CN111388505A - 一种动物胎盘转移因子的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，提出了一种动物胎盘转移因子的制备方法，包括以下步骤：将动物胎盘与水混合，匀浆后进行细胞破碎得到胎盘组织；将胎盘组织用酸调节pH至3.5～4.5，得到调酸后的胎盘组织液；将胎盘组织液在‑20℃、‑40℃、‑60℃下分阶冻融，每个温度梯度的冷冻时间16～24h，冷冻完成后，在20～25℃水浴解冻，每个温度梯度冻融1次，得到冻融后的胎盘组织液，将胎盘组织液离心，收集上清液；将上清液用5μm～0.22μm的滤膜分级过滤，收集微滤透过物，得到动物胎盘转移因子。通过上述技术方案，解决了现有技术中提取的胎盘有效活性物质分子量大以及提取方法的提取效率低的问题。

Description

一种动物胎盘转移因子的制备方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种动物胎盘转移因子的制备方法。
背景技术
我国利用动物的各种器官、组织及代谢产物进行治病、防病和医疗保健的历史悠久，历代本草也都记录了胎盘在医疗保健上的作用。无论是根据祖国医学的长期实践经验，还是从现代科学的研究结果看，胎盘及其提纯物质(或制剂)具有调节免疫、抗氧化、抗疲劳和延缓衰老等保健作用，并正在被开发应用。
家畜脏器(如胎盘)中含有多种多样具有生物活性的物质，在许多行业有着广泛的用途和独特的功效。随着生物技术的不断进步与发展，生物制药、生化产品、生物农业、生物食品、生物活性化妆品以及生物源性保健产品的兴起，均需大量生物脏器及其提取物作为主要原料或重要辅料，为脏器资源加工提供了巨大的机遇与市场。
目前，已有多种利用胎盘提取有效活性物质的专利，这些专利获取胎盘提取物的方法主要有以下几种：(1)直接提取:：将胎盘组织经匀浆后加提取液提取；(2)超临界CO2萃取：将胎盘组织冻干、粉碎、超临界萃取后，萃取物匀浆、离心，冻干离心液；(3)酶辅助提取：胎盘经1-2种蛋白酶适度酶解后，离心、冻干离心液。采用以上这些方法制备的胎盘提取物中有效活性物质以大分子蛋白为主，分子量大，人体吸收率低，而且以上方法提取效率低。因此，发明一种提取效率高的分子量小的动物胎盘转移因子的制备方法，很有必要。
发明内容
本发明提出一种动物胎盘转移因子的制备方法，解决了现有技术提取的胎盘有效活性物质分子量大以及提取方法的提取效率低的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种动物胎盘转移因子的制备方法，包括以下步骤：
胎盘组织液的制备、胎盘组织液的分阶冻融、离心、过滤，得到动物胎盘转移因子，
所述分阶冻融具体为将胎盘组织液在-20℃、-40℃、-60℃下分阶冻融，每个温度梯度的冷冻时间16～24h，冷冻完成后，解冻，每个温度梯度冻融1次，得到冻融后的胎盘组织液。
作为进一步的技术方案，所述胎盘组织液的制备具体为将动物胎盘与水混合，匀浆后进行细胞破碎，用酸调节pH至3.5～4.5，得到调酸后的胎盘组织液。
作为进一步的技术方案，所述离心为在4℃、6000r/min的条件下离心20min，所述过滤为用5μm～0.22μm的滤膜分级过滤。
作为进一步的技术方案，所述动物胎盘与水的质量体积比为1：(3～5)，匀浆时间为5～10min。
作为进一步的技术方案，动物胎盘与水混合前先将动物胎盘绞碎。
作为进一步的技术方案，所述酸为冰乙酸或盐酸。
作为进一步的技术方案，过滤之后还包括以下步骤：将动物胎盘转移因子调节pH至4.0～6.0，注射用水配液，除菌、灌装，得到动物胎盘转移因子注射液。
作为进一步的技术方案，所述除菌为采用0.1μm的除菌过滤器除菌，得到的动物胎盘转移因子注射液中小分子肽含量≥2.0mg/mL。
作为进一步的技术方案，将动物胎盘绞碎前还包括以下步骤：取动物胎盘，用消毒液第一次浸泡后用纯化水冲洗，再用酒精第二次浸泡，用纯化水冲洗后，剔除脂肪组织、筋膜，再用纯化水冲洗。
作为进一步的技术方案，所述消毒液为新洁尔灭溶液，第一次浸泡时间为15～20min，酒精的质量分数为70％～75％，第二次浸泡时间为15～20min。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明中，通过对动物胎盘组织破碎、调酸后，应用纯物理阶梯温度冻融技术，有效的提取胎盘活性物质，大大提高了使胎盘转移因子中小分子肽的含量，提取效率大大提高，降低了生产成本，同时，得到的小分子肽分子量在3KD～6KD之间，提高了活性物质的有效性，解决了现有技术中提取的胎盘有效活性物质分子量大以及提取方法的提取效率低的问题。
2、本发明中，在冻融时选择阶梯温度冻融，在冷冻时间相同的情况下，在-20℃、-40℃、-60℃三个温度下各冻融1次不仅使得提取的猪胎盘转移因子中小分子肽的含量显著提高，提高了提取效率同时降低了能耗，还保证了小分子肽的分子量范围在3KD～6KD之间，确保了有效活性物质小分子肽的活性。采用阶梯温度冻融提取动物胎盘转移因子，无任何化学物质、生物物质等污染，保证了小分子活性肽的绿色、无污染等特点。
3、本发明中，阶梯温度冻融前先对动物胎盘组织破碎、调酸，能有效的破碎组织细胞，保证小分子肽提取得率的同时，缩短了小分子肽的提取时间，节约了成本。
4、本发明中，阶梯温度冻融后通过用5μm～0.22μm滤膜分级过滤，进一步保证了有效成分小分子肽的分子量范围，确保其有效性，并增加了成品的应用方向与价值，进而保证了小分子肽无抗原性、无过敏性，有提高机体免疫力的免疫原性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明实施例1及对比例1、4、7的猪胎盘转移因子小分子肽电泳图；
图中：孔1为MAKER1，分子量分别为170KD、130KD、100KD、70KD、55KD、40KD、35KD、25KD、15KD、10KD；孔2为MAKER2，分子量分别为40KD、25KD、15KD、10KD、4.6KD；孔3为对比例1的猪胎盘转移因子样品；孔4为对比例4的猪胎盘转移因子样品；孔5为-对比例7的猪胎盘转移因子样品；孔6为实施例1的猪胎盘转移因子样品。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验一、一种猪胎盘转移因子的制备方法，包括以下步骤：
S0、取经外源病毒检验合格的猪胎盘30kg，用1％的新洁尔灭溶液浸泡15-20min，纯化水冲洗三遍，再用70％～75％的酒精浸泡15-20min，纯化水反复冲洗三遍后，剔除猪胎盘组织的脂肪组织、筋膜，再用纯化水清洗3次，去血水、沥干，得到预处理的猪胎盘；
S1、将预处理的猪胎盘用绞肉机绞碎，称重29.6kg，分成14份(供实施例1～3及对比例1～10用)。然后与注射水按料水重量体积比1：4(w/v)混合，然后用胶体磨匀浆8min，匀浆后的猪胎盘组织于超声波细胞破碎仪进行细胞破碎5～10min，得到猪胎盘组织；
S2、将猪胎盘组织用冰乙酸调节pH值至4.0，得到调酸后的猪胎盘组织液；
S3、将猪胎盘组织液在-20℃、-40℃、-60℃下分阶冻融，每个温度梯度的冷冻时间16～24h，冷冻完成后，在20～25℃水浴解冻，每个温度梯度冻融1次，得到冻融后的猪胎盘组织液，将猪胎盘组织液在4℃、6000r/min离心20min，收集上清液；
S4、将上清液用5μm、3μm、1μm、0.45μm、0.22μm滤膜分级过滤，收集微滤透过物分级过滤，收集微滤透过物，得到猪胎盘转移因子。
S5、将猪胎盘转移因子用2.0mol/LHCl或2.0mol/LNaOH调节pH值至4.0～6.0之间，福林酚比色法测收集的微滤透过物中小分肽的含量后，用注射用水配置成小分子肽含量为≥2.0mg/mL的液体，配液后，采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得猪胎盘转移因子注射液。
实施例1～3及对比例1～11的方法同实验一，其中步骤S3的具体操作如下表：
表1实施例1～3级对比例1～11步骤S3、的具体操作参数设置
Figure BDA0002437325330000031
Figure BDA0002437325330000041
采用福林酚比色法测定实施例1～3及对比例1～11的猪胎盘转移因子中小分子肽的含量，测试中所用试剂及仪器如下：
试剂：牛血清白蛋白(北京普博欣生物科技有限责任公司)，型号：PB10056；福林酚试剂(国药集团化学试剂有限公司)，型号：73104861；无水硫酸铜，氢氧化钠、酒石酸钾等均为国产分析纯。
仪器：数显恒温水浴锅，型号：DK-98-11；双光束紫外分光光度计，型号：P7紫外/可见分光光度计。
测试方法：
(1)对照品贮备液：取血清白蛋白对照品适量，精密称定为0.0249g，置于100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得到对照品贮备液；
(2)碱性铜溶液：取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合作为乙液。临用前，合并甲、乙两液，并加水至500ml，得到碱性铜溶液；
(3)对照品溶液：量取对照品贮备液0.5mL置于20mL具塞刻度试管中，加水补足到1mL，加碱性铜溶液1mL，摇匀，快速加入福林酚溶液4mL，密封，置于涡旋振荡器上振荡，在55℃水浴锅放置5min后取出，冰水浴至室温，得到对照品溶液；
(4)供试品溶液：称取猪胎盘转移因子1.1g，置于100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过滤；取滤液1mL，置于20mL具塞刻度试管中，加碱性铜溶液1mL，摇匀，快速加入福林酚溶液4mL，密封，置于涡旋振荡器上振荡，在55℃水浴锅放置5min后取出，冰水浴至室温，得到供试品溶液；
(5)测定：分别精密量取对照贮备液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mL，置于20mL具塞刻度试管中，加水补足到1mL，加碱性铜溶液1mL，摇匀，快速加入福林酚溶液4mL，密封，置于涡旋振荡器上振荡，在55℃水浴锅放置5min后取出，冰水浴至室温；分别采用双光束紫外分光光度计在650nm波长处测定吸光度。以吸光度(A)对质量浓度(c)进行线性回归，得到回归方程A＝0.0194c+0.0126(r＝0.9990)，按照上述方法测试实施例1～3及对比例1～9供试品溶液在650nm下的吸光度，根据回归方程计算各胎盘转移因子中小分子肽的含量；
测定结果见下表：
表2实施例1～3及对比例1～9的猪胎盘转移因子中小分子肽的含量
Figure BDA0002437325330000051
从表2中可以看出，与对比例1～9相比，实施例1～3的猪胎盘转移因子中小分子肽的含量显著提高。对比例9～11都是在-60℃冻融，但是冻融次数不同，通过对比得到的小分子肽含量可以看出，在-60℃冻融时，冻融3次比冻融1次的小分子肽的含量显著提高，而冻融5次与冻融3次的小分子肽含量基本无差别，因此，冻融3次的效果更好。对比例1～9是分别是在-20℃、-40℃、-60℃三个温度冻融次数3次，而通过小分子肽含量结果可以看出，随着冻融温度的降低，小分子肽的含量显著增加，而相同冷冻温度下，随着冷冻时间的提高，所得的小分子肽含量略有提高。从这里可以看出，冷冻温度越低，得到的猪胎盘转移因子中小分子肽的含量越高。但是，本申请中并没有选用冷冻温度为-60℃这个条件冻融3次，而是选择阶梯冻融，在-20℃、-40℃、-60℃三个温度下各冻融1次，结果得到的猪胎盘转移因子中小分子肽的含量显著提高，起到了意料不到的效果，尤其是冷冻时间20～24h时，小分子肽的含量显著提高，因此，提取效率大大提高，解决了现有技术中提取的胎盘有效活性物质分子量大以及提取方法的提取效率低的问题。与在-60℃下冻融3次，每次冷冻时间均为24小时相比，在相同的冷冻时间下，本发明的阶梯冻融方法即在-20℃、-40℃、-60℃三个温度下各冻融1次不仅使得提取的猪胎盘转移因子中小分子肽的含量显著提高，提高了提取效率同时降低了能耗，实用性强。
采用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳测实施例1～3及对比例1～11得到的猪胎盘转移因子中小分子肽的分子量，测试中所用仪器、试剂及测试方法如下：
仪器：Mini-Protein垂直电泳槽和电泳仪。
试剂及其厂家：N，N’-甲叉双丙烯酰胺(Sigma)；Tris(Serva)；Tricine(Serva)；过硫酸铵和TEMED(Sigma，USA)；SDS、尿素、甘油等均为国产分析纯。
具体操作步骤如下：
(1)制备电泳贮存液配制及胶的制备
阳极缓冲液：0.2mol/L Tris用HCl调节pH至8.9；
阴极缓冲液：0.2mol/L Tris，0.1mol/L Tricine，0.01g/L SDS；
胶缓冲液：3.0mol/L Tris，0.03g/L SDS，用HCl调节pH至8.4；
丙烯酰胺贮液：称取48g丙烯酰胺和1.5g N，N’-甲叉双丙烯酰胺于100mL水中，溶解混匀后即得凝胶总质量浓度(T)49.5g/L，交联度(C)30g/kg的贮液；
Tricine-SDS-PAGE的凝胶采用3层不连续胶的结构，由分离胶、间隙胶和浓缩胶构成，各层胶由不同分子组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成，具体组成见下表：
表3 Tricine-SDS-PAGE的凝胶各层胶具体组成
Figure BDA0002437325330000061
(2)样品缓冲液的制备及样品处理
上样缓冲液成分为：50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，质量分数2％SDS、0.1％溴酚蓝，体积分数10％甘油、2％巯基乙醇；将实施例1～3及对比例1～9的得到的猪胎盘转移因子测小分子肽样品10μL(10μg)与上样缓冲液按质量分数2：1混匀后，煮沸3～5min。
(3)电泳条件
10mA电泳1～2h，当样品全部进入分离胶后，将电流升至20mA，电泳约7h，当溴酚蓝到达离底部边缘约有0.5cm时停止电泳。
(4)染色
采用考马斯亮蓝G-250法染色。将胶体放进固定液(乙醇：冰醋酸：水＝5：1：4)中，至少固定30min，倒掉固定液，用超纯水漂洗2～3次，加入考马斯亮蓝染色液(1.6％磷酸、8％硫酸铵、0.02％CBBG250、20％乙醇)，过夜染色，染色结束后水洗至完全脱色。
其中，实施例1和对比例1、4、7猪胎盘转移因子的电泳图如图1所示，从图中可以看出，对比例1的猪胎盘转移因子中多肽的分子量集中在20KD～25KD之间，且有拖尾现象；对比例4的猪胎盘转移因子中多条的分子量集中在15KD～20KD之间，此外还有一条10KD以下条带，分子量在7KD-8KD之间，有拖尾现象；对比例7的猪胎盘转移因子中，出现4个条带，分子量范围在5KD～20KD之间，且条带分离清晰；实施例1中猪胎盘转移因子中多肽的分子量范围集中在3KD～6KD之间。对比例1猪胎盘转移因子制备过程中冻融条件为在-20℃冻融3次，对比例4猪胎盘转移因子制备过程中冻融条件为在-40℃冻融3次，对比例7猪胎盘转移因子制备过程中冻融条件为在-60℃冻融3次，从对比例1、4、7的结果可以看出，不同温度冻融胎盘均可得还有一定多肽的转移因子，随温度的降低，分子量相对变小。而实施例1的猪胎盘转移因子制备过程中冻融条件选择阶梯温度冻融，在-20℃、-40℃、-60℃温度下分别冻融1次，得到的猪胎盘转移因子中多肽的分子量更小，并没有按照上述规律，起到了意料不到的效果。因此，本申请中，制备过程中采用阶梯温度冻融，使得制备的猪胎盘转移因子多肽的分子量显著降低，有效解决了现有技术中提取的胎盘有效活性物质分子量大的问题。
实施例2～3的电泳图同实施例1，对比例2～3的电泳图同对比例1，对比例5～6的电泳图同对比例4，对比例8～11的电泳图同对比例7，故省略。
实验二、一种羊胎盘转移因子的制备方法，包括以下步骤：
S0、取经外源病毒检验合格的羊胎盘30kg，用1％的新洁尔灭溶液浸泡15-20min，纯化水冲洗三遍，再用70％～75％的酒精浸泡15-20min，纯化水反复冲洗三遍后，剔除羊胎盘组织的脂肪组织、筋膜，再用纯化水清洗3次，去血水、沥干，得到预处理的羊胎盘；
S1、将预处理的羊胎盘用绞肉机绞碎，称重29.0kg，分成12份(供实施例4～6及对比例12～20用)。然后与注射水按料水重量体积比1：4(w/v)混合，然后用胶体磨匀浆8min，匀浆后的羊胎盘组织于超声波细胞破碎仪进行细胞破碎5～10min，得到羊胎盘组织；
S2、将胎盘组织用2.0mol/L盐酸调节pH值至4.0，得到调酸后的羊胎盘组织液；
S3、将羊胎盘组织液在-20℃、-40℃、-60℃下分阶冻融，每个温度梯度的冷冻时间16～24h，冷冻完成后，在20～25℃水浴解冻，每个温度梯度冻融1次，得到冻融后的羊胎盘组织液，将羊胎盘组织液在4℃、6000r/min离心20min，收集上清液；
S4、将上清液用5μm、3μm、1μm、0.45μm、0.22μm滤膜分级过滤，收集微滤透过物分级过滤，收集微滤透过物，得到羊胎盘转移因子。
S5、将羊胎盘转移因子用2.0mol/LHCl或2.0mol/LNaOH调节pH值至4.0～6.0之间，福林酚比色法测收集的微滤透过物中小分肽的含量后，用注射用水配置成小分子肽含量为≥2.0mg/mL的液体，配液后，采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得羊胎盘转移因子注射液。
实施例4～6及对比例12～20的方法同实验二，其中步骤S3的具体操作如下表：
表4实施例4～6及对比例12～20步骤S3的具体操作参数设置
组别 胎盘组织(kg) 冷冻温度(℃) 冷冻时间(h) 冻融次数
实施例4 2.5 -20、-40、-60(阶梯温度冻融) 16 每个温度梯度冻融1次
实施例5 2.5 -20、-40、-60(阶梯温度冻融) 20 每个温度梯度冻融1次
实施例6 2.3 -20、-40、-60(阶梯温度冻融) 24 每个温度梯度冻融1次
对比例12 2.4 -20 16 3
对比例13 2.3 -20 20 3
对比例14 2.5 -20 24 3
对比例15 2.4 -40 16 3
对比例16 2.4 -40 20 3
对比例17 2.4 -40 24 3
对比例18 2.6 -60 16 3
对比例19 2.4 -60 20 3
对比例20 2.3 -60 24 3
采用福林酚比色法测定实施例4～6及对比例12～20的羊胎盘转移因子中小分子肽的含量，测定结果见下表：
表5实施例4～6及对比例12～20的羊胎盘转移因子中小分子肽的含量
Figure BDA0002437325330000081
从表5中可以看出，与对比例12～20相比，实施例4～6的羊胎盘转移因子中小分子肽的含量显著提高。对比例10～18是分别是在-20℃、-40℃、-60℃三个温度冻融次数3次，而通过小分子肽含量结果可以看出，随着冻融温度的降低，小分子肽的含量显著增加，而相同冷冻温度下，冷冻时间16h、20h、24h所得的小分子肽含量无显著差异，从这里可以看出，冷冻温度越低，得到的羊胎盘转移因子中小分子肽的含量越高。但是，本申请中并没有选用冷冻温度为-60℃这个条件冻融三次，而是选择阶梯冻融，在-20℃、-40℃、-60℃三个温度下各冻融1次，结果得到的猪胎盘转移因子中小分子肽的含量显著提高，起到了意料不到的效果，尤其是冷冻时间20～24h时，小分子肽的含量显著提高，因此，提取效率大大提高，解决了现有技术中提取的胎盘有效活性物质分子量大以及提取方法的提取效率低的问题。与在-60℃下冻融3次，每次冷冻时间均为24小时相比，在相同的冷冻时间下，本发明的阶梯冻融方法即在-20℃、-40℃、-60℃三个温度下各冻融1次不仅使得提取的猪胎盘转移因子中小分子肽的含量显著提高，提高了提取效率同时降低了能耗，实用性强。
实验三、一种猪胎盘转移因子的制备方法，包括以下步骤：
S0、取经外源病毒检验合格的猪胎盘30kg，用1％的新洁尔灭溶液浸泡15-20min，纯化水冲洗三遍，再用70％～75％的酒精浸泡15-20min，纯化水反复冲洗三遍后，剔除猪胎盘组织的脂肪组织、筋膜，再用纯化水清洗3次，去血水、沥干，得到预处理的猪胎盘；
S1、将预处理的猪胎盘用绞肉机绞碎，称重29.5kg，分成12份(供实施例7～18用)。然后与注射水按料水重量体积比1：(3～5)(w/v)混合，然后用胶体磨匀浆5～8min，匀浆后的猪胎盘组织于超声波细胞破碎仪进行细胞破碎5～10min，得到胎盘组织；
S2、将胎盘组织用冰乙酸或2.0mol/L盐酸溶液(pH值调节剂)调节pH值至3.5～4.5，得到调酸后的胎盘组织液；
S3、将胎盘组织液在-20℃、-40℃、-60℃下分阶冻融，每个温度梯度的冷冻时间20h，冷冻完成后，在20～25℃水浴解冻，每个温度梯度冻融1次，得到冻融后的胎盘组织液，将胎盘组织液在4℃、6000r/min离心20min，收集上清液；
S4、将上清液用5μm、3μm、1μm、0.45μm、0.22μm滤膜分级过滤，收集微滤透过物分级过滤，收集微滤透过物，得到猪胎盘转移因子。
S5、将猪胎盘转移因子用2.0mol/LHCl或2.0mol/LNaOH调节pH值至4.0～6.0之间，福林酚比色法测收集的微滤透过物中小分肽的含量后，用注射用水配置成小分子肽含量为≥2.0mg/mL的液体，配液后，采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得猪胎盘转移因子注射液。
实施例7～18的方法同实验三，其中步骤S1、S2、S3的具体操作及小分子肽的含量如下表：
表6实施例7～18中步骤S1、S2、S3的具体操作参数设置及小分子肽的含量
Figure BDA0002437325330000091
Figure BDA0002437325330000101
从表6中可以看出，冰乙酸和2.0mol/L盐酸溶液都可以作为酸液调节剂，有效调节猪胎盘组织；pH值在3.5～4.5之间对组织冻融后小分子肽含量影响差异不显著；料液比在1：(3～5)、匀浆时间在5～8min时，不同料液比、不同匀浆时间最终所得猪胎盘转移因子成品量基本无太大的差异。
实验四、一种羊胎盘转移因子的制备方法，包括以下步骤：
S0、取经外源病毒检验合格的羊胎盘30kg，用1％的新洁尔灭溶液浸泡15-20min，纯化水冲洗三遍，再用75％的酒精浸泡15-20min，纯化水反复冲洗三遍后，剔除羊胎盘组织的脂肪组织、筋膜，再用纯化水清洗3次，去血水、沥干，得到预处理的羊胎盘；
S1、将预处理的羊胎盘用绞肉机绞碎，称重28.9kg，分成12份(供实施例19～30用)。然后与注射水按料水重量体积比1：(3～5)(w/v)混合，然后用胶体磨匀浆5～8min，匀浆后的羊胎盘组织于超声波细胞破碎仪进行细胞破碎5～10min，得到羊胎盘组织；
S2、将羊胎盘组织用冰乙酸调节pH值至3.5～4.5，得到调酸后的胎盘组织液；
S3、将羊胎盘组织液在-20℃、-40℃、-60℃下分阶冻融，每个温度梯度的冷冻时间16～24h，冷冻完成后，在20～25℃水浴解冻，每个温度梯度冻融1次，得到冻融后的羊胎盘组织液，将羊胎盘组织液在4℃、6000r/min离心20min，收集上清液；
S4、将上清液用5μm、3μm、1μm、0.45μm、0.22μm滤膜分级过滤，收集微滤透过物分级过滤，收集微滤透过物，得到羊胎盘转移因子。
S5、将羊胎盘转移因子用2.0mol/LHCl或2.0mol/LNaOH调节pH值至4.0～6.0之间，福林酚比色法测收集的微滤透过物中小分肽的含量后，用注射用水配置成小分子肽含量为≥2.0mg/mL的液体，配液后，采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得羊胎盘转移因子注射液。
实施例19～30的方法同实验四，其中步骤S1、S2、S3的具体操作及小分子肽的含量如下表：
表7实施例19～30中步骤S1、S2、S3的具体操作参数设置及小分子肽的含量
Figure BDA0002437325330000111
从表7中可以看出，冰乙酸和2.0mol/L盐酸溶液都可以作为酸液调节剂，有效调节羊胎盘组织；pH值在3.5～4.5之间对组织冻融后小分子肽含量影响差异不显著；料液比在1：(3～5)、匀浆时间在5～8min时，不同料液比、不同匀浆时间最终所得羊胎盘转移因子成品量基本无太大的差异。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
胎盘组织液的制备、胎盘组织液的分阶冻融、离心、过滤，得到动物胎盘转移因子，
所述分阶冻融具体为将胎盘组织液在-20℃、-40℃、-60℃下分阶冻融，每个温度梯度的冷冻时间16～24h，冷冻完成后解冻，每个温度梯度冻融1次，得到冻融后的胎盘组织液。
2.根据权利要求1所述的一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，所述胎盘组织液的制备具体为将动物胎盘与水混合，匀浆后进行细胞破碎，用酸调节pH至3.5～4.5，得到调酸后的胎盘组织液。
3.根据权利要求1所述的一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，所述离心为在4℃、6000r/min的条件下离心20min，所述过滤为用5μm～0.22μm的滤膜分级过滤。
4.根据权利要求2所述的一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，所述动物胎盘与水的质量体积比为1：(3～5)，匀浆时间为5～10min。
5.根据权利要求2所述的一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，动物胎盘与水混合前先将动物胎盘绞碎。
6.根据权利要求2所述的一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，所述酸为冰乙酸或盐酸。
7.根据权利要求1所述的一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，过滤之后还包括以下步骤：将动物胎盘转移因子调节pH至4.0～6.0，注射用水配液，除菌、灌装，得到动物胎盘转移因子注射液。
8.根据权利要求7所述的一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，所述除菌为采用0.1μm的除菌过滤器除菌，得到的动物胎盘转移因子注射液中小分子肽含量≥2.0mg/mL。
9.根据权利要求5所述的一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，将动物胎盘绞碎前还包括以下步骤：取动物胎盘，用消毒液第一次浸泡后用纯化水冲洗，再用酒精第二次浸泡，用纯化水冲洗后，剔除脂肪组织、筋膜，再用纯化水冲洗。
10.根据权利要求9所述的一种动物胎盘转移因子的制备方法，其特征在于，所述消毒液为新洁尔灭溶液，第一次浸泡时间为15～20min，酒精的质量分数为70％～75％，第二次浸泡时间为15～20min。
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