SI9520146A - Proteini bogati na hidroksiprolinu in farmacevtske ter kozmetične formulacije, ki jih vsebujejo - Google Patents

Abstract

Izum se nanaša na glikoproteine bogate na hidroksiprolinu, ki se jih da dobiti s kislinsko-alkoholno ekstrakcijo iz Taxus spp., Gingko (ali Ginkgo) biloba, Lycopersicum esculentum in Daucus carota celičnih kultur z naslednjimi karakteristikami: povprečna molekulska masa 20 000 daltonov z intervalom variabilnosti med 12 000 in 38 000, določeno s pomočjo gelne permeacije in elektroforeze, in veliko topnostjo v vodi. Glikoproteini, ki se jih da dobiti po predloženem izumu, imajo boljše lastnosti kot kolagen glede hidratacije, tvorbe filma, tonusa in celjenja kože. Uporabni so v kozmetiki in farmaciji.ŕ

Description

Proteini bogati na hidroksiprolinu in farmacevtske ter kozmetične formulacije, kijih vsebujejo

Predloženi izum se nanaša na glikoproteine bogate na hidroksiprolinu, ki se jih da dobiti iz rastlinskih virov, ter na njihovo farmacevtsko in kozmetično uporabo.

Podrobneje se izum nanaša na glikoproteine bogate na hidroksiprolinu, ki se jih da dobiti s kislinsko-alkoholno ekstrakcijo iz Taxus spp., Gingko (ali Ginkgo) biloba, Lycopersicum esculentum in Daucus carota celičnih kultur z naslednjimi karakteristikami:

• povprečna molekulska masa 20 000 daltonov z intervalom variabilnosti med 12 000 in 38 000, določeno s pomočjo gelne permeacije in elektroforeze;

• topnostjo v kislih vodnih raztopinah.

Nekateri glikoproteini živalskega izvora kot so npr. kolagen in proteoglikani, so znani po tem, da izvajajo pri zunanji uporabi pozitiven učinek na kožo, sami ali vdelani v primerne formulacije.

Kolagen, ki je glikoprotein bogat na prolinu in hidroksiprolinu, se posebno uporablja kot tak sam ali v kombinaciji z drugimi polipeptidnimi bazami pri negi oz. zdravljenju gub in drugih neestetskih hib, ki so v zvezi s slabo hidratacijo in elastičnostjo kože. Vendar pa živalski izvor kolagena omejuje njegovo uporabo zaradi tveganja kontaminacije z virusi in toksini. Čeprav spojine rastlinskega izvora ne povzročajo takega tveganja, pa je bila njihova uporaba v kozmetiki doslej kar omejena: tako na primer so znane kozmetične formulacije, ki vsebujejo surove ekstrakte rastlin kot Aloe, in celo zmečkane cele rastline kot avokado.

Znani so rastlinski glikoproteini imenovani ekstenzini, ki so proizvedeni iz rastlinskih celic v stopnji proliferacije (razmnoževanja) in imajo podobno strukturo kot živalski kolagen.

EP-A-0 533 4078 opisuje kozmetično uporabo ekstenzinov s povprečno molekulsko maso nad 10 000 daltonov. Vendar pa doslej opisane metode za ekstrakcijo ekstenzinov, ki obsegajo ekstrakcijo rastlinskih materialov različnega izvora s pomočjo vodnih raztopin soli, čemur sledi čiščenje z močnimi kislinami, kot je triklorocetna kislina, ne omogočajo priprave primernih proizvodov za kozmetiko, zaradi problemov, ki se nanašajo na njihovo topnost, stabilnost, ponovljivost in zanesljivost njihovih kemično-fizikalnih karakteristik.

Sedaj pa smo ugotovili, daje mogoče dobiti glikoproteine bogate na hidroksiprolinu, ki so strukturno podobne zgoraj opisanim ekstenzinom, vendar imajo nižjo molekulsko maso in večjo topnost v kislih vodnih raztopinah, po postopku, ki obsega in vitro gojenje celic izbranih rastlin ter ekstrakcijo celic zraslih v primernem mediju, s kislimi alkoholnimi raztopinami.

Glikoproteini, ki se jih da dobiti po predloženem izumu, imajo boljše lastnosti kot kolagen glede hidratacije, tvorbe filma, tonusa in celjenja kože. Zato se da uporabiti glikoproteine po predloženem izumu v kozmetičnih ali dermatoloških formulacijah za nego oz. zdravljenje suhe kože, psoriaze, ihtioze, prhljaja, keratoze, gub, akne, ekcemov, inflamatome dermatoze, staranja kože in vseh drugih indikacij, za katere so doslej predlagali uporabo živalskega kolagena.

Vodne raztopine glikoproteinov po predloženem izumu ostanejo stabilne brez polimerizacije glikoproteinov, ki bi vodila do tvorbe netopnih proizvodov. Poleg tega je viskoznost teh raztopin posebno visoka in ni odvisna od koncentracij: 0.1% koncentracije imajo presenetljivo enako moč tvorbe filma in hidratacije, kot 1% raztopine kolagena ali 5% raztopine rastlinskega albumina.

Rastlinski material za ekstrahiranje dobimo iz fermentacijskih kultur celic Taxus spp., Gingko biloba, Lycopersicum esculentum in Daucus carota. Uporaba celic rastlinskih vrst Tcucus spp., Gingko biloba in Lycopersicum esculentum je posebno prednostna. Tehnike gojenja celic so običajne in vključujejo suspenzijsko gojenje izhajajoč iz kultur callusa iz različnih delov rastlin, kot so listi, lubje, korenine, stebla ali semena, tako kot sta opisala

Dobbs in Roberts, Experiments in Plant Tissue Culture, 2^nd ed. Cambridge University Press, New York, 1985.

Rastlinsko tkivo callusa po sterilizaciji in eventualnem dodatku antibakterijskih sredstev, je tipično uporabljeno za inokuliranje prikladnih tekočih gojilnih medijev, kot je opisano v zgoraj omenjenem učbeniku avtorjev Dobbs in Roberts. Posebno prikladen medij za predloženi izum je Murashige in Skoog medij. Dodatek specifičnih aditivov kot so prolin, reducima sredstva, etilen ali spojine, ki lahko oddajajo etilen, kot sta npr. Ethephon ali Laminociklopropankarboksilna kislina, so lahko prikladni za povečanje produktivnosti želenih glikoproteinov.

Prednostna je uporaba naftilocetne kisline kot as avksina, 6-(y,y-dimetilamino)-purina kot citokinina, vitaminov in 3 % saharoze kot vira ogljika. Dodatek vitamina C je lahko prikladen v odvisnosti od izbranega materiala, da preprečimo porjavenje končnega proizvoda.

Fermentacij ski čas lahko variira od 3 do 12 dni in je prednostno med 5 in 6 dni. Ko je fermentacija zaključena, gojilni medij centrifugiramo in celično maso ekstrahiramo z alkoholi prednostno etanolom, v prisotnosti razredčenih mineralnih kislin, prednostno klorovodikove ali žveplove kisline. Ta ukrep dezaktivira nekatere encime, ki bi lahko ogrožali stabilnost glikoproteinov po predloženem izumu, specifično polifenol oksidaze in tirozin oksidaze, ki težijo k polimerizaciji glikoproteinov s posledično tvorbo netopnih proizvodov.

Alkoholna ekstrakcija v prisotnosti mineralnih kislin omogoča popolno ekstrakcijo bazičnih glikoproteinov in se je izkazala kot izredno selektivna za ta namen. Poleg etanola se da uporabiti druge alkohole, ki se mešajo z vodo, kot sta npr. metanol ali izopropanol. Nastali vodno-alkoholni ekstrakti so nevtralizirani in nato koncentrirani ter segreti na temperaturo 70 do 100 °C, prednostno okoli 80 °C, do popolnega obaijanja denaturiranih proteinov. Suspenzijo nato zbistrimo s koncentriranjem in tekočino podvržemo frakcionirni ultrafiltraciji, da odstranimo snovi z visoko in nizko molekulsko maso. Ultrafiltracijo izvedemo s pomočjo polisulfonskih membran s selekcijo 10 000 do 40 000 daltonov, kot so Centricon^R ali Romicon^R, pri čemer so njihova vlakna lahko votla ali alternativno v obliki navitja. Nastali filtrirani proizvod elektrodializiramo za odstranitev nezaželenih snovi, kot so soli in sladkorji z nizko molekulsko maso. Po filtraciji in dializi lahko uporabimo nastalo raztopino kot tako v kozmetičnih ali farmacevtskih pripravkih, ali pa jo lahko koncentriramo do manjšega volumna, zatem pa liofiliziramo ali atomiziramo.

Analitsko karakterizacijo proizvodov po predloženem izumu smo izvedli z gelno permeacijo z uporabo opreme za visokotlačne tekočinske kromatografije, kije obstajala iz Waters črpalne enote opremljene s Ultrahydrogel Linear Waters^R kolonsko baterijo 30 cm x 0.5 cm in Waters UV absorpcijskim detektorjem model 484. Kot eluent smo uporabili vodno raztopino, ki je vsebovala 0.067 M monokalijevega fosfata 0.1 M NaCl in 6 χ IO^-4 M NaN₃. Vzorce glikoproteina namenjene za analizo, smo raztopili v enaki raztopini eluenta (3 mg/10 ml) in graduiranih množinah snovi, kot tudi referenčnih snovi, izbranih po molekulskih masah izmed Cytochrome C (12 400 daltonov) in dekstran modrega (2 000 000 daltonov); Alternativno ali istočasno lahko določamo proizvode ali njihove intermediate z elektroforezo na 12.5% poliakrilamidnem gelu in 4% gela za akumuliranje proizvoda. Vzorce, namenjene za analizo, raztopimo v pufru, ki vsebuje SDS in 0.1% merkaptoetanola, in s precipitiranimi množinami med 100 in 300 mg. Migracijo izvedemo s konstantnim tokom 20 mA v teku 4 ur. Narišemo krivuljo s 5 standardnimi masami (7 kD, 14 kD, 24 kD, 54 kD in 66 kD). Mase po 22.5 kD in 25 kD izračunamo iz te krivulje za dve glavni progi in mase po 31 kD in 34 kD izračunamo za manj intenzivne proge. Postopki, ki jih opisujemo, omogočajo pridobivanje zmesi proizvodov s primerljivimi molekulskimi masami in primerljivimi aminokislinskimi sestavami iz raznih celičnih eksplantov izhajajoč iz različnih rastlin. Kot primer spodaj navajamo rezultate aminokislinske analize za glikoproteine ekstrahirane iz celic Ginkgo biloba.

Amino kislina	Vršno področje %
Asp	4.399
Glu	4.328
Hyp	17.505
Ser	7.065
Gly	6.056

Hys	1.782
Arg	2.471
Thr	4.739
Pro	10.036
Ala	8.2
Tyr	2.388
Val	6.162
Met	1.154
lle	2.479
Leu	5.525
Phe	1.862
Lys	14.254

Zgornji podatki se nanašajo na odstotke celotne množine aminokislin prisotnih v zmesi glikoproteinov. Sladkorja v zmesi sta arabinoza in galaktoza. Razmerje med aminokislinami in sladkorji je povprečno 2 : 1 za različne proizvode.

Kot smo zgoraj omenili, lahko uporabimo proizvode po predloženem izumu tako na področju farmacije kot tudi kozmetike. Na področju farmacije lahko vdelamo proizvod v gele ali mazila, lahko pa ga nanesemo tudi na zdravilne obveze za specifično oskrbo opeklin ali ran. V tem primeru proizvod običajno steriliziramo ali sterilno filtriramo in liofiliziramo.

Kozmetične in dermatološke pripravke v smislu izuma lahko pripravimo po tradicionalnih metodah. Primeri za take aplikacijske oblike vključujejo vodna razpršila (spraye), losione, raztopine, emulzije, gele, mazila in kreme.

Kozmetični in dermatološki pripravki po predloženem izumu lahko vsebujejo glikoproteine bogate na hidroksiprolinu v masnih odstotkih okoli 0.01% do okoli 50%, prednostno od 0.05% do 5%, poleg običajnih polnil oz. aditivov. Zaradi visoke stabilnosti glikoproteinov po predloženem izumu lahko dobimo farmacevtske in kozmetične pripravke, ki vsebujejo nad 50% topnih glikoproteinov bogatih na hidroksiprolinu.

Glikoproteine po predloženem izumu lahko dodamo farmacevtskim in kozmetičnim pripravkom kot take ali v obliki mikrokapsul, da omogočimo dolgotrajno hidratacijsko delovanje. Mikrokapsule so bodisi hidrofilne ali lipofilne. Pripravki po predloženem izumu lahko vključujejo druge učinkovine s komplementarno ali koristno učinkovitostjo za želene namene.

Izum nadalje pojasnjujemo z naslednjimi Primeri.

Primer 1

Priprava callusa in tekoče kulture Gingko biloba za proizvodnjo glikoproteinov

Pripravimo eksplant mladih listov Gingko biloba z izpiranjem listov v 0.1 % Tween 80® raztopini. Lističe smo porazdelili v frakcije po okoli 0.5 cm ter predhodno sterilizirali 1 minuto s 75% etanolom. Sterilizacijo smo nato dokončali z 2% raztopino natrijevega hipoklorita in trojnim izpranjem eksplanta v sterilni vodi. Dobljene eksplante smo prenesli v petrijevko z Murashige & Skoog medijem, ki je vseboval 3% saharoze z dodatkom Lynsmeyer & Skoog vitaminov in hormonov kot 2,4-diklorofenoksiocetne kisline in naftilocetne kisline. Proizvode smo inkubirali 20 dni v temi pri temperaturi 23 °C. Po tem času smo dobili drobljive calluse, ki zlahka rastejo in jih prenesemo v kontinuirne vrste s pomočjo subkultur pri enakih pogojih, kot se jih lahko uporablja za razmnoževanje v tekočem mediju. Te calluse uporabimo za inokuliranje erlenmejeric z vsebnostjo 200 ml Murashige & Skoog medija, ob dodatku naftilocetne kisline in 6-(y,Y-dimetilamino)-purina, Lynsmeyer & Skoog vitaminov in 3% saharoze kot vira ogljika. Bučke smo inkubirali ob mešanju v kontinuimi svetlobi v teku 4 dni, nakar smo pobrali celično biomaso za ekstrakcijo glikoproteinov.

Primer 2

Priprava glikoproteinov iz celic Gingko biloba

Litrov kulture dobljene po Primeru 1 smo centrifugirali pri nizki hitrosti in pridelek celic ( 1.5 kg sveže mase) ekstrahirali z 1.5 litri 70% etanola, ki je vseboval 1% žveplove kisline. Ekstrakcijo smo dvakrat ponovili, pri čemer smo kvantitativno pridobili bazične glikoproteine. Po nevtralizaciji smo ekstrakte filtrirali, da smo odstranili vso motnost in koncentrirali v vakuumu pri 50 °C do popolne odstranitve etanola. Vodni koncentrat smo segrevali 30 minut pri 85 °C in ponovno centrifugirali, da smo odstranili oborino, ki smo jo zavrgli. Nastalo bistro raztopino smo ultrafiltrirali s pomočjo Centricon^R membrane z zgornjo mejo propustnosti 40 000 daltonov, da smo izključili višje molekulske mase.

Filtrirani proizvod smo nato ultrafiltrirali ob uporabi membrane s spodnjo mejo propustnosti 10 000 daltonov, da smo odstranili snovi z nizko molekulsko maso, katere niso glikoproteini. Filtrat nato dializiramo in koncentriramo na 1% trdnega preostanka. Dobimo 1.5 1 lahno viskoznega proizvoda, ki se ga da uporabiti kot takega v kozmetičnih formulacijah.

Pri analizi z elektroforezo je proizvod vseboval 6 prog, od katerih so imele 4 molekulske mase po 16 000,22 000, 33 000 in 36 000 daltonov.

Primer 3

Priprava glikoproteinov iz Lvcopersicum esculentum

V skladu s postopkom iz Primera 1 pripravimo celično maso iz sterilnih brstov Lycopersicum esculentum v 14-litrskem fermentorju, ki vsebuje 10 litrov Murashige & Skoog medija, ki smo mu dodali naftilocetno kislino in 6-(y,y-dimetilamino)-purina, Lynsmeyer & Skoog vitaminov in 3% saharoze kot vira ogljika. Fermentacijo izvajamo 5 dni pri 23 °C ob mešanju s 150 obr./minuto v prisotnosti sladnega ekstrakta s koncentracijo 0.05% in s približno 70% koncentracijo raztopljenega kisika. Na koncu fermentacije zberemo juho in jo mikrofiltriramo skozi 0.2 pm keramično membrano za koncentriranje celic. Tako dobljeni celični pasti dodamo nekoliko izopropanola, ki vsebuje 0.5% klorovodikove kisline, ter izvajamo metodo opisano pri Primeru 2 na ekstrakte. Dobimo 3.5 litrov raztopine z 0.5% suhega preostanka. Analiza liofiliziranih raztopin je dala vsebnost 10% prolina in 31% hidroksiprolina.

Primer 4

Kozmetična formulacija
100 g emulzije olje-v-vodi vsebuje:
RAZTOPINA IZ PRIMERA 2 ALI 3	10.0 g
Acetiliran lanolin alkohol PEG-10	2.0 g
Cetil-stearil alkohol	1.5 g
Cetil palmitat	2.0 g
Stearinska kislina	7.0 g
Oktil oktanoat	7-1 g
Kalijev cetil fosfat	0.5 g
Konzervirna sredstva	q.s.
Dišave	q.s.
Očiščena voda	q.s. do 100 g
Primer 5
Kozmetična formulacija
100 g emulzije olje-v-vodi vsebuje:
RAZTOPINA IZ PRIMERA 2 ALI 3	10.0 g
Cetil-stearil glukozit	5.0 g
Jojoba olje	10.0 g
Izopropil miristat	8.0 g
Dimetikon	0.5 g
Antioksidant	q.s.
Konzervirna sredstva	q.s.
Dišave	q.s.
Očiščena voda	q.s. do 100 g

Za:

Claims (3)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Glikoproteini bogati na hidroksiprolinu (HPRG), značilni po tem, da se jih da dobiti s kislinsko-alkoholno ekstrakcijo iz Gingko (ali Ginkgo) biloba, Lycopersicum esculentum ali njunih celičnih kultur, po postopku, ki obsega;

   a) gojenje Gingko biloba, Lycopersicum esculentum in celic v tekočem mediju v času 3 do 12 dni;

   b) ekstrahiranje celične mase z alkoholi, ki se mešajo z vodo, v prisotnosti razredčenih mineralnih kislin;

   c) nevtraliziran)e, koncentriranje in segrevanje ekstraktov na temperature med 70 in 100 °C;

   d) centrifugiranje z zavrženjem oborine, frakcionirno ultrafiltracijo in dializo vrhnjega sloja (supematanta) pri čemer imajo navedeni HPRG povprečno molekulsko maso 20 000 daltonov z intervalom variabilnosti med 12 000 in 38 000 daltonov, določenim s pomočjo gelne permeacije in elektroforeze.
2. 2. Kozmetični in farmacevtski pripravki, značilni po tem, da vsebujejo glikoproteine po zahtevku 1 kot učinkovine s hidratacijskimi, film tvorečimi, ionizirajočimi in celilnimi lastnostmi.
3. 3. Pripravki po zahtevku 2, značilni po tem, da imajo obliko vodnih razpršil (sprayev), losionov, raztopin, emulzij, gelov, mazil, krem, in gaz z dodatkom zdravil.