PL182055B1

PL182055B1 - Sposób wytwarzania glikoprotein bogatych w hydroksyproline oraz kompozycja farmaceutyczna i kosmetyczna zawierajaca te proteiny PL PL PL

Info

Publication number: PL182055B1
Application number: PL95321004A
Authority: PL
Inventors: Ezio Bombardelli; Cesare Ponzone
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 1994-12-28
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 2001-10-31
Also published as: AU692654B2; US6072030A; NO972984D0; NO318552B1; HK1003652A1; HU220456B1; CN1109106C; CZ295489B6; CN1171822A; CZ202497DA3; GR3035842T3; JP2997063B2; CA2208960C; DE69520693D1; PT800585E; DK0800585T3; ITMI942663A0; ITMI942663A1; ATE200518T1; FI972757A

Abstract

1. Sposób wytwarzania glikoprotein bogatych w hydroksyproline (HPRg), znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle komórek milorzebu (Gingko bilboa) i pomidora (Lycopersicum esculentum) w srodowisku cieklym w ciagu 3-12 dni, po czym ekstrahuje sie mase komórkowa za pomoca alkoholu mieszajacego sie z woda, w obecnosci rozcienczonych kwasów mineral- nych, nastepnie neutralizuje sie, zateza i ogrzewa ekstrakty w zakresie temperatur 70-100°C, wiruje, i przeprowadza ultrafiltracje frakcjonowana i dialize uzyskanego filtratu. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania glikoprotein bogatych w hydroksyprolinę, które mogą być otrzymane ze źródeł roślinnych, a także ich farmaceutyczne i kosmetyczne zastosowanie.

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania glikoprotein bogatych w hydroprolinę, na drodze kwasowo-alkoholowej ekstrakcji hodowli komórek miłorzębu (Gingko bilboa) i pomidora (Lycopersicum esculentum), przy czym otrzymane glikoproteiny charakteryzują się następującymi właściwościami:

- śfedma masa czątteczkowa - 20000 w zmiennym pzzedziałe 12000 do 38000, określonym metodą permeacj i żelowej i elektroforezy,

- wysoka rozpuszczalność w wodnych roztworach kwasów'.

Niektóre glikoproteiny pochodzenia zwierzęcego, takie jak kolagen i proteoglikany, są znane jako substancje wywołujące korzystne działanie na skórę, gdy są podawane miejscowo jako takie lub inkorporowane w odpowiednich kompozycjach.

Kolagen, który jest glikoproteiną bogatą w prolinę i hydroksyprolinę, jest stosowany zwłaszcza jako taki lub łącznie z innym podłożem polipeptydowym do leczenia zmarszczek i innych nieestetycznych skaz związanych ze słabym uwodnieniem i elastycznością skóry. Jednak zwierzęce pochodzenie kolagenu ogranicza jego zastosowanie z powodu ryzyka zakażenia wirusami i toksynami.

Mimo, że związki pochodzenia roślinnego nie pociągają za sobą takiego ryzyka, dotychczas ich zastosowanie w kosmetyce było raczej ograniczone. Na przykład, były znane kompozycje kosmetyczne zawierające surowe ekstrakty takich roślin jak aloes, lub nawet posiekanych całych roślin, takich jak awokado.

182 055

Znane są glikoproteiny roślinne (ang. extensines), które są wytwarzane z komórek roślinnych w stadium rozmnażania wegetatywnego i mają strukturę podobną do kolagenu zwierzęcego.

Opis EP-A-0 533 4078 ujawnia zastosowanie kosmetyczne „extensines” posiadających średni ciężar cząsteczkowy około 100000. Jednak opisane dotąd metody ich ekstrakcji, które dotyczą ekstrakcji materiałów roślinnych o różnorodnym pochodzeniu za pomocą wodnych roztworów soli, a następnie oczyszczania za pomocą mocnych kwasów, takich jak trichlorooctowy, nie pozwalają na otrzymanie produktów nadających się do zastosowania w kosmetyce z powodu problemów związanych z ich rozpuszczalnością, stabilnością, powtarzalnością i konsystencją.

Obecnie stwierdzono, że jest możliwe otrzymanie glikoprotein bogatych w hydroksyprolinę, strukturalnie podobnych do opisanych wyżej związków, ale charakteryzujących się mniejszą masą cząsteczkową i wyższą rozpuszczalnością w wodnych roztworach kwasów, za pomocą postępowania obejmującego in vitro hodowlę komórek wyselekcjonowanych roślin, a następnie ekstrakcję kwasowo-alkoholową komórek, które rosły w odpowiednim środowisku.

Sposób wytwarzania bogatych w hydroksyprolinę glikoprotein (HPRg) według wynalazku charakteryzuje się tym, że prowadzi się hodowlę komórek miłorzębu (Gingko bilboa) i pomidora (Lycopersicum esculentum) w środowisku ciekłym w ciągu 3-12 dni, po czym ekstrahuje się masę komórkową za pomocą alkoholu mieszającego się z wodą, w obecności rozcieńczonych kwasów mineralnych, następnie neutralizuje się, zatęża i ogrzewa ekstrakty w zakresie temperatur 70-100°C, wiruje, i przeprowadza ultrafiltrację frakcjonowaną i dializę uzyskanego filtratu.

Kompozycja kosmetyczna i farmaceutyczna według wynalazku zawierająca substancje aktywne i znane środki pomocnicze, charakteryzuje się tym, że jako substancje aktywne o właściwościach nawadniających, błonotwórczych, tonizujących i zabliźniających zawiera glikoproteiny uzyskane w procesie obejmującym hodowlę komórek miłorzębu (Gingko bilboa) i pomidora (Lycopersicum esculentum) w środowisku ciekłym w ciągu 3-12 dni, ekstrakcję masy komórkowej za pomocą alkoholu mieszającego się z wodą, w obecności rozcieńczonych kwasów mineralnych, neutralizację, zatężenie i ogrzewanie ekstraktów w zakresie temperatur 70-100°C, wirowanie, ultrafiltrację frakcjonowaną i dializę, przy czym HPRg ma średni ciężar molekularny 20000, zawarty w zmiennym przedziale od 12000 do 38000 określonym metodą permeacji żelowej i elektroforezy.

Kompozycja według wynalazku korzystnie ma postać wodnych aerozoli, lotionów, roztworów, emulsji, żelów, maści, kremów i gazików nasyconych lekarstwem.

Glikoproteiny dające się otrzymać zgodnie z wynalazkiem mają właściwości uwadniające, błonotwórcze, tonujące i zabliźniające, lepsze niż kolagen. Mogą one więc być stosowane w kosmetycznych i dermatologicznych kompozycjach do leczenia suchej skóry, łuszczycy, rybiej łuski, łupieżu, rogowatości, zmarszczek, trądziku, egzemy, zapalenia skóry, starzenia się skóry i wszystkich innych zastosowań, do których proponuje się użycie kolagenu zwierzęcego. Roztwory wodne glikoprotein według wynalazku pozostają stabilne bez polimeryzacji glikoprotein, prowadzącej do tworzenia się nierozpuszczalnych produktów-'. Dodatkowo lepkość tych roztworów jest szczególnie wysoka i nie zależy od stężenia. Stężenie 0,1% nieoczekiwanie ma taką samą zdolność tworzenia błonki i nawadniania jak 1%o kolagen lub 5% roztwór albuminy roślinnej.

Materiały roślinne do ekstrakcji są otrzymywane z fermentowanych hodowli miłorzębu 1 pomidora. Szczególnie preferowane jest stosowanie komórek gatunku miłorzębu i pomidora. Techniki hodowli komórek są konwencjonalne i obejmują zawiesinową hodowlę, rozpoczynając od hodowli nowej tkanki (kalusa) na uciętej części przed wypuszczeniem nowych pędów, różnorodnych części roślin, takich jak liście, kora, korzenie, pień lub nasiona, jak opisali Dobbs i Roberts, Experiments in Plant Tissue Culturee, Cambridge University Press,

182 055

Nowy Jork, 1985. Tkanki roślinne kalusa, następnie sterylizacja i ewentualny dodatek substancji antybakteryjnych, są zwykle stosowane do otrzymania szczepionki odpowiednich płynnych środowisk hodowlanych, jak opisano w powyższej publikacji Dobbsa i Robertsa.

Szczególnie odpowiednim środowiskiem hodowlanym dla tego wynalazku jest pożywka „Murashige i Skoog”. Dodanie właściwych dodatków, takich jak prolina, czynnik redukujący, etylen lub związki zdolne do uwalniania etylenu jak Ethephon lub kwas L-aminocyklopropanokarboksylowy, mogą być odpowiednie dla zwiększenia wydajności żądanych glikoprotein. Korzystne jest zastosowanie kwasu naftylooctowego jako auksyny, 6-(K,K-dimetylo-amino)-puryny jako cytokininy, witamin i 3% sacharozy jako źródła węgla. Odpowiedni może być dodatek witaminy C, zależnie od wybranych materiałów, aby ochronić produkt końcowy przed zbrązowieniem.

Czas fermentacji może się zmieniać w zakresie od 3 do 12 dni, korzystnie między 5 a 6 dni.

Po zakończeniu fermentacji pożywkę hodowlaną poddaje się odwirowaniu, masę komórkową ekstrahuje się alkoholem, korzystnie metanolem, w obecności rozcieńczonego kwasu mineralnego, korzystnie solnego lub siarkowego. To postępowanie inaktywuje niektóre enzymy mogące zagrażać stabilności glikoprotein według wynalazku, szczególnie polifenoloksydazę i oksydazę tyrozyny, które sprzyjają polimeryzacji glikoprotein powodującej tworzenie się nierozpuszczalnych produktów. Ekstrakcja alkoholowa w obecności kwasu mineralnego pozwala na całkowite wyekstrahowanie podstawowych glikoprotein oraz udowadnia, że jest niezwykle selektywna.

Poza etanolem mogą być stosowane inne, mieszające się z wodą alkohole, jak metanol lub izopropanol. Otrzymane ekstrakty wodno-alkoholowe neutralizuje się, a następnie zatęża i ogrzewa do temperatury 70-100°C, korzystnie około 80°C, do zakończenia wytrącania zdenaturowanego białka. Zawiesinę poddaje się klarowaniu przez zatężanie, a płyn poddaje się ultrafiltracji frakcjonowanej do usunięcia substancji o wysokim i niskim ciężarze cząsteczkowym. Ultrafiltracja jest prowadzona na membranach polisulfonowych, odpowiednich do oddzielenia substancji o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 10000 - 40000. Takimi membranami są Centricon® lub Romicon®, których włókna mogą być wydrążone, lub alternatywnie mogą być skręcone.

Właściwości analityczne produktów według wynalazku określa się metodą permeacji żelowej z zastosowaniem wysokociśnieniowego chromatografu cieczowego, obejmującego pompę Waters i zaopatrzonego w baterię kolumn Ultrahydrogel Linear Waters® o wymiarach 30 cm x 0,5 cm oraz detektor absorpcyjny Waters UV model 484.

Jako eluent stosuje się wodny roztwór zawierający 0,067 M fosforanu jednopotasowego, 0,1 M NaCl i 6 x 10⁴ M NaN₃. Próbki glikoproteiny poddawane analizie rozpuszcza się w takim samym roztworze (3 mg/10 ml) i skalarne ilości substancji, takich jak wybrane substancje wzorcowe o ciężarze cząsteczkowym mieszczącym się między Cytochromem C (12400) i błękitem dekstranowym (2000000). Alternatywnie lub jednocześnie substancje lub ich półprodukty mogą być zdefiniowane drogą elektroforezy na żelu zawierającym 12,5% poliakryloamidu i 4% żelu spiętrzonego (ang. „stacking gel”).

Analizowane próbki rozpuszcza się w roztworze buforowym SDS i 0,1% merkaptoetanolu między 100 i 300 mg. Migrację przeprowadza się przy natężeniu prądu 20 mA przez 4 godziny. Krzywą pomiarową ciągnie się przez pięć standardowych ciężarów' cząsteczkowych (7000, 14000, 24000, 54000 i 66000). Ciężary dla 22500 i 25000 są policzone z tej krzywej dla dwóch głównych pasm, zaś ciężary dla 31000 i 34000 policzono z mniej intensywnych pasm. Postępowanie opisane wyżej pozwala na otrzymywanie mieszaniny produktów o porównywalnym ciężarze cząsteczkowym i porównywalnych mieszanin aminokwasów z różnych przeszczepów komórek wychodząc z różnych roślin. Wyniki analizy aminokwasów glikoprotein wyekstrahowanych z komórek Gingko bilboa są pokazane poniżej jako przykład.

182 055

Aminokwas	Powierzchnia piku %
Asp	4,399
Glu	4,328
Hyp	17,505
Ser	7,065
Gly	6,056
Hys	1,782
Arg	2,471
Thr	4,739
Pro	10,036
Ala	8,2
Tyr	2,388
Val	6,162
Met	1,154
Ile	2,479
Leu	5,525
Phe	1,862
Lys	14,254

Powyższe dane odnoszą się do procentu całkowitej ilości aminokwasów obecnych w mieszaninie glikoprotein. Mieszanina ta zawiera cukry, takie jak arabinoza i galaktoza. Stosunek ilości aminokwasów do ilości cukrów wynosi średnio 2:1 w różnych produktach.

Jak wyżej wskazano, produkty zgodne z wynalazkiem mogą być stosowane zarówno w kosmetyce jak i farmacji. W dziedzinie farmacji produkt może być inkorporowany w żelu lub maści lub podawany na gazie nasączonej lekiem w leczeniu oparzeń lub ran. W tym przypadku produkt jest zwykle poddawany sterylizacji lub filtracji sterylnej i liofilizacji.

Preparaty kosmetyczne i dermatologiczne według wynalazku mogą być otrzymywane zgodnie z tradycyjnymi metodami. Przykłady stosowanych postaci obejmują wodne aerozole, lotiony, roztwory, emulsje, żele, maści i kremy. Preparaty kosmetyczne i dermatologiczne według wynalazku mogą zawierać glikoproteiny bogate w hydroksyprolinę w ilości około 0,01-50% wagowych, korzystnie od 0,05-5%, jak również konwencjonalne zarobki. Możliwe jest otrzymanie preparatów kosmetycznych i dermatologicznych zawierających 50% rozpuszczalnych glikoprotein bogatych w hydroksyprolinę, jeżeli glikoproteiny według wynalazku będą miały wysoką trwałość.

Glikoproteiny według wynalazku mogą być dodawane do preparatów farmaceutycznych i kosmetycznych jako takie lub w postaci mikrokapsułkowanej dla uzyskania długotrwałego działania nawadniającego. Mikrokapsułki mogą być hydrofilowe lub hydrofobowe. Preparaty według wynalazku mogą zawierać również inne aktywne składniki posiadające porównywalną lub użyteczną aktywność w pożądanych celach. Wynalazek jest dalej zilustrowany następującymi przykładami.

182 055

Przykład 1. Wytwarzanie kalusa i ciekłych hodowli miłorzębu (Gingko bilboa) do otrzymywania glikoprotein

Przeszczep młodych liści miłorzębu otrzymano przez wymywanie liści w 0,1% roztworze Tween 80®. Blaszki dzielono na frakcje ok. 0,5 cm i wstępnie sterylizowano w ciągu 1 min w 75% etanolu. Sterylizację dopełniano 2% roztworem podchlorynu sodu i trzykrotnie przemywano przeszczep sterylizowaną wodą. Uzyskane przeszczepy przenoszono do szalek Petriego na pożywkę „Murashige and Skoog” zawierającym 3% sacharozy z dodatkiem witamin i hormonów „Lynsmeyer and Skoog”, takich jak kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy i kwas naftylooctowy. Produkt inkubowano w ciemności w temperaturze 23°C przez 20 dni. W końcu tego okresu otrzymano sypkie kalusy, które rosną łatwo i są przemieszczane w ciągłych rzędach za pomocą przeszczepiania w tych samych warunkach jakie mogą być stosowane do rozmnażania w ciekłej pożywce. Kalusy te stosowano do zaszczepienia kolb Erlenmayera zawierających 200 ml pożywki „Murashige and Skoog” z dodatkiem kwasu naftylooctowego i 6(K,K-dimetylo-ammo)-puryny, witamin „Lynsmeyer and Skoog” oraz 3% sacharozy jako źródła węgla. Kolby inkubowano mieszając w ciągłym świetle przez 4 dni, po czym biomasę komórkową zbiera się dla wyekstrahowania glikoprotein.

Przykład 2. Wytwarzanie glikoprotein z komórek miłorzębu l hodowli otrzymanej zgodnie z przykładem 1 wiruje się z małą szybkością i zebrane komórki (1,5 kg świeżej masy) ekstrahuje się za pomocą 1,5 l 70% etanolu zawierającego 1% kwasu siarkowego. Ekstrakcję powtarza się dwukrotnie, po czym ilościowo zawraca się glikoproteiny podstawowe. Po neutralizacji ekstrakty filtruje się dla usunięcia wszystkich zmętnień i zatęża pod próxniią w temperaturze 50°C do chwili, g<^^ etanol zostanie całkowicie usunięty. Koncentrat wodny ogrzewa się w temperaturze 85°C przez 30 min i wiruje ponownie dla usunięcia wytrąconego osadu, który jest odrzucany. Uzyskany klarowny roztwór poddaje się ultrafiltracji z użyciem membrany Centricon^:K dla oddzielenia substancji o ciężarze cząsteczkowym do 40000 Daltonów, aby wyłączyć związki o wyższym ciężarze cząsteczkowym. Następnie filtrowany produkt poddaje się ultrafiltracji stosując membrany z wydrążonych włókien dla usunięcia nie-glikoprotein, substancji o ciężarze cząsteczkowym do 10000 Daltonów.

Produkt filtrowany następnie poddaje się dializie i zatęża do 1% stałej pozostałości. Otrzymuje się 1,5 l lekko lepkiego produktu, który może być stosowany jako taki w kompozycjach kosmetycznych. Analiza elektroforetyczna wykazała, że produkt zawierał 6 związków, z których cztery mają ciężary cząsteczkowe: 16000; 22000; 33000 i 36000.

Przykład 3. Wytwarzanie glikoprotein z pomidora (Lycopersicum esculentum)

Stosując się do postępowania zgodnego z przykładem l przygotowano masę komórkową ze sterylnych oczek (zawiązków) pomidora w 14 l fermentorze zawierającym 101 pożywki Murashige and Skoog z dodatkiem kwasu naftylooctowego i 6(K,K-dimetylo-amino)-puryny, witamin „Lynsmeyer and Skoog” i 3% sacharozy jako źródła węgla. Fermentację prowadzono przez 5 dni w temperaturze 23°C mieszając z szybkością. 150 obrotów na minutę w obecności ekstraktu drożdży o stężeniu 0,05% oraz rozpuszczonego tlenu o stężeniu w przybliżeniu 70%. W końcu fermentacji bulion zebrano i poddano mikrofiltracji przez membranę ceramiczną 0,2 pm dla zatężenia komórek. Do pasty komórkowej otrzymanej w ten sposób dodano trochę izopropanolu zawierającego 0,5% kwasu solnego i metodę opisaną w przykładzie 2 zastosowano do ekstraktów. Otrzymano 3,5 l roztworu z 0,5% suchej pozostałości. Analiza liofilizowanych roztworów wykazała zawartość odpowiednio 10% proliny i 31% hydroksyproliny.

182 055

Przykład 4. Kompozycja kosmetyczna

100 g O/W emulsji zawiera:
roztwór z przykładu 2 lub 3	10,0 g
acetylowany alkohol lanolinowy PEG-10	2,0 g
alkohol cetylowo-stearylowy	1,5 g
palmitynian cetylowy	2,0 g
kwas stearynowy	7,0 g
ester cetylowy kwasu kaprylowego	7,5 g
fosforan cetylowo-potasowy	0,5 g
środki konserwujące	ile potrzeba
aromat	ile potrzeba
woda oczyszczona	ile potrzeba do 100 g

Przykład 5. Kompozycja kosmetyczna

100 g O/W emulsji zawiera:
roztwór z przykładu 2 lub 3	10,0 g
glukozyd cetylowy-stearylowy	5,0 g
olej jojoba	10,0 g
mirystynian izopropylowy	8,0 g
dimeticon	0,5 g
antyutleniacz	ile potrzeba
środki konserwujące	ile potrzeba
aromat	ile potrzeba
woda oczyszczona	ile potrzeba do 100 g

182 055

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania glikoprotein bogatych w hydroksyprolinę (HPRg), znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek miłorzębu (Gingko bilboa) i pomidora (Lycopersicum esculentum) w środowisku ciekłym w ciągu 3-12 dni, po czym ekstrahuje się masę komórkową za pomocą alkoholu mieszającego się z wodą, w obecności rozcieńczonych kwasów mineralnych, następnie neutralizuje się, zatęża i ogrzewa ekstrakty w zakresie temperatur 70-100°C, wiruje, i przeprowadza ultrafiltrację frakcjonowaną i dializę uzyskanego filtratu.
2. Kompozycja kosmetyczna i farmaceutyczna zawierająca substancje aktywne i znane środki pomocnicze, znamienna tym, że jako substancje aktywne o właściwościach nawadniających, błonotwórczych, tonizujących i zabliźniających zawiera glikoproteiny uzyskane w procesie obejmującym hodowlę komórek miłorzębu (Gingko bilboa) i pomidora (Lycopersicum esculentum) w środowisku ciekłym w ciągu 3-12 dni, ekstrakcję masy komórkowej za pomocą alkoholu mieszającego się z wodą, w obecności rozcieńczonych kwasów mineralnych, neutralizację, zatężenie i ogrzewanie ekstraktów w zakresie temperatur 70-100°C, wirowanie, ultrafiltrację frakcjonowaną i dializę, przy czym HPRg ma średni ciężar molekularny 20000, zawarty w zmiennym przedziale od 12000 do 38000 określonym metodą permeacji żelowej i elektroforezy.
3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że ma postać wodnych aerozoli, lotionów, roztworów, emulsji, żelów, maści, kremów i gazików nasyconych lekarstwem.

* * *