DE2508082A1 - Verfahren zur extraktion und behandlung von glykoproteinen, mucopolysacchariden und deren begleitstoffen - Google Patents
Verfahren zur extraktion und behandlung von glykoproteinen, mucopolysacchariden und deren begleitstoffenInfo
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Description
Andre Thomas
Paris, Frankreich
Dipl.-Ing. Tiedtke
Dipi.-Chem. Bühling Dipl.-Ing. Kinne
Dipi.-Chem. Bühling Dipl.-Ing. Kinne
8 München 2
Tel.: (089) 539653-56 Telex:524845tipat
cable address: Germaniapatent München
cable address: Germaniapatent München
München, den 25. Februar 1975
B 6476/SPI-JO/MAB 93
Dossier No.1864/I864al/
1964a2
'/erfahren zur Extraktion un-Ί Behandlung von
Glykoproteinen, Mucopolysacchariden ur/· deren ?egleitstoffen
Glykoproteinen, Mucopolysacchariden ur/· deren ?egleitstoffen
Die Erfindung "betrifft ein neues Verfahren zur Extraktion
und zur Extraktherstellung aus allen tierischen oder menschlichen Organen oder Geweben und Zellen oder aus allen Pflanzen
oder Mikroorganismen oder Flüssigkeiten biologischen Ursprungs,
wie Seren, Sarr.enflüssigkeiten, Sekreten,Reaktionsflüssigkeiten und
-geweten, !'"lüssigkeiten aus verschiedenen Kulturen mit einem
Gehalt an Glykoproteinen und Kucopolysacchariden und deren Bestandteile
(Proteine, Mucine, Chondroide oder ihre Derivate: Hucoitinschwefelsäure, Kucoitin, Kucosin, Glucosamin,Chondroitinschwefelsäure,
Ohondrcitine, Chondrosaniine und schließlich GIucuronsäure)
oder die sie von Katür aus begleiten (viskose PoIy-
5098A0/1123
mere, wie Hyaluronsäure) un:1 ihre Bestandteile (Glucoronsäure
und N-Acetylglucosamin), sowie Nukleoproteine oder ihre Bestandteile
und andere Proteine,Glucoproteine, Mucopolysaccharide, Lipoproteine,
Glykolipide, Glucide usw..
Die nach zahlreichen Vergleichsversuchen aufgefundenen
erfindungsgemälionen Verfahren gestatten es, diese biologischen
Extrakte in einer mehr oder weniger viskosen, beständigen Forrr;
und in einem nikrobiologisch sterilen Zustand industriell herzustellen.
Die erfindungsgemäß erhaltenen biologischen Extrakte
können allein öler in Verbindung miteinander eingesetzt werden und dabei mit geeigneten Bindemitteln gemischt sein. Sie können
auch mit anderen Stoffen mit therapeutischen Eigenschaften kombiniert
werden, deren Absorption durch die Haut sie erleichtern. Schließlich kennen sie gefriergetrocknet werden und sind dann
vollständig löslich.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die durch dieses Verfahren erhaltenen neuen, beständigen Extrakte, die Bedingungen
der Vereinigung dieser Extrakte miteinander, die bevorzugten Zusammensetzungen und Verbindungen dieser Extrakte mit geeigneten
Bindemitteln oder ihre Bindung an diese Produkte oder ihre Gefriertrocknung mit der Möglichkeit der. vollständigen Wiederauflösung.
In sehr allgemeiner form wird aus der bekannten Tatsache
Vorteil sozogen, daß gewisse Proteine, Glykoproteine, Ku-
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eorolysaecharid e und deren Fegleitstoffe unter den ionischen
Bedingungen, den pH-Wert usw. wärmebe^tangig sind und in
Lösung; bleiben. Es handelt sich hierbei um die Wärmebeständigkoit
in alkalische"! oder fast neutralem Medium. Die unter der.lr:i
ci-i-.en Bedingungen engewandte Erwärmung kann gleichzeitig
irit der· Extraktion die irikrobiologische Sterilität bewirken;
jeioch kann diese Keiir.f-reiheit- erfindungsgenäß in festgelegter
V/eise axich durch wirksame chemische Mittel erreicht werden, die
grfs. selbst zersetzlich sind. Das erfindungsgemäße Verfahren
besteht: darin, daß man nach der Feinzerkleinerung des Organs
oder ^er Mikroorganismen in Wasser oder in einem elekrolytarmen
MediuR"i (oder direkt., wenn nan als Ausgangsmaterial eine Flüssigkeit
biologischer Herkunft verwendet) eine erste Extraktion in eine;n basischen Medium durchführt. Erfindungsgemäß arbeitet
man bei pH-Werten /'.wischen 7,5 und 955i vorzugsweise bei pH-Wertrn
von 8 bin 9· nan setzt die Extraktion durch leichte Hydrolvi-e
der Sur-r^ension oder der Flüssigkeit Lei Umgebungstemperatur
oder im elneir» Heizschrank genügend lange fort, erhitzt
dann i "\ Autoklaven auf 110"G, läßt bei Umgebungstemperatur absitzrn
und trennt dann die gebildete Abscheidung durch Zentrifugieren oder Filtrieren ab.
"Die lieuheit der Erfindung besteht in der Benutzung
eines -vässrigen Puf f er mediums mit eine.Ti pH-Wert oberhalb von
7, während dcch die Empfindlichkeit von■Eiweißstoffen in alkalischer
Umgebung bekannt ist und man bisher praktisch neutrale I'<--dirn benutzt«-· (z.V. die Extraktion des Mucins nach Ward Pig-
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man in „Exposes Annuels de Biochemie Medicale" 1963, S. 67-84).
Die vorteilhafte Arbeitsweise in basischem Medium ist daher eine unerwartete Eigenschaft der Erfindung, die in den oben genannten
Grenzen des pH-Wertes zum Ausdruck kommt..
Der pH-Wert des rohen Extraktes hangt von dem betreffenden Organ ab, so daß'der pH-Wert, der Extraktionsflüssigkeit
entsprechend dem letzteren gewählt werden muß.
Die für die - erfindungsgemäße Extraktion benutzte Flüssigkeit ist Wasser oder eine Pufferlösung, vorzugsweise Natriumdesoxicholat-phosphat
oder Tri(hydrox,ymethyl)aminomethan, N-tri-(hydroxymethyl)n]ethylglycin
oder ein anderer der in der Biologie üblichen Puffer (Handbook of Biochemistr7/-C.3.C.-Seite J.233)
Die Extraktion erfolgt zu zwei Zeiten: zuerst bei normaler oder wenig erhöhter Temperatur, dann in der Hitze bei
100 bis 11O0G. Nach einem besonderen Merkmal der Erfindung kann
dieser Vorgang in einer Stufe oder in mehreren Stufen erfolgen, jede Stufe bei einer Temperatur oder einer Temperaturfolge zwischen
Umgebungstemperatur und 110°C. I'ian kann insbesondere zuerst
zwischen 15 und 600C und dann in einer oder mehreren Stufen
zwischen 60 und 11O0C arbeiten. Bei .einer bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die erste Extraktion zwischen etwa 15 und 4-5 C, während die Temperatur im Laufe 3er folgenden Stufe(n)
80 bis 110 C beträgt. Die tiefsten Temperaturen werden vorzugsweise
bei den stärksten pH-Werten angewandt.
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Die ϋχ-traktionsdauer variiert selbstverständlich mit
der Art und der Konzentration des behandelten Naturstoffs, mit dem pH-Wert und mit der angewandten Temperatur. Ihr wesentliches
Merkmal in 3 ed er Stufe ist die Bildung einer-wesentlichen
Menge von Glykoproteinen und/oder Mucopolysaccharide^ an deren Auflösung
sich die Analyse anschließen kann.
Man kann den beim Zentrifugieren erhaltenen Bödensatz
ein zweites Mal extrahieren, indem man Wasser zugibt und die erneut auf einen pH-Wert von 8-9 eingestellte Suspension ggfs.
erhitzt und dann zur Gewinnung eines neuen Extraktes abermals zentrifugiert.
Generell enthalten die Extrakte Eiweißkomplexe in zuweilen beachtlicher relativer Menge, die weiter unten angegeben
ist: durch Warneeinwirkung werden sie nicht ausgefällt, wohl
aber durch Säuren (insbesondere Trichloressigsäure), Alkohol, Aceton usw.. Sie umfassen auch lösliche Glykoproteide, die mit einer
salzsauren Lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd die charakteristische Eot-Violet-Färbung ergeben.
Die Crganextrskte können erfindungsgemäß in relativ hohen Konzentrationen erhalten werden, beispielsweise etwa um
30%. Sie sind undurchsichtig und mehr oder weniger klebend.
Sie werden daher zum Verbrauch verdünnt und- auf eine Konzentration
von 5 bis 10/i eingestellt. Sie können gleichzeitig geklärt
und stabilisiert werden, 2.B. durch eine Mischung-sterilisierter
oberflächenaktiver Stoffe, wie z.B. Nätrxumlaurylsulfat
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oder andere Stoffe mit gleicher Wirkung, und/oder sogar durch
gemischte Lösungsmittel, Polyoxyäthylenäther 'und Phenoxypolyäthoxyäthanole,
die in der V/eise zugesetzt werden, daß sie im Endprodukt in geringer Konzentration in der Größenordnung von 0,5
bis 1 % vorliegen, Schließlich werden die Extrakte vollständig geklärt, und stabilisiert. Sie bleiben steril, ohne unangenehmen
Geruch, durchdringend, nicht klebend und ölig.
Die erhaltenen Extrakte finden Anwendung in der Hygiene und Kosmetik. Ihre Einarbeitung in verschiedene kosmetische Präparate
verbessert oder aktiviert die Präparate durch eine Hautaufnahme von Glykoproteinen und Ilucopolysacchariden zellular ei1
und hauptsächlich fötaler Herkunft. Man weiß seit kurzem, daß
.gewisse Glycoproteine fast genau fötalen Ursprungs sind und eine
große physiologische Aktivität auf die Zellen und Gewebe ausüben.
Eine andere Anwendung ist die von Fand emitfceln oder
Zusatzstoffen für Arzneimittel oder Substanzen von phjrsiologischem
Interesse.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen gesamten Extrakte sind für die Gefriertrocknung geeignet. Ein
wesentlicher Punkt ist jedoch, daß selche gefriergetrockneten
Produkte in sehr kleinen Mengen wässriger Lösungsmittel löslich sind, wodurch die Möglichkeit eröffnet wird,sie mit Fett-
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stoffen zu mischen. Es bildet sich dann unmittelbar nach kurzer
Rührung eine je nach den gewählten relativen Konzentrationen flüssige oder feste Emulsion, die dadurch gekennzeichnet
ist, daß die wässrige, konzentrierte, hauptsächlich aus Glyko-■nrotein
und fvucopolysaccharid. bestehende Phase in der Fettphase
suspendiert und das erhaltene Präparat sehr ölig und durch die Haut bemerkenswert absorptionsfähig ist. Dieses Präparat kann
daher nach V/u η sch. zur Zeit der Anwendung beispielsweise in einzelnen Dosen zubereitet werden oder es kann gelagert werden,
wobei es beständig bleibt.
Nach einem besonderen Ilerkmel der Erfindung können
die Organextrakte mit Lipid-Komplexen und selbst Extrakten anderer
Organe angereichert sein, die reich an Substanzen sind, wie Proteo- und Glykolipiden, Phosphatid en, Ephingolipiden,
Ceret)rosiden,Gangliosiden und sogar Sterinen. Diese Stoffe
können durch Er'-mrnen geeigneter Organe in alkalischem K ed ium
in einem natürlichen Gleichgewichtszustand erhalten werden. Besonders geeignet sind Extrakte aus fötalem Gehirn oder aus
weißem Knochenmark ,junger Tiere, wobei jedoch die Herkunft nicht
auf diese zwei Quellen beschränkt ist. Geivisse Lipide scheiden
sich hauptsächlich in der Kälte ab; es verbleibt aber eine Lipoproteidemulr:ion,die nan den erfindungsgemäßen Organextrakten
zusetzen kann. Es ist daher festzustellen, daß diese Mischung stabil und durchscheinend ist und die Fettigkeit und
dss Glei tvermögen steigert und die Extrakte durchdringt. Diese
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Eigenschaf tem sind noch, besser, wenn, die Lösung der Organextraktion
Durchdringungsstoffe, wie z.B. Natriumdesoxycholat, enthält.
Das Durchjringungsverraögen kann durch den folgenden
Versuch beurteilt werden: Man vereinigt die Extrakte mit Peroxydase,
man streicht sie auf die Haut und errittelt nach einigen Aufstreichungen auf histologischem Wege die so markierten Extrakte
bis in die Tiefe der-Lederhaut. Man stellt außerdem fest, daß
die Extrakte in den Wachstumszonen mit verstärktem Stoffwechsel angereichert sind.
Eine besonders brauchbare Anwendung des neuen Verfahrens ist die Herstellung von stabilem, flüssigem, pastenförmigem
oder pulverförmigem Milchserumextrakt. Diese Flüssigkeit oder
die wässrige Lösung, die aus der Paste oder dem Pulver gebildet wird, hat den Vorteil, daß sie eine weiße milchige wässrige Suspension
zurücktilden kann und beim Erwärmen keinen Niederschlag
bildet.
Die erste Stufe der Milchserumherstellung ist bekannt: Man fällt das Kasein der Milch durch ein bekanntes Mittel aus,
nämlich durch Zusatz einer Säure oder eines Enzyms. Bei der Durchführung
der vorliegenden Erfindung nimmt man die Ausfällung jedoch vorzugsweise mit Hilfe von Lab vor, übrigens in an sich
bekannter Weise. Die von dem Kasein getrennte Molke wird bis auf
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den weiter oben definierten rH-V/ert alkalisch gemacht und kurzzeitig,
im allgemeinen einige Minuten, auf die weiter oben angegebene Temperatur erhitzt. Beim Abkühlen fallen die wärmeempfindlichen
Proteine aus. Man trennt sie ab und sammelt die Flüssigkeit, die den erfindungsgemäßen KiIchserum-Extrakt darstellt.
Dieses Produkt wird dann ggfs. unter Vakuum konzentriert, vorzugsweise
bei einer nicht über 600C liegenden Temperatur. Das Produkt kann al er auch getrocknet oder durch Vernebelung (Zerstäubung)
pulverisiert werden, wobei man entsprechend der gewählten Maßnahme ein dickflüssiges Material, eine
Paste oder ein Pulver erhält.
Es ist zu bemerken, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die wärmeempfindlichen denaturierten Proteine entfernt
werden, die eine Art unerwünschten Ballast bei den verschiedenen Behandlungsverfahren des rohen Milchserums bilden, wie bei
der Vernebelung (Zerstäubung) und selbst der Entsalzung durch umgekehrte Osmose, Elektrodialyse, usw.. Diese Proteine liegen
in ziemlich geringer relativer Menge vor; sie sind aber lästig, weil sie ausfallen, und es ist zweckmäßig, sie zu entfernen.
Ohne diese Entfernung bildet das rohe Milchserum bei direkter ■
Vernebelung ein Pulver mit einem Gehalt an unlöslichen denaturierten
Produkten, die sich in Wasser abscheiden und eine braune überstehende Flüssigkeit zurücklassen.
Das erfindungsgercäße Verfahren, weist darüberhinaus
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zwei andere Neuigkeiten auf. Die Entfernung der wärmeempfindlichen
Proteine kann "bald nach dem Erhitzen, des alkalischen Milchserums
durch Zentrifugieren in der Hitze oder Filtration erfolgen, ohne daß es notwendig ist, eine Zwischenzeit einzuhalten.
Diese Möglichkeit hat eine Vereinfachung der Anlage und der Arbeitsgänge
zur Folge.
Außerdem können lösliche, ungiftige, durch den Menschen in den angegebenen Dosen verträgliche Substanzen, die
eine Funktion als Schutz ittel und Stabilisator haben, dem heißen Milchserumextrakt gleich nach der Ausfällung der wärmeempfindlichen
Produkte und vor der Konzentration oder Vernebelung zugesetzt werden. Solche Mischungen, die beim Milchserum während
der Trocknung ohne Löslichkeitsverminderung als Schutzmittel und Stabilisator wirken,können hochmolekulare Karboxyvinylpolymere
oder andere wasserlösliche, ungiftige Polymere sein, ggfs. in Verbindung mit geringen Mengen oberflächenaktiver
Stoffe, die selbst wasserlöslich und ungiftig sind.
Als Beispiel werden Mischungen von 0,5 % Karboxyvinylpolynerisafcen
in Wasser genannt. Es genügt, geringe Mengen solcher Stoffe dem Hilchserumertrakt vor der Zerstäubung zuzusetzen,
un einen f'chutzeffekt zu erzieler..
. Der nach dem erfindungsgemäEen Verfahren erhaltene,
flüssige, konzentrierte oder pulverförmige, wärmebeständige
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Kilchserumextrakt bietet sich für eine Benutzung auf verschiedenen
Gebieten an: Nahrungsmittel;industrieller, pharmazeutischer
oder kosmetischer Ausgangsstoff; Kulturmedien für liefen oder
Proteine oder andere Produkte erzeugende Mikroorganismen,
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Extrakte können nach dem Klaren, Stabilisieren und Sterilisieren
zur Herstellung von aktiven Präparaten dienen oder selbst Bindemittel oder Zusatzstoffe für therapeutische Substanzen mit
bekannten Eigenschaften sein. Diese Extrakte bilden beispielsweise
ausgezeichnete Schutzträger und Durchdringungsmittel für
auf die Pigmentierung einwirkende Stoffe, wie z.B. Dihydroxyaceton,
Salicyl säureester, p-Aminobenr.oe säure oder sogar
ITatriur.urocanat .Beispielsweise reagiert das Dihydroxyaceton
ir.it den Aminosäuren des Extraktes, insbesondere aus Placenta
oder II au τ, v/odurch seine Reaktion im Körper reguliert und physiologischer
und homogener gemacht wird. Man kann außerdem diede Reaktion dadurch intensivieren, daß man die Extrakte mit
gewissen Aminosäuren, insbesondere Arginin, anreichert.
V/enn man die erfincungsgemäBen Extrakte als Arzneistoff
bindemittel verwendet, wird die Aufnahme des Kedikaments
vom Knochen erleichtert, und es v/erden die allgemeinen Umsetzungen
erweitert. Außerdem wird das Druchdringungsvermögen durch die Hautabsorption wesentlich vergrößert.
509840/1 123
Diese verschiedenen biologischen stabilen und sterilen Extrakte, die entsprechend den Beispielen dargestellt werden, können
getrennt,mehr oder weniger konzentriert oder auf mannigfache
Art miteinander verbunden eingesetzt werden, wobei sie gelöst oder mit verschiedenen Bindemitteln gemischt oder gefriergetrocknet
sein können.
Die erhaltenen Extrakte bilden in Mischung mit geeigneten Bindemitteln Lösungen, Suspensionen oder mehr oder weniger
fließfähige Gele, die durchscheinend oder undurchsichtig, hellbeige oder ockerfarben, ölig und neutral sind und beispielsweise
auf der Haut auf die Dauer keine Reaktion oder Reizung verursachen, schnell eindringen und schließlich die Haut geschmeidig
machen und hydratisieren.
Die Extrakte, die - so wie sie erhalten wurden - ggfs. durch gasförmiges Kohlendioxid neutral eingestellt werden, unterstützen
die Trocknung oder Gefrierung und die Gefriertrocknung. Das Problem der Gefriertrocknung zeigt sich bei diesen
Extrakten jedoch von besonderer Seite, denn es handelt sich um wärmebeständige- Eiweißkomplexe, die daher auf 11O0C erhitzt
wurden und vor weiteren denaturierenden V/irkungen geschützt
werden nüssen. Es ist außerdem zweckmäßig, daß die sie in Lösung
bringenden Lösungsmittel die Eigenschaften der Ausgangslösungen (Viskosität, Durchdringungsvermögen usw.) wiederherstellen.
Selbst nach der Trocknung z.B. in einem Gebläse von
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80 G kann dieses Ziel erreicht v/erden, jedoch sind die durch Gefriertrocknung
erzielten Resultate eindeutig die besten.
Ohne -Zusatz der Schutzsubstanzen können die gefriergetrockneten
Produkte einen kleinen,- verhältnismäßig denaturierten Anteil enthalten, der nur ziemlich träge wieder in Lösung
geht, üie Erfindung besteht in der Auswahl von den Extrakten
vor der Gefriertrocknung zuzusetzenden Schutzsubstanzen, die selbst gefriergetrocknet v/erden können und keine Veränderung "bewirken,
sowie in der Auswahl von Mischungen, welche die erhaltenen Gefriertrocknungsprodiakte lösen. Mehrere unter solchen
Bedingungen benutzte Substanzen scheiden hier aus, denn sie verändern mehr oder weniger die Eigenschaften der Extrakte. Dies
ist beispielsweise der Fall bei ITatriumricinoleat, das jedoch
ausgezeichnete Gefriertrocknungsprodukte liefert.
Unter den möglichen wirksamen Substanzen, die man den Extrakten vor der Gefriertrocknung zusetzen kann, liefert
das liatriurnlau r.vlsulfat in geeigneter Menge und in unterschiedlichen
Kombinationen gute Resultate. Auf der anderen Seite kann das Lösungsmittelgenisch ein Fuffersystem und ggfs. Durchdrin-'
gungsstoffe in einer zur Denaturierung nicht ausreichenden Dosis,
wie z.B. Ilatriumuesoxycholat, enthalten. Die Zugabe von
r-gch der Erfindung ei^nall-enen: Speichel extrakt oder Hilchseruin-
-„-xtrakt ergibt ausgezeichnete Lösungsmittel, ο ie- ihre Eigenschaften
'it.nen ''es Gefriertrocknv.ngsprodiiktes hinzufügen«
509840/1123
Unter diesen Bedingungen v/erden selbst die en Glycoproteinen
und Hucopolysacchariden reichen Extrakte, insbesondere
Nabelschnur, Schleimhäute, Haut, Gehirn, Placenta, Knorpel, die genannten Flüssigkeiten usw., nach einmaliger Gefriertrocknung
durch eine.geringe Menge geeignetes Lösungsmittel unmittelbar
und vollständig wieder in Lösung gebracht. Die so wiederhergestellten konzentriercen Lösungen haben die physiologischen
Aktivitäten der Ausgangsextrakte behalten.
Bei Verabreichung der Extrakte durch die Haut erfol.rt
schnelle Resorption und es werden den Häuten die biologischen, fötalen und anderen so dargestellten Faktoren zugeführt. Ihre
Zuführung in neutraler Lösung oder nach der Gefriertrocknung
gestattet in vorteilhafter V/eise ihre Verwertung auf dem Verdauungswege.
Die nach den angegebenen Verfahren erhaltenen Extrate können getrennt oder miteinander vereinigt mit oder ohne
Bindemittel verwendet werden. Sie können erfindungsgemäß einerseits
in. menschliche Extrakte , wie Extrakt aus ITabelschnurgallerte,
Placentaextrakt, Extrakt des menschlichen Blutserums usv/., und andererseits in andere, tierische oder pflanzliche
Extrakte , wie ζ. B. Extrakt aus Cchleirdisut;, Haut, Placenta,
Gehirn, Knorpel, Knochenmark5 verschiedener Zellen usw., oder
auch von Milchserum, Speichel extrakt. Blutserumextrakt, Samensaftextrakt-j
Extrakt von Reaktionsflüssigkeiten usv;» oder auch
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Extrakte von Mikroorganismen verschiedener Kulturen, Extrakte
vor Hefen, Algen, Pilzen, Samenkörnern usw., aufgeteilt werden.
Zur Verbindung können die Extrakte nach der Mischung der Ausgangsstoffe
urin, ggfs. Konzentrierung hergestellt v/erden.
Ein generelles, sehr wichtiges Kennzeichen der Erfindung lesteht darin, daß alle diese erhaltenen Extrakte viär-T.eLeständig
sind und einzeln oder in Kombination miteinander
oder rr.it anderen geeigneten Cubstanzen nach ihrer Konditionierung
in jeden Falle zum Schluß einer erneuten Sterilisierung in Autoklaven unterzogen werden können.
Heben den allgemeinen Eigenschaften, die dargelegt
•wurden, zeigen diese bakteriologisch sterilen Extrakte und Zubereitungen
bei Auftragung auf die Kaut behendere Eigenschaften.
Sie wirken in wohltuend er Weise auf gereizte Bereiche, Erythema
to sen, Entzündungen, Verletzungen infolge leichter Brandwunden
oder bei gewissen dermatologischen Reaktionen.
Die Wirkung dieser Präparate kann in verschiedener V/eise verstärkt werfen, denn sie unterstützen die Einführung bekannter
Aktivstoffe ebne Zerstörung ihrer Stabilität, ohne Entmischung oder einen wesentlichen Viskositätsabfall, wenn sie in
Form einer Lösung oder eines Gels verabreicht werden. Diese Einführung kann auch vor der Gefriertrocknung erfolgen.
509840 /112 3
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu begrenzen. Beispiele 1 bis 7 dienen der Erläuterung des
erfindungsgemäßen Verfahrens der Extraktion und der Herstellung aus unterschiedlichen Ausgangsstoffen: menschliche oder tierische
Organe, Gefriertrocknungsprodukte, Flüssigkeiten lebender
Organismen, insbesondere HiIchs erum. Eg ist jedoch verständlich,
daß das Verfahren generell Bedeutung hat und auf andere Organe, Flüssigkeiten und Bildungsprodukte von Organismen anwendbar ist.
Beispiel
Λ
Extraktion aus menschlicher oder tierischer Nabelschnur Man weiß, daß die Nabelschnur eine besondere natürliche Gallerte
hoher Viskosität enthält (V/arton-Gallerte der menschlichen
Nabelschnur), die mit wichtigen Schutzeigenschaften ausgestattet
ist. Sie wird im wesentlichen aus Mucoproteinen, Hyaluronsäure
und unterschiedlichen Anteilen anderer Begleitsubstanzen, wie Proteinen, Lipiden und Gluciden, gebildet. Man weiß, daß
öle relative Viskosität des Salzes der Hyaluronsäure durch die Gegenwart von Elektrolyten 'stark beeinflußt wird, xvas zur Orientierung
bei der Extraktherstellung beiträgt.
Beispielsweise werden die gesunden, menschlichen nicht steril gesammelten Nabelschnüre unter einem V/asserstrahl
gewaschen. Das Blut wird aus den Blutgefäßen entfernt, insbesondere
durch Ausdrücken unter Wasser durch Druck von einem Ende zum anderen (beispielsweise mit einer Walzenmaschine).
509840/1123.
Sie werden in Bruchstücke zerschnitten oder zerhackt und erneut gewaschen. Das verbliebene Hämoglobin wird durch kurzes Eintauchen
in sauerstoffhaltiges Wasser entfernt. Die Bruchstücke werden dann kräftig getrocknet; sie sind weißlich-beige gefärbt.
Die Untersuchungen haben gezeigt, daß das mittlere Gewicht Jeder Nabelschnur bei einer ausreichenden Zahl praktisch
17 bis 18 g betrügt: die Extraktion erfolgt mit destilliertem '//asser odor durch den ITatriumdesoxycholat-Puffer von
0,26 %-Tris, wobei man mit einem Gewichtsverhältnis von Gewebe zu Extraktionsflüssigkeit entsprechend den angestrebten Zwecken
arbeitet.
Die Suspension der Kabelschnurteilchen wird durch einen Zerkleinerer mit hoher Drehzahl (z.B.Mahlwerk „Polytron"
oder ein „Kolloidal" genanntes Mahlwerk mit kontinuierlicher Aufgabe oder andere) fein zerkleinert. Das erhaltene zerkleinerte
Gut wird durch gewöhnliche Soda auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. Seine Viskosität steigt dann beträchtlich: Es handelt
sich um einen weißen undurchsichtigen Lein. Man läßt die
Extraktion beispielsweise bei 57 G während eines Zeitraums von
2 Stunden vor pich gehen.
Die Zubereitung wird dann im Autoklaven beispielsweise auf 1000C bei abströmendem Dampf oder auf 1100C eine Zeitdauer
erhitzt, die im Verhältnis zu der.behandelten Masse steht.
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Man läßt abkühlen und dekantiert bei Umgebungstemperatur nach
beispielsweise 24 Stunden, fiese Arbeitsweise, die tatsächlich
einer zweiten Extraktion entspricht, erzeugt eine Anreicherung an gelösten ocer suspendierten Eiweißsubstanzen, wie es die Gewichtstestinimungen
beweisen. Zweckmäfiigerweise wird die Flüssigkeit
dann zentrifugiert oder durch eine Filterpresse geschickt.
Der rückstand kann mit Wasser erneut extrahiert werden,
wobei seine Suspension wiederum alkalisch gemacht, beispielsweise auf einen pll-V/ert von 9 eingestellt: und dann im Autoklaven
auf beispielsweise 11O0C erhitzt wird,wodurch es möglich ist,
einen denaturierten Rückstand von der überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren oder Filtrieren zu trennen. Diese Flüssigkeit
aus der wiederholten Rückstandsextraktion ist sehr undurchsichtig.
Sie kann dem Hauptextrakt zugesetzt oder bei getrennten Verwendungen eingesetzt werden.
Der erhaltene Extrakt ist blaßgelb, durchscheinend, viskos und von mäßiger Opaleszenz. Sein pll-V/ert liegt zwischen
7 und 7,5; wenn dieser pH-Viert höher liegt, nuß er je nach Abhängigkeit
beispielsweise von der Art des Bindemittels, das später eingemischt werden soll, eingestellt werden. Diese Einstellung
kann durch Einblasen von gasförmigem Kohlendioxid, nicht durch Zusatz von HGl erfolgen.
Die biochemische Analyse zeigt, daß diese Extrakte Mucoproteine und deren Folge- oder Bep;leitsubc;tanzen, sowie -
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selbst nach Erhitzung unter den angegebenen Bedingungen - · Proteine enthalten, die durch verschiedene Tests, insbesondere
durch Elektrophorese, feststellbar und bestimmbar sind. Es ist naher so, da.: selbst bei einem Verfahren mib Erhitzung auf 110 C
die Pro t ei ns\ibs tanzen bei Bestimmung beispielsweise nach der
Ketho^e von Löwry 5 g %'° überschreiten kennen. Diese wärmebeständigen
Extrakte unterstützen die nach der Konditionierung zum
Schluß wiederholte Sterilisation.
Beispiel 2
Extraktion aus menschlicher oder tierischer Placenta
Gesunde Placenta wird reichlich unter einem Wasserstrahl
gewaschen. Sie kann ggfs. einer schnellen Kreislaufwäscht;
beispielsweise mir einer Trinatriumcitrat-Lösung oder
selbrt mit "Wasser unterworfen" werden. Diese Wäsche erfolgt mit
einer Spritze oder einer Waschflasche erst 'lurch die eine und dann durch die andern der zwei Nabeladern. Die Placenta wird
dann ar genau4, ο+, und aus ihren festen Bindestrukturen befreit.
Nach dieser .,Reinigung." wird das Placentage'/ebe zerteilt, von
neuem mit /asser gewaschen und dann an der Luft getrocknet.
Das Hämoglobin der Teilstücke kann nötigenfalls durch Eintauchen
in eauerstoffhaltiges Wasser entfärbt werden. Die Endtrocknung
erfolgt '-odann ~urch kräftigen Liruck.
Die Extraktion kann bis zu einer gewünschten Konzentration durch destilliertes Wasser erfolgen oder vorzugsweise durch
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einen Puffer nach Art des Katrj uindesoxycholats von 0,26 %-tris,
der auf den gewünschten pH-Wert eingestellt ist.
Verwendung der gefriergetrockneten. Extrakte :r-loroentanherstellung
eines einzelnen Cremes '
Das Gofriertrocknungsprodukt, welches 2 ml der nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren dargestellten Organextrakte entspricht,
wird in. 1 ml sterilem, in einer Ampulle enthaltenem
Lösungsmittel gelöst, das aus einem Puffer mit Milchserumextrakt besteht.' Die so erhaltene konzentrierte Lösung v/ird sogleich
durch sehr kurzes Aufrühren von Hand in 10 ml fettem., sterilem
Bindemittel emulgiert, das aus einer Mischung von 80 % Polyoxyäthylenäthern,
10 % Fettalkoholen und 10 % Süßmandelöl besteht.
Man erhält unmittelbar eine Crememenge, in der die .biologischen Extrakte gelöst und in der wässrigen Phase konzentriert sind,
die ihrerseits in der Fettphase emulgiert ist. Diese Emulsion ist ein festes, homogenes, weißes, äußerst fettiges, stabiles,
steriles, kosmetisches Präparat, das im Laufe des Gebrauchs nicht infiziert wird. Dieser bakteriologisch sterile Creme wird
bemerkenswert stark durch die Haut absorbiert, die durch ihn zugleich geschmeidig gemacht, hydratisiert u-nd eingefettet wird.
Er zeigt mehrere kosmetische und hygienische Vorteile.
Feispiel 4
Extraktion aus Speichel
Die Extraktion von Hucin kann aus verschiedenen Mucin
erzeugenden Organen erfolgen: Schleimhaut des Verdauungstraktes,
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Speicheldrüsen uni andere Speichel erzeugende Organe, die selbst
wirbellosen Tieren entnommen wurden.'In diesen Fall kann die Methode befolgt werden, die oben für menschliche Nabelschnur
beschrieben wurde.
Das Beispiel des Speichels wurde gewählt, weil es eine gi'oße Bequemlichkeit erlaubt und eine verhältnismäßig
reichlich vorhandene Quelle darstellt. Der Speichel wird von Rindern geliefert, deren Speichelfluß in bekannter Weise durch
Einwirkung von Pilocarpin angeregt ist. Man weiß, daß man unter diesen Bedingungen eine reichliche Speichelgewinnung erreichen
kann (zur Anschauung sei gesagt, daß der Speichelfluß bei einem Eind in 24 Stunden einige Dekaliter betragen kann). Dieser gesamte
Speichel ist vor allem durch den Unterzungenspeichel an
Mucinen angereichert. Er ist normalerweise alkalisch, beispielsweise mit einem pH-Wert von 8,5·
Der G^samtspeichel wird auf einem Gazefilter vorbehandelt
und dann unmittelbar bei beispielsweise 11O0C während einer
von der zu behandelnden Masse abhängigen Zeit im Autoklaven behandelt.
Am Boden des Behälters haftet dann eine dünne Niederschlagsschicht. Das Produkt wird dann in der Kälte beispielsweise
einen bis riehrere Tage gelagert, was dazu führt, daß sich
eine weitere kleine nichthafter.de iiieaerschlagsmenge absetzt.
Die Flüssigkeit wird dann zweckmäßigerweise zentrifugiert oder filtriert. Sie ist durchsichtig und viskos und hat einen pH-Wert
von 8 oder etwas darüber. Nach der Methode von Löwry werden da-
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rin etwa 1 g 7-o Proteine oder etwas mehr nachgewiesen. Die Elektrophorese
zeigt darin wenigstens zwei Proteinarten an. Dieser sterile Mucoproteine enthaltende Speichelextrakt, ist dann von
großer Stabilität. Er kann z\i verschiedenen Präparaten oder Kischungen
dienen und unterstützt eine nach der Konditionierung
zum Schluß durchgeführte erneute Destillation.
Kilchgerum "
Das nilchserum wird hauptsächlich aus Kuhmilch nach dem üblichen Verfahren hergestellt (Entrahmung, saure oder enzymatische
Kaseinausfällung, Abseihung, Zentrifugieren oder
Filtration). Wenn das Milchserun durch bakteriologische Filtration
sterilisiert wird, ist es eine goldgelbe, klare, nicht vis kose, saure Flürsigkeit: ihr pH-V/ert kann bei 4- oder 5 liegen.
Es kann nach der Bestirnmungsraethode von Löwry G g %e Proteine
enthalten. Kach der Ausfällung durch Erhitzen bei einem sauren
pH-Vert wird ihr Proteingehalt geringer.
Die Erfindung beruht insbesondere auf der Tatsache, daß das erhaltene Produkt unterschiedlich ist, wenn das Ililchseruir.
vorab bin auf einen pH-V/ert von 3 alkalisch gemacht und
dann im Autoklaven auf 11O0C erhitzt wird.. Dieser Hydroljrsegrad
erlaubt es tatsächlich, außer dem Niederschlag eine blaß orangefarbene
Flüssigkeit zu gewinnen, deren pH-Wert während der Erhitzung abgenommen hat, z.P, bis auf etwas unterhalb pH = 7·
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Nach der für die Abkühlung.und Extraktion erforderlichen Zeit
kann man wie oben erwähnt durch Zentrifugieren einen Rückstand
von einer blaß orangefarbenen, opaleszierenden, bemerkenswert stabilen Flüssigkeit trennen, die beim Erhitzen keinen neuen
Niederschlag mehr bildet und aus der sich auf die Dauer nichts
mehr abscheidet. Diese Flüssigkeit behält einen relativ hohen Gehalt an Eiweißstoffen, beispielsweise bei Bestimmung nach der
Ketho^e von Löwry 5,5 g%", d.h. die Konzentration der Proteinsubstanzen
liegt ziemlich nahe bei der des sauren, filtrierten, nicht erhitzten VdIchserums. Die Elektophorese zeigt in der Flüssigkeit
nach dem Erhitzen wenigstens zwei Arten von Proteinen an.
Dieses Darstellungsprinzip durch alkalische Hydrolyse
mit geeigneter Erhitzung ist gleichermaßen auf andere Flüssigkeiten von Organismen anv/en^bar: menschliches νηδ tierisches
Blutserum, Ssmenflüssigkeit, Reaktionsflüssigkeit der Bauchwassersucht
oder euch auf Kulturen von Mikroorganismen, Bakterien,
Pilzen, insbesondere Hefen usw.. Die Extrakte können in diesen Fällen einer entsprechend den vorgeschlagenen Zwecken mehr
oder weniger kräftigen Konzentrierung unterworfen werden und
halten eine erneute Sterilisierung im Autoklaven nach der Konditionierung
auo.
Trockenes konzentriertes Kilchserum
In bekannter Weise wird Lab der Kuhmilch zugesetzt, und das in-
In bekannter Weise wird Lab der Kuhmilch zugesetzt, und das in-
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folge dieser Zugabe ausgefallene Kasein wird durch Filtration oder Zentrifugi-eren abgetrennt. Der erhaltenen Molke wird ein
wenig konzentrierte Soda zugesetzt, so daß ihr pH-Wert sich auf 8 einstellt. Die Flüssigkeit wird dann 5 Minuten auf 800C
erhitzt. Es bildet sich bald ein weißer Hied erschlag aus denaturierten,
wärmeempfindliehen Proteinen. Kan trennt sie im Hinblick
auf eine mögliche Verwendung ab. Dieser Rückstand stellt etwa 1 Gew.-ζέ der behandelten Flüssigkeit dar. Die Abtrennung
liefert einen blaßgelben, schwach grünlichen, opaleszierenden Kiich.·
serumextrakt mit einem pH-Wert von etwa 7»S, der je Liter
5,5 S wärmebeständige Proteine enthält, lach der Konzentrierung
bei 600C liefert die Flüssigkeit ein pastenartiges, weißgelbes
Produkt oder eine konzentrierte Molke. Bei einer anderen Zubereitung wird das pastenartige Produkt bis zum hrreichen des
festen Zustand es getrocknet und durch Zerkleinern pulverisiert oder durch Zerstäuben pulverförmig gemacht. Eine Schutzwirkung
erhält man durch Zugabe.geringer Kengen von Produkten, wie
z.B. Mischungen von 0,5 % karboxylhaltlgen Polymerisaten in
'Wasser. Das se erhaltene Pulver besteht zu 10 Gew.-% aus wärmebeständigen
Proteinstoffen, etwa 75 Gew.-% Gesamtgluciden
(Hexosen, hauptsächlich Lactose, begleitet von einem geringen
Anteil anderer Zucker, insbesondere Glukose und Galaktose), etw8 5 bis 7 Gew.-% Gesamtlipiden und 6 Gew.-h Mineralsalzen.
Das pastenförmige Hilchserum und das zugehörige Pulver halten
sich gut und lassen sich leicht mit Wasser in Lösung bringen.
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Gelierte und mit ilnhrungsstoffen angereicherte Mlchserumkonzentrate
Lie Verfahren zur Herstellung von Milchserumextrakten
führen zu konzentrierten, gelierten, in verschiedener Weise angereicherten
Präparaten.für die Ernährung.
In diesem Fall wird das Ililchserum während etwa 10 Einuten
auf 80 G erhitzt, was ausreichen-! sein kann, so daß die
Konzentration dann das vier- bis fünffache beträgt.
Diesem Konzentrat setzt man ein Geliermittel zu, Gelose,
Alginate oder ein anderes, beispielsweise ein Carrageenan, wie des „Catiagel", deren Menge 0,6 bis 0,8 g % betragen kann.
Das Präparat wird in dieser Form benutzt oder entsprechend dem gewünschten Zweck mit Zusatzstoffen, wie Zucker, Schokolade,
Vanille, Fruchtsaft oder -pulpe oder anderen Aromen oder in Form jeder anderen ilahrungsrnitt;elzubereitung.
Kach der Konditionierung werden die Produkte 30 Minuten
bei 110°C im Autoklaven sterilisiert. Während die nicht im
Autoklaven behandelten Präparate mit den angegebenen Geliermittelraen;;en
flüssig bleiben, bilden sie nach der Autoklavenbehandlung
und Abkühlung homogene, helle oder 'entsprechend den aufgenommenen
Zusatzstoffen verschieden gefärbte, sterile, beständige
Gele mit angenehmem Geschmack und gewissem Nährwert. Wenn
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dagegen die wörmeunbestöndigen Proteine nich't vorweg entfernt
wurden, sind die Produkte klumpig und nicht befriedigend.
Solche Kilchserumkonzentrate haben einen pH-Wert von
etwa ?.♦ Sie enthalten bei einer 4· bis 5fachen Konzentration
je Liter 20 g oder mehr- wärmebeständige Proteine, etwa 5 S ^esamtlipide
und 20 bis 22 %> Gesamtasche. Der Gehalt an Mineralsalzen
kann - falls erforderlich - durch Ionenaustauscherharze, z.B. durch einfache Mischung und Rührung, oder durch jedes andere
Verfahren herabgesetzt -.-/erden. Das Gewicht der gesamten
Trockenmasse des Konzentrats erreicht bis zu 300 g je Liter.
Kur?; zusammengefaßt betrifft die Erfindung die Extraktion
und Behandlung von Glykoprokeinen und/oder Mucopolysacchariden
(Proteoglucane, Glucosaminglucane) und· deren Begleitsubstanzen
aus natürlichen Stoffen, insbesondere Geweben von tierischen, kryptogamischen, bakteriellen und anderen pflanzlichen
Organi-smen oder aus Substanzen, die durch diese Organismen gebildet
werden.
Der Stoff wird in einer Stufe oder in mehreren Stufen
zwischen Umgebringstemperatur und 110 G mit '/lasser oder mit;
Puf f er substanz fin mit einem pH-.-/ert von 7i5 bis 9,5 behandelt.
Die ausgefällten Feststoffe werden abgetrennt und dabei der rohe Extrakt geklärt und stabilisiert und ggfs. mit Fettstoffen
gemischt, die Insbesondere aus Organextrakten stammen können,
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Claims (14)
- die im mtürlichen Gleichgewicht kosplexe Lipide enthalten.Die neuen sehr beständigen Extrakte sind besonders für wässrige, fette oder trockene Kassen zur industriellen, thera-Deutischen oder kosmetischen Verwendung geeignet. Eine wichtige Anwendung ist die Zubereitung eines flüssigen, pastenform!gen oder pulver form! gen Kilchseruir.extraktes, der sehr beständig und löslich ist und beim .Erhitzen keinen Niederschlag ergibt. Die Extrakte können nach der Konditionierung zum Schluß erneut sterilisiert werden. - '509840/1123PatentansprücheMJ Verfahren zur Extraktion von Glucoproteinen und/ oder Mucopolysacclisriden (Proteoglucanen und Glucosaminglucanen) und deren Eegleitsubstanzen aus natürlichen Materialien durch deren Behandlung nit einem xvässrigen basischen Kedium allein oder in Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß flau das Behändlungsmedium auf einen pH-V/ert zwischen 7,5 u-^ 9,5, vorzugsweise zwischen 8 und 9 puffert, die Extraktion durch leichte Hydrolyse bei tiefer Temperatur durchführt, dann in einem Autoklaven auf 11C0G erhitzt und dekantiert, zentrifugiert oder filtriert.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion mit Wasser oder einer basischen wässrigen Pufferlösung durchführt, vorzugsweise auf Basis von Katriumdesoxycholat, Phosphat oder Aminomethan oder Trihydroxymethylglycin.
- 3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt durch Zusatz einer Mischung eines oberflächenaktiven Mittels, eines oder mehrerer Polyoxyäthylenather und von Phenoxypolyäthoxyäthanolen klärt und stabilisiert.5098AO/1123
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer Hydrolysezeit von 1 bis-12 Stunden, vorzugsweise von 3 Stunden, und einer Dauer der Erhitzung auf 110 G von O,?5 bis 5. Stunden arbeitet.
- 5· Verfahren-nach einen der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt nach der Konditionierung erneut sterilisiert.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5> dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gewebe eines tierischen, menschlichen, erwachsenen oder jungen, kryptogairdschen oder bakteriellen Organismus als Ilaturstoff oder eine von einem solchen Organismus gebildete Substanz extrahiert.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche Λ bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gewebe eines pflanzlichen Organismus, insbesondere ein Hülsengewächs oder eine Alge, als Ilaturstoff extrahiert.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Kolke unter Bildung eines beständigen Milchserumextraktes behandelt.
- 9. Verfahren noch Anspruch δ, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-'./ert der Kolke auf 8 einstellt, die Flüssigkeit509840/1123einige Minuten auf 80 G erhitzt, dann den gebildeten Niederschlag abtrennt und vorzugsweise die ei as Ki Ich serum bildende klare Flüssigkeit konzentriert.
- 10. Milchserum,das nach dem Verfahren der Ansprüche 8 oder 9 hergestellt ist, in flüssiger, pnstöser oder fester Form, dadurch gekennzeichnet, dgß dip wässrige Lösung beim Erhitzen keinen Niederschlag bildet.
- 11. Milchserum nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt eine Schutzsubstanz, insbesondere ein oder mehrere Karboxyvinylpo^/merisate, und oberflächenaktive Verbindungen, insbesondere Natriumlaurylsulfat oder gleich wirkende Stoffe, und Polyoxyäthylenäther enthält.
- 12. Verwendung eines nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 9 hergestellten Extraktes für therapeutische oder kosmetische- Präparate.
- 13· Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat gebildet wird durch einen Extrakt, eine Extraktmischung oder eine Lösung eines Gefriertrocknungsproduktes des oder 'der in einer geringen Ilenge '.-/asser oder Lösungsmittel gelösten Extrakte, die mit einer Fettsubstanz enulgiert sind und Vorzugspreise komplexe Lipide im Zustand des natürli-50984 0/1123chen Gleichgewichts und Extrakte aus denselben Organen, insbesondere von Fötalgehirn oder λ^οη Knochenmark enthalten.
- 14. Verwendung eines Extraktes, der nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt ist, zusammen mit Stoffen mit pharmakoclyriamischer oder physiologischer Wirkung auf die Haut, vorzugsv;eise mit Lihydroxyaceton oder gleichwirkenden Stoffen, insbesondere in Gegenwart von Aminosäuren,, wie z.B. Arginin, als Zusatzstoffe.509840/1123
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