CN108948210A

CN108948210A - 杂合抗菌肽pa-mo及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108948210A
Application number: CN201810803448.5A
Authority: CN
Inventors: 侯竹美; 丰艳妮
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2018-07-20
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-07-20
Also published as: CN108948210B

Abstract

本发明提供了一种杂合抗菌肽PA‑MO及其制备方法和应用。本发明通过对鱼源抗菌肽parasin I与moronecidin进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽parasin I与moronecidin进行拼接，中间加入蛋白Lingker，同时进行部分位点氨基酸突变，获得一种新型杂合抗菌肽PA‑MO，使其抗菌效力获得显著提高。将杂合抗菌肽PA‑MO基因进行毕赤酵母偏爱密码子优化后人工合成，克隆于毕赤酵母中表达，结果重组表达的杂合抗菌肽PA‑MO与原始抗菌肽相比抗菌效力获得显著提高。将重组菌株发酵规模放大到发酵罐水平，发酵液进一步纯化后可制成抗菌肽制剂，用于水产动物疾病的预防和治疗。

Description

杂合抗菌肽PA-MO及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种杂合抗菌肽PA-MO及其制备方法和应用。

背景技术

随着抗菌肽结构与杀菌机理研究的深入，人们开始尝试对天然抗菌肽进行设计改造，以期获得一批杀菌活力更强、抗菌谱更广的杂合抗菌肽。目前，国内外已有多篇文献报道多种新型杂合抗菌肽，其抑菌效果明显优于天然抗菌肽，且生物安全性更高。

parasin I是从受伤鲶鱼粘液中提取的一种广谱抗菌肽，来源于组蛋白H₂A N末端的19个氨基酸，强力广谱抗菌，最小抑菌浓度可达到Buforin I的4倍、magainin 2的12倍，且无溶血活性。鱼源抗菌肽moronecidin分离于杂交斑纹鲈鱼，由22个氨基酸组成，能够广谱高效的抵抗鱼类致病菌，是一种具有开发潜力的抗菌肽。

本项目组以鱼源抗原肽parasin I和moronecidin为母本，通过蛋白质结构模拟、关键氨基酸替换等方法设计获得一种抑菌活性高和抗菌谱广的新型杂合抗菌肽PA-MO，可用于鱼类疾病的预防和治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型杂合抗菌肽PA-MO，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种新型杂合抗菌肽PA-MO，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:1；

本发明还提供一种新型杂合抗菌肽PA-MO的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如下：

1）根据新型杂合抗菌肽PA-MO的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；

2）将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达新型杂合抗菌肽PA-MO的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出杂合抗菌肽PA-MO；

3）对重组表达的杂合抗菌肽PA-MO进一步浓缩、纯化后稀释分装，即为抗菌肽制剂。

本发明利用基因工程技术构建了能表达一种新型杂合抗菌肽PA-MO的重组酵母菌株。将重组杂合抗菌肽PA-MO制备成抗菌肽制剂，其抑菌效价高、抑菌谱广，具有广阔的市场前景和开发价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

实施例1 新型杂合抗菌肽PA-MO的获得

1、利用生物软件对抗菌肽parasin I（KGRGKQGGKVRAKAKTRSS）和抗菌肽moronecidin（GenBank登录号：AAV65044）进行空间结构分析，将抗菌肽parasin I的N端15个氨基酸与抗菌肽moronecidin的C端10个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker（GP），获得杂合抗菌肽PM，其氨基酸序列如下：

KGRGKQGGKVRAKAKGPGKTIHRLVTG

进一步对杂合抗菌肽PM进行改造，将杂合抗菌肽PM位于第6位的谷氨酰胺突变为精氨酸（R6Q）、第21位的异亮氨酸突变为精氨酸（R21I）和25位缬氨酸突变为赖氨酸（K25V），并进一步在C末端添加了天冬酰胺（N）以保证抗菌肽C末端的酰胺化。

最后共完成杂合抗菌肽PM的3处氨基酸突变（R6Q、R21I和K25V），C末端添加1个N，获得一种新型杂合抗菌肽PA-MO，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2、根据获得的新型杂合抗菌肽PA-MO的氨基酸序列SEQ ID NO:1，按照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型杂合抗菌肽PA-MO的核苷酸序列，并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。

实施例2基因工程杂合抗菌肽PA-MO表达载体的构建与工程菌的获得

1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。

2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。

3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD₆₀₀值约为5-6。培养物直接转接于25 ml BMMY培养基中，28℃ 继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%。48h后，4℃ 5000 r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型杂合抗菌肽PA-MO的阳性菌株。

实施例3新型杂合抗菌肽PA-MO的制备

1、发酵工艺

1）将筛选得到的阳性重组子活化后按1%-10%接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5%-20%接种量接入10L发酵罐（实装培养基6L），温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM（1L发酵液1min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。

2）发酵结束后原罐蒸汽100℃ 灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。

3）新型抗菌肽制剂

抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。

上述基因工程抗菌肽可做成水产动物饲料添加剂或水产动物疾病的预防和治疗制剂。

实施例4 杂合抗菌肽PA-MO的最小抑菌浓度测定（MIC）

1、试验菌株

金黄色葡萄球菌(Cowan )、鳗弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌。

2、菌株处理：将菌种复苏，在固体培养基中划线，在28℃培养箱中过夜培养。将过夜培养的细菌挑单菌落于含有25mL液体培养基的三角瓶中，将三角瓶放于摇床28℃培养12-18h。将培养后的菌液测600nm处的吸光度值，用培养基调节菌液浓度，使其处于0.6-0.8之间。之后将菌液稀释成浓度为5×10⁵CFU/mL，依次取90μL加入到96孔板的各孔内。

3、杂合抗菌肽PA-MO定量后用培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽各取10μL依次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100μL。96 孔板盖盖后，28℃振荡培养 24h后，观察并用酶标仪测量OD₆₀₀值并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀释后，成一系列浓度，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度（MIC）。菌液和培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100%。同时分别设立杂合抗菌肽PM、鱼源抗菌肽parasin I和抗菌肽moronecidin标准品试验组作为对照，用于观察抗菌肽改造前后的抑菌活性变化。

4、用微量稀释法测定重组新型杂合抗菌肽PA-MO对多种细菌的最低抑菌浓度，结果表明其对水产常见病害菌均有显著的抑制效果，特别是与杂合抗菌肽PM、鱼源抗菌肽parasin I和抗菌肽moronecidin标准品相比，对鳗弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌的抑菌能力均得到广泛提高，显示了本发明对鱼源抗菌肽parasin I的氨基酸突变效果显著。

表1 抗菌肽对多种细菌的最低抑菌浓度

实施例5杂合抗菌肽PA-MO的的最低溶血浓度测定（MHC）

抗菌肽对血红细胞的溶血活性是衡量其对真核细胞毒性的最主要方法。本试验目的即是验证杂合抗菌肽PA-MO是否具有细胞毒性。

1、将重悬于PBS中的8%猪红细胞100 µl加入96孔板中，再加入PBS系列稀释的抗菌肽100µl，使各孔中抗菌肽的浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL和0.78μg/mL。阳性对照孔加入100µl 0.2% Triton X-100，阴性对照孔加100µl PBS，37℃孵育1 h后，3000rpm离心5 min后，从各孔吸取100µl上清到另一96孔板中，550nm波长测定OD 值，计算溶血百分比= [ (实验孔OD值-阴性孔OD值)/(阳性孔OD值-阴性孔OD值) ]×100。

2、结果表明：杂合抗菌肽PA-MO对猪红细胞基本无溶血活性，是一种安全的抗菌肽。

表2：不同浓度抗菌肽对猪红细胞的溶血百分比(%)

抗菌肽浓度（μg/mL）	0.78	1.56	3.12	6.25	12.5	25	50	100
									杂合抗菌肽PA-MO	0	0	0	0	0	0	0	0

上述的结果表明本发明所获得的新型杂合抗菌肽PA-MO具有更好的效果，能够用于商业开发。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 杂合抗菌肽PA-MO及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

Lys Gly Arg Gly Lys Arg Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Gly

1 5 10 15

Pro Gly Lys Thr Arg His Arg Leu Lys Thr Gly Asn

20 25

Claims

1.一种杂合抗菌肽PA-MO，其特征在于，所述的杂合抗菌肽PA-MO的氨基酸序列为SEQID NO:1。

2.权利要求1所述的杂合抗菌肽PA-MO的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1）根据杂合抗菌肽PA-MO的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中；

2）将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序；

3）阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天；待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；

4）将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时；取此菌液按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值约为5-6；培养物直接转接于25 ml BMMY培养基中，28℃ 继续摇振培养；为了维持诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%；48h后，4℃ 5000 r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定；能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生杂合抗菌肽PA-MO的阳性菌株；

5）重组酵母菌株的发酵工艺：将筛选得到的阳性重组子活化后按1%-10%接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5%-20%接种量接入发酵罐，在28-30℃，500-1500r/min，pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM，溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h；

发酵结束后原罐蒸汽100℃ 灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。

3.权利要求1所述的新型杂合抗菌肽PA-MO在制备鱼类饲料添加剂或免疫增强剂中的应用。