CN1109106C - 富羟脯氨酸蛋白及含有这种蛋白的药用和化妆用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及富羟脯氨酸糖蛋白，可以通过酸性醇萃取法从红豆杉、银杏、蕃茄和胡萝卜细胞培养物中获得这种糖蛋白，其具有以下特征：平均分子量为20,000Da，波动范围为12,000～38,000，是通过凝胶渗透和电泳测得；高的水溶性。

Description

富羟脯氨酸蛋白及含有这种蛋白的药用和化妆用组合物

本发明涉及富羟脯氨酸糖蛋白，这种蛋白可以从植物材料中获得，还涉及它的药用和化妆用用途。

更确切地讲，本发明涉及富羟脯氨酸糖蛋白，可以通过酸性醇萃取法从红豆杉(Taxus spp.)、银杏(Gingko biloba)、番茄(Lycopersicum esculentum)和胡萝卜(Daucus carota)细胞培养物中获得这种蛋白，其具有以下特征：-平均分子量20,000Da，波动范围为12,000-38,000，通过凝胶渗透和电泳测得；-可溶于酸性水溶液。

已知源于动物的某些糖蛋白，如胶原和蛋白聚糖在原样或掺入合适的组合物中后进行表面涂敷时能产生有益作用。

胶原是一种富脯氨酸和羟脯氨酸的糖蛋白，可将其直接用于或与其它多肽基质混合后用于治疗与不良的皮肤水化和弹性相关的皱纹和其它有损容貌的缺陷。不过，源于动物的胶原的应用是受限制的，因为其中存在被病毒和毒素污染的危险。尽管源于植物的化合物不存在这种风险，但迄今为止其在化妆品中的应用却十分有限：例如，已知化妆用组合物含有诸如芦荟之类的植物的粗提物或诸如鳄梨之类的切碎的完整植物。

已了解到，被称为伸展蛋白的植物糖蛋白是由处于增殖期的植物细胞所产生的，而且具有类似于动物胶原的结构。EP-A-05334078中披露了平均分子量在100,000Da以上的伸展蛋白在化妆品中的应用。然而，迄今所公开的用于提取伸展蛋白的方法都包括用盐水溶液萃取各种来源的植物材料，接着用诸如三氯乙酸之类的强酸纯化，这些方法不能获得用于化妆品的合适产物，由于存在可溶性、稳定性、再现性及其化学-物理特征一致性的问题。

业已发现，通过下述方法可以获得结构上类似于上述伸展蛋白、但分子量较低、在酸性水溶液中可溶性较高的富羟脯氨酸糖蛋白，该方法包括体外培养选择的植物的细胞，并用酸性醇溶液萃取上述生长于合适培养基中的细胞。

通过本发明方法所获得的糖蛋白，其水化、成膜、调色和结瘢特性优于胶原的相应特性。因此，本发明的糖蛋白可用于化妆用组合物或皮肤病用组合物中，用于治疗干皮病、牛皮癣、鳞癣、皮屑、角化病、皱纹、痤疮、湿疹、炎性皮肤病、皮肤老化以及所有其它曾建议采用动物胶原的用途中。

本发明糖蛋白的水溶液保持稳定，不会发生能导致不可溶的产物形成的任何糖蛋白聚合作用。另外，这种溶液的粘度特别高，而且不取决于其浓度；令人吃惊的是，其0.1％的浓度即具有与1％胶原或5％植物白蛋白溶液相同的成膜和水化力。

待萃取的植物材料获自红豆杉、银杏、番茄和胡萝卜细胞的发酵培养物。优选采用获自红豆杉、银杏和番茄的细胞。细胞培养技术是常见的，包括用来自诸如叶、皮、根、茎或种子之类的植物各部分的愈伤培养物进行悬浮培养，该方法如Dobbs和Roberts所述(Experiments inPlant Tissne Culture，2nd ed.，Cambridge University Press，New York，1985)。

上述植物愈伤组织在灭菌并选择性地添加抗细菌剂后，通常被用作合适的液体培养基的接种物，如在上述Dobbs和Roberts的手册中所述。特别适用于本发明的培养基是Murashige and Skoog培养基。添加诸如脯氨酸、还原剂、乙烯或诸如Ethephon或L-氨基环丙烷羧酸之类的能释放乙烯的化合物之类的添加剂适合于提高目的糖蛋白的产量。

优选以萘乙酸作为植物生长素，以6-(γ，γ-二甲氨基)嘌呤为细胞激动素，以维生素和3％的糖为碳源。可根据所选择的材料添加适量维生素C，以防止最终的产物褐变。

发酵时间在3-12天之间，优选在5-6天之间。一旦发现结束就对培养基进行离心，并在存在稀释的无机酸、优选为氢氯酸或硫酸的条件下，用醇，优选为乙醇萃取细胞材料。该方法能使某些可能破坏本发明糖蛋白稳定性的酶失活，特别是使多酚氧化酶和酪氨酸氧化酶失活，这些酶能使糖蛋白聚合，从而形成不可溶的产物。

在有无机酸的条件下进行醇萃取，可以彻底提取出碱性糖蛋白，而且已证实其对这种用途具有高度选择性。除乙醇之外，还可采用诸如甲醇或异丙醇之类的可水溶混的醇。对所得到的水醇提取物进行中和，然后浓缩并加热至70-100℃温度，优选为80℃左右，接近完全沉淀变性蛋白。通过浓缩澄清悬浮液，并对该液体进行分级超滤，以除去高和低分子量物质。超滤是用截断分子量为10,000-40,000Da的聚磺酸膜，如Centricon^R或Romicon^R进行，其纤维可以是空心的或是卷曲的。对所得到的过滤产物进行电透析，以除去不需要的物质，如盐和低分子量糖。经过滤和透析后得到的溶液，可直接用于化妆品或药品中，或将其浓缩至较小体积，然后冻干或雾化。

通过高压液相层析(HPLC)进行凝胶渗透，对本发明的产物进行分析鉴定，所述HPLC由一个Waters泵装置组成，并具有一个Ultrahydrogel Linear Waters^R柱组30cm×0.5cm和Waters UV吸收检测器，484型。将含有0.067M磷酸二氢钾、0.1M NaCl和6×10^-4MNaN₃的水溶液用作洗脱剂。将待分析的糖蛋白样品溶于同一洗脱溶液(3mg/10ml)中，测定目的物和被选作分子量在细胞色素C(12,400Da)和葡聚糖蓝(2,000,000 Da)之间的参照物的标的量；可通过在12.5％聚丙烯酰胺凝胶和4％积层凝胶上电泳分别或同时测定所述产物或其中间产物。将待分析的样品溶于含有SDS和0.1％巯基乙醇的缓冲液中，使沉淀量为100～300mg。在20mA的稳定电流下进行迁移4小时。用5种标准分子量(7kD、14kD、24kD、54kD和66kD)绘制计量曲线。由该计量曲线计算出两条主带的分子量为22.5kD和25kD，而两条较弱带的分子量为31kD和34kD。用本文所披露的方法可从来源于不同植物的各种细胞外植体中获得分子量相当和氨基酸组成相当的产物混合物。下面以举例方式给出自银杏细胞中提取的糖蛋白的氨基酸分析结果。氨基酸                             峰面积Asp                                4.399Glu                                4.328Hyp                                17.505Ser                                7.065Gly                                6.056Hys                                1.782Arg                                2.471Thr                                4.739Pro                                10.036Ala                                8.2Tyr                                2.388Val                                6.162Met                                1.154Ile                                2.479Leu                                5.525Phe                                1.862Lys                                14.254

上述数据相当于糖蛋白混合物中氨基酸总量的百分比。该混合物中的糖为阿拉伯糖和半乳糖。各种产物中氨基酸与糖之比的平均值为2∶1。

如上所述，本发明的产品既可应用于药品领域又可应用于化妆品领域。对于药品领域来说，可将该产品掺入凝胶或软膏中，或用在医用纱布上用于烧伤或伤口的特殊治疗。在这种场合通常要对所述产物进行灭菌或灭菌过滤和冻干。

可以用传统方法制备本发明的化妆用和皮肤病用制剂。使用形式的例子包括水成喷雾剂、洗液、溶液、乳液、凝胶、药膏和乳油。

本发明的化妆用和皮肤病用制剂可以含有重量百分比为约0.01～约50％的富羟脯氨酸糖蛋白，优选为0.05～5％，还含有常用的赋形剂。由于本发明糖蛋白的高稳定性，可以获得含有50％以上可溶性富羟脯氨酸糖蛋白的药用和化妆用制剂。

可将本发明的糖蛋白直接加入药用和化妆用制剂中或进行微胶囊化，以产生长效水化作用。这种微胶囊可以是亲水的或亲脂的。本发明的制剂可以含有对于预想目标有互补或有用活性的其它活性成分。

下面的实施例将对本发明作进一步说明。

                            例1

制备用于糖蛋白生产的银杏愈伤组织和液体培养物

在0.1％Tween 80^(R)溶液中洗涤银杏嫩叶，制备这种嫩叶的外植体。将叶片切成约0.5cm大小，并用75％乙醇预灭菌1分钟。然后用2％次氯酸钠溶液灭菌，并在无菌水中洗涤3次。将所得外植体转移到装在培养皿里的Murashige & Skoog培养基中，该培养基中含有3％蔗糖并添加了Lynsmeyer & Skoog维生素和诸如2，4-二氯苯氧乙酸和萘乙酸之类的激素。将上述产物在黑暗中、在23℃下培养20天。在这一时期结束时，得到易碎的愈伤组织，它易于生长并可以在同一条件下继代培养的方式连续传代，因为可将其用于制备液体培养基。将该愈伤组织用于接种盛有200ml Murashige & Skoog培养基的Erlenmeyer烧瓶，该培养基中添加了萘乙酸和6(γ，γ-二甲氨基)嘌呤，Lynsmeyer &Skoog维生维和3％蔗糖作为碳源。在搅拌和连续光照条件下将所述烧瓶培养4天。然后收获细胞的生物材料用于提取糖蛋白。

                          例2

                   由银杏细胞制备糖蛋白

对按例1方法得到的培养物进行低速离心，并用1升含有1％硫酸的70％乙醇对收获的细胞(鲜重1.5kg)进行萃取。重复萃取2次，从而定量回收碱性糖蛋白。中和以后对提取物进行过滤，以除去混浊物，在真空中于50℃下浓缩，直到所有的乙醇都被完全除去。将该含水浓缩物在85℃下加热30分钟，并再次离心，以除去沉淀，将沉淀弃除。用具有40,000Da截断极限的Centricon^R对所获得的澄清溶液进行超滤，以排除较高分子量。

再用截断分子量为10,000Da的空心纤维膜对上述过滤产物进行超滤，以除去非糖蛋白低分子量物质。接着对滤液进行透析，并浓缩成1％的固体残余物。得到1.5升略为粘稠的产物，可将这种产物直接用于化妆用组合物。在电泳分析时，该产物含有6条带，其中4条的分子量为16,000、22,000、33,000和36,000Da。

                           例3

                     由蕃茄制备糖蛋白

按照例1的方法用灭菌的蕃茄芽在盛有10升Murashige & Skoog培养基的14升发酵罐中制备细胞材料，所述培养基中加入萘乙酸和6(γ，γ-二甲氨基)-嘌呤，Lynsmeyer & Skoog维生素和3％蔗糖作为碳源。发酵在23℃下进行5天，同时以150rpm的转速搅拌，发酵是在有0.05％的酵母提取物和大约70％溶解氧的条件下进行。在发酵结束时收集发酵液，并通过0.2μm的陶瓷膜进行微量过滤以浓缩细胞。将一定量的含0.5％氢氯酸的异丙醇加入所获得的细胞糊状物中，并用例2的方法进行提取。获得含有0.5％干残余物的3.5升溶液。对冻干的溶液进行分析，分别得出10％的脯氨酸含量和31％羟脯氨酸含量。

例4 化妆用组合物100g O/W乳液中含有：例2或3的溶液             10.0g乙酰化羊毛脂醇PEG-10     2.0g鲸蜡基-十八烷醇          1.5g鲸蜡醇十六酸酯           2.0g硬脂酸                   7.0g辛酸辛酯                 7.5g鲸蜡基磷酸钾             0.5g防腐剂                   适量香料                     适量纯化水                   适量，加至100g的总重量

                           例5 化妆用组合物100g的O/W乳液中含有：例2或3的溶液              10.0g鲸蜡基十八烷基葡糖苷      5.0g西蒙得油(Jojoba oil)      10.0g二甲聚硅氧烷              0.5g十四烷酸异丙酯            8.0g抗氧化剂                  适量防腐剂                    适量香料                      适量纯化水                    适量，加至总重量为100g

Claims (3)

1.富羟脯氨酸糖蛋白(HPRG)，可以用酸-醇提取法从银杏细胞培养物或蕃茄细胞培养物中获得，所述方法包括：

a)在一种液体培养基中培养银杏或蕃茄细胞3-12天；

b)在有稀无机酸的条件下用乙醇或异丙醇提取细胞材料；

c)中和、浓缩并在70～100℃的温度下加热所述提取物。

d)离心，弃沉淀，对上清液进行分级超滤和透析，所述HPRG的平均分子量为20,000道尔顿，其波动范围为12,000～38,000道尔顿，是通过SDS-PAGE测得。

2.含有权利要求1的糖蛋白作为活性成分的化妆用或药用制剂。

3.如权利要求2的制剂，其为乳液形式。