CN101857635A - 一种牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法，旨在提供一种提取蛋白全面、提取纯度高、操作简单的连续分离方法。将牛血液注入盛有抗凝剂的容器中，收集血浆；血浆加入PBS缓冲液、4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的浓度为20％～22％，离心取沉淀和上清液；沉淀溶解，超滤后得纤维蛋白原溶液，冷冻干燥得纤维蛋白原粉末；上清液加入4℃预冷饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的浓度为35％～45％，离心取沉淀物和上清液；沉淀物溶解，超滤后得免疫球蛋白溶液，冷冻干燥得免疫球蛋白粉末；上清液加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的浓度为75％～80％，离心取沉淀物；沉淀物溶解，超滤后得白蛋白溶液，冷冻干燥得白蛋白粉末。

Description

一种牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说，是涉及一种牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法。

背景技术

我国目前屠宰加工业的畜禽血液作为农副产品，资源丰富，绝大部分被作为废弃物排放，仅有小部份被食用或加工，利用率不超过10％，以制“血豆腐”为主，没有得到很好的开发利用。大量的畜禽血液遗弃造成既浪费资源，又污染环境。从大量的文献资料获悉，动物血是一种优质理想的蛋白质原料，可开发出多种产品，能广泛应用于食品开发、生物工程、医药工业、日用化工工业及饲料工业，市场前景十分乐观。

我国每年饲养两亿多头牛羊，每头牛采血量为11～15kg。一个年宰生牛5～10万头的清真肉联厂，可获得牛血约600～800吨。畜禽血液中含有丰富的营养物质和多种具有生物活性的物质。据分析，畜禽的血液中干物质含量为19％～21％，血浆中纤维蛋白原含量约为2～4mg/ml，免疫球蛋白含量约为12～16mg/ml，白蛋白的含量约为50～80mg/ml。

研究表明，纤维蛋白原与纤维生长因子FGF-2结合能促进内皮细胞的增殖作用，外用纤维蛋白原主要被制成纤维蛋白原粉(止血粉)及止血绷带等用于止血。免疫球蛋白具有较强的抗感染、中和毒素和免疫调理作用。随着多种病毒(非典、禽流感、猪链球菌引起的病毒)的泛滥，人们增强免疫能力的意识提高，具有免疫功效食品的需求量越来越大。血清白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白质，能和许多化学物质以不同方式结合，并携带这些物质通过血液在体内进行转运、运输、分配和代谢。白蛋白还具有起泡性和乳化性，可用于食品中。

因此，从动物血中提取多种蛋白质具有重要的意义。

目前，从动物血液中提取蛋白质的方法有多种。

专利号为200510017717，发明名称为《动物血纤维连接蛋白联产工艺》的专利中公开了一种纤维连接蛋白的联产方法，主要为：A.采集新鲜动物血，加入柠檬酸三钠抗凝，离心，分别收集血浆和血球，贮存于10℃以下环境中；B.向A步骤中所得到的血浆中加硫酸铵至饱和度20％-30％，静置1小时以上，过滤，收集纤维连接蛋白沉淀物并溶解，上亲和层析柱，提取分离出FN主峰液，再经分子筛层析纯化，超滤浓缩，最后冷冻干燥，得纤维连接蛋白产品；C、向B步骤的滤液中加入硫酸铵至饱和度50％-60％，静置1小时以上，过滤，收集沉淀物，经超滤脱盐，冷冻干燥，得免疫球蛋白产品。上述方法中没有提取白蛋白，而白蛋白是牛血浆中含量最高的蛋白质，造成大量蛋白质的浪费。同时，由于提取免疫球蛋白时加入硫酸铵溶液的饱和度为50-60％，超滤脱盐，产品纯度低，得率低。大量的文献表明，纤维蛋白原水平的变化不仅与凝血障碍、出血性疾病、弥漫性血管内凝血(DIC)应激等有关，而且与冠心病(CHD)、心肌梗死(AMI)、急性动脉血栓的发生和复发、脑血管病等有关，纤维蛋白原水平增高还被认为是缺血性心脑血管疾病发病的独立主要因素之一，因而纤维蛋白原在人体内的含量研究倍受关注，因此，免疫球蛋白产品中要尽量减少纤维蛋白原的含量。免疫球蛋白的纯度低，影响了其应用范围。另外，由于采用上亲和层析柱、分子筛层析纯化，操作繁琐，设备投资大，不利于工业化生产。

《农业工程学报》23卷第六期刊登了《猪血浆中多种功能蛋白的连续提取工艺》一文，其主要阐述了对猪血浆中主要功能蛋白，如凝血酶、纤维蛋白原、白蛋白及免疫球蛋白等进行了连续提取，利用冻融法先将纤维蛋白原分离提取，经盐析法分离提取白蛋白及免疫球蛋白。该技术方案中采用冻融法从猪血浆中提取纤维蛋白原增加了设备投入。而且，冻融过程中，由于纤维蛋白原聚沉时使部分免疫球蛋白、白蛋白一起沉淀而造成纤维蛋白原的纯度较低。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种提取蛋白全面、提取纯度高、操作简单、投资少、环境污染小的牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法。

本发明通过下述技术方案实现：

一种牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)在常温下，将新鲜牛血液注入盛有抗凝剂的容器中，搅拌，使抗凝剂完全溶解并均匀分布于血液中，其中，牛血液与抗凝剂的重量比为9∶1；然后将已抗凝的牛血液于冷冻离心机中2～10℃下高速离心，收集血浆；

(2)在4℃下，将步骤(1)中得到的血浆中加入与血浆等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)，并加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度达到20％～22％，之后于冷冻离心机中高速离心，取沉淀得纤维蛋白原，并取上清液备用；将得到的纤维蛋白原沉淀用0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液在搅拌下溶解，超滤后得到纤维蛋白原溶液，再将纤维蛋白原溶液冷冻干燥得到纤维蛋白原粉末；

(3)将步骤(2)中得到的备用的上清液搅拌加入4℃预冷饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度为35％～45％，4℃下静置1h，再于冷冻离心机中2～10℃下高速离心，取沉淀物，并取上清液备用；将沉淀物用0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，超滤后得到免疫球蛋白溶液，再将免疫球蛋白溶液冷冻干燥得免疫球蛋白粉末；

(4)将步骤(3)中得到的备用的上清液搅拌加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度达到75％～80％，于4℃下静置1.5h，再于冷冻离心机中2～10℃下高速离心，取沉淀物；将沉淀物用0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，超滤后得到白蛋白溶液，再将白蛋白溶液冷冻干燥，得到白蛋白粉末。

步骤(2)中超滤使用的中空纤维超滤膜截流分子量200kD。

步骤(3)中超滤使用的中空纤维超滤膜截流分子量6kD。

步骤(4)中超滤使用的中空纤维超滤膜截流分子量6kD。

步骤(1)中所使用的抗凝剂可以选用EDTA、柠檬酸钠等，为了降低成本，抗凝剂选用质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液。

本发明具有下述技术效果：

1、本发明的方法采用硫酸铵连续提取，可以反复使用提取纤维蛋白原、免疫球蛋白的硫酸铵提取液，在原有浓度的基础上添加部分硫酸铵，操作简便，由于提取介质均为硫酸铵同一种物质，并且浓度依次增高，减少了提取成本，便于回收，可重复使用，降低了污染。

2、本发明的方法通过对牛血浆中免疫球蛋白的分离、纯化、提取、干制，使其干式混合添加到强化食品中，最大程度的保持其活性，以增强产品免疫功能。

3、本发明的方法直接控制饱和硫酸铵的加入浓度，采用4℃预冷的饱和硫酸铵溶液提取，采用超滤和冷冻干燥工艺，减少了设备投入，操作简便，适合于工业化生产。

4、本发明的方法针对血浆中三种主要蛋白质的特点，采用饱和硫酸铵梯度连续提取法，能依次提取纤维蛋白原、免疫球蛋白和白蛋白，提取蛋白全面，并且，通过对饱和硫酸铵的浓度确定精确，提取的蛋白纯度高，得率高，操作简便，投资少。

具体实施方式

实施例1

1.1提取方法

(1)在常温下，将新鲜牛血液注入盛有质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠的容器中，搅拌，使柠檬酸钠完全溶解并均匀分布于血液中，其中，牛血液与质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠的重量比为9∶1；然后将已抗凝的血液于冷冻离心机中2-10℃下4000r/min离心10min，沉降血细胞，取上清液即为血浆。

(2)在4℃下，将步骤(1)中得到的血浆中加入与血浆等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液，并加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度达到20％，之后于冷冻离心机中4000r/min离心20min，取沉淀得纤维蛋白原，并取上清液备用；将得到的纤维蛋白原沉淀用与沉淀等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液在搅拌下溶解，采用截流分子量200kD的中空纤维超滤膜超滤后得到纤维蛋白原溶液，再将纤维蛋白原溶液冷冻干燥得到纤维蛋白原粉末。

(3)将步骤(2)中得到的备用的上清液搅拌加入4℃预冷饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度为35％，4℃下静置1h，再于冷冻离心机中2-10℃下4000r/min离心20min，取沉淀物，并将上清液备用。将沉淀物用与沉淀物等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，采用截流分子量6kD的中空纤维超滤膜超滤后得到免疫球蛋白溶液，再将免疫球蛋白溶液冷冻干燥得免疫球蛋白粉末。

(4)将步骤(3)中得到的备用上清液搅拌加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到75％，于4℃下静置1.5h，再于冷冻离心机中2-10℃下4000r/min离心20min，取沉淀物。将沉淀物用与沉淀物等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，采用截流分子量6kD的中空纤维超滤膜超滤后得到白蛋白溶液，再将白蛋白溶液冷冻干燥，得到白蛋白粉末。

1.2蛋白质的分析与检测

1.2.1纤维蛋白原的分析与检测

步骤(2)中的沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳后的凝胶放入BIO-RAD凝胶扫描仪对其进行成像分析，沉淀中纤维蛋白原浓度为8.5428mg/ml，上清液中纤维蛋白原浓度为2.1395mg/ml。

从上述数据说明，上清液中纤维蛋白原的含量较低，沉淀较充分。尽可能地减少了步骤(3)提取的免疫球蛋白中纤维蛋白原的残留量。

1.2.2免疫球蛋白的分析与检测

将步骤(3)中得到的免疫球蛋白粉末样品用0.01mol/L、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液稀释，使其吸光度在0.2～2.0之间，用紫外分光光度计在260nm和280nm的单色光照射下测出其吸光度值。根据吸光度与蛋白质浓度的关系，换算出蛋白质的浓度，从而得到蛋白质得率。经计算，样品的蛋白质浓度为33.1078mg/mL，蛋白质得率为11.8424mg/mL。

对照IgG标准品和蛋白质分子量标准的电泳结果，可以得到SDS-PAGE电泳时牛血清IgG轻链与重链的电泳位置，据此，可以对样品SDS-PAGE电泳结果进行定性。然后，用Bandscan软件进行数据分析得知，35％饱和硫酸铵浓度时，每1mg/mL蛋白样所产生IgG的相对峰面积为1819。说明35％饱和硫酸铵浓度时的蛋白样中IgG的含量较高，纯度较高。

1.2.3白蛋白的分析与检测

1.2.3.1凝胶过滤层析：将步骤(4)得到的白蛋白粉末样品与上样缓冲液混合均匀，配制成5mg/ml的样品液。上样缓冲液为：依次加入1.6ml pH＝6.8的Tris-HCl缓冲液、4ml 10％SDS、2.5ml 87％甘油、0.1mg溴酚兰+1mlβ-巯基乙醇，然后用蒸馏水定容至20ml，配制成浓度为0.08mol/L，pH＝6.8的样品缓冲液。

将样品液2.2ml加入到已平衡好的Sephadex G-150凝胶层析柱中，以0.01mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液作为洗脱液进行洗脱。洗脱的同时以试管进行收集，收集出现小峰时的试管中溶液。

1.2.3.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：将装有小峰的样品溶液收集好，装入透析袋中，放到聚乙二醇中进行浓缩，将浓缩后的样品转入1.5ml的离心管中，加入样品缓冲液，沸水浴后离心进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

上样条件：样品浓度：2mg/ml；离心：3min，5000r/min；

煮沸：5min；

电泳条件：恒流40mA；

染色：考马斯亮蓝染色液，染色3-4h；

脱色：甲醇∶冰醋酸∶水＝1∶1∶8。

经凝胶分析得出层析后蛋白质浓度，再由公式(1)计算样品纯度。

层析后样品中白蛋白含量为0.5005g/l，纯度为22.96％。

实施例2

2.1提取方法

(1)在常温下，将新鲜牛血液注入盛有质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠的容器中，搅拌，使柠檬酸钠完全溶解并均匀分布于血液中，其中，牛血液与质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠的重量比为9∶1。然后将已抗凝的血液于冷冻离心机中2-10℃下4000r/min离心10min，沉降血细胞，取上清液即为血浆。

(2)在4℃下，将步骤(1)中得到的血浆中加入于血浆等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液，并加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到21％，之后于冷冻离心机中4000r/min离心20min，取沉淀得纤维蛋白原，并取上清液备用。将得到的纤维蛋白原沉淀用等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液在搅拌下溶解，采用截流分子量200kD的中空纤维超滤膜超滤后得到纤维蛋白原溶液，再将纤维蛋白原溶液冷冻干燥得到纤维蛋白原粉末。

(3)将步骤(2)中得到的备用的上清液搅拌加入4℃预冷饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度为40％，4℃下静置1h，再于冷冻离心机中2-10℃下4000r/min离心20min，取沉淀物，并将上清液备用。将沉淀物用与沉淀物等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，采用截流分子量6kD的中空纤维超滤膜超滤后得到免疫球蛋白溶液，再将免疫球蛋白溶液冷冻干燥得免疫球蛋白粉末。

(4)将步骤(3)中得到的备用上清液搅拌加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到78％，于4℃下静置1.5h，再于冷冻离心机中2-10℃下4000r/min离心20min，取沉淀物。将沉淀物用与沉淀物等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，采用截流分子量6kD的中空纤维超滤膜超滤后得到白蛋白溶液，再将白蛋白溶液冷冻干燥，得到白蛋白粉末。

2.2蛋白质的分析与检测

2.2.1纤维蛋白原的分析与检测

步骤(2)中的沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳后的凝胶放入BIO-RAD凝胶扫描仪对其进行成像分析，沉淀中纤维蛋白原浓度为24.4646mg/ml，上清液中纤维蛋白原浓度为0.1050mg/ml。

从上述数据说明，上清液中纤维蛋白原的含量很低，沉淀充分。尽可能地减少了步骤(3)提取的免疫球蛋白中纤维蛋白原的残留量。

2.2.2免疫球蛋白的分析与检测

将步骤(3)得到的免疫球蛋白粉末样品用0.01mol/L、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液稀释稀释，使其吸光度在0.2～2.0之间，用紫外分光光度计在260nm和280nm的单色光照射下测其吸光度值。根据吸光度与蛋白质浓度的关系，换算出蛋白质的浓度，从而得到蛋白质得率。经计算，样品中的蛋白质浓度为28.8730mg/mL，蛋白质得率为16.0005mg/mL。

对照IgG标准品和蛋白质分子量标准的电泳结果，可以得到SDS-PAGE电泳时牛血清IgG轻链与重链的电泳位置，据此，可以对样品SDS-PAGE电泳结果进行定性。然后用Bandscan软件进行数据分析，40％饱和硫酸铵浓度时，每1mg/mL蛋白样所产生IgG的相对峰面积为3373。峰面积最高，40％饱和硫酸铵浓度时蛋白样中IgG含量最高，提取纯度最高。

2.2.3白蛋白的分析与检测

将步骤(4)得到的白蛋白粉末进行分析和检测，检测方法同1.2.3。

对层析后样品中蛋白质浓度和纯度进行检测，检测结果为：白蛋白含量为11.8378g/l，纯度为67.57％。

实施例3

3.1提取方法

(1)在常温下，将新鲜牛血液注入盛有质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠的容器中，搅拌，使柠檬酸钠完全溶解并均匀分布于血液中，其中，牛血液与质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠的重量比为9∶1。然后将已抗凝的血液于冷冻离心机中2-10℃下4000r/min离心10min，沉降血细胞，取上清液即为血浆。

(2)在4℃下，将步骤(1)中得到的血浆中加入与血浆等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液，并加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到22％，之后于冷冻离心机中4000r/min离心20min，取沉淀得纤维蛋白原，并取上清液备用。将得到的纤维蛋白原沉淀用与沉淀等体积的0.01mol/L、pH7＝.4的PBS缓冲液在搅拌下溶解，采用截流分子量200kD的中空纤维超滤膜超滤后得到纤维蛋白原溶液，再将纤维蛋白原溶液冷冻干燥得到纤维蛋白原粉末。

(3)将步骤(2)中得到的备用的上清液搅拌加入4℃预冷饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度为45％，4℃下静置1h，再于冷冻离心机中2-10℃下4000r/min离心20min，取沉淀物，并将上清液备用。将沉淀物用与沉淀物等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，采用截流分子量6kD的中空纤维超滤膜超滤后得到免疫球蛋白溶液，再将免疫球蛋白溶液冷冻干燥得免疫球蛋白粉末。

(4)将步骤(3)中得到的备用上清液搅拌加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达到80％，于4℃下静置1.5h，再于冷冻离心机中2-10℃下4000r/min离心20min，取沉淀物。将沉淀物用与沉淀物等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，采用截流分子量6kD的中空纤维超滤膜超滤后得到白蛋白溶液，再将白蛋白溶液冷冻干燥，得到白蛋白粉末。

3.2蛋白质的分析与检测

3.2.1纤维蛋白原的分析与检测

将步骤(2)中的沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后的凝胶放入BIO-RAD凝胶扫描仪对其进行成像分析，沉淀中纤维蛋白原浓度10.3689mg/ml，上清液中纤维蛋白原浓度2.3173mg/ml。

在上清液中纤维蛋白原残留量为：

从上述数据说明，上清液中纤维蛋白原的含量低，沉淀充分。步骤(3)提取的免疫球蛋白中含有很少量的纤维蛋白原。

3.2.2免疫球蛋白的分析与检测

将步骤(3)中得到的免疫球蛋白粉末用0.01mol/L、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液稀释，使其吸光度在0.2～2.0之间，用紫外分光光度计在260nm和280nm的单色光照射下测其吸光度值。根据吸光度与蛋白质浓度的关系，换算出蛋白质的浓度，从而得到蛋白质得率。经计算，蛋白质浓度为24.8845mg/mL，蛋白质得率为18.0978mg/mL。

对照IgG标准品和蛋白质分子量标准的电泳结果，可以得到SDS-PAGE电泳时牛血清IgG轻链与重链的电泳位置，据此可以对样品SDS-PAGE电泳结果进行定性。然后用Bandscan软件进行数据分析，45％饱和硫酸铵浓度时，每1mg/mL蛋白样所产生IgG的相对峰面积为2105。峰面积较高，说明45％饱和硫酸铵浓度时蛋白样中IgG含量较高，提取纯度较高。

3.2.3白蛋白的分析与检测

将步骤(4)得到的白蛋白粉末进行分析和检测，检测方法同1.2.3。

对层析后样品中蛋白质浓度和纯度进行检测，检测结果为：白蛋白含量为8.3783g/l，纯度为49.05％。

综上所述，采用本发明的方法所提取蛋白全面，对饱和硫酸铵浓度确定精确，提取纯度高，得率高，操作简便，投资少。提取介质都为同一物质，浓度依次增高，减少成本，便于回收，且可重复使用，降低污染。

Claims (5)

1.一种牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)在常温下，将新鲜牛血液注入盛有抗凝剂的容器中，其中，牛血液与抗凝剂的重量比为9∶1；然后将已抗凝的牛血液于冷冻离心机中2～10℃下高速离心，收集血浆；

(2)在4℃下，将步骤(1)中得到的血浆中加入与血浆等体积的0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液，并加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度达到20％～22％，之后于冷冻离心机中高速离心，取沉淀得纤维蛋白原，并取上清液备用；将得到的纤维蛋白原沉淀用0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液在搅拌下溶解，超滤后得到纤维蛋白原溶液，再将纤维蛋白原溶液冷冻干燥得到纤维蛋白原粉末；

(3)将步骤(2)中得到的备用的上清液搅拌加入4℃预冷饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度为35％～45％，4℃下静置1h，再于冷冻离心机中2～10℃下高速离心，取沉淀物，并取上清液备用；将沉淀物用0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，超滤后得到免疫球蛋白溶液，再将免疫球蛋白溶液冷冻干燥得免疫球蛋白粉末；

(4)将步骤(3)中得到的备用的上清液搅拌加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的质量百分比浓度达到75％～80％，于4℃下静置1.5h，再于冷冻离心机中2～10℃下高速离心，取沉淀物；将沉淀物用0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液溶解，超滤后得到白蛋白溶液，再将白蛋白溶液冷冻干燥，得到白蛋白粉末。

2.根据权利要求1所述的牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法，其特征在于，步骤(2)中超滤使用的中空纤维超滤膜截流分子量200kD。

3.根据权利要求1所述的牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法，其特征在于，步骤(3)中超滤使用的中空纤维超滤膜截流分子量6kD。

4.根据权利要求1所述的牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法，其特征在于，步骤(4)中超滤使用的中空纤维超滤膜截流分子量6kD。

5.根据权利要求1所述的牛血浆中三种蛋白质的连续分离方法，其特征在于，步骤(1)中所使用的抗凝剂为质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠。