CN113185614A - 一种抗蛋白酶降解的猪源抗菌肽突变体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗蛋白酶降解的猪源抗菌肽突变体及其制备方法与应用 Download PDF

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CN113185614A CN202110437861.6A CN202110437861A CN113185614A CN 113185614 A CN113185614 A CN 113185614A CN 202110437861 A CN202110437861 A CN 202110437861A CN 113185614 A CN113185614 A CN 113185614A
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Abstract

本发明公开了一种抗蛋白酶降解的猪源抗菌肽突变体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。一种猪源抗菌肽突变体PMAP‑36(kr‑rr)，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌和短小芽孢杆菌具有显著的抑菌活性，对大肠杆菌E.coli也有抑制作用。重组酵母菌株P.pastoris X33/pPCIZ‑oriopSP(d4)‑PMAP36，实现了PMAP‑36(kr‑rr)在毕赤酵母X‑33中高水平分泌表达。抑菌结果显示，PMAP‑36(kr‑kk)发酵液抑菌活力显著高于PMAP‑36。本研究为抗菌肽PMAP‑36(kr‑kk)在饲料中的安全生产与应用奠定了基础。

Description

一种抗蛋白酶降解的猪源抗菌肽突变体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种抗蛋白酶降解的猪源抗菌肽突变体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。
背景技术
抗生素抗性问题在全球日益普遍，由细菌耐药和药物残留引发的动物性食品安全卫生问题对全球公共卫生系统造成了巨大威胁。抗菌肽因其具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生抗药性、作用机理独特，热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用，在蛋白质分子四级结构和物理化学性质方面显示出的多样性等多重优势。因此，抗菌肽成为国内外医药、食品、饲料和免疫等领域研究和开发的热点，生物抗菌肽的开发利用有望成为解决耐药菌问题的理想途径，有着广阔的开发应用前景。
猪源抗菌肽PMAP-36具有广谱的抗菌活性及多种免疫调节活性，其天然的优异的生物学活性受到人们的广泛关注。PMAP-36是在1994年首次从猪骨髓RNA库中克隆得到的含有36个氨基酸的抗菌肽，其N端为富电荷区，含有13个正电荷氨基酸；C端为疏水区，含有21个疏水性氨基酸。结构分析表明，PMAP-36是一个典型的两亲性α-螺旋结构的高阳离子抗菌肽，通过透化细菌细胞膜起到杀菌作用，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌、病毒等表现出不同程度的杀伤效果。抗菌肽应用前景虽然广阔，但是在制备方面存在一些限制因素。一是来源受到限制，抗菌肽绝大部分来自于动植物组织，天然产量很低且培养成本昂贵，缺乏大规模制备的基础；二是抗菌肽的分子小，从动植物组织中分离提取时存在较多的困难，因而增加了制备成本。如何提高生产效率、降低成本成为抗菌肽基因工程研究亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为提高PMAP-36发酵活力而提供一种抗Kex2蛋白酶降解的抗菌肽突变体PMAP-36(kr-kk)。
本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQID No.7或SEQ ID No.9。
本发明的第二个目的是提供表达所述融合蛋白的载体。
在一种实施方式中，所述融合蛋白的核苷酸序列包括SEQ ID No.8或SEQ IDNo.10。
本发明的第三个目的是提供含有所述融合蛋白或所述载体的重组菌株。
在一种实施方式中，所述重组菌株以毕赤酵母为宿主。
在一种实施方式中，所述重组菌株以pPICZαA为载体。
在一个实施方式中，所述宿主毕赤酵母是X33。
本发明的第四个目的是提供一种构建上述重组菌株的方法，所述方法为：将抗菌肽PMAP-36连接在α-信号肽的C端后，插入表达载体并转入毕赤酵母获得重组菌株。
在一种实施方式中，所述抗菌肽PMAP-36的氨基酸序列包括SEQ ID No.2或SEQ IDNo.4所示。
在一种实施方式中，所述α-信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明的第五个目的是提供一种提高抗菌肽PMAP-36抑菌活性的方法，所述方法为：将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的抗菌肽PMAP-36中的13位精氨酸突变为赖氨酸。
本发明还提供了所述融合蛋白或所述重组菌株在抑制大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)方面的应用。
本发明还提供了所述融合蛋白或所述重组菌株在食品、防腐剂、医药和饲料等领域中的应用。
附图说明
图1.pPICZ-oporiSP+PMAP36质粒图谱。
图2.pPICZ-oporiSP(d4)+PMAP36质粒图谱。
图3.pPICZ-oporiSP(d4)+PMAP36(kr-rr)质粒图谱。
图4.PMAP36和PMAP36(kr-rr)抑菌活力检测图；A为S.aureus，B为B.pumilus，C为M.lysodeikticus，D为B.subtilis，E为P.aeruginosa，F为E.coli；打孔标号1为阴性对照，即转入空载pPICZα空载体的X33发酵液，2为阳性对照，即5μLAMP抗生素，3为50μLPMAP36(kr-kk)重组转化子10，4为50μLPMAP-36重组转化子1的发酵上清液。
具体实施方式
摇瓶发酵方式：参照毕赤酵母表达操作手册(Version F 01030225-0170)，制作毕赤酵母X33感受态细胞。将构建的重组表达载体用Sac I进行线性化酶切，用乙醇沉淀法收集酶切产物。将10μL(含1μg以上DNA)线性化重组表达载体通过电转仪转化毕赤酵母X33感受态，涂含有1mg/mL Zeocin的YPD平板。长出的菌落继续点种到含有不同浓度Zeocin的YPD平板上，分别将Zeocin浓度梯度设为1.5mg/mL，2mg/mL。挑取在2mg/mL zeocin平板中长出来的单菌落10个接含25mL YPD培养基的摇瓶培养，待生物量长到OD600＝30左右时离心收获菌体，转移到新的YP培养中加2％甲醇开始诱导，每24h加一次甲醇，诱导72h后下摇瓶测酶活，挑取酶活最高者做甘油管保菌后-80度保藏备用。
抑菌平板实验：采用琼脂孔穴扩散法，将相关指示菌稀释至1×105CFU/mL后加入到冷却至40-50℃的30mL LB培养基中预混倒板，凝固后进行打孔。以5μL Amp作为阳性对照，以空载酵母发酵液作为阴性对照，每孔各加入50μL待测上清样品，于37℃培养箱正置培养，12-18h观察试验结果，记录透明圈直径并将出现透明圈的指示菌加入到该抗菌肽的抑菌谱中。
蛋白质含量测定方法：本研究蛋白含量的测量方法为考马斯亮蓝法，按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒配制0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5mg/mL BSA蛋白，将不同条件下的摇瓶发酵上清液过0.22μm水系滤膜，稀释到相应浓度，记录稀释倍数。取5μL不同浓度的BSA标准蛋白及处理好的样品加到96孔板的蛋白标准孔中，各孔加入250μL G250染色液，静置2min。用酶标仪测定A595 nm波长的吸光度，2小时内检测数据无显著变化后，根据标准曲线和稀释倍数计算出上清液中的蛋白浓度。
培养基：
YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖；
YPM培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，2％甲醇(每24h加一次)。
菌株和载体：
pPCIZα质粒：本质粒为商业化质粒，由本实验室保存，质粒信息详见PichiaExpression Kit,
Version F,000526,25-0172。
实施例1.重组表达质粒pPCIZ-oriopSP-PMAP36构建
将野生型抗菌肽PMAP-36的核苷酸序列经过密码子优化后(核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示)插入到酵母α-信号肽C末端，构成全长125个氨基酸的序列，在序列的N端和C端分别添加Asu II酶切位点和Not I酶切位点，而后由公司合成相应的基因序列。将合成的基因序列插入pUC57质粒上构成重组质粒pUC57-oporiSP-PMAP36。将重组质粒pUC57-oporiSP-PMAP36经大肠杆菌JM109扩增后，用Asu II和Not I双酶切回收大小为382bp的目的片段，用Asu II和Not I双酶切载体pPICZαA并回收大小为3263bp的载体片段，将酶切后的目的片段和载体片段用T4连接酶连接起来转化大肠杆菌JM109并涂zeocin抗性平板，37℃过夜培养，挑取平板上的单菌落接入含zeocin抗生素的LB培养基扩增培养后，提取质粒并送公司测序鉴定，测序验证成功的重组质粒命名为pPICZ-oporiSP-PMAP36(图1)。
实施例2.重组表达质粒pPCIZ-oriopSP(d4)-PMAP36构建
以实施例1获得的重组质粒pPICZ-oporiSP-PMAP36为模板，设计引物，构建删除α-信号肽C端4个氨基酸EAEA的重组质粒。
F1：CCGGGTCTCAGAGAGGAAGGTTCCGTCG；
R1：CCGCAGCTGCGAGATAGGCTGA；
F2：GGCGAGCTCGCTCATTCCAATTC；
R2：GGCGGTCTCCTCTCTTTTCAAGAGATACGCCC。
以实施例1获得的重组质粒pPICZ-oporiSP-PMAP36为模板，使用引物F1和R1进行PCR扩增得到大小为425bp的条带A，用Bsa I和Pvu II双酶切该条带并回收；
以实施例1获得的重组质粒pPICZ-oporiSP-PMAP36为模板，使用引物F2和R2进行PCR扩增得到大小为1003bp的条带B，用Bsa I和Sac I双酶切该条带并回收；
用Sac I和Pvu II双酶切实施例1获得的重组质粒pPICZ-oporiSP-PMAP36后，回收2237bp的条带C；
将条带A、B和C用T4连接酶连接起来后转化大肠杆菌JM109并涂zeocin抗性平板，37℃过夜培养，再挑取平板上的单菌落接入含zeocin抗生素的LB培养基扩增培养后，提取质粒测序验证，所得重组质粒已经删除α-信号肽C端的四个氨基酸EAEA，α-信号肽C端只留下Kex 2酶切位点，测序验证成功的重组质粒命名pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36(图2)。
实施例3.突变质粒的构建
以实施例2获得的重组质粒pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36为模板，将野生型抗菌肽PMAP-36中的13位氨基酸精氨酸R突变为赖氨酸K获得抗菌肽突变体PMAP36(kr-kk)(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)，设计的突变引物如下所示：
F3：AAAAAAACCCGTAAAAAGCTAAAAAAGATCGGA；
R4：TCCGATCTTTTTTAGCTTTTTACGGGTTTTTTT；
以实施例2获得的重组质粒pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36为模板，使用引物F3和R4进行PCR，扩增得到的PCR产物用Dpn I消化后回收得到大小为3645bp的条带，将条带转化大肠杆菌JM109并涂zeocin抗性平板，37℃过夜培养，再挑取平板上的单菌落接入含zeocin抗生素的LB扩增培养后提取质粒测序验证，测序验证成功的重组质粒命名为pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36(kr-kk)(图3)。
实施例4.重组菌株的构建及性能测试
(1)重组菌株的构建
将实施例2构建的重组质粒pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36和实施例3构建的重组质粒pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36(kr-kk)分别用Sac I进行线性化酶切，用乙醇沉淀法收集酶切产物。将10μL(含1μg以上DNA)线性化重组质粒pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36和pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36(kr-kk)通过电转仪分别转化至毕赤酵母X33感受态，涂布含有1mg/mLZeocin的YPD平板。将平板上长出的菌落继续点种到含有不同浓度Zeocin的YPD平板上，Zeocin浓度梯度设为1.5mg/mL，2mg/mL。分别挑取10个在含有2mg/mL zeocin平板中长出来的单菌落接种至含25mL YPD培养基的摇瓶培养，待生物量长到OD600＝30左右时离心收获菌体，将菌体转移到新的25mL YPM培养中，添加2％甲醇开始诱导表达，每24h加一次甲醇，诱导72h后下摇瓶测抑菌活力，挑取抑菌活力最高者做甘油管保菌后-80℃保藏备用，获得重组菌株P.pastoris X33/pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36和重组菌株P.pastoris X33/pPICZ-oporiSP(d4)-PMAP36(kr-kk)。
以相同的方法将实施例1构建的重组表达载体pPICZ-oporiSP-PMAP36转化毕赤酵母获得重组菌株P.pastoris X33/pPCIZ-oriopSP-PMAP36。
(2)重组菌株的性能测试
使用采用琼脂孔穴扩散法测定重组菌株的抑菌活力。
含完整α-信号肽加抗菌肽基因的重组菌株P.pastoris X33/pPCIZ-oriopSP-PMAP36发酵液上清液无法检测到抑菌活力，可能是α-信号肽C末端切割不完整导致残留的酸性氨基酸谷氨酸GLu和抗菌肽PMAP-36的N端碱性带正电氨基酸Lys形成离子键，妨碍其发挥功能，并且容易形成淀粉状沉淀，从而大大降低抗菌肽活性。
α-信号肽C末端删除EAEA四个氨基酸后仅保留Kex2蛋白酶识别位点KR，被Kex2蛋白酶切割后可以使抗菌肽PMAP-36形成天然N端。α-信号肽C端EAEA氨基酸被删除的重组菌株P.pastoris X33/pPCIZ-oriopSP(d4)-PMAP36发酵液上清液出现明显抑菌活力，摇瓶筛选10个单菌落结果如表1所示。对比说明维持抗菌肽PMAP-36天然N端对其表达活性有重要影响。
表1 P.pastoris X33/pPCIZ-oriopSP(d4)-PMAP36发酵结果
Figure BDA0003033863290000051
α-信号肽C端删除EAEA四个氨基酸和抗菌肽PMAP-36序列第13位氨基酸Arg突变成Lys的重组菌株P.pastoris X33/pPCIZ-oriopSP(d4)-PMAP36(kr-kk)，摇瓶筛选10个单菌落结果如表2所示。
表2 P.pastoris X33/pPCIZ-oriopSP(d4)-PMAP36(kr-kk)发酵结果
Figure BDA0003033863290000061
由2个表对比可以看出抗菌肽突变体PMAP36(kr-kk)发酵上清液抑菌活力显著高于野生型抗菌肽PMAP-36发酵液上清活力。
(3)广谱抑菌测试
采用琼脂孔穴扩散法，将E.coli、S.aureus、M.lysodeikticus、P.aeruginosa、B.subtilis和B.pumilus等指示菌稀释至1×105CFU/mL后分别加入到冷却至40-50℃的30mL LB培养基中充分混匀并倒平板，凝固后分别打4个孔，其中1号孔设置为阴性对照，2号孔设置为阳性对照，3号孔设置为抗菌肽突变体PMAP36(kr-kk)，4号孔设置为野生型抗菌肽PMAP-36。1号孔添加50μL空载毕赤酵母X33的摇瓶发酵72h的发酵液作为阴性对照，2号孔添加5μL Amp作为阳性对照，3号孔添加50μL步骤(2)中的重组菌株P.pastoris X33/pPCIZ-oriopSP(d4)-PMAP36(kr-kk)-10摇瓶发酵72h的发酵上清液，4号孔添加50μL步骤(2)中的重组菌株P.pastoris X33/pPCIZ-oriopSP(d4)-PMAP36-1摇瓶发酵72h的发酵上清液。于37℃培养箱正置培养，12-18h后观察试验结果，记录透明圈直径并将出现透明圈的指示菌加入到该抗菌肽的抑菌谱中。
结果如表3和图4所示，可看到抗菌肽突变体PMAP36(kr-kk)抑菌圈明显大于野生型抗菌肽PMAP-36。
表3图中各平板透明圈大小统计表
Figure BDA0003033863290000062
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种抗蛋白酶降解的猪源抗菌肽突变体及其制备方法与应用
<130> BAA210479A
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aatggacttc tttttattaa cacgacgatt gcttccatag cagctaaaga agagggcgta 240
tctcttgaaa agagaggaag gttccgtcgt ctgcgtaaaa aaacccgtaa aagactaaaa 300
aagatcggaa aggtgctaaa atggatacca cctatcgtgg gcagtattcc attaggttgc 360
gga 363
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Gly Arg Phe Arg Arg Leu Arg Lys Lys Thr Arg
85 90 95
Lys Lys Leu Lys Lys Ile Gly Lys Val Leu Lys Trp Ile Pro Pro Ile
100 105 110
Val Gly Ser Ile Pro Leu Gly Cys Gly
115 120
<210> 10
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgagatttc cttccatctt taccgctgtt ttgtttgccg cttcttctgc acttgccgct 60
cccgtgaata cgacaaccga ggacgagaca gcacagatac ctgctgaggc agtcataggc 120
tattctgatt tggaaggaga ttttgatgtg gctgttttgc cattctcaaa ctccacgaat 180
aatggacttc tttttattaa cacgacgatt gcttccatag cagctaaaga agagggcgta 240
tctcttgaaa agagaggaag gttccgtcgt ctgcgtaaaa aaacccgtaa aaagctaaaa 300
aagatcggaa aggtgctaaa atggatacca cctatcgtgg gcagtattcc attaggttgc 360
gga 363

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID No.7或SEQ IDNo.9。
2.表达权利要求1所述融合蛋白的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述融合蛋白的核苷酸序列包括SEQ IDNo.8或SEQ ID No.10。
4.含有权利要求1所述融合蛋白或权利要求2或3所述载体的重组菌株。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，以pPICZαA为载体。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主毕赤酵母包括P.pastorisX33。
7.构建权利要求4～6所述重组菌株的方法，其特征在于，所述方法为：将抗菌肽PMAP-36连接在α-信号肽的C端后，插入表达载体并转入毕赤酵母获得重组菌株；所述抗菌肽PMAP-36的氨基酸序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示；所述α-信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
8.一种提高抗菌肽PMAP-36抑菌活性的方法，其特征在于，所述方法为：将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的抗菌肽PMAP-36中的13位精氨酸突变为赖氨酸。
9.权利要求1所述融合蛋白或权利要求4～6任一所述重组菌株在抑制大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)方面的应用。
10.权利要求1所述融合蛋白或权利要求4～6任一所述重组菌株在食品、防腐剂、医药和饲料等领域中的应用。
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