DE69520693T2

DE69520693T2 - Hydroxyprolin reiche proteine und sie enthaltende pharmazeutische und kosmetische zubereitungen

Info

Publication number: DE69520693T2
Application number: DE69520693T
Authority: DE
Inventors: Ezio Bombardelli; Cesare Ponzone
Original assignee: Indena SpA
Current assignee: Indena SpA
Priority date: 1994-12-28
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 2001-08-30
Anticipated expiration: 2015-12-22
Also published as: GR3035842T3; NO972984L; NO318552B1; CA2208960A1; JPH10510432A; RU2163266C2; ES2155541T3; AU692654B2; EP0800585A1; HK1003652A1; SK86097A3; FI118156B; WO1996020284A1; CZ295489B6; CN1109106C; SI9520146A; HU220456B1; HUT77703A; FI972757A; SK280572B6

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hydroxyprolin-reiche Glykoproteine, die aus pflanzlichen Quellen erhalten werden können, sowie deren pharmazeutische und kosmetische Verwendung.
Im einzelnen betrifft die Erfindung Hydroxyprolin-reiche Glykoproteine, die erhalten werden können durch saure Alkoholextraktion aus Gingko biloba- und Lycopersicum esculentum-Zellkulturen mit den folgenden Merkmalen:
- durchschnittliches Molekulargewicht von 20 000 Dalton mit einem Variabilitätsintervall von 12 000 bis 38 000, bestimmt durch Gelpermeation uni. Elektrophorese;
- Löslichkeit in sauren, wäßrigen Lösungen.
Einige Glykoproteine tierischen Ursprungs, wie Collagen und Proteoglykane, sind dafür bekannt, daß sie eine günstige Wirkung auf die Haut ausüben, wenn sie topisch als solche oder innerhalb geeigneter Formulierungen aufgebracht werden.
Collagen, bei dem es sich um ein an Prolin und Hydroxyprolin reiches Glykoprotein handelt, wird insbesondere als solches oder in Kombination mit anderen Polypeptidbasen bei der Behandlung von Falten und anderen unästhetischen Mängeln, die mit einer schlechten Hauthydratation und -elastizität verbunden sind, verwendet. Der tierische Ursprung des Collagens jedoch beschränkt dessen Verwendung aufgrund von Risiken einer Verunreinigung durch Viren und Toxine. Obgleich die Verbindungen pflanzlichen Ursprungs diese Risiken nicht beinhalten, war deren Verwendung in Kosmetika bislang ziemlich eingeschränkt: beispielsweise sind kosmetische Formulierungen bekannt, die Rohextrakte von Pflanzen, wie Aloe oder sogar zerkleinerte Gemüse, wie Avocado, enthalten.
Pflanzliche Glykoproteine, als Extensine bezeichnet, die von Pflanzenzellen im Proliferationsstadium produziert werden und eine tierischem Collagen ähnliche Struktur besitzen, sind bekannt. EP-A-0 533 4078 offenbart die kosmetische Verwendung von Extensinen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht oberhalb 100 000 Dalton. Plant Physiology 84, 1987: 820-825, offenbart Extensin-2, ein Salz-extrahierbares, Hydroxyprolinreiches Glykoprotein aus Karotten, für das man ein scheinbares Molekulargewicht von 40 400 Dalton annimmt. Die bis heute beschriebenen Methoden für die Extraktion von Ertensinen, die die Extraktion der pflanzlichen Materialien unterschiedlichen Ursprungs mit Hilfe wäßriger Salzlösungen und anschließende Reinigung mit starken Säuren, wie Trichloressigsäure, beinhalten, erlauben jedoch nicht aufgrund von Problemen hinsichtlich Löslichkeit, Stabilität, Wiederholbarkeit und Konsistenz·ihrer chemisch-physikalischen Eigenschaften Produkte zu erhalten, die für Kosmetika geeginet sind.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, Hydroxyprolinreiche Glykoproteine, die den vorstehend beschriebenen Extensinen strukturell ähnlich sind, jedoch ein niedrigeres Molekulargewicht und eine höhere Löslichkeit in sauren, wäßrigen Lösungen aufweisen, mit Hilfe eines Verfahrens zu erhalten, das die in vitro-Kultur von Zellen ausgewählter Pflanzen und die Extraktion mit sauren, alkoholischen Lösungen der in einem geeigneten Medium gezüchteten Zellen umfaßt.
Die erfindungsgemäß erhältlichen Glykoproteine besitzen hydratisierende, filmbildende, tonisierende und cicatrisierende Eigenschaften, die stärker sind als diejenigen des Collagens. Die Glykoproteine der vorliegenden Erfindung können daher in kosmetischen oder dermatologischen Formulierungen für die Behandlung von trockener Haut, Psoriasis, Ichthyosis, Schuppen, Keratosis, Falten, Akne, Ekzemen, entzündlicher Dermatose, Hautalterung und sämtlichen anderen Anwendungen, für die die Verwendung von tierischem Collagen vorgeschlagen worden ist, eingesetzt werden.
Die wäßrigen Lösungen der erfindungsgemäßen Glykoproteine bleiben ohne eine Polymerisation der Glykoproteine, die zur Bildung von unlöslichen Produkten führt, stabil. Zusätzlich ist die Viskosität dieser Lösungen besonders hoch und hängt nicht von der Konzentration ab; Konzentrationen von 0,1% besitzen überraschenderweise das gleich Filmbildungs- und Hydratisierungsvermögen wie 1%ige Collagenlösungen oder 5%ige pflanzliche Albuminlösungen.
Das zu extrahierende pflanzliche Material wird aus Fermenterkulturen von Gingko biloba- und Lycopersicum esculentum-Zeilen erhalten. Die Techniken der Zellkulturen sind die üblichen und umfassen die Suspensionskultur, ausgehend von Calluskulturen aus verschiedenen Pflanzenteilen, wie Blättern, Rinde, Wurzeln, Stamm oder Samen, wie von Dobbs und Roberts, Experiments in Plant Tissue Culture, 2. Auflage, Cambridge University Press, New York, 1985, beschrieben.
Das pflanzliche Gewebe des Callus wird nach Sterilisation und etwaigem Zusatz von antibakteriellen Komponenten typischerweise für das Inokulum geeigneter Flüssigkulturmedien verwendet, wie in dem vorstehend genannten Manual von Dobbs und Roberts beschrieben. Ein besonders geeignetes Medium für die vorliegende Erfindung ist das Murashige- und Skoog-Medium. Der Zusatz spezifischer Additive, wie Prolin, Reduktionsmittel, Ethylen oder Verbindungen, die imstande sind, Ethylen freizusetzen, wie Ethephon oder L-Aminocyclopropancarbonsäure, können dazu geeignet sein, die Produktivität an erwünschten Glykoproteinen zu erhöhen.
Die Verwendung von Naphthylessigsäure, wie die von Auxin, 6- (γ,γ-Dimethylamino)-purin, wie die von Cytokinin, von Vitaminen und 3% Saccharose als Kohlenstoffquelle ist bevorzugt. Der Zusatz von Vitamin C kann in Abhängigkeit vom gewählten Material geeignet sein, das Endprodukt vor einer Bräunung zu schützen.
Die Fermentationsdauer kann von 3 bis 12 Tagen variieren und liegt bevorzugt zwischen 5 und 6 Tagen. Nach Beendigung der Fermentation wird das Kulturmedium zentrifugiert und die Zellenmasse mit Hilfe von Alkoholen, vorzugsweise Ethanol, in Anwesenheit verdünnter Mineralsäuren, vorzugsweise Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, extrahiert. Dieses Verfahren inaktiviert einige Enzyme, die die Stabilität der erfindungsgemäßen Glykoproteine beeinträchtigen können, insbesondere Polyphenoloxydase und Tyrosinoxidase, die die Polymerisation der Glykoproteine, begleitet von der Bildung unlöslicher Produkte, begünstigen.
Die Alkoholextraktion in Anwesenheit von Mineralsäuren erlaubt die vollständige Extraktion der basischen Glykoproteine und erwies sich als diesbezüglich außerordentlich selektiv. Andere mit Wasser mischbare Alkohole, wie Methanol oder Isopropanol, körnen außer Ethanol eingesetzt werden. Die entstandenen wäßrig-alkoholischen Extrakte werden neutralisiert und hiernach eingeengt und auf eine Temperatur von 70 bis 100ºC, vorzugsweise etwa 80ºC, bis zur vollständigen Ausfällung der denaturierten Proteine erhitzt. Hiernach wird die Suspension durch Einengen geklärt, und die Flüssigkeit wird einer fraktionierten Ultrafiltration unterzogen, um Substanzen mit hohem und niedrigen Molekulargewicht zu entfernen. Die Ultrafiltration erfolgt mit Hilfe von Polysulfonmembranen mit Rückhaltevermögen von 10 000 bis 40 000 Dalton, wie Centricon(R) oder Romicon(R), deren Fasern hohl oder, alternativ, spiralförmig sein können. Das resultierende filtrierte Produkt wird einer Elektrodialyse unterzogen, um unerwünschte Substanzen, wie Salze und Zucker mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Nach der Filtration und Dialyse kann die entstandene Lösung als solche in kosmetischen oder pharmazeutischen Präparaten verwendet werden oder sie kann auf ein geringeres Volumen eingeengt und hiernach lyophilisiert oder atomisiert werden.
Die analytische Charakterisierung der erfindungsgemäßen Produkte wurde durch Gelpermeation unter Verwendung eines Hochdruck-Flüssigchromatographen, bestehend aus einer Vaters- Pumpeneinheit und versehen mit einer Ultrahydrogel Linear Waters(R)-Säulenbatterie 30 cm · 0,5 cm und einem Waters UV Absorptionsdetektor, Model 484, durchgeführt. Eine wäßrige, 0,067 M Monokaliumphosphat, 0,1 M NaCl und 6 · 10- M NaN3 enthaltende Lösung wurde als Elutionsmittel verwendet. Die zu analysierenden Glykoproteinproben werden in der gleichen Elutionslösung (3 mg/10 ml) und Skalarmengen der Substanz ebenso wie der Referenzsubstanzen, ausgewählt als Molekulargewichte zwischen Cytochrome vC (12 400 Dalton) und Dextran blue (2 000 000 Dalton), gelöst. Alternativ oder gleichzeitig können die Produkte oder deren Zwischenprodukte durch Elektrophorese an 12,5% 596 Polyacrylamidgel und 4% Stapelgel bestimmt werden. Die zu analysierenden Proben werden in einem SDS und 0,1% Mercaptoethanol enthaltenden Puffer gelöst, wobei Mengen zwischen 100 und 300 mg abgeschieden werden. Die Migration erfolgt bei konstantem Strom bei 20 mA während 4 Stunden. Man zeichnet eine Eichkurve mit 5 Standardgewichten (7 kD, 14 kD, 24 kD), 54 kD und 66 kD). Man berechnet aus dieser Eichkurve die Gewichte von 22,5 kD und 25 kD) für die beiden Hauptbanden und Gewichte von 31 kD) und 34 kD) für die weniger intensiven Banden. Die hier beschriebenen Verfahren ermöglichen Produkt-Mischungen mit vergleichbaren Molekulargewichten und vergleichbaren Aminosäurezusammensetzungen aus verschiedenen Zell-Pflanzenmaterialien, ausgehend von verschiedenen Pflanzen, zu erzielen. Die Ergebnisse der Aminosäureanalyse der aus Gingko biloba-Zellen extrahierten Glykoproteine werden nachstehend als Beispiel aufgeführt.
Die vorstehenden Daten beziehen sich auf den Prozentanteil der Gesamtmenge der in der Glykoproteinmischung vorhandenen Aminosäuren. Die Zucker in der Mischung sind Arabinose und Galactose. Das Verhältnis der Aminosäuren zu den Zuckern beträgt durchschnittlich 2 : 1 bei den verschiedenen Produkten.
Wie vorstehend erwähnt, können die erfindungsgemäßen Produkte sowohl in pharmazeutischem als auch kosmetischem Bereich eingesetzt werden. Für den pharmazeutischen Bereich kann das Produkt in Gele oder Salben eingearbeitet werden oder auf antiseptische Gazen für die spezifische Behandlung von Verbrennungen oder Wunden aufgebracht werden. In diesem Fall wird das Produkt gewöhnlich einer Sterilisation oder sterilen Filtrationen unterzogen und lyophilisiert.
Die kosmetischen und dermatologischen Präparate der Erfindung können nach herkömmlichen Methoden hergestellt werden. Beispiele für Verabreichungsformen umfassen wäßrige Sprays, Lotionen, Lösungen, Emulsionen, Gele, Salben und Cremes.
Die erfindungsgemäßen kosmetischen und dermatologischen Präparate können Hydroxyprolin-reiche Glykoproteine in Gewichtsprozentanteilen von etwa 0,01% bis etwa 50%, vorzugsweise von 0,05 bis 5%, sowie übliche Exzipienten enthalten. Aufgrund der hohen Stabilität der erfindungsgemäßen Glykoproteine können pharmazeutische und kosmetische Präparate, die mehr als 50% der löslichen, Hydroxyprolin-reichen Glykoproteine enthalten, erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Glykoproteine können pharmazeutischen und kosmetischen Präparaten als solche mikroverkapselt zugesetzt werden, um eine anhaltende hydratisierende Wirkung zu ergeben. Die Mikrokapseln können entweder hydrophil oder lipophil sein. Die erfindungsgemäßen Präparate können andere aktive Bestandteile mit komplementärer Aktivität oder für die gewünschten Ziele nützlicher Aktivität einschließen.
Die Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Herstellung des Callus und der Flüssigkultur von Gingko biloba für die Gewinnung von Glykoproteinen

Man stellt ein Pflanzenmaterial aus jungen Blättern von Gingko biloba durch Waschen der Blätter in eine 0,1% Tween 80(R)-Lösung her. Die Blätter werden in Stücke von etwa 0,5 cm verteilt und 1 Minute mit 75%igem Ethanol prästerilisiert. Hiernach wird die Sterilisation mit einer 2%igen Natriumhypochloritlösung und dreifachem Waschen des Pflanzenmaterials in sterilem Wasser vorgenommen. Die entstandenen pflanzlichen Produkte werden in eine Petrischale in Murashige & Skoog-Medium mit einem Gehalt von 3% Saccharose unter Zusatz von Lynsmeyer & Skoog Vitaminen und -Hormonen, wie 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und Naphthylessigsäure, überführt. Die Produkte werden 20 Tage im Dunkeln bei 23ºC inkubiert. Am Ende dieser Periode erhält man krümelige Calli, die leicht wachsen und mit Hilfe von Subkulturen unter den gleichen Bedingungen, wie sie für die Vermehrung in einem flüssigen System verwendet werden, in kontinuierliche Reihen übergeführt werden. Diese Calli werden zur Inokulation von Erlenmeyerkolben verwendet, die 200 ml Murashige & Skoog Medium unter Zusatz von Naphthylessigsäure und 6-(γ,γ-Dimethylamino)-purin, Lynsmeyer & Skoog-Vitaminen und 3% Saccharose als Kohlenstoffquelle enthalten. Die Kolben werden unter Rühren in kontinuierlichem Licht während 4 Tagen inkubiert, wonach die Zellbiomasse zur Extraktion der Glykoproteine geerntet wird.

Beispiel 2

Herstellung von Glykoproteinen aus Gingko biloba-Zellen

5 l der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kultur werden bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und die geernteten Zellen (1,5 kg Frischgewicht) werden mit 1,5 l 70%igem Ethanol, enthaltend 1% Schwefelsäure, extrahiert. Die Extraktion wird zweimal wiederholt, wobei man quantitativ die basischen Glykoproteine gewinnt. Nach Neutralisation werden die Extrakte zur Entfernung jeglicher Trübung filtriert und unter Vakuum bei 50ºC eingeengt, bis das Ethanol vollständig entfernt ist. Das wäßrige Konzentrat wird 30 Minuten bei 85ºC erhitzt und erneut zur Entfernung des Niederschlags, welcher verworfen wird, zentrifugiert. Die entstandene klare Lösung wird mit Hilfe einer Centricon(R)-Membran mit einer Ausschlußgrenze von 40 000 Dalton ultrazentrifugiert, um die höheren Molekulargewichte auszuschließen.
Das filtrierte Produkt wird dann ultrafiltriert, wobei man eine Hohlfaser-Membran mit einer Ausschlußgrenze von 10 000 Dalton verwendet, um Nicht-Glykoprotein, Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, zu entfernen. Das Filtrat wird dann einer Dialyse unterzogen und auf 1% festen Rückstand konzentriert. Man erhält 1,5 l eines leicht viskosen Procfiukts, das als solches in kosmetischen Formulierungen verwendet werden kann. Bei der. Elektrophorese-Analyse enthielt das Produkt 6 Banden, von denen 4 Molekulargewicht von 16 000, 22 000, 33000 und 36 000 Dalton aufwiesen.

Beispiel 3

Herstellung von Glykoproteinen aus Lycopersicum esculentum

Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wird eine Zellmasse aus sterilen Keimen von Licopersicum esculentum in einem 14 l- Fermenter hergestellt, der 10 l Murashige & Skoog-Medium, versetzt mit Naphthylessigsäure und 6-(γ,γ-Dimethylamino)- purin, Lynsmeyer & Skoog Vitaminen und 3% Saccharose als Kohlenstoffquelle, enthält. Die Fermentation wird 5 Tage bei 23ºC fortgeführt, während man bei 150 U/min in Gegenwart von Hefeextrakt mit einer Konzentration von 0,05% und bei einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von annähernd 70% rührt.
Am Ende der Fermentation wird die Brühe gesammelt und durch eine 0,2 um keramische Membran mikrofiltriert, um die Zellen zu konzentrieren. Etwas, 0,5% Chlorwasserstoffsäure enthaltendes Isopropanol wird der so erhaltenen Zenpaste zugesetzt, und man wendet die in Beispiel 2 beschriebene Methode auf die Extrakte an. Man erhält 3,5 l einer Lösung mit 0,5% trockenem Rückstand. Die Analyse der lyophilisierten Lösungen ergab einen Gehalt an 10% Prolin und 31% Hydroxyprolin.

Beispiel 4

Kosmetische Formulierung

100 g einer 0/W-EDlulsion, enthaltend:
Lösung von Beispiel 2 oder 3 10,0 g
acetylierter Lanolinalkohol PEGIO 2,0 g
Cetylstearylalkohol 1,5 g
Cetylpalmitat 2,0 g
Stearinsäure 7,0 g
Octyloctanoat 7,5 g
Kaliumcetylphosphat 0,5 g
Konservierungsmittel q.s.
Duftstoffe q.s.
gereinigtes Wasser q.s, auf 100 g

Beispiel 5

Kosmetische Formulierung

100 g einer O/W-Emulsion, enthaltend:
Lösung von Beispiel 2 oder 3 10,0 g
Cetylstearylglucosid 5,0 g
Jojobaöl 10,0 g
Isopropylmyristat 8,0 g
Dimethioon 0,5 g
Antioxidans q.s.
Konservierungsmittel q.s.
Duftstoffe q.s.
gereinigtes Wasser q.s. auf 100 g.

Claims

1. Hydroxyprolin-reiche Glykoproteine, erhältlich durch Säure-Alkohol-Extraktion aus Gingko biloba- und Lycopersicum esculentum-Zellen nach einem Verfahren, das umfaßt:

a) Kultur von Gingko biloba- und Lycopersicum esculentum- Zellen in einem flüssigen Medium während einer Zeitdauer von 3 bis 12 Tagen;

b) Extraktion der Zelimasse mit Wasser-mischbaren Alkoholen in Gegenwart von verdünnten Mineralsäuren;

c) Neutralisation, Konzentrieren und Erhitzen des Extrakts bei Temperaturen zwischen 70ºC und 100ºC;

d) Zentrifugieren unter Verwerfen des Präzipitats, fraktionierte Ultrafltration und Dialyse des Überstands, wobei die HPRGs die folgenden Merkmale besitzen:

- ein durchschnittliches Molekulargewicht von 20.000 Dalton mit Variabilitätsintervall von 12.000 bis 38.000, bestimmt durch Gelpermeation und Elektrophorese;

- hohe Löslichkeit in Wasser.

2. Kosmetische und pharmazeutische Präparate, enthaltend die Glykoproteine gemäß Anspruch 1 als Wirkstoff mit hydratisierenden, filmbildenden, tonisierenden und cicatrisierenden Eigenschaften.

3. Präparate gemäß Anspruch 2 in Form von wässrigen Sprays, Lotionen, Lösungen, Emulsionen, Gelen, Salben, Cremes und medizinischen Gazen.