CN113024662B - 一种抗糖化的胶原蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗糖化的胶原蛋白肽及其制备方法，该抗糖化的胶原蛋白肽由如下步骤制成：步骤S1总蛋白粗提物的制备；步骤S2胶原蛋白粗提物的制备；步骤S3胶原蛋白粗提物的精制；步骤S4胶原蛋白肽的制备；步骤S5抗糖化胶原蛋白肽的制备；本发明制备的抗糖化的胶原蛋白肽富含G l y‑Hyp‑Pro‑G l y‑Arg‑Pro‑G l y‑Hyp序列，分子量范围在850‑1800道尔顿之间，具有安全无毒副作用，易于消化，抗糖化，可以作为药品、保健食品和食品的原料，并且能够添加至酸性饮料中，能够用于改善皮肤水分皱并改善血管弹性。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及一种抗糖化的胶原蛋白肽及其制备方法。
背景技术
20世纪，人类平均寿命增加了30年，老化引起了研究者的巨大兴趣。老化是一种复杂的过程，有多种机制参与，包括基因组突变的累积，有毒代谢产物的堆积、激素减少及糖化导致的大分子交联等。糖化反应是一种发生于游离氨基和还原糖之间的非酶促反应，即蛋白质的糖基化反应。这一反应能够产生糖化终末产物(advancedglycationendproducts,AGE),如羧甲基赖氨酸，羧乙基赖氨酸，糖基化胶原等。由于皮肤组织真皮细胞外机质中的胶原蛋白可逆转性低，更容易与葡萄糖等代谢分子发生非酶促反应生成AGEs，对组织产生一系列不良影响，因此推测糖化在老化中发挥重要作用。
胶原蛋白肽是将大分子胶原蛋白经酶解后制成的小分子肽类产品。据研究报道，胶原蛋白肽有提高皮肤水分、减少皱纹，抗衰老等作用，但是没有关于抗糖化胶原蛋白肽的报道。
本专利试图制备一种对皮肤抗糖化起作用的胶原蛋白肽，使之能延缓组织老化，尤其对有助于糖尿病人皮肤护理和治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗糖化的胶原蛋白肽及其制备方法。
本发明要解决的技术问题：
现有的胶原蛋白肽抗糖化效果差，不利于延缓皮肤衰老、改善血管弹性、以及糖尿病人皮肤护理和治疗。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种抗糖化的胶原蛋白肽，由如下步骤制成：
步骤S1总蛋白粗提物的制备：称取原料加入氢氧化钠溶液浸泡2-4h，清洗2-3次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
步骤S2胶原蛋白粗提物的制备：将总蛋白粗提物调整pH值为2-4，加热至75-90℃，保温提胶3-8h，制得胶原蛋白粗提物；
步骤S3胶原蛋白粗提物的精制：将澄清剂加入胶原蛋白粗提物中，调整pH值为2-7，搅拌均匀后静置2-8h，制得胶原蛋白精制物；
步骤S4胶原蛋白肽的制备：将胶原蛋白精制物调节pH值为5-8，加入复合蛋白酶酶解,在温度为45-60℃的条件下，酶解2-6h，得到酶解液；
步骤S5抗糖化胶原蛋白肽的制备：将酶解液采用2KD超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，喷雾干燥后得到胶原蛋白肽；将胶原蛋白肽经离子交换树脂、凝胶柱层析纯化后，通过荧光检测糖化抑制率，得到抗糖化胶原蛋白肽。
进一步，步骤S1所述的原料为动物的皮、鳞或骨中的一种，氢氧化钠溶液的质量分数为0.5％。
进一步，步骤S3所述的澄清剂为秋葵胶，仙草胶，瓜尔豆胶以质量比1:1-3:2-6混合并静置4-6h，澄清剂的加入量为胶原蛋白粗提物质量的0.1-2％，澄清剂的pH值为2-4。
进一步，步骤S4所述的复合蛋白酶为碱性蛋白酶和风味酶组合，两种酶质量比为5:2，组合酶的加入量为胶原蛋白精制物质量的0.4％-1％，酶解pH值为7.5-8.0。
所述酶解温度为50-60℃，酶解时间为4-6h。
步骤S5所述的离子交换树脂、凝胶柱层析纯化具体步骤如下：
离子交换树脂层析：将上述胶原蛋白肽溶于双蒸水，配成浓度为10-30mg/mL的溶液，经过D113弱酸性阳离子交换树脂，流速为20-30m/h，去除带负电荷的肽和离子，再通过D301弱碱性阴离子交换树脂，流速为15-20m/h，去除带正电荷的肽和离子。
凝胶柱层析：将离子交换树脂层析后的溶液通过SephadexG-10柱层析分离，流速为0.2-1.0ml/min，洗出溶液每3min收集一管，并于280nm检测，按峰合并试管内溶液。
本发明的有益效果：本发明制备的抗糖化的胶原蛋白肽富含Gly-Hyp-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly-Hyp序列，分子量范围在850-1800道尔顿之间，具有安全无毒副作用，易于消化，抗糖化，可以作为药品、保健食品和食品的原料，并且能够添加至酸性饮料中，能够用于改善皮肤水分并改善血管弹性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种抗糖化的胶原蛋白肽，由如下步骤制成：
步骤S1总蛋白粗提物的制备：称取原料加入氢氧化钠溶液浸泡2h，清洗2次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
步骤S2胶原蛋白粗提物的制备：将总蛋白粗提物调整pH值为2，加热至75℃，保温提胶3h，制得胶原蛋白粗提物；
步骤S3胶原蛋白粗提物的精制：将澄清剂加入胶原蛋白粗提物中，调整pH值为2，搅拌均匀后静置2h，制得胶原蛋白精制物；
步骤S4胶原蛋白肽的制备：将胶原蛋白精制物调节pH值为5，加入复合蛋白酶酶解,在温度为45℃的条件下，酶解2h，得到酶解液；
步骤S5抗糖化胶原蛋白肽的制备：将酶解液采用2KD超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，喷雾干燥后得到胶原蛋白肽；将胶原蛋白肽经离子交换树脂、凝胶柱层析纯化后，通过荧光检测糖化抑制率，得到抗糖化胶原蛋白肽。
实施例2
一种抗糖化的胶原蛋白肽，由如下步骤制成：
步骤S1总蛋白粗提物的制备：称取原料加入氢氧化钠溶液浸泡3h，清洗3次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
步骤S2胶原蛋白粗提物的制备：将总蛋白粗提物调整pH值为3，加热至80℃，保温提胶5h，制得胶原蛋白粗提物；
步骤S3胶原蛋白粗提物的精制：将澄清剂加入胶原蛋白粗提物中，调整pH值为5，搅拌均匀后静置5h，制得胶原蛋白精制物；
步骤S4胶原蛋白肽的制备：将胶原蛋白精制物调节pH值为7，加入复合蛋白酶酶解,在温度为50℃的条件下，酶解4h，得到酶解液；
步骤S5抗糖化胶原蛋白肽的制备：将酶解液采用2KD超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，喷雾干燥后得到胶原蛋白肽；将胶原蛋白肽经离子交换树脂、凝胶柱层析纯化后，通过荧光检测糖化抑制率，得到抗糖化胶原蛋白肽。
实施例3
一种抗糖化的胶原蛋白肽，由如下步骤制成：
步骤S1总蛋白粗提物的制备：称取原料加入氢氧化钠溶液浸泡4h，清洗3次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
步骤S2胶原蛋白粗提物的制备：将总蛋白粗提物调整pH值为4，加热至90℃，保温提胶8h，制得胶原蛋白粗提物；
步骤S3胶原蛋白粗提物的精制：将澄清剂加入胶原蛋白粗提物中，调整pH值为7，搅拌均匀后静置8h，制得胶原蛋白精制物；
步骤S4胶原蛋白肽的制备：将胶原蛋白精制物调节pH值为8，加入复合蛋白酶酶解,在温度为60℃的条件下，酶解6h，得到酶解液；
步骤S5抗糖化胶原蛋白肽的制备：将酶解液采用2KD超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，喷雾干燥后得到胶原蛋白肽；将胶原蛋白肽经离子交换树脂、凝胶柱层析纯化后，通过荧光检测糖化抑制率，得到抗糖化胶原蛋白肽。
实施例4
一种抗糖化的胶原蛋白肽，由如下步骤制成：
步骤S1：称取罗非鱼鱼皮100g切成小块，加入2000mL质量分数0.5％的氢氧化钠溶液浸泡4小时，清洗3次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
步骤S2：将总蛋白粗提物调整pH值为2.5，加热至90℃，保温提胶6h，制得胶原蛋白粗提物；
步骤S3：称取1g秋葵胶，3g仙草胶，5g瓜尔豆胶,加入胶原蛋白粗提物中，调整pH值为2.5，搅拌均匀后静置6h，制得胶原蛋白精制物；
步骤S4：将胶原蛋白精制物调整pH值为8.0，温度为60℃，加入0.5g碱性蛋白酶和0.2g风味酶，酶解时间为6h，得到酶解液；
步骤S5：将酶解液采用2KD超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，离子交换树脂层析：将上述胶原蛋白肽溶于双蒸水，配成浓度为20mg/ml的溶液，经过D113弱酸性阳离子交换树脂，流速为20m/h，去除带负电荷的肽和离子，再通过D301弱碱性阴离子交换树脂，流速为15m/h，去除带正电荷的肽和离子，将上述溶液通过SephadexG-10柱层析分离，流速为0.6ml/min，得到的组分荧光检测糖化抑制率，得到抗糖化胶原蛋白肽，喷雾干燥后得到粉末状产品，HPLC-MS检测该类肽富含Gly-Hyp-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly-Hyp序列，分子量范围在850-1800道尔顿之间。
得到的抗糖化胶原蛋白肽溶液浓度10％，调整pH2.5，在121℃，加热30min，溶液澄清透明，无任何絮凝和沉淀，适用于酸性饮料。
多肽序列如下表1所示；
表1
实施例4
市购胶原蛋白肽(北京盛美诺生物技术有限公司提供)，实施例3中得到抗糖化胶原蛋白肽，按照抗糖化能力评价方法进行实验，结果如下；
抗糖化能力评价：采用BSA-果糖模拟反应体系，将1mL果糖溶液(1.5mol/L)与1mL胶原蛋白肽组分溶液混合，37℃孵育2h后，加入1mL30mg/mLBSA溶液，以上反应物均用50mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲液(含有0.1％叠氮化钠)溶解，用同质量浓度的氨基胍溶液代胶原蛋白肽各组分溶液作为阳性对照组，用磷酸盐缓冲液代替胶原蛋白肽各组分溶液作为空白组，用磷酸盐缓冲液代替果糖溶液作为BSA、胶原蛋白肽共孵育组，将各样品于生化培养箱中37℃孵育6d后，在激发波长370nm、发射波长440nm条件下测定各样品的荧光强度，胶原蛋白肽对荧光性AGEs生成的抑制率R通过以下公式进行计算。
R/％＝(1-FA/FB)*100
式中：FA为各样品组的荧光强度；FB代表空白组的荧光强度。
将抗糖化能力最强组分采用HPLC－MS检测其中肽含量，发现其中富含Gly-Hyp-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly-Hyp序列，分子量范围在850-1800道尔顿之间。进行真空冻干或喷雾干燥，得到可改善血管弹性的胶原蛋白肽。
HPLC－MS检测方法：ZORBAXSB-C18色谱柱(2.1mm×150mm，5μm)；流动相A-水(0.1％TFA)，B-乙腈(0.1％TFA)；梯度洗脱，0-7min，5％-20％B；7-50min，20％-32％B；50-90min，32％-72％B；进样量50μL；流速0.2mL·min-1。喷雾电压4.5kV；毛细管温度300℃；鞘气(N2)253kPa；正离子模式，一级质谱扫描范围m/z300-1500，精确质量数扫描(Zoomscan)和二级质谱(MS/MS)扫描均为数据依赖型扫描(DataDependentScan)；动态排除次数1；动态排除时间0.5min；二级质谱碰撞能量35％。
实施例4制备的抗糖化胶原蛋白肽的糖化抑制率为98％，市购胶原蛋白肽的糖化抑制率为23％。
实施例5
以野生型AB品系斑马鱼为研究对象，通过蛋黄粉、胆固醇和葡萄糖饲喂斑马鱼，可使斑马鱼血液中葡萄糖含量快速升高，糖化血红蛋白是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物，检测其含量可以客观评价抗糖化效果。
饲喂市购胶原蛋白肽(北京盛美诺生物技术有限公司提供)以及实施例4中得到抗糖化胶原蛋白肽，结果如下表2所示；
表2
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种抗糖化的胶原蛋白肽，其特征在于：由如下步骤制成：
步骤S1总蛋白粗提物的制备；
步骤S2胶原蛋白粗提物的制备；
步骤S3胶原蛋白粗提物的精制；
步骤S4胶原蛋白肽的制备；
步骤S5抗糖化胶原蛋白肽的制备；
具体包括如下步骤：
步骤S1总蛋白粗提物的制备：称取原料加入氢氧化钠溶液浸泡2-4h，清洗2-3次，加入软化水，在研磨机中匀浆至糊状，制得总蛋白粗提物；
步骤S2胶原蛋白粗提物的制备：将总蛋白粗提物调整pH值为2-4，加热至75-90℃，保温提胶3-8h，制得胶原蛋白粗提物；
步骤S3胶原蛋白粗提物的精制：将澄清剂加入胶原蛋白粗提物中，调整pH值为2-7，搅拌均匀后静置2-8h，制得胶原蛋白精制物；
步骤S4胶原蛋白肽的制备：将胶原蛋白精制物调节pH值为5-8，加入复合蛋白酶酶解,在温度为45-60℃的条件下，酶解2-6h，得到酶解液；
步骤S5抗糖化胶原蛋白肽的制备：将酶解液采用2KD超滤膜过滤，再通过纳滤去除无机盐和水溶性游离氨基酸，喷雾干燥后得到胶原蛋白肽；将胶原蛋白肽经离子交换树脂、凝胶柱层析纯化后，通过荧光检测糖化抑制率，得到抗糖化胶原蛋白肽；
步骤S3所述的澄清剂为秋葵胶，仙草胶，瓜尔豆胶以质量比1:1-3:2-6混合并静置4-6h，澄清剂的加入量为胶原蛋白粗提物质量的0.1-2％，澄清剂的pH值为2-4；
步骤S1所述的原料为罗非鱼皮；
步骤S4所述的复合蛋白酶为碱性蛋白酶和风味酶组合，两种酶质量比为5:2，组合酶的加入量为胶原蛋白精制物质量的0.4％-1％，酶解pH值为7.5-8.0。
2.根据权利要求1所述的一种抗糖化的胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：氢氧化钠溶液的质量分数为0.5％。
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