CN1944463B - 具有α干扰素活性的融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有α干扰素活性的融合蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一种具有α干扰素活性的融合蛋白及其编码基因，以及该融合蛋白的表达方法和在制备提高机体免疫力药物中的应用。该融合蛋白是在人IFNα-2b的羧基端连接有人IgG Fc-γ1或人IgG Fc-γ2的融合蛋白；所述人IFNα-2b具有序列表中SEQ ID №：13的氨基酸残基序列；所述人IgG Fc-γ1为野生型人IgG Fc-γ1或其突变体；所述人IgG Fc-γ2为野生型人IgG Fc-γ2或其突变体。该融合蛋白具有以下优点：1)α干扰素活性高；2)半衰期长；3)ADCC杀伤作用小。本发明在医学和生物制药领域，尤其是提高机体免疫力药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

Description

具有α干扰素活性的融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及由具有α干扰素活性的融合蛋白及其编码基因，以及该融合蛋白的表达方法和在制备提高机体免疫力药物中的应用。

背景技术

α干扰素(IFN-α)是一组能够诱导一系列细胞内蛋白表达，继而发挥抗病毒、抗细胞增殖和调节免疫应答作用的细胞因子。天然IFN-α主要由白细胞、成纤维细胞等在细菌、DNA、RNA病毒、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(Poly I-C)或多核苷酸等刺激物的诱导下产生。据统计，IFN-α至少有20种以上的亚型，这些家族成员具有相似的结构特点：分子量均在19-26kD之间，等电点(pI)约为5-7，氨基酸残基数目为165或166(约19.4kD)，有2个二硫键(C1-C98，C29-C138或C1-C99，C29-C139)，二硫键对IFN-α的正确折叠和生物活性十分重要，此外，大多数IFN-α没有糖基化。

人α干扰素家族是最大、最复杂的干扰素家族，其家族成员具有相似的氨基酸序列，因此将其定义为一个区别于其它干扰素的家族，氨基酸残基序列比对结果表明人α干扰素家族成员的氨基酸序列相似性至少为35％。SwissProt数据库包含大量的人IFNα蛋白，这些蛋白与约由23个氨基酸残基组成的引导序列一起合成，成熟蛋白的分子量约为19kD。

人IFN-α是第一批可通过重组DNA技术生产的细胞因子，其中，重组人α-2a干扰素(rHuIFNα-2a)及重组人α-2b干扰素(rHuIFNα-2b)已被广泛用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和某些癌症，包括阴道瘤、毛细胞白血病、慢性骨髓瘤细胞白血病、黑色素瘤、肾细胞癌以及艾滋病引起的卡波西肉瘤，同时还被用于治疗水痘和带状苞疹等。此外，包含人IFN-α的治疗策略对前列腺癌和慢性粒细胞性白血病的治疗功效也具有促进作用。

研究表明，干扰素的半衰期为4-16h，肌内或皮下注射3-8h后到达血浆峰浓度。静脉、肌内或皮下注射24h后，干扰素在血清中的浓度就会很低甚至检测不到。其中IFN-α在体内循环半衰期相当短且仅在局部起作用，依照目前的临床实践，成品的IFN-α通过肌肉注射后，其在血清中的水平即下降，其中，IFNα-2a的半衰期为5小时，IFNα-2b的半衰期为2-4小时(PHYSICIANS KESK REFERENCE，50th edition，1996：2145-2147和2364-2373)。若将IFN-α用作一种有效的系统治疗药物，需要相当大的剂量及频繁用药，如此频繁用药很不方便且很痛苦，另外，与IFN-α相关的毒性副作用相当严重，以致某些癌症患者无法忍受该药物治疗，这些副作用很可能与高剂量用药相关。因此，追切需要疗效显著，半衰期长的IFN-α。

免疫球蛋白(Immunoglobulins，Ig)是具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白.免疫球蛋白分子是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成，这种四链结构为Ig分子的单体，是构成Ig分子的基本单位.根据重链恒定区氨基酸序列及抗原性不同，重链可分为γ、α、μ、δ和ε五类，相应的Ig分别被命名为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE.IgG在血清中以单体形式存在，占血清Ig总量的75-80％，半衰期20-23天.人IgG有4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4.IgG为体内主要的抗感染抗体，能通过胎盘，可激活补体，通过Fc受体结合细胞发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC，表达Fc受体的杀伤细胞识别抗体的Fc段，通过释放介质直接杀伤被抗体结合的靶细胞)和调理作用(IgG的Fc段与巨噬细胞、中性粒细胞表面的IgG Fc受体结合，促进吞噬细胞对抗原的吞噬)。IgG Fc-γ1和IgG Fc-γ2均为IgG的Fc受体，GenBank号分别为：gi：184739和gi：14030849。

随着DNA重组技术的出现，现已可以将人α干扰素基因克隆在微生物体中，并由此生产出足够数量的人IFN-α[Platis D，Foster GR.(2003)Protein Expr Purif.31(2)：222-30；Neves FO，Ho PL.(2004)Protein Expr Purif.35(2)：353-9；Srivastava P，Bhattacharaya P.(2005)Protein Expr Purif.41(2)：313-22]。专利号为5710027，5661009，4765903，5196323，4315852，4845032和4530901的美国专利以及专利号为EP0032134和EP0679718的欧洲专利中都阐述了利用重组大肠杆菌和酿酒酵母生产人α干扰素的方法。尽管在大肠杆菌中经表达及纯化获得了人α干扰素，该表达方法克服了由天然来源生产这种干扰素而存在的相关问题和潜在的危险，但这种方法也有它本身的缺陷：一方面，在某些场合下，所表达的蛋白不能进行正确的加工；另一方面，为除去细菌内毒素，还需要纯化步骤，由于纯化方法包括多个层析步骤，因此难于放大进行大规模生产。而人α干扰素在酿酒酵母中的产量很低，也难于进行大规模生产。因此，需要寻找其它的合适的表达系统用于人α干扰素的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有α干扰素活性且半衰期较长的融合蛋白。

本发明所提供的具有α干扰素活性的融合蛋白，是在人IFNα-2b的羧基(C)端连接有人IgG Fc-γ1或人IgG Fc-γ2的融合蛋白；所述人IFNα-2b具有序列表中SEQ ID №：13的氨基酸残基序列；所述人IgG Fc-γ1为野生型人IgG Fc-γ1或其突变体；所述人IgG Fc-γ2为野生型人IgG Fc-γ2或其突变体。

序列表中的SEQ ID №：13由165个氨基酸残基组成。

所述具有α干扰素活性的融合蛋白，命名为Human IFNα-human IgG-Fc(或HuIFNα-2b-IgG/Fc)，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)序列表中的SEQ ID №：2；

3)序列表中的SEQ ID №：3；

4)序列表中的SEQ ID №：4；

5)将序列表中SEQ ID №：1-4的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有α干扰素活性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由397个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-165位为人IFNα-2b的氨基酸残基序列，自氨基端第166-397位为人IgG Fc-γ1的氨基酸残基序列；序列表中的SEQ ID №：2由397个氨基酸残基组成，自氨基端第1-165位为人IFNα-2b的氨基酸残基序列，自氨基端第166-397位为带有突变位点的人IgGFc-γ1的氨基酸残基序列，与序列表中SEQ ID №：1相比，自氨基端第184位由Leu突变为Val，自氨基端第185位由Leu突变为Ala，自氨基端第281位由Pro突变为Ser；序列表中的SEQ ID №：3由390个氨基酸残基组成，自氨基端第1-165位为人IFNα-2b的氨基酸残基序列，自氨基端第166-390位为人IgG Fc-γ2的氨基酸残基序列；序列表中的SEQ ID №：4由390个氨基酸残基组成，自氨基端第1-165位为人IFNα-2b的氨基酸残基序列，自氨基端第166-390位为带有突变位点的人IgGFc-γ2的氨基酸残基序列，与序列表中SEQ ID №：3相比，自氨基端第277位由Pro突变为Ser。

编码上述具有α干扰素活性的融合蛋白的基因(Human IFNα-human IgG-Fc或Hu IFNα-2b-IgG/Fc)也属于本发明的保护范围，它是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：5的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：6的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID №：7的DNA序列；

4)序列表中SEQ ID №：8的DNA序列；

5)编码序列表中SEQ ID №：1-4的DNA序列；

6)与序列表中SEQ ID №：5-8限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有α干扰素活性的核苷酸序列；

7)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：5-8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：5由1194个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1194位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-495位碱基为人IFNα-2b的编码序列，自5’端第496-1194位碱基为人IgG Fc-γ1的编码序列；序列表中的SEQ ID №：6由1194个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1194位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-495位碱基为人IFNα-2b的编码序列，自5’端第496-1194位碱基编码带有突变位点的人IgG Fc-γ1，自5’端第550-552位碱基编码Val，自5’端第553-555位碱基编码Ala，自5’端第841-843位碱基编码Ser；序列表中的SEQ ID №：7由1182个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1182位碱基，编码具有序列表中SEQ ID№：3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-495位碱基为人IFNα-2b的编码序列，自5’端第496-1182位碱基为人IgG Fc-γ2的编码序列；序列表中的SEQ ID №：8由1182个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1182位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：4的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-495位碱基为人IFNα-2b的编码序列，自5’端第496-1182位碱基编码带有突变位点的人IgG Fc-γ2，自5’端第829-831位碱基编码Ser。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种表达上述具有α干扰素活性的融合蛋白的方法。

本发明所提供的表达上述具有α干扰素活性的融合蛋白的方法，是将含有上述具有α干扰素活性的融合蛋白编码基因的重组毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母(Pichiapastoris)中，表达得到具有α干扰素活性的融合蛋白；所述具有α干扰素活性的融合蛋白编码基因的5’端连接有具有Kex2单一蛋白酶酶切位点或Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子(α-Factor)信号肽片段的编码序列；所述具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段具有序列表中SEQ ID №：9的氨基酸残基序列；所述具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段具有序列表中SEQ ID №：10的氨基酸残基序列。

序列表中的SEQ ID №：9由85个氨基酸残基组成，自氨基端第1-83位氨基酸残基为α-因子信号肽序列，自氨基端第84-85位氨基酸残基为Kex2蛋白酶酶切位点；序列表中的SEQ ID №：10由89个碱基组成，自氨基端第1-83位氨基酸残基为α-因子信号肽序列，自氨基端第84-85位氨基酸残基为Kex2信号肽酶切位点，自氨基端第86-89位氨基酸残基为Ste13蛋白酶酶切位点。

所述具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段的编码序列可为序列表中的SEQ ID №：11，序列表中的SEQ ID №：11由255个碱基组成，自5’端第1-249位碱基为α-因子信号肽的编码序列，自5’端第250-255位碱基编码Kex2蛋白酶酶切位点；所述具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段的编码序列可为序列表中的SEQ ID №：12，序列表中的SEQ ID №：12由267个碱基组成，自5’端第1-249位碱基为α-因子信号肽的编码序列，自5’端第250-255位碱基为Kex2信号肽酶切位点，自5’端第256-267位碱基编码Ste13蛋白酶酶切位点。

用于构建所述重组毕赤酵母表达载体的出发载体为任意一种可在毕赤酵母中表达外源基因的表达载体，如pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K等。

以pPIC9K为出发载体，构建的重组毕赤酵母表达载体为α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ1/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ1-mut/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2-mut/pPIC9K、

α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ1/pPIC9K、

α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ1-mut/pPIC9K、

α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K或

α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ2-mut/pPIC9K。

上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

所述毕赤酵母菌株可为毕赤酵母GS115、KM71(购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(购自美国Invitrogen公司)等。

培养重组毕赤酵母菌使外源基因表达时，需用甲醇进行诱导，甲醇的终浓度可为0.5-1％，优选为1％。

本发明还提供了一种提高机体免疫力的药物。

本发明所提供的提高机体免疫力的药物，它的活性成分为上述具有α干扰素活性的融合蛋白。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、吸收促进剂或吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为：成人一般剂量为100-600万IU，慢性乙型肝炎治疗方案一般为每次300-500万IU。肌肉注射，每周一次，连续三个月为一疗程，建议使用1-3个疗程，

本发明提供了一种具有α干扰素活性的融合蛋白及其编码基因与应用。该融合蛋白是将人IFNα-2b和带/(“/”表示或)不带突变位点的人IgG Fc-γ1/IgG Fc-γ2融合在一起得到的融合蛋白。该融合蛋白与市售α干扰素相比具有以下优点：1)α干扰素活性高，可达4×10⁷IU/mg；2)半衰期长，动物实验结果表明在注射后约12小时，带/不带突变位点的本发明具有IFN-α活性的融合蛋白均达到血药峰值，消除半衰期可达65小时；3)ADCC杀伤作用小，且本发明IgG Fc段带有突变位点的融合蛋白的ADCC杀伤作用比相应的未突变的融合蛋白至少降低10％。此外，本发明所提供的表达该融合蛋白的方法具有表达量高，可达(IFNα-2b)160mg/L即(HuIFNα-2b-IgG/Fc)400mg/L，易纯化，生产周期短，生产规模大，制备成本低的优点。基于上述优点，本发明的融合蛋白及其编码基因在医学和生物制药领域，尤其是提高机体免疫力药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1为具有α干扰素活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的构建流程图

图2为具有α干扰素活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的部分物理图谱

图3为1-8号工程菌培养上清的还原SDS-PAGE电泳和Western Blot检测结果，以及IFNα-Fc-γ1、IFNα-Fc-γ1-mut、IFNα-Fc-γ2和IFNα-Fc-γ2-mut培养上清经还原SDS-PAGE电泳和非还原SDS-PAGE电泳的检测结果

图4为具有α干扰素活性的融合蛋白的表达量的检测结果

图5为重组毕赤酵母α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K培养上清、相应Protein A Agarose浓缩样品及Protein A Agarose浓缩样品经Superdex200纯化蛋白的SDS-PAGE检测结果

图6为具有α干扰素活性的融合蛋白的抗病毒活性测定结果

图7为本发明具有α干扰素活性的融合蛋白Hu IFNα-2b-IgG/Fcγ2在大鼠体内的血药浓度曲线

具体实施方式

下述实施例中的所有引物由上海生工合成，测序工作由英俊公司完成。

实施例1、具有α干扰素活性的融合蛋白编码基因的获得

用PCR法扩增本发明具有α干扰素活性的融合蛋白的编码基因，具体过程包括以下步骤：

一、IFNα-2b基因的扩增

1)连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子及IgGγ1片段的人IFNα-2b基因的扩增

以含有人IFNα-2b基因的质粒pGEM-7Z-Fa2-T7[pGEM-7Z-Fa2-T7构建方法：将人IFNα-2b基因(GenBank号：184581)克隆入载体pGEM-7Zf(+)(Promega)多克隆位点的EcoR I和Hind III限制性内切酶酶切位点之间得到重组载体]为模板，在上游引物IFNα-2b-K-Fw(5’-CTCGAGAAAAGATGTGATCTGCCTCAAACCCAC-3’)及下游引物IFNα2b/γ1-Rv(5’-GATTTGGGCTCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTG-3’)的引导下PCR扩增连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子及IgGγ1片段的人IFNα-2b基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃30秒，68℃1分钟，共30个循环；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约500bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为IFNα2b/γ1-K。

2)连接连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子及IgGγ2片段的人IFNα-2b基因的扩增

以含有人IFNα-2b基因的质粒pGEM-7Z-Fa2-T7为模板，在上游引物IFNα-2b-K-Fw及下游引物IFNα2b/γ2-Rv(5’-CATTTGCGCTCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTG-3’)的引导下PCR扩增连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子及IgGγ2片段的人IFNα-2b基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃30秒，68℃1分钟，共30个循环；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约500bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为IFNα2b/γ2-K。

3)连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子及IgGγ1片段的人IFNα-2b基因的扩增

以含有人IFNα-2b基因的质粒pGEM-7Z-Fa2-T7为模板，在上游引物IFNα-2b-K/S-Fw(5’-GAGGCTGAAGCTTGTGATCTGCCTCAAACCCAC-3’)及下游引物IFNα2b/γ1-Rv的引导下PCR扩增连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子及IgGγ1片段的人IFNα-2b基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃30秒，68℃1分钟，共30个循环；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约500bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为IFNα2b/γ1-K/S。

4)具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子及IgGγ2片段的人IFNα-2b基因的扩增

以含有人IFNα-2b基因的质粒pGEM-7Z-Fa2-T7为模板，在上游引物IFNα-2b-K/S-Fw及下游引物IFNα2b/γ2-Rv的引导下PCR扩增连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子及IgGγ2片段的人IFNα-2b基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃30秒，68℃1分钟，共30个循环；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约500bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mcfilter回收纯化该目的条带。将该片段命名为：IFNα2b/γ2-K/S。

二、pPic9k的α-Factor信号肽片段扩增

1)具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子(α-Factor)信号肽片段编码序列的扩增

以pPic9k质粒(购自Invitrogen公司)为模板，在引物α-Factor-Fw(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’)和引物α-Factor-K-Rv(5’-GCAGATCACATCTTTTCTCGAGAGATACCC-3’)的引导下PCR扩增具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段的编码序列，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，68℃1分钟，共30个循环；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约270bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为α-Factor-K。

2)具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的扩增

以pPic9k质粒为模板，在引物α-Factor-Fw和引物α-Factor-K/S-Rv(5’-GAGGCAGATCACAAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3’)的引导下PCR扩增具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段的编码序列，PCR反应条件与步骤1)相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约270bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为α-Factor-K/S。

三、5’端连接α-Factor信号肽片段编码序列的人IFNα-2b基因的扩增

1)5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的人IFNα-2b基因的扩增

1.1)以步骤一获得的IFNα2b/γ1-K和步骤二获得的α-Factor-K为模板，在上游引物α-Factor-Fw和下游引物IFNα2b/γ1-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的人IFNα-2b基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，50℃1分30秒，68℃1.5分钟，循环3次；再94℃45秒，50℃45秒，68℃1.5分钟，循环32次；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约750bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名α-Factor-IFNα-2b-γ1-K。

1.2)以步骤一获得的IFNα2b/γ2-K和步骤二获得的α-Factor-K为模板，在上游引物α-Factor-Fw和下游引物IFNα2b/γ2-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的人IFNα-2b基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，50℃1分30秒，68℃1.5分钟，循环3次；再94℃45秒，50℃45秒，68℃1.5分钟，循环32次；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约750bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名α-Factor-IFNα-2b-γ2-K。

2)5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的人IFNα-2b基因的扩增

2.1)以步骤一获得的IFNα2b/γ1-K/S和步骤二获得的具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-Factor-K/S为模板，在上游引物α-Factor-Fw和下游引物IFNα2b/γ1-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的人IFNα-2b基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，50℃1分30秒，68℃1.5分钟，循环3次；再94℃45秒，50℃45秒，68℃1.5分钟，循环32次；最后68℃10分钟.反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约750bp的条带，与预期结果相符.用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带，将该片段命名α-Factor-IFNα-2b-γ1-K/S。

2.2)以步骤一获得的IFNα2b/γ2-K/S和步骤二获得的具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-Factor-K/S为模板，在上游引物α-Factor-Fw和下游引物IFNα2b/γ2-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的人IFNα-2b基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，50℃1分30秒，68℃1.5分钟，循环3次；再94℃45秒，50℃45秒，68℃1.5分钟，循环32次；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约750bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名α-Factor-IFNα-2b-γ2-K/S。

四、带有突变位点的人IgG Fc-γ2编码基因质粒的获得

对人IgG Fc-γ2(gi：25141589)的以下位点进行突变，突变位点如见表1所示：

表1人IgG Fc-γ2基因的突变位点

人IgG Fc-γ2	331
		突变前	Pro(CCC)
突变后	Ser(TCC)

采用定点突变法扩增带有上述突变位点的人IgG Fc-γ2的编码基因，具体方法包括

以下步骤：

1)带有突变位点的人IgG Fc-γ2编码基因的5’端序列的扩增

以含有人IgG Fc-γ2完整mRNA序列的质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH6[pEF6/V5-His-TOPO-IGH6构建方法：将人IgG Fc-γ2完整mRNA克隆入载体pEF6/V5-His-TOPO(购自Invitrogen公司)的TOPO克隆位点得到重组载体pEF6/V5-His-TOPO-IGH6]为模板，在上游引物HuIgG Fcγ2-Fw(5’-GAAGTAAGGAAGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTG-3’)和下游引物Fcγ2-331Pro-MutRv(5’-GTTTTCTCGATGGAGGCTGGGAGGCCTTTGTTGGAG-3’)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃2minutes；然后94℃30s，55℃40s，68℃1minute，共35个循环；最后68℃10minutes。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约350bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为IgG Fc-γ2-mut-5’。

2)带有突变位点的人IgG Fc-γ2编码基因的3’端序列的扩增

以含有人IgG Fc-γ2完整mRNA序列的质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH6为模板，在上游引物Fcγ2-331Pro-MutFw(5’-CTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCC-3’)和下游引物HuIgG Fcγ-Rv(5’-CTGAATTCCTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC-3’)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件与步骤1)相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约360bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为IgGFc-γ2-mut-3’。

3)带有突变位点的人IgG Fc-γ2编码基因的获得

以步骤1)扩增的IgG Fc-γ2-mut-5’和步骤2)扩增的IgG Fc-γ2-mut-3’基因片断为模板，在上游引物HuIgG Fcγ2-Fw和下游HuIgG Fcγ-Rv的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃2minutes；然后94℃45s，55℃1.5minute，68℃1.5minute，共3个循环；最后94℃45s，55℃45s，68℃1.5minute，共35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约700bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带，将该基因片段命名为IgG Fc-γ2-mut。

4)带有突变位点的人IgG Fc-γ2编码基因质粒的获得

对步骤3)获得的PCR产物进行加A反应，反应条件为：将PCR产物与dATP、Taq酶在72℃下反应10minutes，然后将反应物与pEF6/V5-His TOPO载体混合孵育30minutes，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒，测序，测序结果与预期结果一致，表明获得了插入序列及位置均正确的具有点突变的HuIgG Fc-γ2基因的质粒，命名为pEF6/V5-His-TOPO-Fcγ2-mut。

五、带有突变位点的人IgG Fc-γ1编码基因质粒的获得

对人IgG Fc-γ1(gi：230581)的以下位点进行突变，突变位点如见表2所示：

表2人IgG Fc-γ1基因的突变位点

人IgG Fc-γ1	234	235	331
				突变前	Leu(CTC)	Leu(CTC)	Pro(CCC)
突变后	Val(GTC)	Ala(GCG)	Ser(TCC)

采用定点突变法扩增带有上述突变位点的人IgG Fc-γ1的编码基因，具体方法包括以下步骤：

1)带有突变位点的人IgG Fc-γ1编码基因的5’端序列的扩增

以含有人IgG Fc-γ1完整mRNA序列的质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH7[pEF6/V5-His-TOPO-IGH7构建方法：将人IgG Fc-γ2完整mRNA克隆入载体pEF6/V5-His-TOPO(购自Invitrogen公司)的TOPO克隆位点得到重组载体pEF6/V5-His-TOPO-IGH7]为模板，在引物Fcr1-234/235Mut-Fw1(5’-ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGTCGCGGGGGGACCGTCAGT-3’)和Fcr1-331Pro-MutRv(5’-GTTTTCTCGATGGAGGCTGGGAGGGCTTTGTTGGAG-3’)的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃2minutes；然后94℃30s，55℃40s，68℃1minute，共35个循环；最后68℃10minutes。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约330bp的条带，与预期结果相符。回收该目的条带，用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带，将该片段命名为IgGFc-γ1-mut-5’.

2)带有突变位点的人IgG Fc-γ1编码基因的3’端序列的扩增

以含有人IgG Fc-γ1完整mRNA序列的质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH7为模板，在上游引物Fcr-331Pro-MutFw和下游引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件与步骤1)相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约370bp的条带，与预期结果相符。回收该目的条带，用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带，将该片段命名为IgGFc-γ1-mut-3’。

3)带有突变位点的人IgG Fc-γ1编码基因的获得

以步骤1)扩增的IgG Fc-γ1-mut-5’和步骤2)扩增的IgG Fc-γ1-mut-3’基因片断为模板，在上游引物Fcr1-234/235Mut-Fw2(5’-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC-3’)和下游引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃2minutes；然后94℃45s，55℃1.5minute，68℃1.5minute，共3个循环；最后94℃45s，55℃45s，68℃1.5minute，共35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约700bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带，将该基因片段命名为IgG Fc-γ1-mut。

4)带有突变位点的人IgG Fc-γ1编码基因质粒的获得

对步骤3)获得的PCR产物进行加A反应，反应条件为：将PCR产物与dATP、Taq酶在72℃下反应10minutes，然后将反应物与pEF6/V5-His TOPO载体混合孵育30minutes，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒，测序，测序结果与预期结果一致，表明获得了插入序列及位置均正确的具有点突变的HuIgG Fc-γ1基因的质粒，命名为pEF6/V5-His-TOPO-Fcγ1-mut。

六、IgG Fc基因的扩增

1)人IgG Fc-γ1基因的扩增

以含有人IgG Fc-γ1基因的质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH7为模板，在上游引物HuIgG Fcγ1-Fw(5’-GAAGTAAGGAAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC-3’)及下游引物HuIgGFcγ-Rv的引导下PCR扩增IgG Fc-γ1基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，52℃40秒，68℃1.5分钟，共35个循环；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约700bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为IgG Fc-γ1。

2)人IgG Fc-γ1-mut基因的扩增

以含有人IgG Fc-γ1-mut基因的质粒pEF6/V5-His-TOPO-Fcγ1-mut为模板，在上游引物Fcγ1-234/235Mut-Fw2及下游引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增IgGFc-γ1-mut基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，52℃40秒，68℃1.5分钟，共35个循环；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约700bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为IgG Fc-γ1-mut。

3)人IgG Fc-γ2基因的扩增

以含有人IgG Fc-γ2基因的质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH6为模板，在上游引物HuIgG Fcγ2-Fw及下游引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增IgG Fc-γ2基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，52℃40秒，68℃1.5分钟，共35个循环；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约690bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为IgG Fc-γ2。

4)人IgG Fc-γ2-mut基因的扩增

以含有人IgG Fc-γ2-mut基因的质粒pEF6/V5-His-TOPO-Fcγ2-mut为模板，在上游引物Fcγ1-234/235Mut-Fw2及下游引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增IgGFc-γ2-mut基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，52℃40秒，68℃1.5分钟，共35个循环；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约700bp的条带，与预期结果相符。用Millipore公司的ultrafree-mc filter回收纯化该目的条带。将该片段命名为IgGFc-γ2-mut。

七、5’端连接α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因的获得

1)5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因α-Factor-Kex2-IFNα-Fc-γ1的扩增

以上述步骤三获得的人α-Factor-IFNα-2b-γ1-K基因和步骤六获得的IgGFc-γ1基因片段为模板，在引物α-Factor-Fw和引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamH I和EcoRI识别位点，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，50℃2分钟，68℃2分20秒，循环3次；再94℃45秒，50℃45秒，68℃2分20秒，循环32次；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约为1500bp的条带，与预期结果相符。用V-gene公司的凝胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收纯化该目的DNA。将该片段命名为α-Factor-Kex2-IFNα-Fc-γ1。

2)5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因α-Factor-Kex2-IFNα-Fc-γ2的扩增

以上述步骤三获得的人α-Factor-IFNα-2b-γ2-K基因和步骤六获得的IgGFc-γ2基因片段为模板，在引物α-Factor-Fw和引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamH I和EcoRI识别位点，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，50℃2分钟，68℃2分20秒，循环3次；再94℃45秒，50℃45秒，68℃2分20秒，循环32次；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约为1500bp的条带，与预期结果相符。用V-gene公司的凝胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收纯化该目的DNA。将该片段命名为α-Factor-Kex2-IFNα-Fc-γ2。

3)5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因α-Factor-Kex2-IFNα-Fc-γ1-mut的扩增

以上述步骤三获得的人α-Factor-IFNα-2b-γ1-K基因和步骤六获得的IgGFc-γ1-mut基因片段为模板，在引物α-Factor-Fw和引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamHI和EcoR I识别位点，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，50℃2分钟，68℃2分20秒，循环3次；再94℃45秒，50℃45秒，68℃2分20秒，循环32次；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约为1500bp的条带，与预期结果相符。用V-gene公司的凝胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收纯化该目的DNA。将该片段命名为α-Factor-Kex2-IFNα-Fc-γ1-mut。

4)5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因α-Factor-Kex2-IFNα-Fc-γ2-mut的扩增

以上述步骤三获得的人α-Factor-IFNα-2b-γ2-K基因和步骤六获得的IgGFc-γ2-mut基因片段为模板，在引物α-Factor-Fw和引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamHI和EcoR I识别位点，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃45秒，50℃2分钟，68℃2分20秒，循环3次；再94℃45秒，50℃45秒，68℃2分20秒，循环32次；最后68℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约为1500bp的条带，与预期结果相符。用V-gene公司的凝胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收纯化该目的DNA。将该片段命名为α-Factor-Kex2-IFNα-Fc-γ2-mut。

5)5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因α-Factor-Kex2/Ste13-IFNα-Fc-γ1的扩增

以上述步骤三获得的人α-Factor-IFNα-2b-γ1-K/S基因和步骤六获得的IgGFc-γ1基因片段为模板，在引物α-Factor-Fw和引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamHI和EcoR I识别位点，PCR反应条件与步骤1)相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约为1500bp的条带，与预期结果相符。用V-gene公司的凝胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收纯化该目的DNA。将该片段命名为α-Factor-Kex2/Ste13-IFNα-Fc-γ1。

6)5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因α-Factor-Kex2/Ste13-IFNα-Fc-γ2的扩增

以上述步骤三获得的人α-Factor-IFNα-2b-γ2-K/S基因和步骤六获得的IgGFc-γ2基因片段为模板，在引物α-Factor-Fw和引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamHI和EcoR I识别位点，PCR反应条件与步骤1)相同.反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约为1500bp的条带，与预期结果相符.用V-gene公司的凝胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收纯化该目的DNA.将该片段命名为α-Factor-Kex2/Ste13-IFNα-Fc-γ2.

7)5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因α-Factor-Kex2/Ste13-IFNα-Fc-γ1-mut的扩增

以上述步骤三获得的人α-Factor-IFNα-2b-γ1-K/S基因和步骤六获得的IgGFc-γ1-mut基因片段为模板，在引物α-Factor-Fw和引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamH I和EcoR I识别位点，PCR反应条件与步骤1)相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约为1500bp的条带，与预期结果相符。用V-gene公司的凝胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收纯化该目的DNA。将该片段命名为α-Factor-Kex2/Ste13-IFNα-Fc-γ1-mut。

8)5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因α-Factor-Kex2/Ste13-IFNα-Fc-γ2-mut的扩增

以上述步骤三获得的人α-Factor-IFNα-2b-γ2-K/S基因和步骤六获得的IgGFc-γ2-mut基因片段为模板，在引物α-Factor-Fw和引物HuIgG Fcγ-Rv的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段编码序列的具有α干扰素活性的融合蛋白基因，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamH I和EcoR I识别位点，PCR反应条件与步骤1)相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约为1500bp的条带，与预期结果相符。用V-gene公司的凝胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收纯化该目的DNA。将该片段命名为α-Factor-Kex2/Ste13-IFNα-Fc-γ2-mut。

实施例2、具有α干扰素活性的融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化

一、具有α干扰素活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的构建

参见图1构建具有α干扰素活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体，具体方法为：用限制性内切酶BamH I和EcoR I对实施例1步骤七获得的8个基因片段(统称α-Factor-IFNα-Fc)分别进行双酶切，再将8个酶切片段分别与经相同酶双酶切的质粒pPic9k用T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒，测序，测序结果与预期结果一致，表明获得了插入序列及位置均正确的具有α干扰素活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体，分别命名为α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ1/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ1-mut/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2-mut/pPIC9K、α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ1/pPIC9K、α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ1-mut/pPIC9K、α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K和α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ2-mut/pPIC9K(统称pPic9k-IFNα-Fc，部分物理图谱见图2)。

二、具有α干扰素活性的融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达

1、电转化毕赤酵母GS115菌株

用限制性内切酶Sal I对步骤一获得的具有α干扰素活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体pPic9k-IFNα-Fc(α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ1/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ1/pPIC9K、α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K、α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ1-mut/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ1-mut/pPIC9K、α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ2-mut/pPIC9K和α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2-mut/pPIC9K)进行单酶切使其线性化，用Sal I线性化的pPIC9K质粒作为阴性对照。再按每100ul毕赤酵母GS115感受态细胞加入20ul线性化质粒(约10ug)的比例，用0.2cm电转化杯进行电转化(参数设定：电压1500V、电容25uF、电阻200欧姆、放电时间4-5ms)。同时用MD平板和含0.5mg/mL G418的YPD平板(培养基配方参见Invitrogen公司的产品说明书)筛选阳性克隆，得到分别转化有上述不同重组毕赤酵母表达载体的工程菌(8种，依次编号1-8)。

2、具有α干扰素活性的融合蛋白的诱导表达

挑取步骤1获得的8种工程菌的阳性单克隆，将其接种于MGY液体培养基(培养基配方参见Invitrogen公司的产品说明书)中，以转染有pPic9K空载体的重组毕赤酵母GS115菌株为对照，在30℃、250rpm下培养至OD₆₀₀约为2-6，离心收集细胞，用含体积百分浓度1％甲醇的BMMY培养基(培养基配方参见Invitrogen公司的产品说明书)进行诱导，每隔24h补加1％甲醇，第4天停止诱导。培养结束后，3000g离心5分钟，收集上清，用下述方法对表达产物进行鉴定。

3、阳性克隆表达产物的鉴定

1)SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定

重组毕赤酵母表达载体的阳性克隆诱导表达4天后，取各10ul上述1-8号阳性克隆及阴性对照菌株培养上清进行还原性SDS-PAGE电泳，再进行Western blot检测，Western blot检测时所用的一抗分别为Anti-HuIFN IFNα抗体(安科生物公司)及HRPconjugated anti huIgG(H+L)抗体(购自广州中杉生物公司)，二抗为HRP-conjugatedgoat anti-mouse IgG抗体(购自博士德公司)。1-8号工程菌培养上清的还原SDS-PAGE电泳检测结果见图3(泳道1为阴性对照，泳道2-9分别对应1-8号工程菌)中的图A，在45kD左右，1-8号工程菌培养上清处出现表达条带而在阴性对照菌株培养上清中没有目的条带出现；Western Blot检测结果见图3中的图B(一抗为Anti-HuIFNα抗体)和图C(一抗为HRP conjugated anti huIgG(H+L))抗体，在泳道2-9也有目的条带出现，而在阴性对照中没有检测出该目的条带，表明1-8号工程菌均能表达分泌型融合蛋白，其中具有Kex2单一酶切位点信号肽的蛋白具有IFNα-2b的天然N端，其后的融合蛋白生物活性试验选择具有Kex2单一酶切位点的蛋白，分别命名为IFNα-Fc-γ1(或IFN-α2b-Fcγ1)、IFNα-Fc-γ1-mut(或IFN-α2b-Fcγ1-mut)、IFNα-Fc-γ2(或IFN-α2b-Fcγ2)和IFNα-Fc-γ2-mut(或IFN-α2b-Fcγ2-mut)。

取IFNα-Fc-γ1、IFNα-Fc-γ1-mut、IFNα-Fc-γ2和IFNα-Fc-γ2-mut培养上清分别在还原条件和非还原条件下进行SDS-PAGE电泳，结果如图3中的图D所示，表明在非还原条件下，在90KD处有目的条带，在还原条件下条带位于45KD处，说明融合蛋白以二聚体形式存在。

2)用ELISA法测定培养上清中融合蛋白的表达量

采用Bender公司的人IFNα-2b ELISA试剂盒并参照试剂盒说明书对步骤2的表达产物进行筛选，并对培养上清中融合蛋白的分泌量进行检测。

结果8种工程菌表达产物的检测结果均呈阳性，表明所携带的融合基因均可正确表达，培养上清中的融合蛋白表达量的检测结果如图4所示，四种融合蛋白的表达量约为400mg/L，即IFNα-2b表达量约为160mg/L。

三、融合蛋白的浓缩及纯化

1、用Protein A Agarsoe对表达上清进行浓缩和纯化

先用Protein A Agarsoe(购自Invitrogen公司)对步骤二8种工程菌的表达上清进行浓缩和纯化，包括以下步骤：

1)取1.5mL重组毕赤酵母菌培养液，10000rpm离心10min，取1mL上清加入1.5mLEP管，向管中加入10ul Protein A Agarose；

2)将EP管置于40rpm的脱色摇床上，室温孵育2小时；

3)将EP管室温静置5mintue，弃上清，用500ul TBS重悬Protein A Agarose；

4)重复步骤3)一次；

5)将EP管室温静置5mintue，弃上清，用100ul洗脱缓冲液(50mM Glycine-HCl，pH3.0)重悬Protein A Agarose；

6)将EP管室温静置5mintue，取约90ul上清，加入10ul中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 8.0；1.5M NaCl；1mM EDTA)，使pH接近7.0，-20℃保存。

2、分子筛纯化

用分子筛Superdex200(购自Amersham公司)对经步骤1经Protein A亲和纯化的蛋白样品做进一步纯化，用pH 8.0含0.4M NaCl的Tris-HCl平衡Superdex200柱并洗脱蛋白。重组毕赤酵母α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K培养上清(泳道1)、相应Protein A Agarose浓缩样品(泳道3)及Protein A Agarose浓缩样品经Superdex200纯化蛋白(泳道2)的SDS-PAGE检测结果如图5所示，表明经纯化获得了纯度较高的融合蛋白。再对蛋白样品的SDS-PAGE电泳图片用BandScan软件进行分析，结果经Protein A Agarose亲和纯化后的样品中，目的蛋白含量大于93％，经分子筛纯化后，无明显杂蛋白条带，杂蛋白含量小于1％。

实施例3、本发明融合蛋白的IFN-α活性检测

对实施例2经表达获得的融合蛋白用人羊膜细胞Wish株(Wish细胞)/水泡性口膜炎病毒(VSV病毒)系统进行IFN-α活性检测，具体方法为：将生长48h的Wish细胞用含10％小牛血清的DMEM培养基(购自Invitrogen公司)配成细胞浓度为3.5×105/mL的悬液，加到96孔细胞培养板上，100ul/孔，在含5％CO₂的37℃孵箱中培养4-6h后，每孔加入经4倍梯度稀释的实施例2经表达获得的融合蛋白样品100ul(样品稀释液为含7％小牛血清的DMEM培养液)，同时设立IFNα-2b标准品对照和空白对照孔，在37℃下培养18-24h。培养结束后，弃上清，用含3％小牛血清的DMEM培养基稀释的VSV病毒(100TCID50)攻击，然后置于含5％CO₂的37℃孵箱中培养36h.培养结束后，每孔加入20ul的MTT溶液(MTT浓度5mg/mL)，37℃孵箱中培养4h，培养结束后，弃部分上清，加入20％SDS(100ul/孔)，37℃放置过夜(10-12小时)，溶解深蓝色的结晶，用酶标仪读取各孔的A570nm值.结果如图6所示，本发明的融合蛋白具有较高的IFN-α活性，IFNα2b-Fcγ1，IFNα2b-Fcγ2，IFNα2b-Fcγ1-mut和IFNα2b-Fcγ2-mut的抗病毒活性分别为3.63×10⁷，4.29×10⁷，4.05×10⁷和3.79×10⁷IU/mg。

实施例4、本发明具有IFN-α活性的融合蛋白的ADCC检测

对本发明具有IFN-α活性的融合蛋白进行ADCC检测，具体方法为：取正常人肝素抗凝血10mL，用淋巴细胞分离液(南京生兴生物技术有限公司)分离单个核细胞，用PBS溶液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L，pH7.4)洗涤三次后用RMPI1640完全培养基(购自Invitrogen公司)调整至6×10⁶/mL，得到效应细胞PBMC；取生长良好的单层Wish细胞，用胰酶消化后，再用RMPI1640完全培养基调整至1×10⁵/mL作为靶细胞，实验分组如下：

实验组1：Wish细胞，PBMC，IFNα-Fc-γ1(No.1)、IFNα-Fc-γ2(No.2)和RMPI1640完全培养基；

实验组2：Wish细胞，PBMC，IFNα-Fc-γ1-mut(No.1)、IFNα-Fc-γ2-mut(No.2)和RMPI1640完全培养基；

对照组1：Wish细胞，IFNα-Fc-γ1(No.1)、IFNα-Fc-γ2(No.2)和RMPI1640完全培养基；

对照组2：Wish细胞，IFNα-Fc-γ1-mut(No.1)、IFNα-Fc-γ2-mut(No.2)和RMPI1640完全培养基；

对照组3：Wish细胞，PBMC，IFNα-2b标准品和RMPI1640完全培养基；

对照组4：Wish细胞，PBMC和RMPI1640完全培养基；

对照组5：Wish细胞和RMPI1640完全培养基；

对照组6：RMPI1640完全培养基。

取96孔板，每孔加入PBMC 100ul，Wish细胞100ul，蛋白样品1ug，用RMPI1640完全培养基补齐至300ul，每组设6个复孔，在37℃、5％CO₂下培养12-24小时，滴加MTT(5mg/mL)(20ul/孔)，继续培养4h。培养结束后，弃部分上清，加入20％SDS(100ul/孔)，37℃放置过夜，溶解深蓝色的结晶，用酶标仪读取各孔的A_570nm值。用统计学处理比较各组之间的均数，计算杀伤率。IFNα2b-Fcγ1，IFNα2b-Fcγ2，IFNα2b-Fcγ1-mut和IFNα2b-Fcγ2-mut的ADCC细胞毒性分别为19.42％，11.04％，15.78％和8.98％。较之IgG蛋白本身及一般抗体的毒性(多在50-60％，甚至更高)，本发明具有IFN-α活性的融合蛋白的ADCC毒性较低，分析原因可能是引入了Fc片段N端连接的IFNα2b改变Fc片段空间结构，影响Fc与PBMC细胞中Fc受体的结合，从而降低了ADCC毒性。

实施例5、本发明具有IFN-α活性的融合蛋白的在大鼠体内的半衰期测定

通过皮下注射，将商品化的rHuIFN(购自安科生物公司)和实施例2得到的抗病毒活性最高的IFNα2b-Fcγ2分别注入SD大鼠(注射剂量分别为2.5ug/kg体重和5ug/kg体重)，以注射相同体积PBS的SD大鼠作为对照(每组3只)。注射后，在不同时间点(0、1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、96、120小时)通过剪尾取血法收集血样肝素钠抗凝，将采集的血样3000rpm离心10min，收集血浆，-70℃冷冻保藏。将血样用IFN-α ELISA试剂盒并参照说明书检测血清中本发明具有IFN-α活性的融合蛋白的含量，并根据结果绘制出反映蛋白含量变化的曲线图，如图7所示，在注射后约12小时，IFNα2b-Fcγ2蛋白达到血药峰值，消除半衰期约为65小时，而用作对照的商品化rHuIFN经皮下注射后，血药达峰时间约为6小时，消除半衰期约为9小时，用相同方法检测IFNα2b-Fcγ1，IFNα2b-Fcγ1-mut和IFNα2b-Fcγ2-mut的半衰期，结果较之IFNα-2b对照品也具有很大程度的提高.上述检测结果表明本发明具有IFN-α活性的融合蛋白的半衰期较之IFNα-2b对照品具有很大程度的提高.

序列表

<160>13

<210>1

<211>397

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1               5                   10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

        35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

    50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

                165                 170                 175

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

            180                 185                 190

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

        195                 200                 205

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

    210                 215                 220

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

225                 230                 235                 240

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

                245                 250                 255

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

            260                 265                 270

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

        275                 280                 285

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

    290                 295                 300

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

305                 310                 315                 320

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

                325                 330                 335

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

            340                 345                 350

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

        355                 360                 365

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

    370                 375                 380

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385                 390                 395

<210>2

<211>397

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1               5                   10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

        35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

    50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

                165                 170                 175

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Val Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

            180                 185                 190

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

        195                 200                 205

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

    210                 215                 220

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

225                 230                 235                 240

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

                245                 250                 255

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

            260                 265                 270

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

        275                 280                 285

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

    290                 295                 300

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

305                 310                 315                 320

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

                325                 330                 335

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

            340                 345                 350

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

        355                 360                 365

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

    370                 375                 380

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385                 390                 395

<210>3

<211>390

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1               5                   10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

        35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

    50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys

                165                 170                 175

Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

            180                 185                 190

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

        195                 200                 205

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

    210                 215                 220

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His

                245                 250                 255

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

            260                 265                 270

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

        275                 280                 285

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

    290                 295                 300

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

305                 310                 315                 320

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

                325                 330                 335

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

            340                 345                 350

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

        355                 360                 365

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

    370                 375                 380

Lys Ser Leu Ser Leu Ser

385                 390

<210>4

<211>390

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1               5                   10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

        35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

    50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys

                165                 170                 175

Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

            180                 185                 190

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

        195                 200                 205

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

    210                 215                 220

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His

                245                 250                 255

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

            260                 265                 270

Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

        275                 280                 285

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

    290                 295                 300

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

305                 310                 315                 320

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

                325                 330                 335

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

            340                 345                 350

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

        355                 360                 365

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

    370                 375                 380

Lys Ser Leu Ser Leu Ser

385                 390

<210>5

<211>1194

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca    540

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc    600

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac    660

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag    720

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac    780

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc    840

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc    900

ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa    960

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac    1020

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc    1080

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag    1140

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atag          1194

<210>6

<211>1194

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca    540

gcacctgaag tcgcgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc    600

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac    660

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag    720

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac    780

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc    840

tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc    900

ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa    960

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac    1020

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc    1080

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag    1140

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atag          1194

<210>7

<211>1182

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaagagcg caaatgttgt gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct    540

gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc    600

cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag    660

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag    720

cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg    780

aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa    840

accatctcca aaaccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc    900

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc    960

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccaca    1020

cctcccatgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag    1080

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac    1140

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ag                       1182

<210>8

<211>1182

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag    60

atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag    120

gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc    180

cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc    240

ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata    300

cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg    360

aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg    420

gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt    480

ttaagaagta aggaagagcg caaatgttgt gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct    540

gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc    600

cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag    660

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag    720

cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg    780

aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcctc catcgagaaa    840

accatctcca aaaccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc    900

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc    960

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccaca    1020

cctcccatgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag    1080

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac    1140

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ag                       1182

<210>9

<211>85

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1               5                   10                  15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

            20                  25                  30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

        35                  40                  45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

    50                  55                  60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65                  70                  75                  80

Ser Leu Glu Lys Arg

                85

<210>10

<211>89

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1               5                   10                  15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

            20                  25                  30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

        35                  40                  45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

    50                  55                  60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65                  70                  75                  80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala

                85

<210>11

<211>255

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct    60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt    120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat    180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta    240

tctctcgaga aaaga                                                     255

<210>12

<211>267

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct    60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt    120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat    180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta    240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagct                                        267

<210>13

<211>165

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met

1               5                   10                  15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp

            20                  25                  30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

        35                  40                  45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

    50                  55                  60

Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

                85                  90                  95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

            100                 105                 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

    130                 135                 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145                 150                 155                 160

Leu Arg Ser Lys Glu

                165

Claims (10)

1.具有α干扰素活性的融合蛋白，是在人IFNα-2b的羧基端连接有人IgG Fc-γ1或人IgG Fc-γ2的融合蛋白；所述人IFNα-2b的氨基酸序列为序列表中SEQ ID №：13所示；所述人IgG Fc-γ1为野生型人IgG Fc-γ1或其突变体；所述人IgG Fc-γ2为野生型人IgG Fc-γ2或其突变体。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述蛋白是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)序列表中的SEQ ID №：2；

3)序列表中的SEQ ID №：3；

4)序列表中的SEQ ID №：4。

3.编码权利要求1或2所述的具有α干扰素活性的融合蛋白的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：5的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：6的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID №：7的DNA序列；

4)序列表中SEQ ID №：8的DNA序列。

5.含有权利要求3所述基因的重组表达载体、转基因细胞系和重组菌。

6.一种表达权利要求1或2所述的具有α干扰素活性的融合蛋白的方法，是将含有权利要求3所述的具有α干扰素活性的融合蛋白编码基因的重组毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中，表达得到具有α干扰素活性的融合蛋白；所述具有α干扰素活性的融合蛋白编码基因的5’端连接有具有Kex2单一蛋白酶酶切位点或Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段的编码序列；所述具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段具有序列表中SEQ ID №：9的氨基酸残基序列；所述具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段具有序列表中SEQ ID №：10的氨基酸残基序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段的编码序列为序列表中的SEQ ID №：11；所述具有Kex2及Ste13两个蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段的编码序列为序列表中的SEQ ID №：12。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：用于构建所述重组毕赤酵母表达载体的出发载体为pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K；以pPIC9K为出发载体构建的重组毕赤酵母表达载体为

α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ1/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ1-mut/pPIC9K、

α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K、α-Factor-Kex-IFNα-Fc-γ2-mut/pPIC9K、

α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ1/pPIC9K、

α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ1-mut/pPIC9K、α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ2/pPIC9K或α-Factor-Kex/Ste-IFNα-Fc-γ2-mut/pPIC9K。

9.根据权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：所述毕赤酵母菌株为毕赤酵母GS115、KM71或SMD1168。

10.权利要求1或2所述的融合蛋白在制备提高机体免疫力药物中的应用。

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