CN102286098B - 一种天然水蛭素的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天然水蛭素的生产方法，该生产方法的特征在于包括含天然水蛭素液体的提取、酸沉、加热、脱水和干燥等步骤，所得到的天然水蛭素粉末，可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其活性成分的含量，使质量稳定，产品疗效有保证。该方法具有工艺简单、提取率高、生产成本低、产品纯度高、保存期长等特点，可为食品、保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料。

Description

一种天然水蛭素的生产方法

技术领域

本发明涉及一种从动物体中提取有效活性成分的生产方法，特别是以吸血水蛭为原料生产天然水蛭素的方法。

背景技术

天然水蛭素是由65～66氨基酸组成的低分子多肽，其分子量仅为7000道尔顿，极易溶于水和生理盐水，在常温下非常稳定，单纯的温度升高（100℃水浴），或pH改变（1～13）均不影响其活性。天然水蛭素是迄今为止世界上所发现的最强的天然抗凝血酶物质，对人类心脑血管疾病尤其是脑血栓等血栓性疾病有特效，其防治效果是任何物质所不能比拟的。同时相关研究还表明，天然水蛭素是一种直接凝血酶抑制剂，其抗凝作用非常专一，抗凝效果比肝素强，且天然水蛭素在抑制凝血酶活性时不依赖于ATⅢ和肝素辅助因子Ⅱ的参与。天然水蛭素与其他抗凝药如肝素相比, 其抗凝效果更可靠，这是因为: ①天然水蛭素不与血浆蛋白结合，血浆蛋白的种类、浓度不影响它的活性，抗凝效果一般不会因患者的不同发生变化,对凝血功能的监测要求不高。②天然水蛭素不但灭活游离的凝血酶，还可灭活与纤维蛋白结合的凝血酶，所以抑制血栓生长的作用比肝素明显。③天然水蛭素不与血小板因子Ⅵ结合，在栓子附近仍然有良好的抗凝作用，不会引起血小板减少。④天然水蛭素抗凝作用与维生素K无关，且不受食物的影响，药物之间互相影响小。由于上述这些优点，作为直接凝血酶抑制剂的天然水蛭素，目前，在欧洲及北美地区，已经被推荐取代传统肝素，常规用于心血管疾病的抗凝防治。

亦有研究，水蛭的药理活性强弱取决于其体内活性成分的抗凝血酶活性强度即天然水蛭素含量，也就是说水蛭的抗凝血酶活性强即天然水蛭素含量高，其药理活性就强，反之就弱。吸血水蛭的抗凝血酶活性明显强于非吸血水蛭，吸血水蛭的抗凝血酶活性成分主要是天然水蛭素（英文名为：Hirudin），天然水蛭素仅存于吸血水蛭的唾液腺及其所分泌的唾液中，这就为天然水蛭素的提取增加了难度。非吸血水蛭的抗凝血酶活性成分不含天然水蛭素，到目前为止，其活性成分尚未清楚。

对现有技术中天然水蛭素的生产方法检索如下：

1、中国专利：03113566.8，发明名称：菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取技术。该发明是通过引进优良种源或野外捕捉到健壮的菲牛蛭，进行人工分级分段驯、喂养，进行人工繁殖，待饲养到一定程度，采用化学物质刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后对其唾液进一步分离过滤得到水蛭素粗品，再将水蛭素粗品进行深加工得到符合医用的水蛭素，该菲牛蛭含抗凝血物质比其它品种菲牛蛭含量高，药用效果好，提取水蛭素方法简单，提取水蛭素后将菲牛蛭放回水池养殖，相隔一周或10天又可以再提取，每条鲜活菲牛蛭可以反复提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右，产品质量好，又节约资源，提高了菲牛蛭的利用价值。但该发明所提供的技术提取到的仅是天然水蛭素的粗品，杂质多，不能直接供临床使用。

2、中国专利：200610019531.0 ，发明名称：一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用。该发明制备方法的特征在于包括吸血水蛭制浆、配制悬浊液和干燥三个步骤，所得到的粉末，它保存了吸血水蛭最主要的有效活性成分——天然水蛭素。该发明具有工艺简单、生产成本较低、产品保存期长、并可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测天然水蛭素含量，从而使质量稳定，产品疗效有保证等特点。水蛭素应用范围广泛，可通过常规的方法单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂使用，或与其它动、植物药制成复方制剂，用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。但该发明采用喷雾干燥设备，其投资和占地面积均较大，管理不便，且提取率低、生产成本高。

3、中国专利：200710066096.1 ，发明名称：一种天然水蛭素有效成分的提取方法。该发明公开了一种天然水蛭素有效成分的提取方法，是用水清洗吸血水蛭干净后加入含量15～25％的乙醇水溶液浸泡30-50小时后，过滤，得滤液和药渣；将菲牛蛭药渣绞碎，再加含量15～25％的丙酮水溶液浸泡，滤过，得滤液，分别将两次滤液真空回收乙醇和丙酮后，合并滤液，常规真空冷冻干燥，得到产品。该发明工艺简单、成本低廉，收率较高、产品质量好、保存期长，整个生产过程无“三废”排放，产品作为医药、美容、保健食品三大领域的原料。但在天然水蛭素提取过程中，要使用到乙醇、丙酮，而乙醇和丙酮为易燃品，存在着安全隐患。

4、中国专利：200710026462.0，发明名称：一种以菲牛蛭冷冻新鲜体为原材料的水蛭素生产工艺。该发明属于中药制药领域，涉及动物有效成分的提取，目的是解决传统水蛭素提取工艺难以工业化生产的问题。该工艺采用从整体菲牛蛭中提取水蛭素，可以工业化生产。先把菲牛蛭匀浆，浆状物用生理盐水提取三次，过滤。滤液煮沸、过滤除杂蛋白。收集滤液，经冷冻浓缩，醇沉后得水蛭素粗品。再用生理盐水洗涤水蛭素粗品，然后浓缩洗涤液，最后冷冻干燥得到产品。该水蛭素生产工艺方法简单，成品质量合格，药理实验结果表明，用该工艺提取的水蛭素有很好的药理作用。但在天然水蛭素提取过程中，要使用到乙醇，而乙醇为易燃品，存在着安全隐患。

5、中国专利：200710026461.6 ，发明名称：一种以菲牛蛭唾液为原材料的水蛭素生产工艺。该发明属于中药制药领域，涉及动物有效成分的提取。目的是解决传统水蛭素提取工艺难以工业化生产的问题。该工艺用菲牛蛭唾液提取水蛭素，可以工业化生产。菲牛蛭唾液用生理盐水提取，提取液煮沸、过滤、取滤液。固形物用生理盐水提取，过滤，取滤液。合并前后的全部滤液，加入Lyphgel处理两次，过滤，去滤液。固形物用生理盐水提取，过滤。滤液煮沸后迅速冷却，冷藏过夜。离心，取上清液减压浓缩后再冷冻干燥成冻干粉。该生产工艺简单，产品活力高，有很强的溶血栓作用。但该发明提取到的天然水蛭素，其杂质较多，纯度较低。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术中存在的问题，提供一种新的天然水蛭素的提取方法，得到具有纯度高，质量好的天然水蛭素。

本发明是这样实现的：

天然水蛭素的生产方法，其特征在于：它包括含天然水蛭素液体的提取、酸沉、加热、脱水和干燥的工艺，具体步骤如下：

（1）含天然水蛭素液体的提取：选取吸血水蛭，经除杂、洗净、晾干后直接放入磨浆机内磨浆，制得浆液，然后按浆液重量的1～10倍加入生理盐水或饮用水浸泡20～40分钟，用40～150目筛网过滤后取其滤液，备用；或者从活体吸血水蛭挤出分泌物，用40～150目筛网过滤后取其滤液，备用；

（2）酸沉：在上述滤液中加入三氯乙酸，用三氯乙酸调节溶液的pH至0.5～3.5进行沉淀，静置10～60分钟，离心，去沉淀物，取上清液，备用；

（3）加热：将上述上清液装入容器中，置于50～85℃的恒温水浴中隔水加热20～50分钟，取出冷却至常温，再用氢氧化钠调节溶液的pH至6.0～8.0，离心，去沉淀物，取上清液，备用；

（4）脱水：脱掉步骤（3）中上清液30%～80%的水分，得浓缩液，备用；

（5）干燥：在上述浓缩液中加入水溶性填充剂，其加入量为浓缩液重量的0.1%～50%，然后进行冷冻干燥，得到粉末成品即为天然水蛭素产品。

以上第（2）、第（3）所说的离心是用5000转/分钟～15000转/分钟的离心机离心5～20分钟。

以上所述的吸血水蛭是含有天然水蛭素的吸血水蛭活体或其干燥体或其冷冻保存的尸体。

以上所述的从活体吸血水蛭挤出分泌物，是让吸血水蛭充分饥饿后再让其吃饱用低浓度的有机酸、无机酸、无机盐配制成的诱导液，然后对其进行挤压，使其分泌出唾液和体内的诱导液，备用，吸血水蛭继续饲养。具体方法见本专利申请人有关的广西壮族自治区南宁市民族大道38-2号泰安大厦18层 广西科康生物公司周维海申请的“从菲牛蛭活体中提取天然水蛭素的方法”，专利申请号：03113566，授权公告日：20060906，见以上的背景技术提供的文献1，具体技术方案是：将吸血水蛭清洗干净，然后用诱导液喂饱吸血水蛭，所采用的诱导液是浓度较低的有机酸、无机酸、无机盐，选用乙酸、柠檬酸、精氨酸、赖氨酸、胱氨酸、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、磷酸钠或磷酸二氢钾的一种或两种、两种以上，其重量百分浓度为0.1～3％，pH在6～8之间，配置成水溶液，首先给吸血水蛭饥渴再给其充分吃饱半小时以后，对其进行挤压，使其分泌出唾液和体内的诱导物质，每条鲜活吸血水蛭可以重复提取6～7次，每次能提取水蛭素粗品6～7毫升左右。

以上第（6）步所说的浓缩液中加入的水溶性填充剂是淀粉、蔗糖、可溶性纤维素、甘露醇、麦芽糊精和乳糖其中一种或者其中两种以上的混合物。

  本发明所得到的天然水蛭素产品可以用于食品、保健食品、药品或化妆品的原料，具有抗凝溶栓、改善血液循环、促进新陈代谢等作用，在临床上用于防治心脑血管疾病如中风、冠心病、高血脂等。

所得到的粉末成品，可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其活性成分的含量，其天然水蛭素的含量为100～50000国际单位/克。

根据水蛭素能与凝血酶特异性结合，使凝血酶失活，其结合比例为1：1的原理，用Markwardt凝血酶直接滴定法可检测天然水蛭素的含量。

水蛭素的计量单位为国际单位，以ATU表示，凝血酶活性的国际单位为NIH，即1个ATU等于中和1个NIH凝血酶的水蛭素量。

天然水蛭素含量检测方法：

取本品粉末约1g，精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl，置试管（10mm×100ml）中，加入0.5％（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1mol/L盐酸溶液约40ml，加水至100 ml，调节pH值至7.4）200μl，摇匀，置水浴（37℃±0.5℃）中缓缓滴加每1ml(中)含40 U（单位）的凝血酶溶液（每分钟5μl，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算：

U＝C1V1/C2V2W

式中：U---每1g含凝血酶活性单位，即水蛭素含量，ATU/g；

C1---凝血酶溶液的浓度，μ/ ml；    

C2---供试品溶液的浓度，g / ml；

V1---消耗凝血酶溶液的体积，μl；

V2 ---供试品溶液的加入量，μl；

W---取样量。

上述天然水蛭素含量检测方法均适用于以天然水蛭素为主要原料所制成的各种产品的质量监测。

本发明的有益效果是：

工艺简单、提取率高、生产成本低、产品纯度高、保存期长、可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其活性成分含量，特别是本发明采用了与现有技术不同的提取、酸沉、加热、脱水和干燥的工艺，从而使质量更稳定，携带和服用方便，可为食品、保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料，在临床应用中，根据不同的需要，可以将本发明制成具有针对性的产品。

具体实施方式

实施例一：

取日本医蛭活体15千克，除去杂质，用水洗干净、自然晾干后，放在磨浆机里反复磨浆3次，得到日本医蛭浆液；然后加入生理盐水150千克，浸泡40分钟，用150目筛网过滤后得滤液158.5千克；在上述滤液中加入三氯乙酸，调节滤液pH至0.5进行酸沉，静置10分钟，用6000转/分钟离心机离心30分钟，除去沉淀物，得上清液151.3千克；将上述上清液装入水浴锅中进行隔水加热，待锅内的上清液温度达到85℃后继续恒温水煮25分钟后，取出冷却，再用氢氧化钠调节pH至7.3，接着用10000转/分钟离心机离心10分钟，去沉淀物，得上清液147.6千克；将上述上清液置于分子量为3000道尔顿的超滤装置中进行超滤，使其滤出上清液中31.3%的水分后得浓缩液 49.6千克；在上述浓缩液中加入10%的木薯淀粉后进行冷冻干燥，得到天然水蛭素粉末成品5.06千克,经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测该产品天然水蛭素的含量为915ATU/克。

实施例二：

取冷冻结冰保存的菲牛蛭尸体30千克，待其自然溶解后放入磨浆机里反复磨浆4次，得到菲牛蛭浆液；然后在浆液中加入干净水60千克，浸泡25分钟，用100目筛网过滤后得滤液80.8千克；在上述滤液中加入三氯乙酸，调节pH至3.3进行酸沉，静置45分钟，用10000转/分钟离心机离心5分钟，去沉淀物，得上清液71.1千克；将上述上清液放入电加热夹层锅进行隔水加热，待锅内的上清液温度达到50℃后继续恒温加热50分钟后，取出冷却，再用氢氧化钠调pH节至6.5，接着用15000转/分钟离心机离心15分钟，去沉淀物，得上清液68.4千克；将上述上清液装入分子量为5000道尔顿的透析袋内，置于蒸馏水中，在4℃的条件下进行透析12小时后，得透析液；用68.4千克聚乙二醇对透析液进行脱水，使其脱掉透析液中79.3%的水分后得浓缩液14.2千克；在上述浓缩液中分别加入0.142千克的药用淀粉和0.142千克的麦芽糊精,然后再进行冷冻干燥，得到天然水蛭素粉末成品0.296千克,经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测该产品天然水蛭素的含量为49500ATU/克。

实施例三：

取菲牛蛭活体200千克，除去杂质，用水洗干净、自然晾干后，放在磨浆机里反复磨浆2次，得到菲牛蛭浆液；然后加入干净水200千克，浸泡30分钟，用40目筛网过滤后得滤液363.7千克；在上述滤液中加入三氯乙酸，调节pH至1.7进行酸沉，静置60分钟，用10000转/分钟管式离心机离心，去沉淀物，得上清液332.2千克；将上述上清液装入铝桶中，然后置于75℃的恒温水浴中进行水煮20分钟（从上清液的温度达到与水浴的温度相同时开始算起）后，取出冷却，再用氢氧化钠调pH节至7.0，接着用15000转/分钟管式离心机离心，去沉淀物，得上清液325.3千克；将上述上清液置于分子量为4000道尔顿的超滤装置中进行超滤，使其滤出上清液中53.7%的水分后得浓缩液174.7千克；在上述浓缩液中加入20.5千克的甘露醇后再进行冷冻干燥，得到天然水蛭素粉末成品20.96千克,经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测该产品天然水蛭素的含量为4777国际单位/克。

实施例四：

取冷冻结冰保存的日本医蛭尸体50千克，待其自溶后放入磨浆机里反复磨浆3次，得到日本医蛭浆液；然后加入生理盐水250千克，浸泡20分钟，用80目筛网过滤后得滤液271.8千克；在上述滤液中加入三氯乙酸，调节pH至2.2进行酸沉，静置20分钟，用7000转/分钟离心机离心30分钟，去沉淀物，得上清液260.5千克；将上述上清液放入调温锅内进行隔水加热，从上清液的温度达到85℃时算起恒温50分钟后，取出上清液冷却至常温，接着，用氢氧化钠调pH至6.8，用8000转/分钟离心机离心15分钟，去沉淀物，得上清液258.6千克；将上述上清液置于分子量为3000道尔顿的超滤装置中进行超滤，使其滤出上清液中43.8%的水分后，得浓缩液113.3千克；在上述浓缩液中加入53.7千克的甘露醇,然后进行冷冻干燥，得到天然水蛭素粉末成品54.16千克,经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测该产品天然水蛭素的含量为356国际单位/克。

实施例五：

将本发明人水蛭饲养场的5千克已饥饿3个月的菲牛蛭活体清洗干净，然后用0.3%柠檬酸诱导液喂饱菲牛蛭，半小时后人工对其进行挤压，以挤压出其唾液和体内的诱导液，共得混合溶液12.6千克，先用150目筛网过滤后得滤液12.1千克，然后在上述滤液中加入三氯乙酸，调节pH至3.0进行酸沉，静置15分钟，用15000转/分钟管式离心机离心，去沉淀物，得上清液10.3千克；将上述上清液装入铝桶中，置于75℃的恒温水浴中进行水煮40分钟（从上清液的温度达到与水浴的温度相同时开始算起）后，取出冷却，再用氢氧化钠调pH节至7.0，接着用15000转/分钟管式离心机离心，去沉淀物，得上清液9.6千克；将上述上清液装入分子量为5000道尔顿的透析袋内，置于蒸馏水中，在6℃的条件下进行透析10小时后得透析液；用0.96千克聚乙二醇对透析液进行脱水，使其脱掉透析液中30.2%的水分后得浓缩液6.7千克；在上述浓缩液中加入3.35千克的可溶性木薯淀粉,然后再进行冷冻干燥，得到天然水蛭素粉末成品3.42千克,经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测该产品天然水蛭素的含量为102国际单位/克。

实施例六：

取冷冻结冰保存的湖北牛蛭尸体10千克，待其自溶后放入磨浆机里反复磨浆3次，得到湖北牛蛭浆液；然后加入自来水30千克，浸泡35分钟，用50目筛网过滤后得滤液36.7千克；在上述滤液中加入三氯乙酸，调节pH至2.8进行酸沉，静置25分钟，用12000转/分钟分离机离心，去除沉淀物，得上清液32.4千克；将上述上清液放入调温锅内进行隔水加热，从上清液的温度达到75℃时算起恒温45分钟后，取出上清液冷却至常温，接着，用氢氧化钠调pH至6.8，用8000转/分钟离心机离心25分钟，去沉淀物，得上清液31.6千克；将上述上清液置于分子量为4000道尔顿的超滤装置中进行超滤，使其滤出上清液中53.4%的水分后，得浓缩液14.73千克；在上述浓缩液中分别加入3.0千克的玉米淀粉和3.63千克的乳糖，然后进行冷冻干燥，得到天然水蛭素粉末成品6.88千克,经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测该产品天然水蛭素的含量为636国际单位/克。

Claims (4)

1.一种天然水蛭素的生产方法，其特征在于：它包括含天然水蛭素液体的提取、酸沉、加热、脱水和干燥的工艺，具体步骤如下：

（1）含天然水蛭素液体的提取：选取吸血水蛭，经除杂、洗净、晾干后直接放入磨浆机内磨浆，制得浆液，然后按浆液重量的1～10倍加入生理盐水或饮用水浸泡20～40分钟，用40～150目筛网过滤后取其滤液，备用；

或者选取吸血水蛭，让吸血水蛭充分饥饿后再让其吃饱诱导液，然后对其进行挤压，使其分泌出唾液和体内的诱导液，备用；所述的诱导液是用乙酸、柠檬酸、精氨酸、赖氨酸、胱氨酸、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、磷酸钠和磷酸二氢钾其中的一种或两种以上配制而成，重量百分浓度为0.1～3％，pH在6～8之间，挤压后的吸血水蛭继续饲养；

从活体吸血水蛭挤出分泌物后，用40～150目筛网过滤后取其滤液，备用；

（2）酸沉：在上述滤液中加入三氯乙酸，用三氯乙酸调节溶液的pH至0.5～3.5进行沉淀，静置10～30分钟，离心，去沉淀物，取上清液，备用；

（3）加热：将上述上清液装入容器中，置于50～85℃的恒温水浴中隔水加热20～50分钟，取出冷却至常温，再用氢氧化钠调节溶液的pH至6.0～8.0，离心，去沉淀物，取上清液，备用；

（4）脱水：脱掉步骤（3）中上清液30%～80%的水分，得浓缩液，备用；

（5）干燥：在上述浓缩液中加入水溶性填充剂，其加入量为浓缩液重量的0.1%～50%，然后进行冷冻干燥，得到粉末成品即为天然水蛭素产品；所述的水溶性填充剂是淀粉、蔗糖、可溶性纤维素、甘露醇、麦芽糊精和乳糖其中一种或者两种以上的混合物。

2.根据权利要求1所述的天然水蛭素的生产方法，其特征在于：所述的吸血水蛭是含有天然水蛭素的吸血水蛭活体或其干燥体或其冷冻保存的尸体。

3.根据权利要求1所述的天然水蛭素的生产方法，其特征在于：步骤（2）、步骤（3）所述的离心是用5000转/分钟～15000转/分钟的离心机离心5～30分钟。

4.根据权利要求1所述的天然水蛭素的生产方法，其特征在于：步骤（4）所述的脱水是使用超滤膜材料的截留分子量为3000～6500道尔顿的超滤装置对上清液直接脱水，或者首先将步骤（3）中的上清液装入截留分子量为3000～6500道尔顿的透析袋内，置于蒸馏水中，在4～10℃的条件下透析6～12小时，得透析液，然后将聚乙二醇粉末撒在透析袋表面上，聚乙二醇加入重量为透析液的0.1～1倍，使透析袋内的透析液脱掉30%～80%的水分，得浓缩液。