炳岭; 张海江; 刘永江; 张爱晶; 王艳; 陈晓; 张尧; 银飞; 伍树明
Original assignee: Beijing Kangleweishi Biological Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Kangleweishi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2040-12-10
Also published as: ZA202209123B; WO2022121322A1; CN112480268B

Abstract

本发明公开一种含有新型冠状病毒COVID‑19疫苗的抗原表位的融合蛋白，所述融合蛋白由新型冠状病毒COVID‑19疫苗的抗原表位片段和免疫球蛋白Fc片段构成，其中新型冠状病毒COVID‑19疫苗的抗原表位片段是S1亚基中的RBD片段和SD1片段。本发明经过研究和探索，发现在RBD的基础上融合SD1，可以增加其柔韧和可变性，容易形成头对尾的结构，结构更加稳定，相对于仅融合RBD更具有优势。进一步通过实验表明本发明获得的抗原表位的融合蛋白具较好的免疫特性和稳定性，其效果显著优于仅融合RBD时的效果。

Description

一种新型冠状病毒的重组亚单位疫苗及其应用

技术领域：

本发明属于生物及医药技术领域，具体涉及新型冠状病毒的重组亚单位疫苗及其应用，更具体涉及在通过基因工程手段人工合成的病毒基因在真核细胞中表达出有免疫活性的重组亚单位蛋白，并且利用表达出的重组蛋白研制成疫苗的方法。

背景技术：

新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。新冠病毒SARS-CoV-2的结构蛋白包括S蛋白、N蛋白、E蛋白、M蛋白。对于SARS-CoV-2而言，只有直接针对S蛋白的中和抗体才能够中和病毒的毒力、阻止病毒对机体的感染，冠状病毒外套膜上的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)是病毒感染过程中识别宿主细胞受体的一种关键蛋白，S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中S1亚基中包含受体结合结构域(Receptor Binding Domain,RBD)介导吸附作用，S2亚基主要体现融合活性。

新型冠状病毒COVID-19严重危害人们的生命健康，重在预防，因此疫苗能够非常有效的预防护病毒感染。针对新型冠状病毒COVID-19，已经有一些研究获得相关的疫苗，例如CN111333704A的专利申请中筛选和优化了可以用于制备新型冠状病毒COVID-19疫苗的优势抗原表位片段，并将该蛋白片段与人Fc片段融合，制备成新型的病毒疫苗。而2020年5月22日《The Lancet》重磅刊发我国首个由于军事科学院军事医学研究院生物工程研究所COVID-19疫苗I期临床试验结果，结果表明国内进入人体试验阶段的新型冠状病毒疫苗目前试验结果反馈良好，单一剂量的新5型腺病毒载体COVID-19(Ad5-nCoV)疫苗在14天内产生的特异抗体和T细胞，相关的疫苗已申请专利。

但是基于新型冠状病毒的特点，仍需开发有效的结果可靠的疫苗。

发明内容：

对此，本发明通过基因重组表达技术，把S1亚基中的RBDSD1序列和人Fc序列融合表达，研制出一种新型的疫苗。本发明经过研究和探索，通过同源建模，推断SD1序列有稳定RBD结构的作用，与仅融合单独的RBD相比，进一步融合SD1可以增加一对二硫键(在氨基酸第591到538位间)，如此可让整个结构更加稳定，由此构成本发明的基础。进一步通过实验表明其效果非常好，最终完成本发明。

本发明首先提供一种含有新型冠状病毒COVID-19疫苗的抗原表位的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由新型冠状病毒COVID-19疫苗的抗原表位片段和免疫球蛋白Fc片段构成，其中新型冠状病毒COVID-19疫苗的抗原表位片段是S1亚基中的RBD片段和SD1片段。

优选地，所述RBD片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述SD1片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc片段选自于人、小鼠、兔子、牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、或豚鼠的免疫球蛋白Fc片段；进一步地，所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc片段；其中优选地，所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG1 Fc片段、IgG2 Fc片段、IgG3 Fc片段、或IgG4 Fc片段；尤其优选地，所述免疫球蛋白Fc片段是人IgGFc片段，最优选地其是如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

最优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

本发明相应提供根据所述的融合蛋白的编码核酸，优选地，其中RBD片段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或其简并序列；所述SD1片段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示或其简并序列；所免疫球蛋白Fc片段编码核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或其简并序列。最优选地，融合蛋白的编码核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示或其简并序列。

本发明进一步提供含有如所述的编码核酸的重组载体、重组细胞。

本发明还提供一种新型冠状病毒COVID-19疫苗，其特征在于，所述疫苗包含所述的融合蛋白。进一步还包括佐剂，例如氢氧化铝。其中，所述融合蛋白通过化学合成，或基因重组方法获得。

本发明经过研究和探索，通过同源建模和实验发现在RBD的基础上融合SD1，可以增加其柔韧和可变性，容易形成头对尾的结构，结构更加稳定，相对于仅融合RBD更具有优势；同时，由于与Fc片段融合可以形成二聚体，进一步推测增加免疫原性和更加提高的稳定性。本发明步通过实验表明本发明获得的抗原表位的融合蛋白具较好的免疫特性和稳定性，其效果显著优于仅融合RBD时的效果。

附图说明

图1：质粒构建核酸胶以及双酶切鉴定(HindIII和XhoI)电泳图。加样顺序：A1：pcDNA3.1-RBD质粒，A2：pcDNA3.1-RBD双酶切鉴定(HindIII和XhoI)，A3：DNA Marker。B1：pcDNA3.1-RBD-Fc质粒，B2：pcDNA3.1-RBD-Fc双酶切鉴定(HindIII和XhoI)，B3：DNAMarker。C1：pcDNA3.1-RBDSD1-Fc质粒，C2：pcDNA3.1-RBDSD1-Fc双酶切鉴定(HindIII和XhoI)，C3：DNA Marker。

图2：SDS-PAGE电泳图。加样顺序：蛋白Marker，RBD，RBDSD1-Fc，RBD-Fc。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例一、载体构建

通过化学合成的方法，由北京六合华大基因科技有限公司合成目的基因序列。其中，

RBD核苷酸序列如下(SEQ ID NO：1)：

ATGTTTGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCACTGGTGTCCAGCCAGTGTAGGGTCCAACCAACAGAGAGCATTGTGAGGTTTCCAAACATCACCAACCTGTGTCCATTTGGAGAGGTGTTCAATGCCACCAGGTTTGCCTCTGTCTATGCCTGGAACAGGAAGAGGATTAGCAACTGTGTGGCTGACTACTCTGTGCTCTACAACTCTGCCTCCTTCAGCACCTTCAAGTGTTATGGAGTGAGCCCAACCAAACTGAATGACCTGTGTTTCACCAATGTCTATGCTGACTCCTTTGTGATTAGGGGAGATGAGGTGAGACAGATTGCCCCTGGACAAACAGGCAAGATTGCTGACTACAACTACAAACTGCCTGATGACTTCACAGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGAGGCAACTACAACTACCTCTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCATTTGAGAGGGACATCAGCACAGAGATTTACCAGGCTGGCAGCACACCATGTAATGGAGTGGAGGGCTTCAACTGTTACTTTCCACTCCAATCCTATGGCTTCCAACCAACCAATGGAGTGGGCTACCAACCATACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTTGAACTGCTCCATGCCCCTGCCACAGTGTGTGGACCAAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGTGTGAACTTC。

其编码的RBD氨基酸序列如下(SEQ ID NO：2)：

MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF

SD1核苷酸序列如下(SEQ ID NO：4)：

AACTTCAATGGACTGACAGGCACAGGAGTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAACAGTTTGGCAGGGACATTGCTGACACCACAGATGCTGTGAGGGACCCACAGACCTTGGAGATTCTGGACATCACACCATGTTCC

其编码的SD1氨基酸序列如下(SEQ ID NO：3)：

NFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS

hFc核苷酸酸序列如下(SEQ ID NO：6)：

GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

其编码的hFc氨基酸序列如下(SEQ ID NO：5)：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

RBDSD1-hFc核苷酸序列如下(SEQ ID NO：8)：

aagcttgccaccATGTTTGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCACTGGTGTCCAGCCAGTGTAGGGTCCAACCAACAGAGAGCATTGTGAGGTTTCCAAACATCACCAACCTGTGTCCATTTGGAGAGGTGTTCAATGCCACCAGGTTTGCCTCTGTCTATGCCTGGAACAGGAAGAGGATTAGCAACTGTGTGGCTGACTACTCTGTGCTCTACAACTCTGCCTCCTTCAGCACCTTCAAGTGTTATGGAGTGAGCCCAACCAAACTGAATGACCTGTGTTTCACCAATGTCTATGCTGACTCCTTTGTGATTAGGGGAGATGAGGTGAGACAGATTGCCCCTGGACAAACAGGCAAGATTGCTGACTACAACTACAAACTGCCTGATGACTTCACAGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGAGGCAACTACAACTACCTCTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCATTTGAGAGGGACATCAGCACAGAGATTTACCAGGCTGGCAGCACACCATGTAATGGAGTGGAGGGCTTCAACTGTTACTTTCCACTCCAATCCTATGGCTTCCAACCAACCAATGGAGTGGGCTACCAACCATACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTTGAACTGCTCCATGCCCCTGCCACAGTGTGTGGACCAAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGTGTGAACTTCAACTTCAATGGACTGACAGGCACAGGAGTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAACAGTTTGGCAGGGACATTGCTGACACCACAGATGCTGTGAGGGACCCACAGACCTTGGAGATTCTGGACATCACACCATGTTCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGActcgag

RBDSD1-hFc氨基酸序列(SEQ ID NO：7)

MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

由基因公司直接合成的方式将上述目的基因(即RBD、RBD-Fc和RBDSD1-Fc)构建到pcDNA3.1表达载体，分别获得DNA质粒pcDNA3.1-RBD、pcDNA3.1-RBD-Fc、pcDNA3.1-RBDSD1-Fc。并通过凝胶电泳进行了验证。

质粒的酶切：取质粒DNA，按下表中的酶切反应体系Xho I酶、Hand III酶进行酶切，于37℃，恒温培养箱中反应2h，随后进行凝胶电泳。

	双酶切
		质粒DNA	4μl
10×buffer4	1μl
		Hind III	0.5μl
Xho I	0.5μl
		注射用水	4μl
总体积	10μl

琼脂糖凝胶的制备及电泳步骤如下：

(1)用电子天平称取0.5g琼脂糖，加入1×TAE 50mL，在微波炉中加热溶解，混匀，冷却至55℃左右时，倒入已准备好的制胶槽中，插上样品梳。

(2)待胶凝固后，拨去梳子，放入加有足够1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm。

(3)将经酶切后的质粒DNA加入2μl 6×载样缓冲液，混匀，然后用微量移液器加入样品孔中，同时用合适的DNA分子量标准品作对照。

(4)接通电极，在110v/cm凝胶的电压下恒压进行电泳，DNA由负极向正极移动。

(5)当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。

(6)准备一个容器，倒入50mL的1×TAE电泳缓冲液，加入15μl GelredTM，混匀，把电泳胶放入容器中，避光染色30min。

(7)在紫外凝胶成像仪下观察，酶切片段的大小。预期pCDNA3.1大小为5.6Kb，RBD的大小为715bp，RBDhFc大小为1399bp，RBDSD1hFc的大小为1549bp。如图1所示，验证正确的情况下进行后续的实验。

实施例二、细胞瞬转

①转染前一天按照2.0×10⁶cells/mL密度接种，培养第二天细胞密度可至4.0×

10⁶cells/mL左右；

②培养第二天细胞计数后，细胞活率＞95％，活细胞密度≥4.0×

10⁶cells/mL，可直接使用；若细胞密度低于4.0×10⁶cells/mL，可通过离心(800rpm，5min)收集细胞，将细胞以4.0×10⁶cells/mL密度重悬于Transpro CD01培养基中；

③按照优化后的瞬转工艺，制备DNA和PEI混合液；

④将混合液加入到培养液中，进行培养；

⑤培养18h后，建议补加一次终浓度为2mM丙戊酸(VPA)和初始培养体积5％+0.5％DN feed2+DN feed B2，可进一步提高活细胞密度和蛋白表达量，瞬转后培养过程若出现细胞结团现象，可以添加0.05-0.10g/L硫酸葡聚糖。

⑥培养至7天，或者活力低于60％，结束培养，收集细胞上清，用于蛋白纯化。

实施例三、蛋白纯化

一、对于RBD-Fc，RBDSD1-Fc的纯化采取下述Protein A亲和层析方法

层析柱：AT Protein A Diamond亲和层析介质，柱体积CV：5ml，流速：5ml/min，限压：≤0.3MPa。

预处理：用纯化水冲洗至少5个CV。

平衡：先用洗脱缓冲液淋洗1个CV，后用结合缓冲液充分平衡至少10个CV备上样。

上样：取过滤后CHO悬浮细胞培养物上样至平衡好的层析柱，收集上样流穿，并从中取样100μl用于电泳检测。

淋洗：上样完成后流速提高至5ml/min，用结合缓冲液淋洗至少6个CV至UV基线平。

洗脱：用100％洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱至UV基线平，分管收集各洗脱组分，同时在各收集管内根据收集体积加入适量收集体积的中和缓冲液并混匀。

二、对于RBD的纯化采取下述SP阳离子交换层析

层析柱：SP阳离子交换层析柱，柱体积CV：5ml，流速：5ml/min，限压：≤0.3MPa。

预处理：先用1M NaOH冲洗至少3个CV，后用纯化水冲洗至少10个CV。

平衡：先用SP-B Buffer淋洗2个CV，后用SP-A Buffer充分平衡至少10个CV备上样。

上样：取G25换液收集样品上样至平衡好的层析柱，收集上样流穿，并从中分别取样100μl用于电泳检测。

淋洗：上样完成后流速提高至5ml/min，用SP-A Buffer淋洗至少6个CV至UV基线平。

洗脱：先用0-20％SP-B Buffer，20个CV进行线性洗脱，接着用20-100％SP-BBuffer，10个CV进行线性洗脱，分管收集各洗脱组分。

实施例四、SDS PAGE电泳检测

取纯化过程中收集的各样品按100μl样品+25μl Loading dye(还原型)的比例配制各待电泳样品(沸水浴5min)，然后取适量上样进行电泳，电泳条件为：胶浓度10％，先恒压100V跑15min，后改恒压200V跑至前沿刚好跑出，接着考马斯亮蓝染色，沸水脱色，拍照记录电泳结果(电泳图如图2所示)。用Labworks软件对Protein A亲和层析收集样品对应泳道进行电泳纯度分析，记录分析结果。

实施例五、BCA法蛋白浓度测定

将供试样品用注射用水稀释不同倍数，使稀释后样品浓度在编准品浓度范围内，并记录稀释倍数。将稀释好的对照品溶液、供试品溶液以20ul/孔量加入微孔板，每个样品平行上样3复孔。将甲液(2，2'-联喹啉-4，4'二羧酸钠溶液)：乙液(硫酸铜)按50:1的比例配置适量碱性铜试液，混匀后200ul/孔加入微孔板，37℃温育30min。确保孔中无气泡、孔底洁净后，用酶标仪在570nm处测定吸光度值。各样品3复孔平均值减去空白孔3孔平均值计算最终的光吸收值，用对照品值。对其浓度作标准曲线，A＝a*c+b，计算质控样品和供试品的浓度，结果如下表所示。

实施例六、小鼠免疫和中和抗体检测

将各重组蛋白分别与氢氧化铝佐剂混合，并免疫小鼠。采购30只6-8周雌性BALB/c小鼠，随机分成3组(RBD-Fc，RBDSD1-Fc和阴性对照)，每组10只。每只小鼠肌肉免疫10ug蛋白。每隔两周加强免疫一次，共加强免疫两次。从第一次免疫开始，每隔两周采集小鼠血液，离心取上清，进行中和抗体滴度检测。

中和抗体滴度检测实验方法如下：

1.细胞准备：实验前一天，将约为1x10⁴个细胞/孔的接种量把待感染细胞接种于96孔细胞培养板中。

2.假病毒感染：取出冻存的假病毒置融化，待完全融化后，吸取所需量假病毒加入细胞培养体系中感染目的细胞，病毒感染后6-8H后更换新鲜培养基继续培养。

3.感染检测：细胞感染假病毒48-72H后,通过观察检测荧光素酶的活性判定感染效率。

4.以抑制50％的感染时血清的最大稀释倍数作为中和抗体滴度。

实验结果如下表所示，可以发现RBDSD1-Fc中和抗体滴度远高于RBD-Fc，而且高滴度中和抗体维持时间长。

实施例七、放置稳定性

将纯化的蛋白RBD-Fc和RBDSD1-Fc放入37℃温箱，放置15天(相当于4℃放置两年)，参照实施例六免疫小白鼠，并检测中和抗体，发现37℃温箱放置15天的RBDSD1-Fc蛋白仍然能诱导机体产生高滴度的中和抗体，而37℃温箱放置15天的RBD-Fc蛋白诱导机体的中和抗体滴度相对较低(结果见下表)。

由此可见，RBDSD1-Fc在37℃温箱放置15天，仍然能诱导机体产生高滴度的中和抗体，说明SD1有稳定RBDSD1-Fc蛋白结构的作用。

序列表

<110>北京康乐卫士生物技术股份有限公司

<120>一种新型冠状病毒的重组亚单位疫苗及其应用

<160>8

<170> PatentIn Version 3.1

<210>1

<211> 238

<212>DNA

<213>人工序列RBD

<400> 1

MFVFLVLLPL VSSQCRVQPT ESIVRFPNIT NLCPFGEVFN ATRFASVYAW NRKRISNCVA 60

DYSVLYNSAS FSTFKCYGVS PTKLNDLCFT NVYADSFVIR GDEVRQIAPG QTGKIADYNY 120

KLPDDFTGCV IAWNSNNLDS KVGGNYNYLY RLFRKSNLKP FERDISTEIY QAGSTPCNGV 180

EGFNCYFPLQ SYGFQPTNGV GYQPYRVVVL SFELLHAPAT VCGPKKSTNL VKNKCVNF 238

<210>2

<211> 714

<212>DNA

<213>人工序列RBD

<400> 2

atgtttgtgt tcctggtgct gctgccactg gtgtccagcc agtgtagggt ccaaccaaca 60

gagagcattg tgaggtttcc aaacatcacc aacctgtgtc catttggaga ggtgttcaat 120

gccaccaggt ttgcctctgt ctatgcctgg aacaggaaga ggattagcaa ctgtgtggct 180

gactactctg tgctctacaa ctctgcctcc ttcagcacct tcaagtgtta tggagtgagc 240

ccaaccaaac tgaatgacct gtgtttcacc aatgtctatg ctgactcctt tgtgattagg 300

ggagatgagg tgagacagat tgcccctgga caaacaggca agattgctga ctacaactac 360

aaactgcctg atgacttcac aggctgtgtg attgcctgga acagcaacaa cctggacagc 420

aaggtgggag gcaactacaa ctacctctac agactgttca ggaagagcaa cctgaaacca 480

tttgagaggg acatcagcac agagatttac caggctggca gcacaccatg taatggagtg 540

gagggcttca actgttactt tccactccaa tcctatggct tccaaccaac caatggagtg 600

ggctaccaac catacagggt ggtggtgctg tcctttgaac tgctccatgc ccctgccaca 660

gtgtgtggac caaagaagag caccaacctg gtgaagaaca agtgtgtgaa cttc 714

<210>3

<211> 50

<212>DNA

<213>人工序列SD1

<400>3

NFNGLTGTGV LTESNKKFLP FQQFGRDIAD TTDAVRDPQT LEILDITPCS 50

<210>4

<211> 150

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 4

aacttcaatg gactgacagg cacaggagtg ctgacagaga gcaacaagaa gttcctgcca 60

ttccaacagt ttggcaggga cattgctgac accacagatg ctgtgaggga cccacagacc 120

ttggagattc tggacatcac accatgttcc 150

<210>5

<211> 227

<212>DNA

<213>人工序列hFc

<400> 5

DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 60

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK 120

GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 180

DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 227

<210>6

<211> 684

<212>DNA

<213>人工序列hFc

<400> 6

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa atga 684

<210>7

<211> 515

<212>DNA

<213>人工序列RBDSD1-hFc

<400>7

MFVFLVLLPL VSSQCRVQPT ESIVRFPNIT NLCPFGEVFN ATRFASVYAW NRKRISNCVA 60

DYSVLYNSAS FSTFKCYGVS PTKLNDLCFT NVYADSFVIR GDEVRQIAPG QTGKIADYNY 120

KLPDDFTGCV IAWNSNNLDS KVGGNYNYLY RLFRKSNLKP FERDISTEIY QAGSTPCNGV 180

EGFNCYFPLQ SYGFQPTNGV GYQPYRVVVL SFELLHAPAT VCGPKKSTNL VKNKCVNFNF 240

NGLTGTGVLT ESNKKFLPFQ QFGRDIADTT DAVRDPQTLE ILDITPCSDK THTCPPCPAP 300

ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR 360

EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP 420

PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV 480

DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK 515

<210>8

<211> 1566

<212>DNA

<213>人工序列RBDSD1-hFc

<400> 8

aagcttgcca ccatgtttgt gttcctggtg ctgctgccac tggtgtccag ccagtgtagg 60

gtccaaccaa cagagagcat tgtgaggttt ccaaacatca ccaacctgtg tccatttgga 120

gaggtgttca atgccaccag gtttgcctct gtctatgcct ggaacaggaa gaggattagc 180

aactgtgtgg ctgactactc tgtgctctac aactctgcct ccttcagcac cttcaagtgt 240

tatggagtga gcccaaccaa actgaatgac ctgtgtttca ccaatgtcta tgctgactcc 300

tttgtgatta ggggagatga ggtgagacag attgcccctg gacaaacagg caagattgct 360

gactacaact acaaactgcc tgatgacttc acaggctgtg tgattgcctg gaacagcaac 420

aacctggaca gcaaggtggg aggcaactac aactacctct acagactgtt caggaagagc 480

aacctgaaac catttgagag ggacatcagc acagagattt accaggctgg cagcacacca 540

tgtaatggag tggagggctt caactgttac tttccactcc aatcctatgg cttccaacca 600

accaatggag tgggctacca accatacagg gtggtggtgc tgtcctttga actgctccat 660

gcccctgcca cagtgtgtgg accaaagaag agcaccaacc tggtgaagaa caagtgtgtg 720

aacttcaact tcaatggact gacaggcaca ggagtgctga cagagagcaa caagaagttc 780

ctgccattcc aacagtttgg cagggacatt gctgacacca cagatgctgt gagggaccca 840

cagaccttgg agattctgga catcacacca tgttccgaca aaactcacac atgcccaccg 900

tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 960

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 1020

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 1080

acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1140

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1200

ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1260

tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1320

gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1380

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1440

aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1500

catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1560

ctcgag 1566

Claims

1.一种含有新型冠状病毒COVID-19疫苗的抗原表位的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由新型冠状病毒COVID-19疫苗的抗原表位片段和免疫球蛋白Fc片段构成，其中新型冠状病毒COVID-19疫苗的抗原表位片段是S1亚基中的RBD片段和SD1片段。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述RBD片段的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示；所述SD1片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc片段选自于人、小鼠、兔子、牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、或豚鼠的免疫球蛋白Fc片段；进一步地，所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc片段；其中优选地，所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG1 Fc片段、IgG2Fc片段、IgG3 Fc片段、或IgG4 Fc片段；尤其优选地，所述免疫球蛋白Fc片段是人IgG Fc片段，最优选地其是如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4任一项所述的融合蛋白的编码核酸，优选地，其中RBD片段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或其简并序列；所述SD1片段的编码核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示或其简并序列；所免疫球蛋白Fc片段编码核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或其简并序列。

6.如权利要求5所述的编码核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示或其简并序列。

7.含有如权利要求5所述的编码核酸的重组载体、重组细胞。

8.一种新型冠状病毒COVID-19疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1-4任一项所述的融合蛋白。

9.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，其还包括佐剂，例如氢氧化铝。

10.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述融合蛋白通过化学合成，或基因重组方法获得。