CN113321740B - 一种融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种融合蛋白及其制备方法和用途，包括通过氨基酸连接子依次连接的第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元；第一结构单元包括Fc片段；第二结构单元包括IL‑15Rα的sushi结构域；第三结构单元包括IL‑15。本申请的融合蛋白延长了IL‑15单体的半衰期，并且具有良好的活性，可以有效预防和治疗肿瘤等疾病，或者作为免疫佐剂、免疫调节药物。

Description

一种融合蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明一般涉及生物技术药物领域，具体涉及一种融合蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
白细胞介素15(Interleukin 15，IL-15)在1994年作为一种可溶性T细胞生长因子被发现，而后因其对CD8+T细胞和NK细胞强烈的促进增殖和分化作用，成为有效的肿瘤免疫治疗候选药物和疫苗佐剂。IL-15与IL-2类似，属于α-四螺旋家族的一员，分子量在14-15kDa之间。人类大部分非淋巴系统的器官如胎盘、骨骼肌、肾脏、肺、肝、胰腺、小脑中都能检测到IL-15mRNA的存在，IL-15主要还是由重要的免疫细胞如单核细胞和巨噬细胞分泌。IL-15在肿瘤免疫治疗、HIV等感染性疾病的治疗方面具有广泛的前景(Guo Y,etal.Cytokine Growth Factor Rev.2017；Moynagh PN.Nat Immunol.2019)，已有研究显示IL-15可用于治疗转移性黑色素瘤和肾癌；白血病，实体瘤；NCT03127098用于CEA阳性的多种肿瘤治疗，包括甲状腺癌，结肠癌，肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌(美国临床试验编号NCT01021059、NCT01572493)。
IL-15通过与IL-15受体(IL-15R)结合发挥作用，IL-15R由三个亚基构成，α链(IL-15Rα)、β链(IL-15Rβ)和γ链(IL-15Rγ)。其中IL-15Rβ/γ与IL-2共用，可表达在大多数静息T细胞和NK细胞中，对IL-2或IL-15反应浓度在nM级，亲和力中等。而IL-15Rα为IL-15独有的高亲和力受体，主要表达在活化T细胞上，对IL-15展现出高亲和性和特异性，反应浓度在pM级。
研究发现IL-15与IL-15R的作用后，能够显著增强IL-15的生物学活性。IL-15通常以顺式和反式的结合方式与其受体相互作用。对于顺式作用而言，IL-15的三个受体即IL-15Rα、IL-15Rβ和IL-15Rγ都存在于T细胞上。在反式转导中，与T细胞相邻的细胞表达IL-15Rα，T细胞表达IL-15Rβ、IL-15Rγ。两种模式中，IL-15/IL-15Rα复合物都经过相同的信号传导通路，与IL-2/15Rβ链和Rγ链的膜受体结合激活下游JAK/STAT信号通路。
由于IL-15单体在血浆中半衰期不足一小时，目前大多是将IL-15与IL-15R作用，以提高IL-15的半衰期。但是这种方式对IL-15的半衰期改善效果有限，并且重组IL-15分子的生产工艺也十分复杂，在多种表达系统中表达、纯化均有难度。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种融合蛋白，能够有效延长IL-15的半衰期，便于表达和纯化，且具有良好活性。
在一个方面，本发明提供一种融合蛋白，包括通过氨基酸连接子连接的第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元，其中第一结构单元包括Fc片段，第二结构单元包括IL-15Rα的sushi结构域，第三结构单元包括IL-15。融合蛋白中三个结构单元的融合使得IL-15的体内半衰期得到有效延长，且便于在表达系统中表达和纯化。
在本发明的另一个方面，本发明的融合蛋白中第一结构单元通过第一氨基酸连接子共价连接于第二结构单元的N端，第三结构单元通过第二氨基酸连接子共价连接于第二结构单元的C端。由此融合蛋白从N端到C端依次包含Fc片段、含sushi结构域的IL-15Rα片段和IL-15。本发明意外的发现，对于含有IL-15和IL-15Rα胞外区(SRα)的Fc融合蛋白，当Fc片段位于N端时融合蛋白的生物活性显著提升，明显优于Fc片段位于C端的融合蛋白。
在本发明的另一个方面，本发明融合蛋白中的IL-15为包括N72D突变的IL-15突变体，相比于包含天然(野生型)IL-15的融合蛋白，包含N72D突变的IL-15突变体的融合蛋白显示增强的生物活性。
在本发明的另一个方面，本发明融合蛋白中第一和/或第二氨基酸连接子包含选自GS、GSGGS、GGGGS和GGGS序列的重复。作为可选的方案，第一氨基酸连接子的序列为GGGGSGGGGS；作为可选的方案，第二氨基酸连接子的序列为SGGSGGGSLQ。
在本发明的另一个方面，提供一种融合蛋白复合体，作为可选的方案，本发明的融合蛋白复合体为包含本发明融合蛋白的同源或异源二聚体蛋白质，复合体中各融合蛋白可通过Fc片段间形成的链间键连接。
在本发明的一些方面，提供编码本发明融合蛋白的核酸、用于制备本发明融合蛋白的表达载体、宿主细胞、制备方法，以及本发明融合蛋白在治疗肿瘤、传染病或自身免疫疾病方面的应用。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的融合蛋白结构示意图；
图2为本发明的IgG4Fc-sRα-IL-15(N72D)融合蛋白(下文命名为F4RLI-M)ProteinA亲和层析柱亲和纯化图；
图3为本发明的F4RLI-M融合蛋白经亲和层析后SDS-PAGE图；
图4为本发明的F4RLI-M融合蛋白阴离子交换层析纯化图；
图5为本发明的F4RLI-M融合蛋白经阴离子交换层析后SDS-PAGE图；
图6为本发明的F4RLI-M融合蛋白Western Blot鉴定图(anti-Fc抗体)；
图7为本发明的F4RLI-M融合蛋白Western Blot鉴定图(anti-IL-15抗体)；
图8为本发明的IL-15单体促进细胞增殖实验结果图；
图9为本发明的融合蛋白F4RLI(IL-15无N72D突变)促进细胞增殖实验结果图；
图10为本发明的融合蛋白F4RLI-M促进细胞增殖实验结果图；
图11为本发明的融合蛋白F4RLI-M(10％)促进细胞增殖实验结果图；
图12为本发明的融合蛋白F4RLI-M(20％)促进细胞增殖实验结果图；
图13为本发明的融合蛋白sRα-IL-15-Fc促进细胞增殖实验结果图；
图14为本发明的融合蛋白延长Linker的IgG4Fc-sRα-IL-15(N72D)融合蛋白(下文命名为F4RLI-E)促进细胞增殖实验结果图；
图15为本发明的融合蛋白IgG1Fc-sushi-IL-15(N72D)(下文命名为F1SLI-M)促进细胞增殖实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
本发明的融合蛋白包括通过氨基酸连接子连接的第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元，其中第一结构单元包括Fc片段，第二结构单元包括含sushi结构域的IL-15Rα片段，第三结构单元包括IL-15。
本文中“融合蛋白”意指通过基因重组方法、化学方法或其他适当方法共价连结(亦即，融合)的生物性活性多肽与效应物分子。若有需要，融合分子可经由氨基酸连接子于一个或数个位置融合。融合蛋白可以以单体或多聚体(例如二聚体)的形式存在。
本发明融合蛋白中各结构单元通过氨基酸连接子连接。任何合适的氨基酸连接子都可用于本发明。在具体的实施方案中，氨基酸连接子的长度可以为5-25个氨基酸，优选为10-20个氨基酸；本发明的实施例使用的氨基酸连接子长度适中，有利于避免了氨基酸连接子长度太短造成两蛋白折叠相互干扰，氨基酸连接子长度太长造成免疫原性的问题。
在一个实施方案中，氨基酸连接子包含选自GS、GSGGS、GGGGS和GGGS序列的重复。连接第一结构单元和第二结构单元的第一氨基酸连接子与连接第二结构单元和第三结构单元的第二氨基酸连接子可以相同，也可以不同。在一个实施方案中，第一氨基酸连接子为GGGGSGGGGS。在一个实施方案中，第二氨基酸连接子的序列为SGGSGGGSLQ。
本发明中“Fc片段”包括源于抗体Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式，也包括此类多肽的截短形式。在一些实施方案中，Fc片段含有抗体CH2和CH3域。包含Fc片段的融合蛋白可提供延长的体内半衰期，且有利于在蛋白A或蛋白G柱上进行亲和层析纯化。优选的，Fc片段衍生自人IgG，其包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。更优选的，Fc片段为人IgG4Fc片段，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在一些实施方案中，Fc片段为人IgG1Fc片段，氨基酸序列如SEQID No.5所示。
Fc片段的本发明的“Fc片段”包括通过一个或多个氨基酸替换、增加或者缺失突变获得的Fc变体。本领域已知许多Fc变体，例如Idusogie et al.,Journal of Immunology,2000,164,4178-4184；Shields et al.,Journal of Biological Chemistry,2001,276,9,6591-6604中例示的Fc变体，在此将上述文献通过引用并入本文。可使用本领域已知的常规方法制备和检测任何合适的变体。
本发明的“IL-15”是指白介素15，包括任何天然(野生型)的IL-15、其功能性片段或突变体，优选为人IL-15或鼠IL-15。在一些实施方案中，IL-15为全长人IL-15或截短的人IL-15多肽序列。优选的，IL-15的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的“IL-15”包括天然的IL-15蛋白以及通过一个或多个氨基酸替换、增加或者缺失突变获得的IL-15突变体。在一些实施方案中，IL-15为具有选自C42S、L45C、Q48C、V49C、L52C、E53C、E87C和E89C的一个或多个氨基酸取代的突变体。在一些实施方案中，IL-15为具有选自N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D和Q108E的一个或多个氨基酸取代的突变体。在某些实施方案中，氨基酸取代是N4D/N65D。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q108E。在某些实施方案中，氨基酸取代是N65D。在其它实施方案中，氨基酸取代是D30N/E64Q/N65D。在某些实施方案中，氨基酸取代是N65D。在一些实施方案中，氨基酸取代是N1D/N65D。优选的，IL-15为具有N72D突变的突变体，本发明中发现，包含N72D突变的IL-15突变体的本发明融合蛋白显示增强的生物活性，本发明的IL-15的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明的“IL-15Rα”是指IL-15的α受体，可以是任何物种的IL-15Rα蛋白、其功能性片段或突变体，优选为人IL-15Rα。在一些实施方式中，本发明的IL-15Rα具有NCBI参考序列号NP_002180.1所示的氨基酸序列。如本领域已知的，IL-15Rα含有“sushi结构域”，其是保留IL-15结合活性的受体的最短区域。在一些实施方案中，本发明的第二结构单元包含IL-15Rα的sushi结构域。优选的，本发明的第二结构单元包含人IL-15Rα。本发明融合蛋白中的IL-15与IL-15Rα的sushi结构域结合，可延长其在血浆中的半衰期，增强活性。
本发明的“IL-15Rα”包括天然的IL-15Rα蛋白以及通过一个或多个氨基酸替换、增加或者缺失突变获得的IL-15Rα突变体。在一些实施方案中，IL-15Rα为具有选自D96、P97、A98、D96/P97、D96/C97、D96/P97/A98、D96/P97/C98和D96/C97/A98的氨基酸插入的突变体。在一些实施方案中，IL-15Rα为具有选自K34C、A37C、G38C、S40C和L42C的一个或多个氨基酸取代的突变体。
在本发明的一些实施方案中，融合蛋白中第一结构单元通过第一氨基酸连接子共价连接于第二结构单元的N端，第三结构单元通过第二氨基酸连接子共价连接于第二结构单元的C端。融合蛋白从N端到C端依次包含Fc片段、含sushi结构域的IL-15Rα片段和IL-15。本发明意外的发现，对于含有IL-15和IL-15Rα胞外区(sRα)的Fc融合蛋白，当Fc片段位于N端时融合蛋白的生物活性显著提升，明显优于Fc片段位于C端的融合蛋白(见实施例5，当Fc位于C端时难以检测到生物学活性)。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包括IgG1 Fc片段、IL-15Rα和IL-15，其中IgG1 Fc片段位于N端，通过氨基酸连接子与IL-15Rα相连，IL-15片段位于C端，通过氨基酸连接子与IL-15Rα相连。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包括IgG1 Fc片段、IL-15Rα和IL-15(N72D)，其中IgG1 Fc片段位于N端，通过氨基酸连接子与IL-15Rα相连，IL-15(N72D)片段位于C端，通过氨基酸连接子与IL-15Rα相连。
在本发明的一个实施方案中，如图1所示，融合蛋白包括IgG4 Fc片段、IL-15Rα和IL-15，其中IgG4 Fc片段位于N端，通过氨基酸连接子与IL-15Rα相连，IL-15片段位于C端，通过氨基酸连接子与IL-15Rα相连。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包括IgG4 Fc片段、IL-15Rα和IL-15(N72D)，其中IgG4 Fc片段位于N端，通过氨基酸连接子与IL-15Rα相连，IL-15(N72D)片段位于C端，通过氨基酸连接子与IL-15Rα相连。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白F4RLI-M的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。在一个实施方案中，编码融合蛋白F4RLI-M的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明的一个实施方案涉及融合蛋白复合体，本发明的融合蛋白复合体可以是包括两个不同或相同的融合蛋白结合而成的二聚体蛋白；也就是，融合蛋白复合体可以是同源二聚体，也可以是异源二聚体。融合蛋白复合体中各融合蛋白可通过Fc片段之间形成的链间键连接，优选的通过Fc片段间形成的二硫键共价连接。在一些实施方案中，融合蛋白复合体中包含两个本发明的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白复合体中除包含本发明的融合蛋白外，还包含其他融合蛋白，例如含有PD-1抗体片段的Fc融合蛋白。
本发明还提供编码融合蛋白的核酸、相应的表达载体和宿主细胞。本发明的核酸分子可以是DNA分子或RNA分子，也可以是核酸类似物。在本发明中的核酸分子可以包含天然存在的核酸残基或人工生成的核酸残基。本发明的核酸分子可以是单链或双链的、线性或环状的、天然的或合成的，并且若没有另外指出，则没有任何大小限制。核酸分子还可以包含启动子，启动子可以是同源或异源的。
本发明的核酸分子可以克隆到载体中。本发明的“载体”包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它在遗传工程中通常使用的载体。在一些实施方案中，这些载体适用于转化细胞、真核生物细胞如真菌细胞、微生物的细胞诸如酵母或原核细胞。在一个优选的实施方案中，这些载体适用于细菌细胞的稳定转化，例如以转录本发明的核酸分子。
本发明的载体可以是表达载体。已经在文献中广泛描述的合适的表达载体都可用于本发明。在一个实施方案中，表达载体可以含有标志基因和确保在选择的宿主中的复制的复制起点，以及启动子和转录终止信号。在启动子和终止信号之间，优选地，有至少一个能够插入期望表达的核酸序列/分子的限制性位点。优选的，本发明的表达载体是pMF09表达载体。
在本发明的一个实施方案中，通过重组手段生成本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，在真核细胞中表达融合蛋白，随后分离多肽，并通常纯化到药学可接受的纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码其蛋白质的核酸插入表达载体中。在合适的稳定真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞中实施表达，并且从所述细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收蛋白质。
在另一个实施方案中，可以将本发明的核酸分子和/或其中含有本发明核酸分子的载体转导、转化或转染、或者以其它方式导入宿主细胞中。例如，宿主细胞是真核或原核细胞，优选地真核细胞。作为一个非限制性例子，宿主细胞是哺乳动物细胞。
本发明的宿主细胞可以是包含本发明核酸分子或本发明载体的原核或真核细胞，优选为真核细胞，或者由这类细胞衍生且含有本发明核酸分子或载体的细胞。本发明的宿主细胞可以是人、酵母或真菌细胞。优选的，本发明的宿主细胞是人HEK293细胞。
本发明还提供用于制备本发明融合蛋白的方法，包括以下步骤：在适合表达融合蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，并从细胞或细胞培养物上清液回收融合蛋白。在一个实施方案中，制备本发明融合蛋白的方法包括以下步骤：构建包含融合蛋白编码基因的表达载体，通过瞬时转染宿主细胞的方法构建包含表达载体的宿主细胞，培养宿主细胞并收集细胞上清；通过填料为ProteinA/G的亲和层析纯化融合蛋白。
可以通过标准方法来实施用本发明的核酸分子或载体对宿主细胞的转化或遗传工程化改造，如例如记载于Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A LaboratoryManual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA；Methods in Yeast Genetics,ALaboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990中的方法。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。
本发明还提供包含本发明融合蛋白、核酸、表达载体和/或融合蛋白复合体的药物组合物。在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以进一步包含药学可接受载体、赋形剂和/或稀释剂。合适的药用载体的例子是本领域中公知的。可以通过公知的常规方法配制包含这类载体的药物组合物。在一些实施方案中，本发明药物组合物中还可以含有其他用于治疗的活性成分。
可以通过不同方式，例如经肠、口服(例如丸剂、片剂、含服、舌下、崩散剂、胶囊剂、薄膜、液体溶液或悬浮液、粉末、固体晶体或液体)、直肠(例如栓剂、灌肠剂)、经由注射(例如静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、皮内)、经由吸入(例如支气管内)、表面、阴道、皮肤上或鼻内施用本发明的药物组合物。优选的，本发明的药物组合物为冻干制剂或水溶液的形式。临床给药剂量方案会由主治内科医生和临床因素决定。如医学领域中公知的，针对任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者体格、体表面积、年龄、待施用的药物、性别、施用时间和路径、一般健康、和同时施用的其它药物。可以局部或系统施用本发明药物组合物。优选地，可通过静脉内或皮下进行施用。也可以对靶部位直接施用本发明的药物组合物，例如通过对内部或外部靶部位进行靶向给药的方式来进行。
已有大量报道显示IL-15可用于肿瘤的免疫治疗，以及HIV等感染性疾病、血液病和自身免疫疾病的治疗。本发明的融合蛋白、核酸、表达载体、融合蛋白复合物和药物组合物可用于治疗癌症、传染病或自身免疫疾病，其中，传染病包括，但不限于天花病毒感染、HIV感染、细菌感染、真菌感染、HBV感染。癌症包括，但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红细胞性白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏症、非何杰金氏症)、巨球蛋白血症及实体肿瘤，如肉瘤及恶性肿瘤(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、依汶氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳突腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精母细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤、子宫颈癌、子宫癌、睪丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶瘤、星状细胞瘤、神经管胚细胞瘤、颅咽瘤、类室管膜瘤、松果腺瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡树突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经胚细胞瘤、及视网膜胚细胞瘤)。自身免疫性疾病包括，但不限于多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、胃炎、黏膜炎。
实施例1 F4RLI-M融合蛋白的制备
1.1构建编码F4RLI-M融合蛋白的表达载体
通过基因合成和PCR技术制备如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，该核苷酸序列编码F4RLI-M融合蛋白(SEQ ID NO.4)，如图1所示，F4RLI-M融合蛋白中Fc片段来自IgG4，位于N端，通过氨基酸连接子与sRα相连，IL-15(N72D)片段位于C端，通过氨基酸连接子与sRα相连。
将获得的片段通过同源重组插入pMF09质粒的BamHI与EcoRI酶切位点之间，将同源重组产物转化DH5α菌株，得到表达载体pMF09/F4RLI-M。通过测序验证载体构建正确的菌株。培养至对数生长期后，加入终浓度为20％的甘油长期保存于-80℃。
1.2质粒扩增
按照1：100倍接菌量扩大体积培养表达载体pMF09/F4RLI-M菌，使用OMEGA公司提供的E.Z.N.A Endo-free Plasmid Maxi Kit试剂盒(货号：D6926-03)，通过碱裂解法抽提质粒，质粒经无菌滤膜过滤后保存于-20℃。
1.3细胞培养及转染表达F4RLI-M融合蛋白
(1)悬浮培养人HEK293细胞，培养基成分配方为SFM4HEK293Medium(Hyclone,USA)与Freestyle 293Expression Medium(Invitrogen,USA)两种培养基按照1:1体积混合，再加入终浓度为2％的胎牛血清。悬浮液以1×106/mL密度传代至新鲜培养基中，在37℃恒温摇床(CO2含有量为5％)中以125rpm转速悬浮培养。
(2)转染前一天，将细胞传代至500mL锥形培养瓶，调整细胞状态及密度至4×106个/mL，培养体积200mL。
(3)细胞转染密度达到为6×106/mL，细胞存活率95％以上时进行转染；离心收集细胞，用Freestyle293培养基洗涤一次。
(4)用100mL Freestyle293培养基重悬细胞；
(5)每106个细胞需要0.5μg质粒，将质粒过滤除菌并用Freestyle293培养基重悬至终浓度为40ng/μL；
(6)质粒与聚醚酰亚胺(PEI)(转染试剂，购自Polysciences公司)质量比为1:5，将质粒与PEI混匀，室温静置10-15分钟；
(7)将质粒与PEI混合物加入细胞悬液中，在37℃恒温摇床(CO2含有量为5％)中以125rpm转速悬浮培养；
(8)4小时后补加100mL SFM4HEK293培养基，终浓度为3.75mM的丙戊酸钠(VPA)溶液，终浓度为50mg/mL的遗传霉素(G418)溶液；
(9)24小时后补加终浓度为0.5％的蛋白胨TN1溶液及1000×抗结团试剂Anti-clumping；
(10)监测细胞存活率变化，培养6-7天后至细胞存活率下降至50％以下，收集细胞培养上清液进行下一步纯化。
1.4 F4RLI-M融合蛋白的纯化
(1)样品准备：将细胞悬液7000rpm离心30分钟后弃沉淀，上清液经0.45μm滤膜过滤后待用；
(2)20％乙醇冲洗蛋白纯化系统，分别用10倍柱体积双蒸水和上样缓冲液冲洗和平衡Protein A柱；
(3)利用蛋白纯化仪蠕动泵上样，流速按照柱体积设定，一般不超过1个柱体积/分钟，收集流穿液；
(4)上样结束后，利用10倍柱体积的上样缓冲液再次平衡Protein A柱；
(5)使用洗脱缓冲液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH＝2.8)进行洗脱，洗脱液分管收集，每1mL收集一管，并根据紫外280nm吸收值观察洗脱峰；将洗脱峰的收集管加入适量pH为9.0的1M Tris-HCl使得目的蛋白溶液pH被调整到7.0至8.0左右；融合蛋白F4RLI-M的Protein A亲和层析纯化图如图2所示，可以看到超过500mAU的紫外吸收峰，显示目标蛋白被洗脱缓冲液洗脱。
(6)利用NaOH溶液(一般不超过0.5M)冲洗Protein A柱；后依次用10倍柱体积的双蒸水及20％乙醇冲洗Protein A柱，最后使得乙醇完全浸没柱填料；
(7)通过SDS-PAGE检测各洗脱管纯度，合并各洗脱管，经超滤、置换buffer操作后使蛋白溶于PBS中，待下一步操作；经亲和层析纯化后融合蛋白F4RLI-M的SDS-PAGE电泳图见图3，其中Reduced为经还原处理的样品，Non-reduced为未经还原处理的样品；泳道F1，F2为蛋白流出峰流出蛋白，S泳道为蛋白上样前原液，FT泳道为蛋白流穿液，Na为氢氧化钠洗脱峰流出蛋白；上样量均为10μL；如图3所示，经亲和层析后得到目标蛋白，经非还原处理的样品分子量在150kDa与250kDa之间，经还原处理的样品分子量在80kDa与100kDa之间，并且条带单一。
1.5 F4RLI-M融合蛋白精制
(1)样品准备：将经Protein A亲和层析柱的融合蛋白用调节缓冲液(50mM Tris，1mM EDTA，pH＝7.4)进行稀释；
(2)20％乙醇冲洗蛋白纯化系统，分别用10倍柱体积双蒸水和平衡缓冲液(50mMTris，1mM EDTA，100mM NaCl，pH＝7.4)冲洗和平衡阴离子交换柱；
(3)利用蛋白纯化仪蠕动泵上样，不超过1个柱体积/分钟，收集流穿液；
(4)调节蠕动泵泵入不同比例的洗脱缓冲液(50mM Tris,1mM EDTA，1M NaCl，pH＝7.4)进行梯度洗脱；洗脱液分管收集，每1mL收集一管，并根据紫外280nm吸收值观察洗脱峰。融合蛋白F4RLI-M的阴离子交换层析纯化图如图4所示，可以看到在使用10％洗脱缓冲液及20％洗脱缓冲液时分别出现单峰。其中，10％洗脱缓冲液对应的蛋白洗脱峰为100mAU左右，20％洗脱缓冲液对应的蛋白洗脱峰为55mAU左右。
(5)依次利用100％洗脱缓冲液、双蒸水、20％乙醇冲洗阴离子交换柱；
(6)通过SDS-PAGE检测各洗脱管纯度，将不同洗脱峰产物分别合并，经超滤、置换buffer操作后使蛋白溶于PBS中，经BCA蛋白定量后分装冻存于-80℃。经阴离子交换层析纯化后所述融合蛋白SDS-PAGE电泳图见图5，其中Reduced为经还原处理的样品，Non-reduced为未经还原处理的样品；泳道10(1)，10(2)为10％洗脱缓冲液蛋白流出峰流出蛋白，泳道20(1)，20(2)为20％洗脱缓冲液蛋白流出峰流出蛋白，S泳道为蛋白上样前原液，FT泳道为蛋白流穿液；上样量均为10μL。如图5所示，经非还原处理的样品分子量在150kDa与250kDa之间，经还原处理的样品分子量在80kDa与100kDa之间，与此前亲和层析后的SDS-PAGE情况一致。
1.5 Western Blot验证F4RLI-M融合蛋白的表达
(1)取适量经过亲和层析和离子交换层析的F4RLI-M融合蛋白进行SDS-PAGE。电泳 条件：100V，100min；
(2)通过湿转法将目标蛋白转到PVDF膜上。转膜条件：200mA，90min；
(3)转膜结束后，用5％的脱脂奶粉将PVDF膜室温封闭2h或4度过夜；
(4)一方面选用鼠抗人IL-15抗体作为一抗，羊抗鼠-HRP抗体作为二抗验证F4RLI-M融合蛋白中IL-15的表达；另一方面选用抗人重链及轻链-HRP抗体直接作为二抗验证F4RLI-M融合蛋白中Fc片段的表达。其中一抗孵育时间：室温2h或4度过夜；二抗孵育时间：室温1h；
(5)通过洗膜、ECL法显色后得到如图6和图7所示结果，两种抗体孵育方法都证明了经非还原处理的F4RLI-M融合蛋白条带在150kDa与250kDa之间，经还原处理的分子量在80kDa与100kDa之间，与此前蛋白纯化的SDS-PAGE情况一致。并且Western Blot中抗体的结合确定了Fc片段(图6)和IL-15(图7)的表达。
实施例2 F4RLI融合蛋白的制备
采用实施例1相同的方法制备IgG4Fc-sRα-IL-15(F4RLI)融合蛋白，其中通过化学基因合成和PCR技术制备的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，该核苷酸序列编码F4RLI融合蛋白，F4RLI融合蛋白中Fc片段来自IgG4，位于N端，通过氨基酸连接子与sRα相连，IL-15片段位于C端，通过氨基酸连接子与sRα相连。
实施例3 F4RLI-M具有促进人巨细胞白血病细胞(Mo7e)增殖活性
(1)用含有10ng/mL商业化重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的1640完全培养基(RPMI 1640，Gibco，USA)悬浮培养Mo7e细胞；
(2)当细胞处于良好的状态，用不含hGM-CSF的完全培养基洗涤两次，将细胞密度稀释至4×105/mL，96孔板每孔加入50μL细胞悬液。
(3)选取给药浓度为1,3,10,30,100,300,1000,3000,10000,30000ng/ml，将融合蛋白用不含hGM-CSF的完全培养基稀释至目标浓度，每孔加入50μL药液。
(4)设置加入相同给药体积但不含待测融合蛋白的完全培养基组作为对照组，同时设置仅加入完全培养基组作为空白对照组。选取IL-15单体作为阳性对照。
(5)37℃培养4天后加入10μL CCK-8(Cell counting kit-8，CCK-8)溶液，37℃孵育2-3小时后检测450nm波长处吸收值。
(6)数据经处理软件GraphPad Prism8进行四参数拟合，对融合蛋白促淋巴细胞中增殖效果进行评估。
IL-15单体、F4RLI和F4RLI-M蛋白促进Mo7e细胞增殖的结果分别如图8、图9、图10所示。经四参数拟合求得各融合蛋白的半最大效应浓度即EC50值，EC50值越小代表对细胞的刺激活性越强。从图8、9、10可见，F4RLI(图9)和F4RLI-M(图10)融合蛋白的EC50相近，均为nM级，F4RLI-M的活性好于F4RLI，即N72D突变对提高IL-15分子的生物学活性具有益处。F4RLI-M融合蛋白的EC50值是IL-15单体EC50值(图8)的20倍左右。进一步检测离子交换层析精制之后产品的活性，如图11、12所示，10％洗脱得到的F4RLI-M样品(图11)生物学活性好于20％洗脱(图12)得到的样品。
实施例4 Fc融合在sRα-IL-15 N端增强融合蛋白的促淋巴细胞增殖活性
在CTLL-2细胞增殖模型上检测Fc-sRα-IL-15(F4RLI)融合蛋白和sRα-IL-15-Fc融合蛋白的促淋巴细胞增殖效果，结果显示sRα-IL-15-Fc融合蛋白基本无活性，无法获得EC50数据(图13)，而F4RLI融合蛋白促进CTLL-2细胞增殖的EC50达到3nM(图9)。该结果显示IL-15融合蛋白中各片段的连接顺序影响融合蛋白的促细胞增殖功能，Fc片段位于N端时融合蛋白的促细胞增殖效果显著优于Fc片段位于C端的融合蛋白。
实施例5不同linker长度的F4RLI融合蛋白具有促进人巨细胞白血病细胞(Mo7e)增殖活性
采用实施例1相同的方法制备与融合蛋白F4RLI-M具有不同linker长度的IgG4Fc-sRα-IL-15(下文命名为F4RLI-E)融合蛋白(其中，连接子的长度为10-20个氨基酸)，其中通过化学基因合成和PCR技术制备的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，该核苷酸序列编码F4RLI-E融合蛋白，F4RLI-E融合蛋白中Fc片段来自IgG4，位于N端，通过氨基酸连接子与sRα相连，IL-15片段位于C端，通过延长的氨基酸连接子与sRα相连。
采用实施例3相同的方法在人巨细胞白血病细胞(Mo7e)检测增殖活性，检测结果如图14所示。由图14可见，F4RLI-E融合蛋白具有较强的增殖活性，为nM级。
实施例6 IgG1Fc-sushi-IL-15(N72D)融合蛋白具有促进人巨细胞白血病细胞(Mo7e)增殖活性
采用实施例1相同的方法制备融合蛋白IgG1Fc-sushi-IL-15(N72D)(下文命名为F1SLI-M)融合蛋白，其中通过化学基因合成和PCR技术制备的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，该核苷酸序列编码F1SLI-M融合蛋白，F1SLI-M融合蛋白中Fc片段来自IgG1，位于N端，通过氨基酸连接子与sRα相连，IL-15片段位于C端，通过氨基酸连接子与sRα相连。
采用实施例3相同的方法在人巨细胞白血病细胞(Mo7e)检测增殖活性，检测结果如图15所示。由图15可见，F1SLI-M融合蛋白具有较强的增殖活性，为nM级。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学
<120> 一种融合蛋白及其制备方法和用途
<130> 20210122
<140> CNXXXXX
<141> 2021-01-22
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 未知
<400> 1
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<213> 未知
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Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His
385 390 395 400
Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Ser Gly
405 410 415
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp
420 425 430
Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr
435 440 445
Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
450 455 460
Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp
465 470 475 480
Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp
485 490 495
Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
500 505 510
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val
515 520 525
His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
530 535
<210> 5
<211> 217
<212> PRT
<213> 未知
<400> 5
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 6
<211> 1617
<212> DNA
<213> 未知
<400> 6
gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360
gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600
gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660
aagagcctct ccctgtctct gggtaaaggc ggcggtggta gcggtggcgg tggctcgatc 720
acgtgcccgc cccccatgtc cgtggagcac gcagacatct gggtcaagag ctacagcttg 780
tactcccggg agcggtacat ctgcaactcg ggtttcaagc ggaaggccgg cacgtccagc 840
ctgacggagt gcgtgttgaa caaggccacg aatgtcgccc actggacgac cccctcgctc 900
aagtgcatcc gcgacccggc cctggttcac cagcggcccg cgccaccctc caccgtaacg 960
acggcggggg tgaccccgca gccggagagc ctctccccgt cgggaaagga gcccgccgcg 1020
tcgtcgccca gctcgaacaa cacggcggcc acaactgcag cgatcgtccc gggctcccag 1080
ctgatgccgt cgaagtcgcc gtccacggga accacggaga tcagcagtca tgagtcctcc 1140
cacggcaccc cctcgcaaac gacggccaag aactgggaac tcacggcgtc cgcctcccac 1200
cagccgccgg gggtgtatcc gcaaggccac agcgacacca cgtcgggtgg ctcaggcggt 1260
ggctcgctgc agaactgggt gaacgtgatc tcggacctga agaagatcga ggacctcatc 1320
cagtcgatgc acatcgacgc gacgctgtac acggagtcgg acgtccaccc gtcgtgcaag 1380
gtcacggcga tgaagtgctt cctcctggag ctccaagtca tctcgctcga gtcgggggac 1440
gcgtcgatcc acgacacggt ggagaacctg atcatcctgg cgaacgactc gctgtcgtcg 1500
aacgggaacg tcacggagtc gggctgcaag gagtgcgagg agctggagga gaagaacatc 1560
aaggagttcc tgcagtcgtt cgtgcacatc gtccagatgt tcatcaacac gtcgtga 1617
<210> 7
<211> 1617
<212> DNA
<213> 未知
<400> 7
gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180
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gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540
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gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660
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cagtcgatgc acatcgacgc gacgctgtac acggagtcgg acgtccaccc gtcgtgcaag 1380
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<210> 8
<211> 1647
<212> DNA
<213> 未知
<400> 8
gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300
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gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660
aagagcctct ccctgtctct gggtaaaggc ggcggtggta gcggtggcgg tggctcgatc 720
acgtgcccgc cccccatgtc cgtggagcac gcagacatct gggtcaagag ctacagcttg 780
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cacggcaccc cctcgcaaac gacggccaag aactgggaac tcacggcgtc cgcctcccac 1200
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acggagtcgg acgtccaccc gtcgtgcaag gtcacggcga tgaagtgctt cctcctggag 1440
ctccaagtca tctcgctcga gtcgggggac gcgtcgatcc acgacacggt ggagaacctg 1500
atcatcctgg cgaacgactc gctgtcgtcg aacgggaacg tcacggagtc gggctgcaag 1560
gagtgcgagg agctggagga gaagaacatc aaggagttcc tgcagtcgtt cgtgcacatc 1620
gtccagatgt tcatcaacac gtcgtga 1647
<210> 9
<211> 1311
<212> DNA
<213> 未知
<400> 9
gcacctgaac tcctgggggg accatcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180
ccgcgggagg agcagtacgc cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360
ctgcccccat cccgggaaga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccaggtaa aatcacgtgc 660
ccgcccccca tgtccgtgga gcacgcagac atctgggtca agagctacag cttgtactcc 720
cgggagcggt acatctgcaa ctcgggtttc aagcggaagg ccggcacgtc cagcctgacg 780
gagtgcgtgt tgaacaaggc cacgaatgtc gcccactgga cgaccccctc gctcaagtgc 840
atccgcgacc cggccctggt tcaccagcgg cccgcgccac cctccaccgt aacaacagcg 900
ggagtgagcg gaggatctgg cggaggaggc tctggaggag gatctggagg cggaggaagc 960
ctgcagaact gggtgaacgt gatctcggac ctgaagaaga tcgaggacct catccagtcg 1020
atgcacatcg acgcgacgct gtacacggag tcggacgtcc acccgtcgtg caaggtcacg 1080
gcgatgaagt gcttcctcct ggagctccaa gtcatctcgc tcgagtcggg ggacgcgtcg 1140
atccacgaca cggtggagaa cctgatcatc ctggcgaacg actcgctgtc gtcgaacggg 1200
aacgtcacgg agtcgggctg caaggagtgc gaggagctgg aggagaagaa catcaaggag 1260
ttcctgcagt cgttcgtgca catcgtccag atgttcatca acacgtcgtg a 1311

Claims (9)

1.一种融合蛋白，其特征在于，包括通过氨基酸连接子连接的第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元；所述氨基酸连接子的长度为5-25个氨基酸；
所述第一结构单元为SEQ ID NO:2所示的IgG4 Fc片段；
所述第二结构单元包含sushi结构域的IL-15Rα片段，第二结构单元的序列为SEQ IDNO:4的第240-414位氨基酸；
所述第三结构单元为SEQ ID NO:1或3所示的IL-15；
所述第一结构单元通过第一氨基酸连接子共价连接于所述第二结构单元的N端，所述第三结构单元通过第二氨基酸连接子共价连接于所述第二结构单元的C端，所述第一氨基酸连接子和第二氨基酸连接子选自GS、GSGGS、GGGGS和GGGS序列的重复。
2.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的表达载体。
5.一种制备权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在适合表达所述融合蛋白的条件下培养权利要求4所述的宿主细胞；
收集并纯化所述融合蛋白。
6.一种包含如权利要求1所述融合蛋白的融合蛋白复合体。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白复合体，其特征在于，包含两个如权利要求1所述的融合蛋白。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的融合蛋白、如权利要求2所述的核酸、如权利要求3所述的表达载体、或如权利要求6或7所述的融合蛋白复合体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，还包含其他的活性成分。
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