NO318552B1 - Hydroksyprolinrike proteiner og farmasoytiske og kosmetiske formuleringer inneholdende dem - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører hydroksyprolinrike glykoproteiner som kan isoleres ved syrealkoholekstraksjon fra Gingko biloba eller Lycopersicum esculentum-celler i henhold til en fremgangsmåte som omfatter de trekk som er an-gitt i krav 1, og hvor disse hydroksyprolinrike glykoproteiner har følgende karakteristiske egenskaper: midlere molekylvekt 20000 Dalton med variasjonsintervallet 12000-38000, bestemt ved hjelp av gelpermeasjon og elektroforese;

høy oppløselighet i vann.

Noen glykoproteiner av animalsk opprinnelse, så som kollagen og proteoglykaner, er kjent for å ha en velgjørende innvirkning på huden når de appliseres topikalt som sådanne eller inkorporeres i egnede formuleringer.

Kollagen, som er et glykoprotein rikt på prolin og hydroksyprolin, er særlig anvendt som sådant eller kombinert med andre polypeptidbaser for behandling av rynker og andre uestetiske skader forbundet med dårlig hudhydrering og elastisitet. Den animalske opprinnelse av kollagen begren-ser imidlertid dens anvendelse pga. risikoen for kontamine-ring fra viruser og toksiner. Skjønt forbindelsene av vegetabilsk opprinnelse ikke medfører disse risikoer, har deres anvendelse hittil i kosmetiske midler vært ganske be-grenset: det er for eksempel kjent kosmetiske formuleringer som inneholder råekstrakter av sådanne planter som aloe eller også hele opphakkede grønnsaker så som avokado.

Vegetabilske glykoproteiner, kalt ekstensiner, som fremstilles fra vegetabilske celler i proliferasjonsstadiet og har en lignende struktur som animalsk kollagen, er kjent. EP-A-0 533 4078 beskriver kosmetisk anvendelse av ekstensiner som har en midlere molekylvekt over 100000 Dalton. Ekstraksjonsmetodene for ekstensiner som er beskrevet opp-til dags dato, hvilke innbefatter ekstraksjon av vegetabilske materialer av forskjellig opprinnelse ved hjelp av vandige saltoppløsninger, etterfulgt av rensing med sterke syrer, så som trikloreddiksyre, gjør det imidlertid ikke mulig å erholde egnede produkter for kosmetika, pga. pro-blemer vedrørende oppløselighet, stabilitet, reproduserbar-het og konsistens når det gjelder deres kjemisk-fysikalske egenskaper.

Det er nå blitt funnet at det er mulig å oppnå hydroksyprolinrike glykoproteiner som strukturelt ligner de ovennevnte ekstensiner, men de har en lavere molekylvekt og høyere oppløselighet i sure vannoppløsninger, ved hjelp av en fremgangsmåte som omfatter in vitro dyrking av celler av utvalgte planter og ekstraksjon med syrealkoholløsninger av cellene dyrket i et egnet medium.

Glykoproteinene som kan fremstilles ifølge oppfinnelsen, har hydratiserende, filmdannende, tonende og cicatrizante egenskaper som er bedre enn kollagenets. Glykoproteinene ifølge denne oppfinnelse, kan derfor anvendes i kosmetiske og dermatologiske formuleringer for å behandle tørr hud, psoriasis, ikteosis, flass, keratose, rynker, akne, eksem, inflammatorisk dermatose, aldring av huden og alle andre applikasjoner hvor animalsk kollagen er blitt foreslått anvendt .

De vandige oppløsninger av glykoproteinene ifølge oppfinnelsen, forblir stabile uten polymerisasjon av glykoproteinene som fører til dannelse av uløselige produkter. I tillegg er viskositeten i disse løsninger spesielt høy og ikke avhengig av konsentrasjonene; 0,1 % konsentrasjonen har overraskende den samme filmdannende og hydratiserende kraft som 1 % kollagen eller 5 % vegetabilske albuminløs-ninger.

Det vegetabilske materialet som skal ekstraheres, erholdes fra fermenteringskulturer av Gingko biloba og Lycopercium esculentum-celler. Cellekulturteknikkene er konvensjonelle og innbefatter suspensjonskulturen utgående fra kalluskul-turer fra forskjellige deler av plantene, så som blader, bark, røtter, stammen eller frøene, som beskrevet av Dobbs and Roberts, "Experiments in Plant Tissue Culture", 2nd ed. Cambridge University Press, New York, 1985.

Det vegetabilske vev i kallus anvendes etter sterilisering og eventuelt tilsetning av antibakteriske midler normalt som inoculum av egnede flytende kulturmedier som beskrevet i ovennevnte veiledning av Dobbs og Roberts. Et spesielt egnet medium for denne oppfinnelse er Murashige and Skoog-mediet. Tilsetningen av spesifikke additiver, så som prolin, reduksjonsmidler, etylen eller forbindelser som er i stand til å frigi etylen, så som Ethephon eller L-amino-syklopropankarboksylsyre, kan være egnet for å øke produk-tiviteten i de ønskede glykoproteiner.

Anvendelsen av naftyeddiksyre som auxin, 6-(y-Y-dimetyl-amino)purin som cytokinin, vitaminer og 3 % sakkarose som karbonkilde er foretrukket. Tilsetningen av vitamin C kan være velegnet, avhengig av det valgte materiale, for å for-hindre at sluttproduktet blir brunt.

Fermenteringstiden kan variere fra 3 til 12 dager og er fortrinnsvis mellom 5 og 6 dager. Når fermenteringen er ferdig, sentrifugeres kulturmediet og cellemassen ekstraheres ved hjelp av alkoholer, fortrinnsvis etanol, i nærvær av fortynnede mineralsyrer, fortrinnsvis saltsyre eller svovelsyre. Denne fremgangsmåte inaktiverer noen enzymer som kan være skadelig for stabiliteten av glykoproteinene ifølge oppfinnelsen, spesielt hydrofenoloksydase og tyro-sinoksydase som begunstiger polymerisasjonen av glykoproteiner med påfølgende dannelse av uløselige produkter.

Alkoholekstraksjonen i nærvær av mineralsyrer gjør det mulig å fullstendig ekstrahere basiske glykoproteiner og har vist seg å være ekstremt selektivt for dette formål. Andre vannblandbare alkoholer, så som metanol eller isopropanol kan anvendes i tillegg til etanol. De resulterende hydroalkoholiske ekstrakter nøytraliseres og konsentreres deretter og oppvarmes til en temperatur av 70 °C til 100

°C, fortrinnsvis ca. 80 °C, inntil de denaturerte proteiner er fullstendig utfelt. Suspensjonen klargjøres deretter ved konsentrasjon og væsken utsettes for fraksjonell ultrafiltrering for å fjerne høymolekylære og lavmolekylære substanser. Ultrafiltreringen utføres ved hjelp av polysul-fonmembraner som har en "cut-off" på 10000 Dalton til 40000 Dalton, så som Centricon<R> eller Romicon<R>, hvis fibre kan være hule eller alternativt spiralrullet. Det resulterende filtrerte produkt elektrodialyseres for å fjerne ønskede substanser, så som salter og lavmolekylære sukkere. Etter filtrering og dialyse kan den resulterende løsning anvendes som sådan i kosmetiske eller farmasøytiske preparater, eller den kan konsentreres til et mindre volum og deretter frysetørkes eller atomiseres.

Den analytiske karakterisering av produktene ifølge oppfinnelsen utføres ved gelpermeasjon under anvendelse av en høytrykksvæskekromatograf bestående av en Waters pumpeenhet og utstyrt med en Ultrahydrogen Linear Waters<R->kolonnebat-teri 30 cm x 0,5 cm og Wat3ers UV-absorpsjonsdetektor, modell 484. En vandig oppløsning inneholdende 0,067 M kaliumfosfat, 0,1 M NaCl og 6 x IO-<4> M NaN3 ble anvendt som eluent. Glykoproteinprøvene som skal analyseres oppløses i den samme eluentløsning (3 mg/10 ml), og skalare mengder av substansen samt av referansesubstansene valgt som molekylvekt mellom Cytochrome C (12400 Daltons) og dekstran blått (2000000 Dalton); alternativt eller samtidig kan produktene eller deres mellomprodukter bestemmes ved elektroforese på 12,5 % polyakrylamidgel og 4 % stablegel. Prøvene som skal analyseres oppløses i en buffer inneholdende SDS og 0,1 % merkaptoetanol mens man deponerer mengder mellom 100 mg og 300 mg. Migrasjonen utføres ved en konstant strøm på 20 mA i 4 timer. En kalibreringskurve tegnes med 5 standard-vekter (7kD, 14kD, 24kD, 54kD og 66kD). Vekter på 22,5kD og 25kD beregnes fra denne kalibreringskurve for de to hovedbåndene og vekter på 31kD og 34kD beregnet for de mindre intense bånd. Fremgangsmåten som er beskrevet her, gjør det mulig å oppnå blandinger av produkter med sammen-lignbar molekylvekt og sammenlignbare aminosyresammenset-ninger fra de forskjellige celleeksplanatater utgående fra forskjellige planter. Resultatene av aminosyreanalysen av glykoproteiner ekstrahert fra Gingko bilobaceller er vist som et eksempel.

Ovennevnte data refererer til prosentandelen av den totale mengde aminosyrer som foreligger i glykoproteinblandingen. Sukkerene i blandingen er arabinose og galaktose. Andelen av aminosyrer i forhold til sukkere er gjennomsnittlig 2:1 for de forskjellige produkter.

Som nevnt ovenfor kan produktene ifølge oppfinnelsen, anvendes både på det farmasøytiske og kosmetiske området.

For det farmasøytiske området kan produktet inkorporeres i geler eller salver eller påføres på medisinert gasbind for spesifikk behandling av forbrenning eller sår. I dette tilfellet utsettes produktet vanligvis for sterilisering eller sterile filtreringer og frysetørkes.

De kosmetiske og dermatologiske preparater ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ifølge tradisjonelle metoder. Eksempler på administrasjonsformer innbefatter vandige sprayblandinger, lotioner, oppløsninger, emulsjoner, geler, salver og kremer.

De kosmetiske og dermatologiske preparater ifølge oppfinnelsen kan inneholde hydroksyprolinrike glykoproteiner i vektandeler på ca. 0,01 % eller ca. 50 %, fortrinnsvis fra 0,05 % til 5 %, samt konvensjonelle eksipienser. Med den høye stabilitet som glykoproteinene i denne oppfinnelse har, kan farmasøytiske og kosmetiske preparater inneholdende mer enn 50 % oppløselige hydroksyprolinrike glykoproteiner erholdes.

Glykoproteinene ifølge oppfinnelsen, kan tilsettes til far-masøytiske og kosmetiske preparater som sådanne eller mik-roinnkapslet slik at de tilveiebringer en langtids hydratiserende virkning. Mikrokapslene kan enten være hydrofile eller lipofile. Preparatene ifølge oppfinnelsen kan innbe-fatte andre aktive prinsipper med komplementær eller nyttig aktivitet for de ønskede formål.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved følgende eksempler:

Eksempel 1

Fremstilling av kallus og flytende kultur av Gingko biloba for produksjon av glykoproteiner

Et eksplantat av unge blad av Gingko biloba fremstilles ved å vaske bladene i en 0,1 % Tween 80(R,-oppløsning. Blad-platene seksjoneres i fraksjoner på ca. 0,5 cm og forhånds-steriliseres i 1 minutt med 75 % etanol. Steriliseringen fullføres deretter med en 2 % natriumhypoklorittløsning og tre gangers vasking av eksplantatet i sterilt vann. De resulterende eksplantater overføres til en Petri-skål i Murashige & Skoog-medium inneholdende 3 % sakkarose med tilsetning av Lynsmeyer & Skoog-vitaminer og hormoner så som 2,4-diklorfenoksyeddiksyre og naftyleddiksyre. Produktene inkuberes i mørke ved 23 °C i 20 dager. Mot slutten av denne periode oppnås skjøre kalli som vokser lett og be-veges i kontinuerlige rader ved hjelp av underkulturer ved de samme betingelser, idet de kan anvendes for videre opp-formering i et flytende medium. Disse kalli anvendes for å inokulere Erlenmeyerkolber inneholdende 200 ml Murashige & Skoog-medium, med tilsetning av naftyleddiksyre og 6-(y~Y~ dimetylamino)purin, Lynsmeyer & Skoog-vitaminer og 3 % sakkarose som karbonkilde. Flaskene inkuberes under omrøring i kontinuerlig lys i 4 dager og deretter høstes cellebio-massen for ekstraksjon av glykoproteiner.

Eksempel 2

Preparering av glykoproteiner fra Gingko bilobaceller

5 liter av kulturen erholdt i henhold til eksempel 1 sentrifugeres ved lav hastighet, og de høstede celler (1,5 kg ferskvekt) ekstraheres med 1,5 liter 70 % etanol inneholdende 1 % svovelsyre. Ekstraksjonen gjentas to ganger, hvorved de basiske glykoproteiner utvinnes kvantitativt. Etter nøytralisering filtreres ekstraktene for å fjerne en-hver turbiditet og konsentreres under vakuum ved 50 °C inntil etanolen er fullstendig fjernet. Det vandige konsen-trat oppvarmes ved 85 °C i 30 minutter og sentrifugeres igjen for å fjerne feiningen som kastes. Den resulterende klare løsning ultrafiltreres ved hjelp av en Centricon<R->membran med "cut-off" 40000 Dalton for å utelukke høyere molekylvekter.

Det filtrerte produkt ultrafiltreres deretter ved hjelp av en hulfibermembran med "cut-off" 10000 Dalton for å fjerne ikke-glykoprotein, lavmolekylære substanser. Filtratet utsettes deretter for dialyse og konsentreres til 1 % fast residuum. 1,5 liter av et noe viskøst produkt erholdes, og dette kan anvendes som sådant i kosmetiske formuleringer.

I elektroforeseanalysen inneholdt produktet 6 bånd, og 4 av dem hadde molekylvekter på 16000, 22000, 33000 og 36000 Dalton.

Eksempel 3

Fremstilling av glykoproteiner fra Lycopersicum esculentum Idet man følger fremgangsmåten i eksempel 1 fremstilles en cellemasse fra sterile knopper av Lycopersicum esculentum i en 14 liters fermenter inneholdende 10 liter Murashige & Skoog-medium tilsatt metyleddiksyre og 6-(y,Y~dimetyl-amino)-purin, Lynsmeyer & Skoog-vitaminer og 3 % sakkarose som karbonkilde. Fermenteringen utføres i 5 dager ved 23 °C under omrøring ved 150 rpm i nærvær av gjærekstrakt i 0,05 % konsentrasjon og med en konsentrasjon på ca. 70 % oppløst oksygen. Mot slutten av fermenteringen oppsamles væsken og mikrofiltreres gjennom en 0,2 um keramisk membran for å konsentrere cellene. Noe isopropanol inneholdende 0,5 % saltsyre tilsettes til den således erholdte celle-pasta, og metoden beskrevet i eksempel 2 anvendes på ekstraktene. 3,5 liter av en løsning erholdes med 0,5 % tørt residuum. Analysen av de lyofiliserte løsninger ga et inn-hold på 10 % prolin, henholdsvis 31 % hydroksyprolin.

Eksempel 4

Kosmetisk formulering

100 g olje/vannemulsjon inneholder:

Eksempel 5

Kosmetisk formulering

100 g O/W emulsjon inneholder:

Claims (3)

1. Hydroksyprolinrike glykoproteiner {HPRG-forbindelser) som kan isoleres ved syrealkoholekstraksjon fra Gingko biloba eller Lycopersicum esculentum-celler i henhold til en fremgangsmåte som omfatter: a) dyrking av Gingko biloba og Lycopersicum esculentum-celler i et flytende medium i en tid fra 3 til 12 dager; b) ekstraksjon av cellemassen med vannblandbare alkoholer i nærvær av fortynnede mineralsyrer; c) nøytralisering, konsentrasjon og oppvarming av ekstraktene ved temperaturer mellom 70 °C og 100 °C; d) sentrifugering med fjerning av presipitatet, fraksjo- nær ultrafiltrering og dialyse av supernatanten, idet HPRG-forbindelsene har de følgende særtrekk: en midlere molekylvekt på 20000 Dalton med varie- rende intervaller fra 12000 til 38000 Dalton, bestemt ved hjelp av gelpermeasjon og elektroforese; høy oppløselighet i vann.

2. Kosmetiske og farmasøytiske preparater inneholdende glykoproteinene ifølge krav 1, som aktivt prinsipp med hyd-rerende, filmdannende, tonende og cicatrizante egenskaper.

3. Preparater ifølge krav 2, i form av vandige sprayløs-ninger, lotioner, oppløsninger, emulsjoner, geler, salver, kremer og medikerte gassbind.