DE1667907C2

DE1667907C2 - Verfahren zur Gewinnung von Mucopolysacchariden aus Rinder- oder Schafsfeten und die Mucopolysaccharide enthaltende Haarpflegemittel

Info

Publication number: DE1667907C2
Application number: DE19681667907
Authority: DE
Inventors: Claudine Paris Berrebi; Georges Manoussos
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1967-03-24
Filing date: 1968-03-19
Publication date: 1983-04-21
Also published as: BE712619A; IT1009009B; LU53280A1; DE1667907A1; GB1198005A; FR1582828A; CH500714A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Mucopolysaccharide!! aus Rinder- oder Schafsfeten und Haarpflegemittel, die diese Mucopolysaccharide als Wirkstoffe enthalten. *o

Von der Anmelderin wurde bereits vorgeschlagen, den Haarausfall und die Seborrhöe mit Hilfe einer kosmetischen Zubereitung zu bekämpfen, die Fruchtwasser enthält, das Wiederkäuern während eines Trächtlgkeltszeltraums entnommen worden ist, der weniger als etwa 40% der Gesamtdauer der Trächtigkeit beträgt. Solche Zubereitungen können beispielsweise mit Vorteil ein Fruchtwasser enthalten, das einer Kuh In einem Trächtigkeltsstadium von ungefähr 75 Tagen entnommen wurde.

Weiterhin Ist von der Anmelderin vorgeschlagen wor- ^Μ den, den Haarausfall mit Hilfe einer kosmetischen Zubereitung zu bekämpfen, die als Wirkstoff wäßrige Extrakte der Haut von Rinder- oder Schafsfeten enthält. Die Wirkstoffe dieser Zubereitungen sind aus Rinderfeten mit einem Gewicht von 0,8 bis 2 kg oder aus Schafsfeten mit einem Gewicht von 0,5 bis 0,9 kg gewonnen worden, deren Haut nach dem Zerkleinern bzw. Zermahlen einer extrahierenden Behandlung mit reinem Wasser unterworfen wird.

Aus »Parfümerle und Kosmetik«, 39. Jahrgang (1958) ^M Nr. 1/58, Selten 11 bis 16, Ist es bereits bekannt, das Haarwachstum durch Aminosäuresole zu fördern, die man durch fraktionierte Hydrolyse aus verschiedenen natürlichen Proteinen gewinnen kann.

Es wurde nun von der Anmelderin gefunden, daß man In bestimmter Welse Mucopolysaccharide aus Rinderoder Schafsfeten gewinnen und mit Erfolg zur Behandlung von Haarausfall und Seborrhöe einsetzen kann.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren gemäß den Patentansprüchen 1 bis 4 und ein Haarpflegemittel, das In dieser Welse aus Rinder- oder Schafsfeten gewonnene Mucopolysaccharide enthält.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man als ionenhaltlge Lösung eine einfache Lösung eines Salzes, einer Säure oder eilner Base oder einer lonlslerbaren organischen Verbindung, wie eines Phenols, in Wasser verwenden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man eine physiologische Serumlösung.

lonlslerbare Verbindungen, die erfindungssemäß in den lonenhaltlgen Lösungen enthalten sein können, sind:

Neutrale Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Lllhlumchlorld, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, in einer Konzentration von 0,1 bis 2,5 Mol/l und vorzugsweise In einer Konzentration von 0,4 Mol/l;

saure Salze, wie Kaliumphosphat oder Natriumphosphat, In Lösungen mit einer Konzentration von 0,1 Mol/l und einem pH-Wert zwischen 6 und 8 oder Natrlumcltrat oder Kallumcltrat In Form von Lösungen mit einer Konzentration von 0,1 Mol/l und einem pH-Wert zwischen 3 und 5;

Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, in Form von 0,5-n-Lösungen mit einem pH-Wert von 1,5;

Basen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak, Calciumhydroxid oder Bariumhydroxid, In Form von 0,3- bis 0,5-n-Lösungen mit einem pH-Wert von 8 bis 9; und

organische Verbindungen, wie Harnstoff, In Form von Lösungen mit einer Konzentration von 6 bis 8 Mol/l mit einem pH-Wert von 6 oder Phenol In Form einer 2%lgen Lösung.

Es 1st ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren sich von dem früheren vorstehend erwähnten Verfahren der Anmeluerln dadurch unterscheidet, daß man In gleicher Welse Nabelschnüre verwenden kann und daß es nicht notwendig Ist, die Hauttelle der Feten In einem besonderen Trächtlgkeltszustand zu entnehmen und daß schließlich der Wirkstoff durch Extraktion mit einer lonenhaltlgen Lösung und nicht mit reinem Wasser erhalten wird.

Andererseits Ist es erfindungsgemäß wesentlich, die Wirkstoffe der Hautdecke und der Nabelschnur zu extrahieren, da die unter denselben Bedingungen erhaltenen Extrakte, sofern sie anderen Ursprungs sind, nicht das gleiche kosmetische Interesse besitzen, selbst wenn sie von Rinder- oder Schafsfeten stammen.

Gemäß einer ersten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung gefriert man zunächst die Hautdecke der Feten, zerreibt sie und unterwirft sie dann einem enzymatlschen Abbau In einer lonenhaltlgen Lösung. Diser Abbau kann vorteilhafterweise mit Hilfe von Enzymen aus der Gruppe der proteolytlschen Enzyme, wie Protelnase, Papaln, Pepsinen und Trypsin, bewirkt werden. Dieser Abbau sollte vorzugsweise ohne Entfernung der Lipide bewirkt werden. Er dient Im wesentlichen dazu, einen solchen Abbau bzw. Aufschluß der Proteinsubstanzen zu bewirken, daß die Mucopolysaccharide freigesetzt werden, die erfindungsgemäß gewonnen werden sollen.

Der durch den enzymatlschen Abbau erhaltene Brei wird dann einer Dialyse gegen destilliertes Wasser unterworfen, nachdem er zuvor vorzugsweise zur Abscheidung der festen Anteile zentrifugiert worden Ist. Nach dem Abfiltrieren der die Wirkstoffe enthaltenden Lösung fällt man die Wirkstoffe durch Zugabe von absolutem

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Alkohol und Natriumacetat aus. Der Niederschlag kann dann beispielsweise durch wiederholtes Waschen mit Alkohol, mit einer AlkohoS/Äther-Mischung und mit Äther gereinigt werden und wird dann getrocknet. Der in dieser Weise erhaltene Wirkstoff liegt in Form eines wel· ßen Pulvers vor, das In Wasser und physiologischen Serumlösungen löslich ist.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gefriert man die Hautdecke und die Nabelschnüre, behandett sie nach ihrem Zerklelnern in einer ionenhaltlgen Lösung, wie einem physiologischen Serum, ohne zuvor die Lipide zu entfernen. Man zentrifugiert dann und fällt die In der überstehenden Flüssigkeit enthaltenen aktiven Bestandteile mit Lösungsmitteln, wie absolutem Alkohol, Aceton etc. oder quaternären Ammoniumderivaten, wie Cetyltrimethylammonlumbromld oder Cetylpyridinlumchlorid, aus. Man reinigt den Niederschlag dann durch Wascnen mit absolutem Alkohol und mit einer Alkohol/Äther-Mischung und erhält nach dem Trocknen ein weißes Pul- ver, das In Wasser und physiologischen Lösungen löslich Ist.

Erfindungsgemäß werden alle diese Herstellungsmaßnahmen unter sterilen Bedingungen und bei niedriger Temperatur, beispielsweise bei einer Temperatur von + 4⁰C, durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Haarpflegemittel erhält man dadurch, daß man den Wirkstoff, den man In der oben beschriebenen Welse erhalten hat, In einen geeigneten kosmetischen Träger In einer Konzentration einbringt, die Innerhalb relativ welter Grenzen variieren, beispielsweise zwischen \% und 4%, liegen kann.

Die erfindungsgemäßen Haarpflegemittel können In Form einer wäßrigen Lösung des Wirkstoffs oder in Form von Emulsionen, Cremes oder Gelen vorliegen. Die kosmetischen Zubereitungen können weiterhin andere kosmetische Hilfsmittel, beispielsweise Farbstoffe, Duftstoffe, Eindringmittel und Emulgiermittel enthalten. Es ist weiterhin von Vorteil, den erfindungsgemäßen Haarpflegemitteln Konservierungsmittel zuzu- *o geben, wie Produkte auf der Grundlage von Natrlummerthlolat, oxidierten Benzoatderlvaten oder Hexachlorophen.

Aufgrund von Analysen scheint es so zu sein, daß es sich bei den Wirkstoffen um Mucopolysaccharide han- « delt, da diese Verbindungen nach der Elektrophorese charakteristische Reaktionen mit Acridinorange und Toluidlnblau eingehen. Es Ist jedoch nicht möglich, die chemische Natur sämtlicher Bestandteile der gewonnenen Wirkstoffe genau zu definieren, wobei sich gezeigt hat, daß man wesentlich schlechtere Ergebnisse dann erhält, wenn man andere Tiergewebe, beispielsweise Nieren oder Leber, extrahiert, die ebenfalls verschiedene Wirkstoffe enthalten, die auch als Mucopolysaccharide angesprochen werden können. Allein die Tatsache, daß es sich bei den Wirkstoffen um Mucopolysaccharide handelt, ermöglicht keine Definition der Wirkstoffe, da sie wahrscheinlich weitere Bestandteile enthalten und andererseits der Ursprung der embryonalen Zellen von großer Bedeutung für die kosmetischen Eigenschaften der Zubereitungen 1st und dies, unabhängig von der chemischen Identität der Wirkstoffe.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

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Beispiel 1 Unter aseptischen Bedingungen entnimmt man 1746 g Haut von Rinderfeten. Die Entnahme erfolgt bei Feten, die sich im Trächtlgkeltsstadlum von 20 bis 120 Tagen befinden, wobei die Feten beiderlei Geschlechts sind.

Sofort nach der Entnahme werden die Hautdecken auf eine Temperatur von -20° C eingefroren und dann in Gegenwart einer Salzlösung (15 ml/g) In einer Zerkleinerungseinrichtung, die mit einer Drehzahl von 10 000 min"¹ betrieben wird, während etwa 15 Minuten zerkleinert, wobei auch diese Behandlung unter sterilen Bedingungen erfolgt. Während der gesamten Dauer des Zerkleinern kühlt man mit Eis oder Kohlendloxidschnee, um jegliche Erwärmung zu vermeiden.

Als ionenhaltlge Extraktionslösung verwendet man eine 0,1-m-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5. Zu der erhaltenen, zerriebenen Masse gibt man pro 100 ml 300 g Papain, 788 mg Cysteln-hydrochlorld und 18,6 mg Äthylendlamlntetraessigsäure und bewirkt den enzymatlschen Abbau der Proteine während 15 Stunden bei 65° C. Während dieser Phase wird die Sterilität des Mediums durch Zugabe eines kleinen Thymolkristalls sichergestellt. Der erhaltene Brei wird dann mit Trlchloresslgsäure mit einer Endkonzentration von 7,5% behandelt. Man zentrifugiert den Brei dann während 30 Minuten in einer Zentrifuge bei einer Drehzahl von 4500 min"¹ und trennt die überstehende Flüssigkeit ab. Man unterzieht die überstehende Flüssigkeit dann während 18 Stunden bei 4° C einer Dialyse gegen destilliertes Wasser, wozu man als Dialysemembran einen Celluloseschlauch verwendet.

Das Dlalysat wird dann über ein Filterhilfsmittel (Cellte®) filtriert, wonach man den Wirkstoff durch Zugabe von 21 absolutem Äthylalkohol und 50 g Natriumacetat oder Kaliumacetat pro Liter ausfällt. Man reinigt den Niederschlag dann durch dreifaches Waschen mit absolutem Alkohol, einer Alkohol/Äther-Mischung und Äther, wonach man den Wirkstoff trocknet.

Sämtliche oben beschriebenen Behandlungsmaßnahmen erfolgen bei einer Temperatur von maximal 4° C (natürlich abgesehen von dem enzymatlschen Abbau).

Man erhält 16 g des Wirkstoffs In Form eines weißen Pulvers, das Jn Wasser und physiologischen Serumlösungen löslich ist. Diese Menge entspricht einer Ausbeute von 9,2 g Wirkstoff pro Kilogramm Haut. Das erhaltene Wirkstoffpulver enthält etwa 2,6 mg Hexosamlne pro Gramm Mucopolysaccharide.

Man wiederholt das vorstehende Verfahren unter Verwendung von 1881 g Nabelschnüren von Rinderfeten. Man erhält In diesem Falle 4,25 g des Wirkstoffs In Pulverform, was einer Ausbeute von 2,25 g Wirkstoff pro Kilogramm Nabelschnur entspricht. In diesem Fall enthält das Pulver 18,5 mg Hexosamine pro Gramm Mucopolysaccharide.

Beispiel 2

Man entnimmt unter aseptischen Bedingungen 25Og Haut von 4 bis 5 Monate alten Rinderfeten. Diese Haut wird nach dem Einfrleren In Aceton zerrleben und dann bei -20° C getrocknet. Man extrahiert den erhaltenen Brei dann mit einer 0,14-m-Natriumchlorldlösung In einem Verhältnis von 5 ml Lösung pro Gramm Brei. Man bewirkt vier aufeinanderfolgende Extraktionen unter den gleichen Bedingungen und rührt dann während 24 Stunden bei einer Temperatur von 4° C.

Man filtriert die erhaltene Lösung über Gaze und zentrifugiert dann während 1 Stunde bei einer Drehzahl von 6000 min"¹. Anschließend gibt man eine der Hälften des Volumens des Salzextrakts entsprechende Menge einen

1,8-m-PerchlorsäureIösung zu, um die freien Proteine auszufällen, die in der überstehenden Flüssigkeit vorliegen. Man läßt während 4 Minuten bei 4° C stehen und filtriert dann über einen Whatman-Filter Nr. 4. Zu dem in dieser Weise erhaltenen klaren Filtrat gibt man eine der Hälften seines Volumens entsprechende Menge einer 5%igen Lösung von Phosphorwolframsäure in 2-n-Chloiwasserstoffsäure. Man bewirkt die Ausfällung über Nacht bei einer Temperatur von 4° C. Dann zentrifugiert man das ausgefallene Material ab, das man dreimal mit Acston wäscht und dann im Vakuum trocknet. Man nimmt den Rückstand mit einer 0,1-m-Natriumbicarbonatlösung im Verhältnis von 3 ml der Lösung zu 5 g der frischen Haut auf. Dann gibt man pro 5 g frische Haut 1 mg in 1 ml 0,001-n-Salzsäurelösung gelöstes Trypsin zu. Nach der Zugabe eines kleinen Thymolkristalls bewirkt man den enzymatischen Abbau während etwa 18 Stunden bei 37° C. Dann fällt man die in Kombination mit den Mucopolysacchariden vorliegenden Proteine durch Zugabe einer 3,l-n-Trichlore^esigsäurelösung In einer Menge von 1 ml pro Gramm frische Haut aus. Man läßt über Nacht bei 4° C stehen und zentrifugiert dann während I Stunde bei 4500 Umdrehungen min"¹. Aus der überstehenden Flüssigkeit fällt man die Mucopolysaccharide durch Zugabe von wasserfreiem Natrlumaceiat (7,5 mMol pro Gramm Lösung) aus. Dann versetzt man die Lösung mit dem Doppelten ihres Volumens absolutem Alkohol und läßt über Nacht bei 4° C ausflocken. Man zentrifugiert anschließend während 30 Minuten bei 4500 Umdrehungen min"' und wäscht dann das ausgefallene Material mit Alkohol, einer Alkohol/Äther-Mlschung und schließlich mit Äther, wonach man trocknet.

In dieser Weise erhält man 135 mg Wirkstoff in Form eines Pulvers, was einer Ausbeute von etwa 0,5 g Wirkstoff pro Kilogramm frischer Haut entspricht.

Beispiel 3

1. Man entnimmt unter aseptischen Bedingungen ein Kilogramm Haut von Schafsfeten beiderlei Geschlechts In einem Alter zwischen einem und sechs Monaten.

2. und 3.

Unmittelbar nach der Entnahme wird die Haut in Wasser zerkleinert, dessen pH-Wert mit einer 8-n-Chlorwasserstoffsäurelösung auf 1,5 eingestellt wurde. Es werden 5 ml Wasser pro Gramm Haut verwendet.

Während des gesamten Zerkleinerungsvorganges wird das Ganze mit Hilfe von Eis und Kohlensäureschnee gekühlt, um zu vermeiden, daß die Temperatur auf über 4° C steigt.

4. Man gibt dem Gemisch 2 g/l Pepsin zu, dessen enzymatische Aktivität 250 Elnheiten/mg beträgt und läßt während 3 Tagen bei 37° C digerieren. Die Sterilität des Milieus wird durch eine Schicht aus Toluol und einige Inymolkristalle sichergestellt, die In der Lösung verteilt sind.

5. Nach 3 Tagen bringt man den pH-Wert des Gemi- bo sches mit einer 10-n-Natriumhydroxldlösung auf 7 und gibt 2 g/l Trypsin hinzu, dessen enzymatische Aktivität 250 Elnheiten/mg beträgt. Anschließend läßt man während 24 Stunden bei einer Temperatur von 37 C digerieren. Anschließend wird über ein Filterhilfsmittel abflltrlert.

6. Das Flltrat wird mittels Essigsäure (0,25 n) auf einen pH-Wert von 6 eingestellt, wonach man auf 1 1 Lösung 25 g Calciumacetat und 2 I Äthanol zugibt, um die Mucopolysaccharide auszufällen.
Man läßt über Nacht bei 4° C absitzen. Es wird während 30 Minuten bei 4500 Umdrehungen min¹ abzintrifugiert. Der Niederschlag wird mit Alkohol, anschließend mit einem Alkohol/Äther-Gitnisch (50/50) und schließlich mit Äther gewaschen und anschließend getrocknet.
Es werden 10 g Wirkstoff in Pulverform erhalten.

Beispiel 4

1. Es werden unter aseptischen Bedingungen 500 g Haut von Kuhfeten beiderlei Geschlechts im Alter von 3 bis 9 Monaten entnommen.

2. und 3.

Unmittelbar nach der Entnahme wird die Haut in einer 1-n-Natriumhydroxidlösung in einem Verhältnis von 5 ml Natriumhydroxidlösung pro Gramm Haut zerkleinert.

Während des gesamten Zerkleinerungsvorganges wird das Ganze mit Hilfe von Eis und Kohlensäureschnee gekühlt, um einen Temperaturanstieg oberhalb 4° C zu vermeiden.

4. Anschließend beläßt man das Gemisch während 24 Stunden bei 37° C und stellt anschließend den pH-Wert des Gemisches mittels Essigsäure auf 10 ein.

5. Anschließend gibt man zu 100 ml des Gemisches 100 mg Trypsin hinzu, dessen enzymatische Aktivität 250 Einhelten/mg beträgt und hält das Gemisch während 20 Stunden bei 50° C. Nach Ablauf dieser Zeit wird über ein Filterhilfsmittel abfiltriert.

6. Das Filtrat wird mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und mit 5 g Kaliumacetat und 200 ml Isopropylalkohol pro 100 ml Lösung versetzt. Die Mucopolysaccharide werden ausgefällt. Man läßt während 24 Stunden bei 4° C absitzen. Anschließend wird zentrifugiert und der Niederschlag mit Äthanol, mit einem Alkohol/Äther-Gemisch (50/50) und anschließend mit Äther gewaschen. Das erhaltene Produkt wird getrocknet, wobei man 2 g eines weißen Pulvers erhält.

Das vorstehende Beispiel wird mit der Abwandlung wiederholt, daß man anstelle der vorher verwendeten 200 ml Isopropylalkohol für die Ausfällung der Mucopolysaccharide 900 ml Isopropylalkohol auf 100 ml Lösung verwendet.

Es werden sodann etwa 2,5 g weißes Pulver erhalten. In diesem Beispiel kann die Zerkleinerungsstufe (2) unabhängig von der Extraktionsstufe durchgeführt werden, in welchem Fall das Zerkleinern In Aceton erfolgt, die zerkleinerte Masse anschließend getrocknet und sodann in einer l-n-Natrlumhydroxidlösung in einem Verhältnis von 5 ml Sodalösung pro Gramm zerkleinerte Haut aufgenommen wird.
Gleichfalls kann die Stufe der Ausfällung der Mucopolysaccharide (6) mittels Isopropylalkohol vorteilhaft durch Komplexbildung mit einer 0,l%lgen Lösung von Cetylpyridiniumchlorid In einer 0,03 molaren NaCl-Lösung ersetzt werden. Man läßt während einiger Stunden bei Raumtemperatur stehen und dissoziiert den Mucopolysaccharld-quaternäres Ammonium-Komplex mittels einer NaCl-Lösung steigender Konzentralion (0,3 m bis 3 m). Man entsalzt die erhaltene Lösung der Mucopolysaccharide durch Dlalvse Regen Leitungswasser

während 18 Stunden und lyophlllslert anschließend das Dlaiysat.

Beispiel 5

1. Es werden unter aseptischen Bedingungen Kuhfeten beiderlei Geschlechts Im Alter von 2 bis 6 Monaten 1800 g Haut entnommen.

2. und 3.

Unmittelbar nach der Entnahme werden die Hautdecken In Gegenwart einer salzhaltigen Extraktionslösung In einer Zerkleinerungsvorrichtung (10 000 min"¹) während etwa 15 Minuten zerkleinert. Es werden 10 ml Salzlösung, bestehend aus einer 0,1 molaren Kallumhydrogenphosphat-Lösung mit ι ^ einem pH-Wert von 6.5 pro Gramm Haut verwendet.

Während der gesamten Zerkleinerungsdauer wird das Ganze gekühlt, um zu vermelden, daß die Temperatur über 4° C ansteigt.

4. Nach dem Zerkleinern wird das Gemisch während 48 Stunden bei einer Temperatur von etwa weniger als 4° C belassen. Anschließend wird folgendes zugegeben:

350 mg Papaln mit einer enzymatischen Aktivität von 100 Elnheiten/mg;
780 g Cystein-hydrochlorid;

18,5 mg Äthylendiamlntetraesslgsäure auf 100 ml Lösung, wonach man den enzymatischen Abbau während 30 Stunden bei 50° C durchführt. .

Während dieses Vorganges wird die Sterilität des Milieus durch Zugabe eines kleinen Thymolkrlstalls und einer Deckschicht aus Toluol sichergestellt.

5. Die erhaltene Brühe wird mit Trichloresslgsäure einer Endkonzentration von 9% behandelt. J5 Anschließend wird die Brühe In einer Zentrifuge bei 4500 Umdrehungen min"¹ während 30 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gewonnen, die dann während 20 Stunden bei 4° C gegen destilliertes Wasser dialysiert wird, wobei man als to Dialysemembran einen Celluloseschlauch verwendet.

Das Dlaiysat wird anschließend über ein Filterhilfsmittel abfiltriert.

6. Zu der auf diese Weise filtrierten Lösung wird NaCI « in der Welse zugegeben, daß man am Ende eine 0,03 ' molare NaCl-Konzentration erhält. Anschließend wird eine Lösung von Cetylpyridinlumchlorld zugegeben, bis eine Endkonzentration des quaternären Ammoniumsalzes von 1% erhalten wird. Man läßt so während 3 Stunden bei 35° C koagulieren und zentrifugiert.

Der Kuchen besteht aus einem Komplex aus Mucopolysacchariden und quaternärem Ammoniumsalz und wird mit einer 0,03 molaren Lösung von NaCl gewaschen, die 0,05% Cetylpyridiniumchlorid enthält'.

Der Komplex aus Mucopolysacchariden und quaternärem Ammoniumialz wird mit einer 4 molaren NaCl-Lösung aufgelöst. Man entsalzt die erhaltene Lösung der Mucopolysaccharide durch Dialyse gegen Leitungswasser während 18 Stunden und lyophilisiert anschließend das Dlaiysat. Bei Wiederholung des obigen Verfahrens, jedoch unter Verwendung einer 0,1 molaren Dinatriumcitrat-Lösung mit einem pH-Wert von 6 anstelle der Kaliumhydrogenphosphatlösung, wird ein Produkt erhalten, das praktisch die gleichen Eigenschaften wie das Produkt des vorhergehenden Beispiels aufweist.

Das vorhergehende Beispiel wird wiederholt, wobei man zur Ausfällung der Mucopolysaccharide Cetylpyridiniumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 2% und als Salzlösung eine 0,01 molare N₂SO₄-Lösung verwendet.

Der Komplex aus Mucopolysacchariden und quaternärem Ammoniumsalz wird durch eine 1-m-KCl-Lösung dissoziiert.

Beispiel 6

1. Unter aseptischen Bedingungen werden 500 g Haut von Schafsfeten beiderlei Geschlechts im Alter von 2 bis 5 Monaten entnommen.

2. und 3.

Unmittelbar nach der Entnahme wird die Haut in einer Extraktionslösung zerkleinert, die einen pH-Wert von 7,8 aufweist und aus 191,5 ml einer 0,1 molaren Dinatriumphosphatlösung und einer 0,1 molaren Zitronensäurelösung besteht.

4. Dem erhaltenen Gemisch werden nach dem Zerkleinern 50 mg Proteinase auf 100 ml des Gemisches zugegeben. Die Prcteinase weist eine Aktivität von 45 Einheiten/mg auf.

Man läßt den enzymatischen Abbau über Nacht bei 40⁰C vor sich gehen. Die Sterilität des Mediums wird durch die Anwesenheit eines Thymolkristalls sichergestellt.

5. Die nach dem enzymatischen Abbau erhaltene Brühe wird mit Trichloresslgsäure einer Endkonzentration von 10% behandelt.

Der Brei wird anschließend in einer Zentrifuge bei 4500 Umdrehungen min"¹ während 30 Minuten zentrifugiert, wonach die überstehende Flüssigkeit aufgenommen und während 18 Stunden einer Dialyse gegen fließendes Wasser unterworfen wird.

6. Um die Mucopolysaccharide auszufällen, werden dem Dialysat 2 Volumentelle Aceton auf 1 Volumenteil Dlaiysat zugegeben. Man läßt 24 Stunden stehen.

Es wird zentrifugiert, wonach man den Niederschlag mit Alkohol und anschließend mit Äther wäscht und trocknet. Es werden 3,5 g Produkt erhalten.
Im folgenden werden die Ergebnisse von pharmakologischen Untersuchungen der erfindungsgemäß gewonnenen Mucopolysaccharide angeführt.

Toxizität

Man bestimmt die Toxizität der Wirkstoffe an Wistar-Ratten beiderlei Geschlechts gleicher Zahl mit einem Gewicht von 150+ 10 g, Mäusen des Stammes Swiss beiderlei Geschlechts in gleicher Zahl mit einem -Gewicht von 25 ± 2 g und Albino-Kaninchen des Stammes Bouscat beiderlei Geschlechts und gleicher Zahl mit einem Gewicht von 2,5 kg ± 100 g.

Bei intraperltonealer Injektion des aus Rinder- und Schafsfeten gewonnenen Wirkstoffs in einer Menge von g pro Kilogramm des Körpergewichts an 10 Ratten und Mäusen beobachtet man keinerlei Mortalität. Man beobachtet auch wedereine Mortalität noch die Spur irgendwelcher Störungen, wenn man die gleichen Wirkstoffe intravenös an 10 Kaninchen in einer Dosis von mg/kg des Körpergewichts injiziert.

Verträglichkeit

Man rasiert auf dem Rücken von 30 Wistar-Ratten (15 Männchen und 15 Weibchen) mit einem Gewicht

von etwa 180 g± 10 g, die der mit dem Wirkstoff zu behandelnden Gruppe zugehören, eine Fläche von 5 cm χ 3 cm. Auf die rasierten Flächen trägt man täglich während 3 Wochen 0,5 ml einer 4%Igen Wirkstofflösung auf, deren Herstellung In Beispiel 1 beschrieben Ist.

Nach Ablauf dieses Zeltraums ist festzustellen, daß das Wachstum der Tiere im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von 30 Tieren, die der gleichen Altersgruppe entsprechen und nur mit dem gleichen Volumen des Lösungsmittels auf dem gleichen rasierten Hautbereich behandelt worden sind, normal erfolgt. Es konnten dabei weder ein Krankheitszustand nach sonstige Schäden der behandelten Tiere Im Vergleich zu den Kontrolltleren beobachtet werden.

Untersuchung der Wirkstoffe

Bei einer ersten Untersuchungsreihe verwendet man eine Gruppe von 40 Wlstar-Ratten mit einem Gewicht von 130± 5 g, die derselben Altersgruppe angehören und in einer sehr engen genetischen Verwandtschaft zueinander siehen, in vier Gruppen von jeweils 10 Ratten (1, II, III und IV). Die Tiere werden dann vor der Untersuchung in gleicher Welse ernährt, nämlich mit Rattenkuchen, die 7% Proteine enthalten, Karotten und Wasser ad libitum. Das Wachstum der Ratten verläuft während der 2 Wochen vor der Untersuchung normal.

Dann entzieht man den Ratten der Gruppe I und II während 3 Wochen Biotin, wodurch bei den Tieren Seborrhöe und Haarausfälle auftreten. Während der gleichen 3 Wochen werden die Tiere der Gruppen HI und IV normal ernährt.

Am Tage vor der ersten Behandlung rasiert man bei den Tieren der Gruppen III und IV auf dem Rücken eine Flasche von 5 cm χ 3 cm jeweils zu beiden Selten der Wirbelsäule, um auf diese Welse einen Anwendungsbereich abzugrenzen.

Die Tiere der Gruppe I werden dann während 10 Tagen täglich mit einer Lösung des nach Beispiel 1 hergestellten Wirkstoffs In einer Konzentration von 1,5% durch Bestreichen des rasierten Rockenbereiches mit Hilfe eines Pinsels behandelt. Die Gruppe II, die als Kontrollgruppe dient, wird unter gleichen Bedingungen lediglich mit 0,5 ml destilliertem Wasser behandelt.

Die Gruppe III wjrd der gleichen Behandlung mit dem Wirkstoff unterzogen wie die Gruppe I.

Die Gruppe IV, die als Kontrollgruppe dient, wird unter den gleichen Bedingungen wie die Tiere der Gruppe II lediglich mit 0,5 ml destilliertem Wasser behandelt.

Die Behandlung erfolgt wahrend 10 Tagen, wonach eine klinische Überprüfung der Tiere sämtlicher Gruppen erfolgt ebenso wie eine Entnahme der Rückenham im Anwendungsbereich nach dem Abtöten der Tiere. Die Haut des Rückenbereiches wird htstologisch untersucht, und es erfolgt eine Extraktion zur gravimetrischen Bestimmung der Lipide.

Die klinische Untersuchung erlaubt die Feststellung, daß bei den Tieren der Gruppe I eine Wiederaufnahme des Haarwuchses, insbesondere rings um den Anwendungsbereich und eine deutliche Verringerung des verfetteten und verklebten Zustands der Haare erfolgt, während bei den Tieren der Gruppe II, den an Seborrhöe leidenden Tieren, die nicht behandelt wurden, keine Besserung, sondern eine Verschlechterung ihres Zustandes festzustellen ist.

Bei den Tieren der Gruppe III ist eine deutliche Beschleunigung des Haarwuchses festzustellen, während bei den Kontrolltleren der Gruppe IV die Haare normal ohne Anzeichen der Beschleunigung nachwachsen.

Auf der anderen Seite verläuft das Wachstum der Tiere der Gruppen III und IV (gesunde Tiere) normal 5 ohne Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Bei den Tieren, die wegen des Blotinentzugs an Seborrhöe leiden (Gruppen I und II) erfolgte das Wachstum In gleicher Weise In den beiden Gruppen, wenngleich auch In geringerem Ausmaß als bei den normalen Tleren.

Die hlstologische Untersuchung weist auf das Vorhandensein einer Verringerung des Volumens and der Zahl der Talgdrüsen bei den Tieren der Gruppe I Im Vergleich zu jenen der Gruppe II hin, wobei auch eine Steigerung der Zahl der sich regenerierenden Haarfolllkel festzustel len Ist.

Schließlich zeigt die Bestimmung der Lipide eine Verringerung von Im Durchschnitt 30* bei den Tieren der Gruppe I im Vergleich zu den Tieren der Gruppe H. In jedem Fall 1st dieser Unterschied geringer bei den Tieren der Gruppe HI Im Vergleich zu den Tieren der Gruppe IV, was ganz normal 1st, da es sieb um keinen pathologischen Zustand handelt und demzufolge keine äußere therapeutische Einwirkung gleicher Intensität erforderlich Ist.

Man wiederholt die gleichen Versuche In gleicher Welse und unter gleicher Anwendung der Wirkstoffe, wobei man jedoch die Behandlungszeit bei der Hälfte der Tiere einer jeden Gruppe auf 15 Tage und beider zweiten Hälfte der Tiere auf 22 Tage verlängert. Unter diesen Bedingungen zeigt sich bei der klinischen Untersuchung eine Verringerung der oberflächlichen Lipide nach einer Behandlung von 14 Tagen um 75% bei den Tieren der Gruppe I und 45% bei den Tieren der Gruppe III. Nach einer Behandlung von 21 Tagen zeigen die an Seborrhöe leidenden Tiere der Gruppe I eine Verringerung der Oberflächenllpide um durchschnittlich 150%, während sich bei den normalen Tieren der Gruppe I eine Verringerung um 32% ergibt. Weiterhin ist eine Beschleunigung des Haarwuchses bei den normalen Tieren der Gruppe III um 50% zu beobachten.

Bei weiteren Untersuchungen der Wirksamkeit der erfindungsgemäß gewonnenen Mucopolysaccharide wurden Versuche durchgeführt, bei denen als Vergleichssubstanz ein seit 1966 bekanntes Proteinhydrolysat verwen- det wurde.

Für die Verglelchsversuche wurde eine Zubereitung A In Form einer 2%lgen Lösung des bekannten Proteinhydrolysate [Croda (Typ c)] und eine Zubereitung B In Form einer 2%lgen Lösung des anmeldungsgemäß ei hai tenen Mucopolysaccharide hergestellt.

Beide Zubereitungen A und B wurden anschließend auf Versuchspersonen angewandt, die eine anormale TaigsekrciiOfi zeigten. Die Versuchspersonen wurden in zwei Gruppen eingeteilt, von denen die Gruppe I mit Hilfe der Zubereitung A und die Gruppe II mit Hilfe der Zubereitung B behandelt wurden.

Hierbei wurde in der Welse vorgegangen, daß für jede Versuchsperson die Menge des abgeschiedenen Talges täglich während fünf aufeinanderfolgenden Tagen vor

der Behandlung auf der Stirn nach der Methode von Pocchi et Strauss (Journal of Invest. Dermatol. 36,1961, 393) bestimmt wurde. Nach der auf diese Welse bestimmten mittleren Talgabsonderung jeder Versuchsperson wurde auf die Stirn der Versuchspersonen der Gruppe I 0,5 ml der Zubereitung A und bei den Versuchspersonen der Gruppe II 0,5 ml der Zubereitung B mittels eines Baumwolltupfers aufgebracht. Diese Behandlung wurde während neun aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt und

die Menge des abgeschiedenen Talges nach dem fünften und neunten Tag nach der Im folgenden beschriebenen Methode von Pocchl und Strauss bestimmt:

Es werden hierzu eine HautfJäche von 2,54x2,54 cm auf der StIm der Versuchsperson mittels eines Klebestreifens rahmenförmlg abgegrenzt. Hierauf wird ein rechtekklges Stück (7 χ 3,4 cm) Josepapier, das vorher mit Äther entfettet und anschließend getrocknet Ist, auf den Rahmen aus Klebestreifen aufgelegt und darüber ein Gazestück gelegt. Das Ganze wird mittels eines Heftpflasters gehalten.

Nach 15 Minuten wird das erste Stück Papier durch ein zweites Papier ersetzt, das gleichfalls 15 Minuten In dieser Lage belassen wird. Letzteres wird anschließend durch drei genau aufeinandergelegte Papiere ersetzt, die man dre! Stunden auf der Stirn belaßt.

Die ersten zwei Papiere werden verworfen. Nach drei

Stunden werden die drei anderen Papiere zusammen mit Hilfe einer Pinzette in ein geeignetes Kristallisiergefäß gegeben. Es wird die mit Talg Imprägnierte Fläche des Papiers, die dem Rahmen (2,54x2,54 cm) entspricht, sorgfältig abgehoben. Die Papiere werden in eine Aluminlumkapsel eingegeben, die vorgehend entfettet und tariert wurde. Anschließend werden die Papiere dreimal während jeweils 5 Minuten mit je 25 ml wasserfreiem

ίο Äthyläther gewaschen und gewogen.

Auf diese Weise wurden für die mit der Zubereitung A behandelten Versuchspersonen folgende Werte (Tabelle 1) ermittelt:

Tabelle 1	Geschlecht	Talg vor der Behandlung	Talg nach S Behandlungen	Veränderung nach 5 Behandlungen	Talg nach 9 Behandlungen	Talg vor der Behandlung	Talg nach 5 Behandlungen	Veränderung nach 5 Behandlungen	Talg nach 9 Behandlungen	Veränderung nach 9 Behandlungen	0
Versuchsperson		(mg)	(mg)	(%)	(mg)	(mg)	(mg)	(%)	(mg)	(%)	+ 3
	F	4,66	4,7	+ 1	4,65	3,08	2,08	-31,1	2,61	- 4
1	F	2,37	2,52	+ 6	2,45	3,04	3,12	+ 2,6	2,72	-23
i ²	F	4,3	4,33	+ 1	4,09	7,26	4,23	-41,7	4,66	- 12
i 3	F	5,5	4,42	-20	4,22	2,87	2,83	- 1,3	2,54	- 15
Il 4	F	1.0,03	8,24	- 18	8,73	5,85	5,80	- 0,7	5,21	+ 5
1 ⁵	F	3,51	2,71	-23	2,98	5,48	6,88	+ 25,5	6,73	+ 6
§ 6	F	6,82	6,41	- 6	7,18	4,35	4,02	- 7,6	4,64	+ 8
% 7 # ⁷	M	4,74	5,49	+ 16	5,03	8,49	6,13	-27,7	6,86	- 3,5
I ⁸	M	8,99	9,77	+ 9	9,76	6,98	5,53	-20,7	6,50	2) erhalten:
Il 9				- 3,1
p Mittel					Hilfe der Zubereitung B behandelten Per- 40 sonen wurden folgende Werte (Tabelle	Veränderung nach 9 Behandlungen
I Für die mit		(%)
i I Tabelle 2	Geschlecht	- 15,2
j\| Versuchsperson		-10,5
	F	-35,8
!si 0 1	F	-11,4
1 ²	F	- 10,9
i 3	F	+ 4,5
l^; 4 r-V	F	+ 6,6
I 5	M	- 19,1
F; 6	M	- 6,9
I ⁷	M
K 8	M
ν 9

Mittel

-11,4

- 10,9

Die in der Tabelle 1 angeführten Werte lassen erken- 65 I_n vorteilhaftem Gegensatz hierzu zeigt eine Betrach-

nen, daß die mittlere prozentuale Veränderung nach tung der in der Tabelle 2 enthaltenen Werte, daß die

5 Behandlungen gering ist und sich nach der neunten mittlere prozentuale Veränderung wesentlich stärker ist,

Behandlung nicht wesentlich verändert hat. das heißt etwa das Vierfache der bei der Zubereitung A

festgestellten Veränderung beträgt und daß diese Veränderung nach der neunten Behandlung weiterbesteht.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die erfindungsgemäß aus Hautdecken und Nabelschnüren von Rinder- oder Schafsfeten gewonnenen Mucopolysaccharide eine bemerkenswerte haarbildende Wirkung und eine Wirksamkeit gegen Seborrhöe aufweisen.

Beispiele von Haarpflegemitteln Beispiel A

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Wirkstoff nach Beispiel 1
Wäßriges Trägermaterial

ad 100 ml

Durch iägiiche Anwendung einiger Tropfen dieser Lösung durch Einmassieren In die Kopfhaut, die einen mehr oder weniger fettigen Eindruck macht, wird schnell ein völlig gesunder Zustand erreicht.

Beispiel B

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Wirkstoff nach Beispiel 2
Wäßriges Trägermaterial

Ig

ad 100 ml

Durch tägliches Einmassieren einiger Tropfen der Lösung in die Kopthaut läßt sich der Haarausfall und gegebenenfalls gleichzeitig die Seborrhöe bekämpfen.

Beispiel C

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Wirkstoff nach Beispiel 1
Wäßriges Trägermaterial

4g

ad 100 ml

Durch tägliches oder zweitägiges Einmassieren einiger Tropfen dieser Lösung in die Kopfhaut lassen sich die Seborrhöe und länger anhaltender Haarausfall bekämpfen.

Beispiel D

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Wirkstoff nach Beispiel 2
Vitamin E
Emulgier-Trägermaterial

2g

10 mg ad 100 ml

Wirkstoff nach Beispiel 1

Cholincitrat

Wäßriges Trägermaterial

Ig Ig ad 100 ml

Wirkstoff nach Beispie! 1
Cholincitrat

Ig Ig

Durch tägliches Einmassieren einiger Tropfen der Lösung in den Haarboden lassen sich spröde und trokkene Haare pflegen.

Beispiel F

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Allantoin

Wäßriges Trägermaterial

0,5 g

ad 100 ml

Durch tägliches Einmassieren einiger Tropfen der Lösung in die Kopfhaut lassen sich Seborrhöe und fettige Schuppen bekämpfen.

Beispiel H
Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden

ίο Zusammensetzung:

Wirkstoff nach Beispiel 1

Allantoin

Salicylsäure

Wäßriges Trägermaterial

Ig 0,5 g 0,5 g ad 100 ml

Durch tägliches Einmassieren einiger Tropfen der Lösung in den Haarboden lassen sich Seborrhöe, fettige Schuppen und Haarausfall bekämpfen.

Beispiel I

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Wirkstoff nach Beispiel 2	ig
Milchsäure	Ig
Vitamin E	10 mg
Emulglerträgermaterial	100 ml

Durch tägliches Einmassieren einiger Tropfen der Lösung in den Haarboden lassen sich Seborrhöe, Haarausfall und Reizungsanzeichen des Haarbodens bekämpfen.

Beispiel J

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Wirkstoff nach Beispiel 1

Milchsäure

Cholin

Wäßriges Trägermaterial

Ig

ig

ad 100 ml

Durch tägliches Einmassieren einiger Tropfen der Lösung in die Kopfhaut lassen sich Fälle sehr intensiver Seborrhöe mit Reizungen bekämpfen.

4, Beispiel K

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Wirkstoff nach Beispiel 2

Milchsäure

Allantoin

Wäßriges Trägermaterial

Ig Ig 0,5 g ad 100 ml

Durch tägliches Einmassieren einiger Tropfen der Lösung in die Kopfhaut lassen sich Fälle von intensiver Seborrhöe bekämpfer..

Beispiel G

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Durch tägliches Einmassieren einiger Tropfen der Lösung in den Haarboden läßt sich Seborrhöe mit Schuppen- und Schorfbildung bekämpfen.

Beispiel L

Man bereitet ein Haarpflegemittel der folgenden Zusammensetzung:

Wirkstoff nach Beispiel 1

Cholin

Inosit

Methionin

Wäßriges Trägermaterial

Ig

0,50 g 0,50 g 0,50 g ad 100 ml

Durch tägliches Einmassieren einiger Tropfen der Lösung in die Kopfhaut lassen sich Fälle von Haarausfall mit intensiver Seborrhöe bekämpfen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von Mucopolysaccharlden aus Rinds- oder Schafsfeten, dadurch ge- kennzeichnet, dau man unter sterilen Bedingungen und bei niedriger Temperatur

a) Hautdecken und/oder Gewebe von Nabelschnüren von Rinds- oder Schafsfeten entnimmt,

b) die entnommenen Gewebeteile zerkleinert,

c) die zerkleinerten Gewebeteile mit Hilfe einer lonenhaltlgen Lösung extrahiert,

d) die extrahierten Gewebeteile in der lonenhaltigen Lösung einem enzymatlschen Abbau unterwirft und

e) den Wirkstoff durch Ausfällung mittels eines organischen Lösungsmittels wie Alkohol oder Aceton oder durch Komplexbildung mittels einer quaternären Ammoniumverbindung gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zerkleinern in der lonenhaltigen Extraktionslösung erfolgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß der enzymatische Abbau gleichzeitig mit der Extraktion in der lonenhaltlgen Lösung erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Gewinnung des Wirkstoffs gegen Wasser dialyslert.

5. Haarpflegemittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff Mucopolysaccharide nach einem der Anspreche 1 bis 4 enthält.