CN105753958A - 一种新型鱼源抗菌肽突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体及其制备方法和应用。本发明通过生物软件对鱼源抗菌肽moronecidin的氨基酸序列进行空间结构分析，将其22个氨基酸中的2处氨基酸进行突变(K7R和V20K)，同时为了保证抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，获得一种新型鱼源抗菌肽突变体，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于水产动物饲料添加剂或水产动物疾病的预防和治疗制剂。

Description

一种新型鱼源抗菌肽突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽是生物体内存在的一种分子量较小的多肽，具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性的病原菌，其杀伤作用更为显著。除此之外，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原生动物等也有杀灭作用，甚至具有提高动物体的免疫活性、加速伤口愈合过程等作用。同时，它还具有稳定性好、水溶性好等特点。这些特性使抗菌肽成为医药学，免疫学和分子生物学等相关学科的研究热点。抗菌肽作为水生生物的非特异性免疫因子之一，在防御海水性细菌和病毒入侵方面起着重要作用，近年来有关鱼、虾、贝等水产品中抗菌肽的研究日渐增多。
尽管抗菌肽的功能显著，在水产养殖中的应用前景诱人，但抗菌肽在动物体内含量极微。从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，从而制约了抗菌肽的实际应用。因此，开展对抗菌肽进行基因工程改造的研究具有重要意义。
鱼源抗菌肽moronecidin是由22个氨基酸残基组成的多肽，是从杂交斑纹鲈鱼中分离得到的。该多肽C端被酰胺化，高盐条件下仍保持活力，成熟肽含4个组氨酸，带正电荷，能够广谱高效的抵抗鱼类致病菌，是一种具有开发潜力的抗菌肽。本发明通过碱基替换的方法对鱼源抗菌肽moronecidin进行改造，获得一种新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体，大大提高了其抑菌活性，极具市场开发价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型鱼源抗菌肽突变体，即通过生物软件对鱼源抗菌肽moronecidin(GenBank登录号：AAV65044)的氨基酸序列进行空间结构分析，分别将鱼源抗菌肽moronecidin的22个氨基酸中的2处氨基酸进行突变(K7R和V20K)，获得一种新型鱼源抗菌肽突变体。同时为了保证抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其抗菌效力获得显著提高。
本发明首先提供一种新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1；
上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQIDNO:2；
本发明还提供一种新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如下：
1)根据新型鱼源抗菌肽突变体的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；
2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达鱼源抗菌肽突变体的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出鱼源抗菌肽突变体；
3)对重组表达的鱼源抗菌肽突变体进一步浓缩、纯化后，测定效价达9000U/ml。稀释分装，即为抗菌肽制剂。
本发明利用基因工程技术构建了能表达一种新型鱼源抗菌肽突变体的重组酵母菌株。将重组鱼源抗菌肽突变体制备成抗菌肽制剂，其抑菌效价高、抑菌谱广，具有广阔的市场前景和开发价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
实施例1新型鱼源抗菌肽突变体及其基因的获得
1、鱼源抗菌肽moronecidin(GenBank登录号：AAV65044)是由22个氨基酸残基组成的抗菌肽，对细菌有很强的抑菌活性。为了进一步提高其抑菌活性，通过生物软件对鱼源抗菌肽moronecidin的氨基酸序列进行空间结构分析，分别将鱼源抗菌肽moronecidin的22个氨基酸中的2处氨基酸进行突变(K7R和V20K)，同时为了保证抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其抗菌效力获得显著提高，获得一种新型鱼源抗菌肽突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2、根据获得的新型鱼源抗菌肽突变体的氨基酸序列SEQIDNO:1，按照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型鱼源抗菌肽突变体的核苷酸序列SEQIDNO:2。并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。
实施例2基因工程鱼源抗菌肽突变体表达载体的构建与工程菌的获得
1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。
2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mLZeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3-5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mLZeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4％体积比转接于5mLBMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值约为5-6。培养物直接转接于25mLBMMY培养基中，28℃继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100％甲醇使终浓度达1％。48h后，4℃5000r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型鱼源抗菌肽突变体的阳性菌株，命名为MA株。
实施例3新型鱼源抗菌肽突变体的发酵、纯化制备
1、发酵工艺
1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1％-10％接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5％-20％接种量接入10L发酵罐(实装培养基7L)，温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM(1L发酵液1min通入的氧气量)，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50％甘油5h，待溶氧突然升至100％时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。
2)发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。
3)新型抗菌肽制剂
抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。
上述基因工程抗菌肽可做成水产动物饲料添加剂或水产动物疾病的预防和治疗制剂。
实施例4新型鱼源抗菌肽突变体的最小抑菌浓度测定(MIC)
1、试验菌株
金黄色葡萄球菌(CowanI)、鳗弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌。
2、菌株处理：将菌种复苏，在固体培养基中划线，在28℃培养箱中过夜培养。将过夜培养的细菌挑单菌落于含有25mL液体培养基的三角瓶中，将三角瓶放于摇床28℃培养12-18h。将培养后的菌液测OD600值，用培养基调节菌液浓度，使其处于0.6-0.8之间。之后将菌液稀释成浓度为5×105CFU/mL，依次取90μL加入到96孔板的各孔内。
3、抗菌肽定量后用培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽各取10μL依次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100μL。96孔板盖盖后，28℃振荡培养24h后，观察并用酶标仪测量OD600值并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀释后，成一系列浓度，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度(MIC)。菌液和培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100％。同时设立鱼源抗菌肽moronecidin标准品试验组作为对照，用于观察抗菌肽改造前后的抑菌活性变化。
4、用微量稀释法测定重组新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体对多种细菌的最低抑菌浓度，结果表明其对水产常见病害菌均有显著的抑制效果，特别是改造的新型鱼源抗菌肽突变体与鱼源抗菌肽moronecidin标准品相比，对鳗弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌的抑菌能力均得到广泛提高，显示了本发明对鱼源抗菌肽moronecidin的氨基酸突变效果显著。
表1抗菌肽对多种水产病害菌的最低抑菌浓度

Claims (4)

1.一种新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体，其特征在于，所述的新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2.一种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段用于编码权利要求1所述的鱼源抗菌肽moronecidin突变体。
3.如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:2。
4.权利要求1所述的新型鱼源抗菌肽moronecidin突变体在制备水产动物饲料添加剂或疾病的预防和治疗制剂中的应用。
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