CN104341497B - 一种新型猪源抗菌肽突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型猪源抗菌肽突变体及其制备方法和应用。本发明通过生物软件对猪源抗菌肽PMAP37的氨基酸序列进行空间结构分析，将其37个氨基酸中的3处氨基酸进行突变（L6K、K20L和L31K），获得一种新型猪源抗菌肽突变体，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型猪源抗菌肽突变体基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。

Description

一种新型猪源抗菌肽突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种新型猪源抗菌肽突变体及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽是生物体内存在的一种具有抗菌活性的小分子蛋白，氨基酸数目小于100，常带正电荷，并具广谱抗菌性的一类小肽，是生物体免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽，是生物体先天免疫的重要组成成分，与干扰素、补体等组成了宿主的免疫防御系统。世界上第一个抗菌肽天蚕素cecropin是瑞典科学家G.Boman等人于1980年从惜比古天蚕蛹中诱导分离得到的，继而许多抗菌肽被分离、纯化。目前为止，已经有千余种抗菌肽被分离，它们广泛分布于哺乳动物、甲壳动物、鱼类、昆虫、两栖动物、鸟类、植物、细菌和病毒等生物体内。

大多数天然的抗菌肽具有抑菌活性偏低、抑菌谱窄、对蛋白酶敏感以及存在溶血毒性等技术难题，难以广泛应用于临床。因此人们常对天然抗菌肽进行人工改造以获得更优的抗菌肽突变体来满足临床需求。对天然抗菌肽进行序列修饰包括以下内容：利用生物软件对抗菌肽序列进行结构、空间表位分析，通过人为增加、删除或替代1个或多个残基，截取肽链N端或C端部分序列，连接不同自然来源的抗菌肽片断成为杂合肽等技术手段。近20年来, 这种方法已广泛应用于抗菌肽Cecropins、Melittins、Magainins、Temporins等家族的研究中。

猪源抗菌肽PMAP37（GenBank登录号：L39641.1）由37个氨基酸组成，是AlessandroTOSSI等于1995年首先从猪骨髓细胞分离得到的。其N端与天蚕素A和B具有相似的结构，对多种革兰氏阴性菌、阳性菌均具有抑制作用，是一种具有开发潜力的抗菌肽。本发明即是通过碱基替换的方法对猪源抗菌肽PMAP37进行改造，获得一种新型猪源抗菌肽突变体，大大提高了其抑菌，特别是对革兰氏阳性菌的抑菌活性，极具市场开发价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型猪源抗菌肽突变体，即通过生物软件对猪源抗菌肽PMAP37（GenBank登录号：L39641.1）的氨基酸序列进行空间结构分析，分别将猪源抗菌肽PMAP37的37个氨基酸中的3处氨基酸进行突变（L6K、K20L和L31K），获得一种新型猪源抗菌肽突变体，使其抗菌效力获得显著提高。

本发明首先提供一种新型猪源抗菌肽突变体，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:1；

上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供一种新型猪源抗菌肽突变体的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如下：

1）根据新型猪源抗菌肽突变体的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；

2）将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达猪源抗菌肽突变体的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出猪源抗菌肽突变体；

3）对重组表达的猪源抗菌肽突变体进一步浓缩、纯化后，测定效价达9200U/ml。稀释分装，即为抗菌肽制剂。

本发明利用基因工程技术构建了能表达一种新型猪源抗菌肽突变体的重组酵母菌株。将重组猪源抗菌肽突变体制备成抗菌肽制剂，其抑菌效价高、抑菌谱广，具有广阔的市场前景和开发价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

实施例1 新型猪源抗菌肽突变体及其基因的获得

1、猪源抗菌肽PMAP37（GenBank登录号：L39641.1）是由37个氨基酸组成的具有双亲性α螺旋的抗菌肽，对细菌有很强的抑菌活性。为了进一步提高其抑菌活性，通过生物软件对猪源抗菌肽PMAP37的氨基酸序列进行空间结构分析，选择靠近肽序列离中心位置较远的位置的疏水氨基酸，利用亲水性氨基酸Lys进行取代，目的是为了降低两端的疏水性。同时在肽中部位置用Leu取代Lys来补偿由于在肽的非极性面引入Lys所引起的多肽的整体疏水性的降低。最后共完成猪源抗菌肽PMAP37中3处氨基酸突变（L6K、K20L和L31K），获得一种新型猪源抗菌肽突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2、根据获得的新型猪源抗菌肽突变体的氨基酸序列SEQ ID NO:1，按照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型猪源抗菌肽突变体的核苷酸序列SEQ IDNO:2。并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。

实施例2基因工程猪源抗菌肽突变体表达载体的构建与工程菌的获得

1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。

2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。

3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值约为5-6。培养物直接转接于25 ml BMMY培养基中，28℃ 继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%。48h后，4℃ 5000 r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型猪源抗菌肽突变体的阳性菌株，命名为PA株。

实施例3发酵、纯化新型猪源抗菌肽突变体的制备

1、发酵工艺

1）将筛选得到的阳性重组子活化后按1%-10%接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5%-20%接种量接入10L发酵罐（实装培养基6L），温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM（1L发酵液1min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。

2）发酵结束后原罐蒸汽100℃ 灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。

3）新型抗菌肽制剂

抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。

上述基因工程抗菌肽可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。

实施例4 新型猪源抗菌肽突变体的最小抑菌浓度测定（MIC）

1、试验菌株

金黄色葡萄球菌(Cowan )、猪金黄色葡萄球菌肠毒素75-1、大肠杆菌K12D31、猪大肠杆菌K88、猪大肠杆菌O157-H71和猪副伤寒沙门氏菌C782

2、菌株处理：将菌种复苏，在固体LB培养基中划线，在培养箱中37℃过夜培养。将过夜培养的细菌挑单菌落于含有25ml液体MHB培养基的三角瓶中，将三角瓶放于摇床 37℃培养12-18h。将培养后的菌液在OD600 的条件下测其吸光度值，用MHB培养基调节菌液浓度，使其处于0.6-0.8之间。之后将菌液稀释成浓度为5×10⁵CFU/mL，依次取90μl加入到96孔板的各孔内。

3、抗菌肽定量后用MHB培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽各取10μl依次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100μl。96 孔板盖盖后，37℃振荡培养24h 后，观察并用酶标仪在 600nm 处测量并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀释后，成一系列浓度，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度（MIC）。利用菌液和MHB培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100%。同时设立猪源抗菌肽PMAP37标准品试验组作为对照，用于观察抗菌肽改造前后的抑菌活性变化。

4、用微量稀释法测定重组新型猪源抗菌肽突变体对多种细菌的最低抑菌浓度，结果表明其对革兰氏阳性菌和阴性菌均有显著的抑制效果，特别是改造的新型猪源抗菌肽突变体与猪源抗菌肽PMAP37标准品相比，不单增加了抗菌肽对革兰氏阴性菌的抑菌能力，也大大提高了对革兰氏阳性菌的抑菌活性。

表1 抗菌肽对多种细菌的最低抑菌浓度

实施例5新型猪源抗菌肽突变体的最低溶血浓度测定（MHC）

抗菌肽对血红细胞的溶血活性是衡量其对真核细胞毒性的最主要方法。本试验目的即是验证新型猪源抗菌肽突变体是否具有细胞毒性。

1、将重悬于PBS中的8%猪红细胞100 µl加入96孔板中，再加入PBS系列稀释的抗菌肽100µl，使各孔中抗菌肽的浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL和0.78μg/mL。阳性对照孔加入100µl 0.2% Triton X-100，阴性对照孔加100µl PBS，37℃孵育1 h后，3000rpm离心5 min后，从各孔吸取100µl上清到另一96孔板中，550nm波长测定OD 值，计算溶血百分比= [ (实验孔OD值-阴性孔OD值)/(阳性孔OD值-阴性孔OD值) ]×100。同时设立猪源抗菌肽PMAP37作为对照。

2、结果表明：新型猪源抗菌肽突变体与猪源抗菌肽PMAP37一样，对猪红细胞基本无溶血活性，是一种安全的抗菌肽。

表2 不同浓度抗菌肽对猪红细胞的溶血百分比(%)

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 一种新型猪源抗菌肽突变体及其制备方法和应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> PMAP-37 mutant protein

<400> 1

Gly Leu Leu Ser Arg Lys Arg Asp Phe Leu Ser Asp Arg Gly Arg Arg

1 5 10 15

Leu Gly Glu Leu Ile Glu Arg Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asp Lys Ser

20 25 30

Glu Phe Phe Gln Ser

35

<210> 2

<211> 111

<212> DNA

<213> PMAP-37 mutant gene

<400> 2

ggtttgttgt ctagaaagag agattttttg tctgatagag gtagaagatt gggtgaattg 60

attgaacgta ttggtcaaaa gattaaggat aagtctgaat ttttccaatc t 111

Claims (2)

1.一种猪源抗菌肽突变体基因，其特征在于，所述的基因的编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。