CN107177459A - 一种地龙蛋白多肽酒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地龙蛋白多肽酒及其制备方法，该地龙蛋白多肽酒，地龙蛋白多肽1.5‑2.5份、车前子8‑14份、通草8‑14份、泽泻5‑8份、灯心草5‑8份以及酒精浓度为10‑15%的黄酒75‑85份。本发明以地龙蛋白多肽为主要成分，配以车前子、通草、泽泻、灯心草的中药辅药，制备得到具有增加排尿量、具有利尿活性的保健药酒，两者配合使用，能够起到协同增效的作用，增强利尿活性，可长达7个小时，具有缓释性特点，适应于长期给药，减少不良反应。

Description

一种地龙蛋白多肽酒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术，尤其涉及一种地龙蛋白多肽酒及其制备方法。

背景技术

地龙又名蚯蚓(Earthworm)、地龙子、曲缮,系环节动物。其味咸性寒,人肝、脾、肾经。始载于《别录》“疗伤寒伏热狂谬,大腹黄疽”。据《本草纲目》记载本品具有清热、平肝、定惊、止喘、通络之功效。临床上常用地龙或其复方治疗慢性气管炎、支气管炎、支气管哮喘、消化性溃疡、高血压病、慢性前列腺炎、血尿、血管性头痛、三叉神经痛、癫痈、腮腺炎、湿疹、带状疙疹、烧烫伤等。现代医学研究证明地龙具有清热、镇定、抗惊厥、平喘、降血压之功效。

地龙肽是地龙体内小分子质量多肽的总称，种类繁多，生物学功能复杂多样。人们已从地龙体内提取了多种具有生物活性的肽类，如纤维蛋白溶酶、催产素相关肽、肌肉运动活性肽、抗菌肽等。研究发现地龙肽具有促进动物生长发育、抗凝血溶血栓的双重作用、降压作用、免疫增强作用、抗肿瘤作用、抗肝纤维化及抗菌作用等。

地龙本身药用价值高，高蛋白、低脂肪，是一种潜在的动物蛋白资源。但是目前对地龙的研究主要集中在地龙水提取物、醇提取物等方面，而对地龙丰富蛋白质资源的研究却报道尚少。因此利用现代食品生物技术对地龙蛋白进行深度开发，制备出具有保健作用的功能食品，不仅可提高现有资源的利用率，为地龙的深度加工提供一条新的途径；而且可增强地龙中药产业科技含量和市场竞争力，对提高我国中药产业现代化综合利用技术水平和发展保健食品工业具有重要的社会意义和经济效益。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种地龙蛋白多肽酒。本发明以地龙蛋白多肽为主要成分，配以车前子、通草、泽泻、灯心草的中药辅药，制备得到具有增加排尿量、具有利尿活性的保健药酒，两者配合使用，能够起到协同增效的作用，增强利尿活性，可长达7个小时，具有缓释性特点，适应于长期给药，减少不良反应。

本发明的目的之二在于一种地龙蛋白多肽酒的制备方法，该制备方法操作简单，适合工业化生产，生产得到的地龙蛋白多肽酒效果显著。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：提供一种地龙蛋白多肽酒，由如下重量份的组分制备而成：

地龙蛋白多肽1.5-2.5份、车前子8-14份、通草8-14份、泽泻5-8份、灯心草5-8份以及酒精浓度为10-15％的黄酒75-85份。

进一步地，地龙蛋白多肽酒由如下重量份的组分制备而成：

地龙蛋白多肽2份、车前子13份、通草12份、泽泻6份、灯心草8份以及酒精浓度为10-15％的黄酒80份。

进一步地，所述地龙蛋白多肽为分子量介于1500-2500Da的地龙蛋白多肽，该地龙蛋白多肽由如下步骤制得：

(1)浸提提取：取新鲜的蚯蚓，在水中浸泡24h，使其吐出肠道中的泥土等异物；清洗干净后，加入1.5倍体积的磷酸盐缓冲溶液用组织捣碎机捣碎，搅拌，浸提15-30h，离心15min，取其上清液；

(2)蛋白质改性：步骤(1)得到的上清液，调pH值至6.3-6.5，在45-55℃下，微波处理5分钟得到改性蛋白溶液；

(3)酶解：以改性蛋白溶液为底物，调pH值至6.3-6.5，按照底物质量百分比为1.5-2％加入复合酶拌匀，然后在50-55℃下，微波处理5分钟，得到酶解液；

(4)分离纯化的步骤：将酶解液降至室温，取上清液，依次用0045和002型蜂房式滤器过滤除菌,而后用中空纤维超滤柱超滤，收集滤液冷冻干燥，即得地龙蛋白多肽。

进一步地，在步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02mol/L、pH值为6.0；所述浸提条件为在4℃条件下浸提24h。

进一步地，在步骤(3)中，所述复合酶为由胰蛋白酶和羧肽酶A复合而成的复合酶，所述胰蛋白酶和羧肽酶A的质量比为1.5:1。

进一步地，在步骤(4)中，所述0045型和002型蜂房式过滤器和中空纤维超滤柱购自北京旭邦膜设备有限公司；所述中空纤维超滤柱超滤的截留分子量为1500和2500Da。

进一步地，在步骤(2)和(3)中所述微波功率为200-300w。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：还提供一种如上所述的地龙蛋白多肽酒的制备方法，包括如下步骤：

(1)将按照配方量的车前子、通草、泽泻、灯心草配料，然后倒入部分黄酒浸提2-3个月，然后过滤，取上清液，得到药材浸提液；

(2)将地龙蛋白多肽加入至剩余黄酒中，搅拌均匀，并密封储存1个月，得到地龙蛋白多肽混合酒；

(3)将步骤(1)的药材浸提液和步骤(2)的地龙蛋白多肽混合酒进行勾兑，搅拌均匀，并密封储存1个月，即得地龙蛋白多肽酒。

进一步地，步骤(1)中与步骤(2)中所述黄酒的用量比例为2:1。

进一步地，所述地龙蛋白多肽为分子量介于1500-2500Da的地龙蛋白多肽，该地龙蛋白多肽由如下步骤制得：

(1)浸提提取：取新鲜的蚯蚓，在水中浸泡24h，使其吐出肠道中的泥土等异物；清洗干净后，加入1.5倍体积的磷酸盐缓冲溶液用组织捣碎机捣碎，搅拌，浸提15-30h，离心15min，取其上清液；

(2)蛋白质改性：步骤(1)得到的上清液，调pH值至6.3-6.5，在45-55℃下，微波处理5分钟得到改性蛋白溶液；

(3)酶解：以改性蛋白溶液为底物，调pH值至6.3-6.5，按照底物质量百分比为1.5-2％加入复合酶拌匀，然后在50-55℃下，微波处理5分钟，得到酶解液；

(4)分离纯化的步骤：将酶解液降至室温，取上清液，依次用0045和002型蜂房式滤器过滤除菌,而后用中空纤维超滤柱超滤，收集滤液冷冻干燥，即得地龙蛋白多肽。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明以地龙蛋白多肽为主要成分，配以车前子、通草、泽泻、灯心草的中药辅药，制备得到具有增加排尿量、具有利尿活性的保健药酒，两者配合使用，能够起到协同增效的作用，增强利尿活性，可长达7个小时，具有缓释性特点，适应于长期给药，减少不良反应。

(2)此外，通过改进地龙蛋白多肽的提取、酶解、纯化分离技术，以浸提提取、超波辅助酶解、0045和002型蜂房式滤器过滤、用中空纤维超滤柱超滤分离纯化，制备具有利尿活性的多肽，本发明制备的地龙蛋白多肽的肽得率高，纯度高，可以作为添加剂或活性药物添加至到人类食品、医药、保健品等多种行业和领域，无疑对延长中草药进一步开发的产业链，全面提高地龙产业综合效益，实现农业增效农民增收农村繁荣，对推动一带一路建设有重大意义。

(3)本发明整个地龙蛋白多肽的制备工艺以及地龙蛋白多肽酒的流程短、时间短，能耗低、污染少、不使用有毒试剂、无污染物排放，达到清洁生产目标。

(4)在控制酶解过程中酶的选择是关键，它不仅影响最后地龙蛋白多肽的生理功能、地龙原料利用率，而且也直接影响地龙蛋白多肽酒的风味和物理化学特性。酶的选择、酶解过程的控制是酶解法制备地龙蛋白多肽的关键技术。本发明经过大量试验筛选出复合酶和中性蛋白酶来水解地龙蛋白，并且筛选出最优的用酶条件，对地龙蛋白的酶解效果最好。由于各种酶由于酶作用位点的特异性，对同一底物地龙蛋白具有不同的水解能力。研究发现，尤其在胰蛋白酶和羧肽酶A用量比例为1.5:1使，其水解效果优异，使其水解产物的水解度和肽得率都较高。

(5)由本发明0045和002型蜂房式滤器过滤、用中空纤维超滤柱超滤进行分离纯化，既能出去细菌，还能将有机污染物和盐分除去，达到提高产品质量的目的，得到的地龙蛋白多肽分子量介于1500-2500Da，研究发现，分子量介于1500-2500Da的地龙蛋白多肽利尿用强，而且研究还发现，并非肽分子量越小或越大其抗凝、利尿活性越强，肽的活性也受其氨基酸的组成、排序或肽的空间结构等因素的影响，由本发明纯化得到的分子量介于1500-2500Da地龙蛋白多肽其活性最强。另外，本发明的分离条件温和、样品回收率高、实验结果重现性高、设备简便经济。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种地龙蛋白多肽酒，由如下重量份的组分制备而成：

地龙蛋白多肽2份、车前子13份、通草12份、泽泻6份、灯心草8份以及酒精浓度为10-15％的黄酒80份。

实施例2

一种地龙蛋白多肽酒，由如下重量份的组分制备而成：

地龙蛋白多肽1.5份、车前子8份、通草8份、泽泻5份、灯心草5份以及酒精浓度为10-15％的黄酒75份。

实施例3

一种地龙蛋白多肽酒，由如下重量份的组分制备而成：

地龙蛋白多肽2.5份、车前子14份、通草14份、泽泻8份、灯心草8份以及酒精浓度为10-15％的黄酒85份。

实施例4

实施例1-3的地龙蛋白多肽酒制备方法如下：

(1)将按照配方量的车前子、通草、泽泻、灯心草配料，然后倒入总量三分之二的黄酒浸提2.5个月，然后过滤，取上清液，得到药材浸提液；

(2)将地龙蛋白多肽加入总量三分之一的黄酒中，搅拌均匀，并密封储存1个月，得到地龙蛋白多肽混合酒；

所述地龙蛋白多肽为分子量介于1500-2500Da的地龙蛋白多肽，该地龙蛋白多肽由如下步骤制得：

(a)浸提提取：取新鲜的蚯蚓，在水中浸泡24h，使其吐出肠道中的泥土等异物；清洗干净后，加入1.5倍体积的浓度为0.02mol/L、pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液用组织捣碎机捣碎，搅拌，在4℃条件下浸提24h，离心15min，取其上清液；

(b)蛋白质改性：步骤(1)得到的上清液，调pH值至6.3-6.5，在45-55℃下，微波处理5分钟得到改性蛋白溶液；

(c)酶解：以改性蛋白溶液为底物，调pH值至6.3-6.5，按照底物质量百分比为1.5-2％加入复合酶拌匀，然后在50-55℃下，微波处理5分钟，得到酶解液；所述复合酶为由胰蛋白酶和羧肽酶A复合而成的复合酶，所述胰蛋白酶和羧肽酶A的质量比为1.5:1。

(d)分离纯化的步骤：将酶解液降至室温，取上清液，依次用0045和002型蜂房式滤器过滤除菌,而后用中空纤维超滤柱超滤，收集滤液冷冻干燥，即得地龙蛋白多肽。所述0045型和002型蜂房式过滤器和中空纤维超滤柱购自北京旭邦膜设备有限公司；所述中空纤维超滤柱超滤的截留分子量为1500和2500Da。

(3)将步骤(1)的药材浸提液和步骤(2)的地龙蛋白多肽混合酒进行勾兑，搅拌均匀，并密封储存1个月，即得地龙蛋白多肽酒。

对比例1

与实施例1的区别在于在地龙蛋白多肽过程中，一次酶解的复合酶中胰蛋白酶和羧肽酶A的质量比不在本发明限定的范围内，即为胰蛋白酶和羧肽酶A的质量比1:1.5。

对比例2

与实施例1的区别在于在地龙蛋白多肽过程中，去除浸提提取的步骤，其余步骤与参数相同。

对比例3

与实施例1的区别在于在地龙蛋白多肽过程中，去除分离纯化的步骤，即去除0045和002型蜂房式滤器过滤、用中空纤维超滤柱超滤的步骤，其余步骤与参数相同。

下面，对本发明制备的地龙蛋白多肽的肽得率、纯度以及利尿作用进行测定与验证。

1、肽得率的测定

采用三氯乙酸(TCA)沉淀法与甲醛滴定法相结合进行测定。取10mL酶解液加10mL25％(g/g)TCA，搅匀静置半小时后在4800r/min下离心10min，所得的上清液记作上清液^TCA，分别用凯氏定氮法和甲醛滴定法测定上清液中的总氮含量和氨态氮含量，则肽氮量和肽得率按下式进行计算，结果如表1：

上清液总肽氮量＝上清液^TCA总氮量－上清液^TCA总氨态氮量，

肽得率＝上清液总肽氮含量/原料总蛋白氮含量×100％。

2、纯度的测定

以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，制成不同浓度的BSA溶液。向7支试管中分别加入5mL考马斯亮蓝染色溶液染色5min。以第1支试管中的溶液为空白对照，测定其余6支试管中溶液在595nm处的吸光度。以蛋白质质量浓度(g·L^-1)为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归分析。得到的线性回归方程为Y＝5.684X+0.142(r＝0.99)，线性范围为0-1000μg。结果表明，线性关系良好，可以用来进行蛋白质含量的测定。分别吸取实施例1-3所得的地龙蛋白多肽作为供试品，在595nm处测定吸光度，并根据标准曲线计算蛋白质含量，计算蛋白质质量分数/％，结果如表1。

表1地龙蛋白多肽的肽得率、纯度

	肽得率(％)	纯度(％)
			实施例1	56.4	66.7
实施例2	45.9	60.4
			实施例3	48.3	59.8
对比例1	33.2	40.6
			对比例2	30.9	39.8
对比例3	28.8	38.7

表1结果显示，本发明实施例1-3制备的地龙蛋白多肽的肽得率高，纯度高，可以作为添加剂或活性药物添加至到人类食品、医药、保健品等多种行业和领域，无疑对延长中药产业链，全面提高地龙产业综合效益，实现农业增效农民增收农村繁荣，对推动一带一路建设有重大意义。

3、利尿作用的验证

本申请通过动物实验测定对水负荷大鼠的排尿量的影响，证明地龙蛋白多肽酒具有利尿作用，而且具有缓释性特点，适用于长期给药，减少不良反应。

31.实验仪器

小鼠代谢笼；电子天平，精度:0.1mg。

32.实验动物与材料

昆明种小白鼠，20±2g，雌雄各半，由实验动物中心提供；蒸馏水。

33.实验方法

所有小鼠饲养条件一致，实验前3天置于同一实验室观察饲养，自由摄食与饮水，各组饲料与饮用水完全相同。小鼠随机分组，每组16只，雌雄各半，分为七组，分别为空白组，实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例1组、对比例2组、对比例3组，给药量均为60ml/kg，空白对照组给予同等体积的蒸馏水。实验前禁食不禁水12h，实验期间禁食禁水。实验前禁食不禁水12h，实验时禁食禁水。每日1次，测量7小时的尿量。重复测量6次。每次测量首先轻压小鼠下腹排尽余尿，各组小鼠灌胃给予各药，记录给药时间。将小鼠分别放入代谢笼中，每小时用电子天平称量尿液收集器1次，连续观察记录7小时。

34.实验结果

应用SPSS10·0数据处理系统，对实验数据进行成组t检验(完全随机设计计量资料两均数比较的t检验)。

表2.各药物组7小时尿量(g)

与空白组比较尿量增加有显著差异,*P<0.05,**P<0.01。

表2实验结果显示：与空白对照组比较，实施例1-3以及对比例1-3给药组均表现出一定程度的利尿活性，实施例1-3表现出明显的利尿活性，尤其是实施例1的利尿活性最为有益。另外，本发明的地龙蛋白多肽酒的利尿特性持续稳定，可长达7个小时，具有缓释性特点，适应于长期给药，减少不良反应。

而对比例1虽然有一定的利尿活性，但是其效果与实施例1-3相比，却大打折扣，这可能由于在地龙蛋白多肽过程中，酶解的复合酶中胰蛋白酶和羧肽酶A的质量比不在本发明限定的范围内导致，说明复合酶的筛选对本发明地龙蛋白多肽的提取率以及纯度有一定的影响。

而对比例2虽然有一定的利尿活性，但是其效果与实施例1-3相比，却也大打折扣，这可能由于在地龙蛋白多肽过程中，去除浸提提取步骤的缘故导致，说明超声提取对本发明地龙蛋白多肽的提取率以及纯度有一定的影响。

而对比例3虽然有一定的利尿活性，但是其效果与实施例1-3相比，却也大打折扣，这可能由于在地龙蛋白多肽过程中，去除分离纯化的步骤，即去除用0045和002型蜂房式滤器过滤的步骤和用中空纤维超滤柱超滤的缘故导致，说明超滤对地龙蛋白多肽的提取率以及纯度有一定的影响。

综上所述，在制备地龙蛋白多肽过程中，各个步骤是相辅相成的，各个步骤的综合才能得到本发明具有明显抗凝血作用的地龙蛋白多肽酒。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种地龙蛋白多肽酒，其特征在于，由如下重量份的组分制备而成：

地龙蛋白多肽1.5-2.5份、车前子8-14份、通草8-14份、泽泻5-8份、灯心草5-8份以及酒精浓度为10-15%的黄酒75-85份。

2.如权利要求1所述的地龙蛋白多肽酒，其特征在于，由如下重量份的组分制备而成：

地龙蛋白多肽2份、车前子13份、通草12份、泽泻6份、灯心草8份以及酒精浓度为10-15%的黄酒80份。

3.如权利要求1所述的地龙蛋白多肽酒，其特征在于，所述地龙蛋白多肽为分子量介于1500-2500Da的地龙蛋白多肽，该地龙蛋白多肽由如下步骤制得：

（1）浸提提取：取新鲜的蚯蚓，在水中浸泡24 h，使其吐出肠道中的泥土等异物；清洗干净后，加入1.5倍体积的磷酸盐缓冲溶液用组织捣碎机捣碎，搅拌，浸提15-30h，离心15min，取其上清液；

（2）蛋白质改性：步骤（1）得到的上清液， 调pH值至6.3-6.5，在45-55℃下，微波处理5分钟得到改性蛋白溶液；

（3）酶解：以改性蛋白溶液为底物，调pH值至6.3-6.5，按照底物质量百分比为1.5-2%加入复合酶拌匀，然后在50-55℃下，微波处理5分钟，得到酶解液；

（4）分离纯化的步骤：将酶解液降至室温，取上清液，依次用0045和002型蜂房式滤器过滤除菌, 而后用中空纤维超滤柱超滤，收集滤液冷冻干燥，即得地龙蛋白多肽。

4.如权利要求3所述的地龙蛋白多肽酒，其特征在于，在步骤（1）中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02mol/L、pH值为6.0；所述浸提条件为在4℃条件下浸提24 h。

5.如权利要求3所述的地龙蛋白多肽酒，其特征在于，在步骤（3）中，所述复合酶为由胰蛋白酶和羧肽酶A复合而成的复合酶，所述胰蛋白酶和羧肽酶A的质量比为1.5:1。

6.如权利要求3所述的地龙蛋白多肽酒，其特征在于，在步骤（4）中，所述0045型和002型蜂房式过滤器和中空纤维超滤柱购自北京旭邦膜设备有限公司；所述中空纤维超滤柱超滤的截留分子量为1500和2500Da。

7.如权利要求3所述的地龙蛋白多肽酒，其特征在于，在步骤（2）和（3）中所述微波功率为200-300w。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的地龙蛋白多肽酒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将按照配方量的车前子、通草、泽泻、灯心草配料，然后倒入部分黄酒浸提2-3个月，然后过滤，取上清液，得到药材浸提液；

（2）将地龙蛋白多肽加入至剩余黄酒中，搅拌均匀，并密封储存1个月，得到地龙蛋白多肽混合酒；

（3）将步骤（1）的药材浸提液和步骤（2）的地龙蛋白多肽混合酒进行勾兑，搅拌均匀，并密封储存1个月，即得地龙蛋白多肽酒。

9.一种如权利要求8所述的地龙蛋白多肽酒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中与步骤（2）中所述黄酒的用量比例为2:1。

10.一种如权利要求8所述的地龙蛋白多肽酒的制备方法，其特征在于，所述地龙蛋白多肽为分子量介于1500-2500Da的地龙蛋白多肽，该地龙蛋白多肽由如下步骤制得：

（1）浸提提取：取新鲜的蚯蚓，在水中浸泡24 h，使其吐出肠道中的泥土等异物；清洗干净后，加入1.5倍体积的磷酸盐缓冲溶液用组织捣碎机捣碎，搅拌，浸提15-30h，离心15min，取其上清液；

（2）蛋白质改性：步骤（1）得到的上清液， 调pH值至6.3-6.5，在45-55℃下，微波处理5分钟得到改性蛋白溶液；

（3）酶解：以改性蛋白溶液为底物，调pH值至6.3-6.5，按照底物质量百分比为1.5-2%加入复合酶拌匀，然后在50-55℃下，微波处理5分钟，得到酶解液；

（4）分离纯化的步骤：将酶解液降至室温，取上清液，依次用0045和002型蜂房式滤器过滤除菌, 而后用中空纤维超滤柱超滤，收集滤液冷冻干燥，即得地龙蛋白多肽。