CN103864912A - 猪血中抗菌肽的提取方法 - Google Patents

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张述智
夏伟
朱绍辉
张�浩
王晓丽
徐权汗
李之详
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract

本发明公开了一种猪血中抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤：（1）猪血采集；（2）萃取溶液；（3）溶液除酸、浓缩；（4）抗菌肽的分离；（5）抗菌肽的纯化与浓缩。本发明方法实现了从猪血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法；采用本发明方法生产的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物药物；采用本发明方法提取的抗菌肽，具有广谱抗菌、抗病毒、不产生耐药性、有免疫调节作用等功能。

Description

猪血中抗菌肽的提取方法
 
技术领域
本发明属于抗菌肽的提取方法，具体涉及一种猪血中抗菌肽的提取方法。
 
背景技术
目前，由于抗生素的大量滥用，传统抗生素耐药性的问题越来越引起人们的关注，寻求一种无残留、无耐药性的新型抗菌药物已成为当务之急。抗菌肽因为其高效的抑菌效果和广泛而稳定的生物活性，逐渐引起人们的兴趣和关注。抗菌肽具有广谱、高效的抗微生物活性，还能促进动物生长，诱导动物的获得性免疫。而且其独特的抗菌机理不会使微生物产生耐药性，在机体内无残留，具有良好的应用开发前景，抗菌肽的应用可能会带来一场抗微生物战略的新革命。
我国是养猪业大国，猪血是生猪屠宰加工的废弃物，如何使该废弃物产生高值化的利用，具有废弃物加工利用和公共卫生等多方面的重要意义。有关研究确认，猪血中具有较强抗菌活性的多肽，因此开发研究一种从猪血中提取、纯化抗菌肽的成熟方法，可以一举多得。而目前在国内外还未见有从猪血中提取抗菌肽的技术方法和产品。
 
发明内容
为了克服现有技术领域存在的上述问题，本发明的目的在于，提供一种猪血中抗菌肽的提取方法，解决目前国内没有从猪血中提取抗菌肽的技术方法和产品的问题。
本发明提供的猪血中抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤：
（1）    猪血采集：从屠宰场采取新鲜猪血2-3L，使用5%柠檬酸钠抗凝；
（2）    萃取溶液：将新鲜猪血放置37℃温箱静置1-2h取上清，按照1：4的比例加入0.84%氯化铵溶液，混匀静置3min，常温400r/min，离心10min，弃上清按比例加入氯化铵溶液混匀静置3min，再次500r/min离心10min；弃上清，使沉淀与少量冷的生理盐水，即4℃的生理盐水短时间混合，再用200ml冷的10%冰醋酸，即4℃的10%冰醋酸使沉淀悬浮，充分混匀，倒入50ml烧杯，超声波处理50次，然后溶液使用磁力搅拌器混匀搅动于4℃下萃取一夜；次日，将萃取的溶液取出15000r/min离心30min，取上清4℃下保存，沉淀再次混悬于冷的10%醋酸中，充分混匀，混匀搅动于4℃下萃取一夜；第三天将萃取的溶液取出15000r/min离心30min,最后将溶液4℃下保存；
（3）    溶液除酸、浓缩：合并所保存的溶液,将溶液注入透析袋,扎紧袋口,然后将其放入烧杯,再向烧杯中倒入蒸馏水,蒸馏水液面要超过透析袋，4℃下透析除酸，每12h换水一次，直至透析袋外蒸馏水pH大于6，将透析袋放入瓷盘中，撒上聚乙二醇6000,透析浓缩约3-4h后即可将透析袋取出，将浓缩的溶液取出低温冻干，转移至青霉素小瓶中,密封-20℃保存；
（4）    抗菌肽的分离：将冻干样品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱葡聚糖凝胶SephadexG25，同时打开柱的下端出口，注意控制流速为1mL/min，5mL/管；用部分收集器收集洗脱液，5mL/管，收集的溶液用紫外分光光度计测其在280nm处的吸收值，将在280nm处有吸收的溶液分装于青霉素瓶中，再在低温冻干机中冻干，-80℃保存；取各瓶冻干保存的样品各20mg，分别溶于灭菌双蒸水中,无菌条件下用微孔滤膜过滤样品,将药敏纸片浸泡于过滤后的样品中,浸泡过夜后,用平皿纸片法初筛，收集具有抗菌活性的组分，置于5℃保存；
（5） 抗菌肽的纯化与浓缩：使用超滤装置进行超滤，膜包选用截流分子量为20kD。洗脱液选用0.5%甲醇溶液，滤出液既为所要获得的溶液。
本发明提供的猪血中抗菌肽的提取方法，其有益效果在于，本发明方法实现了从猪血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法；采用本发明方法生产的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物药物；采用本发明方法提取的抗菌肽，具有广谱抗菌、抗病毒、不产生耐药性、有免疫调节作用等功能；本发明方法操作方便，所需设备简单，分离提取率高；实施本发明方法的原料猪血来源丰富，价格低廉，可以满足大规模深化加工的需要，具有很强的开发应用推广价值。原料猪血属于生猪屠宰加工的废弃物，本发明方法可使废弃物得到高值化的利用，因此本发明具有重要的公共卫生学意义。 
 
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明提供的猪血中抗菌肽的提取方法，进行详细的说明。
实施例
参照本实施例的猪血中抗菌肽的提取方法，它包括以下具体步骤：
（1）    猪血采集：从屠宰场采取新鲜猪血2-3L，使用5%柠檬酸钠抗凝；
（2）    萃取溶液：将新鲜猪血放置37℃温箱静置1-2h取上清，按照1：4的比例加入0.84%氯化铵溶液，混匀静置3min，常温400r/min，离心10min，弃上清按比例加入氯化铵溶液混匀静置3min，再次500r/min离心10min；弃上清，使沉淀与少量冷的生理盐水，即4℃的生理盐水短时间混合，再用200ml冷的10%冰醋酸，即4℃的10%冰醋酸使沉淀悬浮，充分混匀，倒入50ml烧杯，超声波处理50次，然后溶液使用磁力搅拌器混匀搅动于4℃下萃取一夜；次日，将萃取的溶液取出15000r/min离心30min，取上清4℃下保存，沉淀再次混悬于冷的10%醋酸中，充分混匀，混匀搅动于4℃下萃取一夜；第三天将萃取的溶液取出15000r/min离心30min,最后将溶液4℃下保存；
（3）    溶液除酸、浓缩：合并所保存的溶液,将溶液注入透析袋,扎紧袋口,然后将其放入烧杯,再向烧杯中倒入蒸馏水,蒸馏水液面要超过透析袋，4℃下透析除酸，每12h换水一次，直至透析袋外蒸馏水pH大于6，将透析袋放入瓷盘中，撒上聚乙二醇6000,透析浓缩约3-4h后即可将透析袋取出，将浓缩的溶液取出低温冻干，转移至青霉素小瓶中,密封-20℃保存；
（4）    抗菌肽的分离：将冻干样品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱葡聚糖凝胶SephadexG25，同时打开柱的下端出口，注意控制流速为1mL/min，5mL/管；用部分收集器收集洗脱液，5mL/管，收集的溶液用紫外分光光度计测其在280nm处的吸收值，将在280nm处有吸收的溶液分装于青霉素瓶中，再在低温冻干机中冻干，-80℃保存；取各瓶冻干保存的样品各20mg，分别溶于灭菌双蒸水中,无菌条件下用微孔滤膜过滤样品,将药敏纸片浸泡于过滤后的样品中,浸泡过夜后,用平皿纸片法初筛，收集具有抗菌活性的组分，置于5℃保存；
（5）    抗菌肽的纯化与浓缩：使用超滤装置进行超滤，膜包选用截流分子量为20kD。洗脱液选用0.5%甲醇溶液，滤出液既为所要获得的溶液。
抗菌肽是生物体内诱导表达具有广谱抗菌活性的小分子多肽。这些多肽是生物体非专一性的免疫应答产物，是生物体内免疫系统的重要成分。国内外关于猪源抗菌肽的研究，主要针对猪小肠中的抗菌肽，而血中抗菌肽的提取及抗菌活性研究在国内外却很少有报道。基于猪血液中白细胞是免疫系统中起主要作用的免疫细胞，其中性粒细胞约占白细胞总量的70%，所以本试验试图从猪血中性粒细胞中提取抗菌肽，优化提取工艺，提高抗菌肽的回收率和纯度。
本发明方法实现了从猪血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法；采用本发明方法生产的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物药物；采用本发明方法提取的抗菌肽，具有广谱抗菌、抗病毒、不产生耐药性、有免疫调节作用等功能；本发明方法操作方便，所需设备简单，分离提取率高；实施本发明方法的原料猪血来源丰富，价格低廉，可以满足大规模深化加工的需要，具有很强的开发应用推广价值。原料猪血属于生猪屠宰加工的废弃物，本发明方法可使废弃物得到高值化的利用，因此本发明具有重要的公共卫生学意义。

Claims (1)

1.一种猪血中抗菌肽的提取方法，其特征在于：它包括以下具体步骤：
（1）    猪血采集：从屠宰场采取新鲜猪血2-3L，使用5%柠檬酸钠抗凝；
（2）    萃取溶液：将新鲜猪血放置37℃温箱静置1-2h取上清，按照1：4的比例加入0.84%氯化铵溶液，混匀静置3min，常温400r/min，离心10min，弃上清按比例加入氯化铵溶液混匀静置3min，再次500r/min离心10min；弃上清，使沉淀与少量冷的生理盐水，即4℃的生理盐水短时间混合，再用200ml冷的10%冰醋酸，即4℃的10%冰醋酸使沉淀悬浮，充分混匀，倒入50ml烧杯，超声波处理50次，然后溶液使用磁力搅拌器混匀搅动于4℃下萃取一夜；次日，将萃取的溶液取出15000r/min离心30min，取上清4℃下保存，沉淀再次混悬于冷的10%醋酸中，充分混匀，混匀搅动于4℃下萃取一夜；第三天将萃取的溶液取出15000r/min离心30min,最后将溶液4℃下保存；
（3）    除酸、浓缩：合并所保存的溶液,将溶液注入透析袋,扎紧袋口,然后将其放入烧杯,再向烧杯中倒入蒸馏水,蒸馏水液面要超过透析袋，4℃下透析除酸，每12h换水一次，直至透析袋外蒸馏水pH大于6，将透析袋放入瓷盘中，撒上聚乙二醇6000,透析浓缩约3-4h后即可将透析袋取出，将浓缩的溶液取出低温冻干，转移至青霉素小瓶中,密封-20℃保存；
（4）    抗菌肽的分离：将冻干样品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱葡聚糖凝胶SephadexG25，同时打开柱的下端出口，注意控制流速为1mL/min，5mL/管；用部分收集器收集洗脱液，5mL/管，收集的溶液用紫外分光光度计测其在280nm处的吸收值，将在280nm处有吸收的溶液分装于青霉素瓶中，再在低温冻干机中冻干，-80℃保存；取各瓶冻干保存的样品各20mg，分别溶于灭菌双蒸水中,无菌条件下用微孔滤膜过滤样品,将药敏纸片浸泡于过滤后的样品中,浸泡过夜后,用平皿纸片法初筛，收集具有抗菌活性的组分，置于5℃保存；
（5）    抗菌肽的纯化与浓缩：使用超滤装置进行超滤，膜包选用截流分子量为20kD，洗脱液选用0.5%甲醇溶液，滤出液既为所要获得的溶液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104341497A (zh) * 2014-11-05 2015-02-11 青岛农业大学 一种新型猪源抗菌肽突变体及其制备方法和应用
CN105341621A (zh) * 2015-09-27 2016-02-24 常州市奥普泰科光电有限公司 一种天然竹叶提取物抗菌剂的制备方法

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