DE3152851A1 - Stark antigene tumorspezifische stoffe und verfahren zum nachweis von krebs unter verwendung dieser stoffe - Google Patents
Stark antigene tumorspezifische stoffe und verfahren zum nachweis von krebs unter verwendung dieser stoffeInfo
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Description
D β μο*Λ5η£& 22, -MierVäηstäassTe 27 «5 I b Z U ü I
TELEGRAMME: MAYPATENT MÜNCHEN TELEX 0244Θ7 PATOP
1 ELEFON COBS} 22 00 01
S-81-P-I/1877 München, 1 3 .Januar 1
FC
PCT/US81 /00720 b0202Ci PCT/Germany Dr.M/hs
Stephen SUGAAR in Staten Island, NY 10304 / USA
Stark antigene tumorspezifische Stoffe und Verfahren zum
Nachweis von Krebs unter Verwendung dieser Stoffe
Die Erfindung stellt stark antigene tumorspezifische Substanzen (und auch Zellmaterial, welches diese stark antigenen
tumorspezifischen Substanzen enthält) zur Verfügung, die hergestellt sind mittels mit hoher Geschwindigkeit schwingender
Energie, vorzugsweise elektromagnetische Hochfrequenzoder Mikrowellenstrahlung, welche auf Krebsgewebe von bekanntem
histologischen Charakter einwirkt. Diese Substanzen und auch Zellmaterial, welches diese Substanzen enthält, sind gekennzeichnet
durch solche antigenen Eigenschaften, daß, wenn sie mit einer Zusammensetzung von natürlich tumorsensibilisierten
Lymphocyten in Berührung gebracht werden, die von einem Wirt genommen sind, der einen histologisch verwandten
Krebs hat, dann in Gegenwart von Makrophagen Aggregation von Makrophagen und MakrophagenverSchmelzungen auftreten. Die Er-
T5 findung liefert auch diese Substanzen in gekapselter Form.
Die Erfindung stellt ferner diagnostische Tests zum Nachweis von Krebs zur Verfügung, welche die genannten stark antigenwirkjamen
tumorspezifischen Substanzen als Reagentien verwenden.
PATENTANWALT „
DR. HANfc Ui-f$K$rt:
TELEX S2 4487 PATOP
IELEFON CO 80} 220001
S-81-P-I/1877 München, 13. Januar 1983
PCT/ US 81 /007 20 Ö0202C1 FCT/Germany Dr. M/hs
Stephen SUGAAR in Staten Island, NY 10304 / USA
Stark antigene tumorspezifische Stoffe und Verfahren zum Nachweis von Krebs unter Verwendung dieser Stoffe
Dies ist eine Continuation-In-Part von (i) Anmeldung
Serial No. 153 535 angemeldet 23. Mai 1980 und (il) Anmeldung
Serial No. 165 559 angemeldet 3.JuIi 1980, welche eine Continuation-In-Part
der fallengelassenen Anmeldung Serial No. 151 906 angemeldet 21. Mai 1980 war.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Methoden zur Herstellung von stark antigenen tumorspezifischen Substanzen
und Krebsdiagnosemethoden unter Verwendung dieser Substanzen und neue Stoffzusammensetzungen zur Verfügung.
Es ist bekannt, daß mehrere menschliche Krebskrankheiten, wie Melanomas, Lungen-, Brust- oder Kolonkrebs schwachantigenwirk
same tumorspezifische Stoffe an den Membranen der sie bildenden Tumorzellen aufweisen. Mit den üblichen Extraktionsmethoden erweisen sich solche tumorspezifische Antigene, die
5 manchmal in der Literatur als TSTAs und im folgenden als 11TSAs"
bezeichnet werden, als noch schwächere Antigene, als wenn sie in ihrer natürlichen Assoziierung mit malignen Tumorzellen
sind; siehe den Artikel von K. Sikora et al. "Partial Purification
of Tumor-Specific Transplantation Antigens from Methylcholantrene-Induced
Murine sarcomas by Immobilized Lectins", British J. Cancer 40:831-838 (1979) ("Partielle Reinigung von
tumorspezifischen Transplantationsantigenen von Methylcholantrene-induzierten Mäusesarkomas durch immobilisierte Lectine").
-■ — ν ■>
τ-«- »
Es gibt einen neueren Bericht über die Sensibilisierung der zirkulierenden Lymphocyten von Frauen mit Brustkrebsen
für Brustkrebs-TSAs; siehe den Artikel von Wm. Gm. Ramey et al
"Detection of Breast Tumor Antigen-Sensitive Circulating T-Lymphocytes
by Antigen-Stimulated Active Rosette Formation", Cancer Research 39:4796-4801 (1979) ("Nachweis von Brusttumorantigen-sensiblen
zirkulierenden T-Lymphocyten durch antigenstimulierte aktive Rosettenbildung")· Es wird angenommen, daß
dieser Effekt auf der dauernden Freisetzung von Brust-TSAs von
schwacher Antigenwirkung in den Kreislauf der Brustkrebspatientin
beruht.
Melanomaextrakte können mit den Lymphocyten anderer Melanomapatienten in vitro reagieren, aber nicht mit Lymphocyten
anderer Tumortypen (U.W. Jehn et al "In Vitro Lymphocyte Stimulation By A Soluble Antigen From Malignant Melanoma",
New England J. of Medicine 283:329-333, 1970) ("In Vitro Lymphocyten-Stimulierung
durch ein lösliches Antigen von malignem Melanoma"). Ähnlich können Extrakte von Osteosarkomas in vitro
Lymphocyten anderer Osteosarkoma-Patienten, jedoch nicht Lymphocyten anderer Krebspatienten stimulieren. (B.J. Gainor
et al, "A Method of Immunological Assay in Human Osteosarcoma,
Clinical Orthopedics and Related Research (Philadelphia) 111:83, 1975) ("Ein Verfahren zum immunologischen Nachweis
bei menschlichem Osteosarkoma").
Es ist bekannt, daß Lymphocyten, die durch starke Antigene, z.B. Bazillus Calmette-Guerin (BCG) sensibilisiert sind,wenn sie
in vivo oder in vitro mit dem starken sensibilisierenden Antigen
wieder in Berührung kommen, am Ort der Reaktion vorhandene Makrophagen verschmelzen und vielkernige Riesenzellen bilden
können; siehe den Artikel von A.H. Warfei "Macrophage Fusion
-*nd Multinucleated Giant Cell Formation, Surface Morphology",
Experimental & Molecular Pathology 28:163-176 (1978) ("Makrophagen-Fusion und Bildung vielkerniger Riesenzellen, Oberflächenmorphologie").
Bisher von Krebszellen erhaltene TSAs sind, wie bemerkt, schwache Antigene, und wenn schwache TSAs
mit Lymphocyten in Gegenwart von Makrophagen in Berührung gebracht werden, tritt weder in vivo noch in vitro eine
Makrophagenverschmelzungsreaktion ein. *
j, O I
Erwärmen auf hyperthermische Temperaturen, z.B. 41,5 bis
43,5°C, verbessert die von Haus aus schwache immunogene Wirkung von Krebszellen, jedoch wurde gefunden, daß die durch
Wärme erzeugte immunologische Veränderung geringer als die durch Röntgenstrahlen erzeugten ähnlichen, immer noch unwirksamen
Immunogen-Veränderungen sind; siehe den Artikel von H.D. Suit et al "Immunogenicity of Tumor Cells Inactivated
by Heat1», Cancer Research 37:3836-3837 (1977) ("Immunogene
Wirkung von durch Hitze inaktivierten Tumor ze Ilen11). Es ist
auch bekannt, daß Röntgenstrahlung eine ähnliche begrenzte Wirkung auf embryonale oder fötale Gewebeantigene hat, nach
E. Sega et al, "Specific Blastogenic Response of Peripheral Blood Lymphocytes from Lung Cancer Patients to a Petal Lung
Antigen", Journal of the National Cancer Institute, Vol. 64, No. 5, pages 1001-1006 (1980) ("Spezifische blastogene Reaktion
von peripheren Blutlymphocyten von Lungenkrebspatienten
auf ein fötales Lungenantigenw). TSAs werden zwar durch das
berichtete Erwärmen oder Röntgenbestrahlung etwas aktiver als TSAs ohne Erwärmen, jedoch sind sie immer noch nicht genügend
aktiviert, um spezifische histologische Veränderungen zu erzeugen oder an in-vitro-Reaktionen teilzunehmen, wie
der Makrophagen Verschmelzungsreaktion.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen
werden hiermit ausdrücklich in die Beschreibung der Anmeldung einbezogen.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Stoffzusammensetzungen
zu erzeugen, welche TSAs mit starker antigener Wirksamkeit enthalten und weiter solche stark antigene TSAs in Krebstestmethoden
und für therapeutische Zwecke zu verwenden.
Zusammenfassende Beschreibung der Erfindung
Stark antigene TSAs werden im brauchbaren Krebsgewebe oder Krebszellen oder Krebszellmembranen, die von malignen
Zellen (einschließlich Zellen von leukämischem Charakter) herrühren, erzeugt durch elektromagnetische Hochfrequenzstrahlen,
welche zyklische, sehr rasche wechselnde Veränderungen der Polarität in dipolaren Molekülbestandteilen von Krebszellen
erzeugen. Solche Strahlen können gleichzeitig die rasch vibrierenden Zellkomponenten erwärmen, falls die Zellen nicht
während der Bestrahlung gekühlt werden. Auf solche Bestrahlungen kann eine Elution oder Extraktion der erzeugten stark
antigenfen TSAs folgen. Bei der Bestrahlung wird die Temperatur des von Krebs herrührenden Materials auf über 22°C
und vorzugsweise über etwa 25°C gehalten, beispielsweise zwischen etwa 42°C und etwa 55°C, und mehr bevorzugt zwischen
etwa 42°C und 500C. Die Dauer der Anwendung der elektromagnetischen
Strahlung kann verschieden sein, je nach dem Energieeinsatz pro Zeiteinheit. Bei Verwendung der gegenwärtig
bevorzugten elektromagnetischen Hochfrequenzstrahlung oder elektromagnetischen Mikrowellenstrahlung wird die Bestrahlung
vorzugsweise für eine Zeitdauer zwischen etwa 20 und 1 80 Mi-
"15 nuten und mehr bevorzugt zwischen etwa 30 und 90 Minuten
durchgeführt. Geschnittenes Krebsgewebe wird in Form von Gewebescheiben bestrahlt oder Aggregate von Tumorzellen oder
Zellmembranen, die aus Krebszellen isoliert sind, suspendiert in wäßrigem Medium. Ein solches Medium reichert sich
an TSAs an, die aus Krebszellen oder Krebszellmembranen austreten, die mit elektromagnetischer Energie bestrahlt werden.
Stark antigenische TSAs können aus Krebszellmaterial, das mit elektromagnetischer Energie bestrahlt wurde, durch
Anwendung verschiedener bekannter Extraktionsverfahren oder Modifizierungen derselben extrahiert werden.
Das Molekulargewicht der TSAs der Erfindung liegt zwischen etwa 20.000 und 300.000 und vorzugsweise zwischen etwa
25.000 und 150.000 Dalton und mehr bevorzugt zwischen etwa
28.000 bis 75.000 Dalton. Rohe TSA-Extrakte enthalten auch Histokompatibilitätsantigene (HL-As), welche, wie die TSAs,
(i) von den Membranen von Tumorzellen stammen und (II) in
nicht kovalenter Bindung Beta-2-mikroglobulin enthalten.
Die TSA-Extrakte, welche Zusammensetzungen gemäß der Erfindung enthalten, können vorzugsweise verwendet werden, wenn
HL-As und ihr gebundenes Beta-2-globulin aus den TSA-Extrakten
entfernt wurden, wie hiernach beschrieben.
Die stark antigenischen TSA-Extrakte können in lamellaren
Liposomtröpfchen eingekapselt sein, um den antigenischen Effekt der TSAs veiterzusteigern. Die Einkapselung kann
unter Verwendung der Methode durchgeführt werden, die im Artikel von G. Poste et al "Lipid Vesicles as a Carrier for
Introducing Materials into Cultured Cells: Influence of Vesicle Lipid Composition on Mechanisms of Vesicle Incorporation
into Cells", Proc. Nat'l. Acad. Sei. 73:1603 (1976)
("Lipidtröpfchen als Träger zur Einführung von Materialien
in kultivierte Zellen: Einfluß der Lipidzusanunensetzung des Tröpfchens auf Mechanismen der Tröpfchenaufnahme in Zellen11)
beschrieben ist oder indem man dem Verfahren von F. Sakai et al folgt, das in "Association of Gross-Virus Associated
Cell-Surface Antigen with Liposomes", British Journal of
Cancer 41:227-235 (1980) ("Assoziierung von mit Gross-Virus assoziiertem Zelloberflächenantigen mit Liposomen") beschrieben
ist.
Die stark antigenischen TSAs, die spezifisch sind für den Typ von Krebszellen oder von diesen gewonnen oder extrahiert,
die erfindungsgemäß erhalten werden, sind gekennzeichnet
durch ihre Fähigkeit, bei Berührung mit Lymphocyten, die von Krebspatienten mit ähnlichem pathohistologischem Tumortyp
erhalten wurden, in Gegenwart von benachbarten (nahen) Makrophagen Aggregation und Fusion von Makrophagen zu verursachen.
Stark antigenische TSA mit Beziehung zum Tumortyp, die erzeugt und enthalten ist in oder eluiert oder extrahiert ist
von Zellen von malignen Tumoren,deren Primärort und histologischer
Charakter bekannt sind, werden getestet auf in vitro-Induktion
von Lymphokine-Erzeugung durch Lymphocyten von Krebspatienten. Wenn die Lymphocyten eines Patienten, nachdem
sie in Berührung gebracht wurden mit stark antigenen Tumorzellen oder Tumorantigen von histologisch bekannter
Tumorherkunft, Lymphokinen absondern, welche zur Aggregation
und Fusion von zugesetzten Makrophagen oder zur Bildung von vielkernigen Riesenzellen führen, dann hat der Patient Krebs
von ähnlichem Typ und/oder histologischen Charakter wie der bekannte Krebs, von dem das spezifische Krebszellmaterial
oder der TSA-Extrakt, die im Test verwendet wurden, stammte.
Stark antigens TSAs haben andere Brauchbarkeit als nur zur Verwendung im Makrophagen Fusionstest. Sie können in
anderen Tests verwendet werden, um die Gegenwart von verwandtem Krebs nachzuweisen, beispielsweise im Blutplättchen-Aggregationstest
oder im cytofluorometrischen Test, die hiernach erläutert
werden. Starke TSAs haben auch therapeutische Brauchbarkeit, besonders TSAs in isolierten KrebsZellmembranen oder gekapselt
in Liposomen, wenn sie verwendet werden für extrakorporale
oder parenterale immunologische Aktivierung von einkernigen Zellen von immunokompetenten Krebspatienten.
Der Makrophagenfusionstest ist analog dem Test, der beschrieben wird von B. Galindo et al, "Fusion of Normal Rabbit
Alveolar Macrophages Induced by Supernatant Fluids from BCG-Sensitized
Lymph Node Cells After Elicitation by Antigen", Infection and Immunity 9:212-216 (1974) ("Fusion von normalen
Kaninchen-Alveolaren-Makrophagen induziert durch überstehende Flüssigkeiten von BCG-sensibilisierten Lymphknotenzellen nach
Hervorrufung durch Antigen"), welche zuerst solche Tests mit nicht von Tumor stammenden stark sensibilisierenden Substanzen,
vie BCG, verwendeten. Das Ergebnis dieses in vitro-Tests wird
erhalten durch Zählen der verschmolzenen Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellbildungen, die bei mikroskopischer Untersuchung
sichtbar sind. Solche Zellaggregationen und Verschmelzung bilden sich durch Vereinigung von Einzelmakrophagen unter
dem Einfluß von Lymphokinen, die von sensibilisierten Lymphocyten stammen, bei denen durch starkes sensibilisierendes
spezifisches Antigen die Erzeugung von Lymphokinen ausgelöst wird.
Der Blutplättchen-Aggregationstest ist analog dem Makrophagenfusionstest.
Dieser Test wurde beschrieben von K.L. Lavelle et al "Identification of a New Platelet Aggregating
Factor Released by Sensitized Leucocytes", Clinical Immunology and Immunopathology 3: 492-502, 197 5) ("Identifizierung
eines neuen plättchenaggregierenden Faktors, der von sensibilisierten
Leukocyten abgegeben wird") und verwendet Blutplättchen
statt Makrophagen als aggregationanzeigende Zellen.
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Es ist bekannt, daß blastogene Transformation von
Lymphocyten, welche intrazellulare DNA-Verändei ungen wiederspiegelt,
eintreten kann, wenn reaktive Lymphocyten von sensibilisierten
Personen erneut mit dem sensibilisierenden Antigen oder Antigenen in vivo oder in vitro in Berührung
kommen. Cytofluorometrische Analyse kann geringe Veränderungen
im intrazellularen DNA-Gehalt nachweisen. Sensibilisierte
Lymphocyten in in-vitro Kultur, welche mit dem sensibilisierenden TSA-Antigen erneut in Berührung kommen,
können sich rasch in diagnostisch bedeutsamer Weise verändern, wenn TSAs, denen gegenüber die Lymphocyten sensibilisiert
sind, dem in-vitro Gewebekulturmedium zugefügt werden. Cytofluorometrie kann in kurzer Zeit (Stunden) genaue
quantitative Information solcher Veränderungen liefern, welche von diagnostischem Wert für Krebs sind. Die zwei vorgeschlagenen
Tests für Krebsdiagnose, d.h. die Zellfusionsteste und der cytofluorometrische Test, hängen von den gleichen Testelementen
ab, nämlich TSAs und Lymphocyten von Krebspatienten, und die Durchführung beider Tests kann in nützlicher Weise
das Ergebnis bekräftigen, das mit einem der Tests allein erhalten wird.
Gegenwärtig ist die molekulare Zusammensetzung der TSAs unbekannt. Die Stärke des TSA in Extrakten kann beuteilt werden
durch deren Proteingehalt, der nach Lowry's Methode bestimmt wird.
TSAs in wäßriger Suspension ist eine brauchbare Form der erfindungsgemäßen stark antigenischen von Turner abgeleiteten
Substanz. Vorzugsweise sind die TSAs verkapselt. Es ist auch möglich, Tumorzellenmaterial oder Tumorzellenmembranen
zu verwenden, welche durch elektromagnetische Strahlung, wie beschrieben, bestrahlt wurden, ohne TSAs aus
ihren natürlichen zellularen Bindungen zu extrahieren und solches Material als Ersatzantigene statt extrahierten oder
eluierten TSAs als Reagentien in diagnostischen Tests oder
für therapeutische Zwecke zu verwenden.
Ursprünglich wurde malignes Tumorgewebe (gut differenzierter menschlicher squamöszelliger Krebs der Lunge) mit
elektromagnetischer Energie bestrahlt, um darin Substanzen zu erzeugen, welche tumorspezifisch sind und starke Antigenaktivität
haben. Eine solche Bestrahlung wurde durchgeführt mittels dielektrischer elektromagnetischer Energie bei
13,56 MHz Frequenz bei 0,25 bis 1 Watt/cm Tumor während bis zu 90 Minuten. Eine zweite 90-Minuten-Behandlung wurde
unter im wesentlichen gleichen Bedingungen durchgeführt.
Stark antigene TSAs wurden im behandelten Krebs gebildet, der mit Lungenkrebs-sensibilisierten Lymphocyten reagierte,
die Lymphokine freisetzten, welche mit m der Nähe befindlichen Makrophagen reagierten und dabei die Fusion von Einzelmakrophagenzeilen
verursachten, wodurch Riesenzellen mit mehreren Kernen in einem einzigen Cytoplasma entstanden.
Hochfrequenzbestrahlung kann durch dielektrische oder induktive elektromagnetische Bestrahlung durchgeführt werden.
. Notwendigerweise liegen die in den USA verwendeten Hochfrequenz-Wellenlängen innerhalb der Wellenlängenbereiche, welche von
der US-Regierung zugelassen sind.
Es können auch Mikrowellen, eine andere Art von elektromagnetischer
Strahlung, verwendet werden. Die Frequenz der Hochfrequenzstrahlung liegt in der Größenordnung von einigen
zehn Millionen Zyklen oder Schwingungen pro Sekunde. Die Frequenz von Mikrowellen liegt in der Größenordnung von
mehreren Milliarden Zyklen pro Sekunde. Da jeder Frequenzzyklus zwei Veränderungen der Polarität bedingt und alle
dipolaren molekularen Zellbestandteile beeinflußt, werden die subzellularen Bestandteile von Krebszellen anhaltend
sehr raschen elektromagnetischen Impulsen unterworfen, welche
auf sie einen Intrinsik-Effekt ausüben. Der nicht erwärmende, jedoch die Antigene potenzierende Intrinsik-Effekt bei
Zellen kann getrennt werden von dem Intrinsik- und Erwärmungseffekt
der Strahlung, indem man das Gefäß kühlt, welches die bestrahlten Krebszellen, Zellmembranen oder TSA-Extrakte einschließt.
3Ί 528 51
Wie von J.W. Schere3chewsky in "Biological Effects of
Very High Frequency Electromagnetic Radiation", Radiology, Vol. 20, pages 246-253 (1933) ("Biologische Effekte von
elektromagnetischer Höchstfrequenzstrahlung") bemerkt, kann
eine verschiedene Wirkung auf einzelne Gewebekomponenten durch die spezielle Frequenz eintreten, bei welcher Zellbestandteile
Energie bevorzugt aufnehmen.
Die Verwendung von Hochfrequenzbehandlungen mit einer Beschreibung der mechanischen Einzelheiten eines Geräts für
diesen Zweck wurden beschrieben von J.A. Diskson et al in "Tumor Eradication in the Rabbit by Radiofrequency Heating",
in Cancer Research 37:2162-2169 (1977) ("Tumorbeseitigung
im Kaninchen durch Hochfrequenzerwärmung").
Die Verwendung von elektromagnetischer Hochfrequenz-5 strahlung zur Behandlung von menschlichen Tumoren wurde beschrieben
im Artikel von S. Sugaar und H.H. LeVeen, "A Histopathologic
Study of the Effects of Radiofrequency Thermotherapy on Malignant Tumors of the Lung", Cancer, Vol. 43,
pages 767-783 (1979) ("Eine histopathologische Untersuchung der Wirkung von Hochfrequenz-Thermotherapie auf maligne
Tumore der Lunge"); und von F.K. Storm et al in "Normal
Tissue and Solid Tumor Effects of Hyperthermia in Animal Models and Clinical Trials", Cancer Research 39:2245 (1979)
("Wirkung von Hypothermie auf normale Gewebe und festen Tumor in Tiermodellen und klinischen Untersuchungen").
Mikrowellenbehandlung von Tumoren wurde beschrieben im Artikel von J. Mendecki et al "Microwave-Induced Hyperthermia
in Cancer Treatment: Apparatus and Preliminary Results", International Journal of Radiation Oncology Biology and
physics, Vol. 4, pages 1095-1103 (1978) ("Durch Mikrowellen induzierte Hypothermie in der Krebsbehandlung: Geräte und
vorläufige Ergebnisse"); und im Artikel von Raymond U et al "Microwave-Induced Hyperthermia in Combination with Radio
Therapy of Human Malignant Tumors", Cancer, Vol. 45, pages 638-646 (1980) ("Mikrowe11en-induzierte Hypothermie in Kombination
mit Hochfrequenztherapie von menschlichen malignen Tumoren"). Ein Intrinsik-Effekt von elektromagnetischer
Strahlung auf Maus-Lymphosarkomazellen ist beschrieben von
V. Riley; Cancer Research, Vol. 20:132, 1979 (ref. 533).
Ultraschallwellen erzeugen ebenfalls subzellulare Schwingungswirkungen hoher Geschwindigkeit bei molekularen
Teilchen in TumorzeIlen und Zellmembranen, und ihre Wirkung
wird vom Anmelder als nützlich bei der Herstellung von antigenwirksamen
TSAs angesehen; siehe den Artikel von G.C. Li et al "Cellular Inactivation by Ultrasound", Nature, Vol. 267,
pages 163-165 (1977) ("Zellulare Inaktivierung durch Ultraschall"),
und den Artikel von J.B. Marmor et al "Treatment of Superficial Human Neoplasms by Local Hyperthermia Induced
by Ultrasound", Cancer, Vol. 43, pages 188-197 (1979) ("Behandlung
von oberflächlichen menschlichen Neoplasmen durch ultraschallinduzierte örtliche Hypothermie"). Röntgenstrahlen
und Alpha-, Beta- und Gamma-Strahlung sind nicht brauchbar.
Andere Arten hoher Energiezufuhr zum Erhitzen, einschließlich Lichtwellen (Laser), Elektronenstrahlerhitzung
usw. können auch geeignet sein. Elektromagnetische Wirkungen können sehr rasche Polaritätsänderungen in dipolaren MoIekülen
von Krebszellen, Krebszellmembranen oder von den_gleichen
abgeleiteten TSAs erzeugen, welche darin genügend starke antigene Veränderungen erzeugen, so daß, wenn diese Materialien
in Berührung kommen mit Lymphocyten, welche durch Krebs des gleichen Typs und/oder der gleichen Histologie
sensibilisiert sind, in Gegenwart von Makrophagen Aggregation
und Fusion von Makrophagen eintritt. Die Menge der in jedem Fall erforderlichen elektromagnetischen Energie hängt
von der Energiequelle, dem Gerät, der Geometrie und den dielektrischen Eigenschaften des Applikators und von dem die
Energie absorbierenden Krebsgewebe ab und wird in jedem Einzelfall empirisch bestimmt.(Applikator:eine HF-Heizelektrode)
Menschliche krebsspezifische Antigene können gewonnen werden aus chirurgisch entfernten malignen Tumoren, bei
Autopsie kürzlich entfernten Tumoren oder aus Massen von in vitro kultivierten Krebszellen.
Für Pilotuntersuchungen können die ersten zwei Quellen ausreichend sein; für Prüparationen in großem Maßstab werden
vorzugsweise in vitro kultivierte Krebszellinien verwendet. Im folgenden sind Methoden angegeben, welche am besten
geeignet sind, stark antigene Krebszellen und Krebszellmembranen, die antigene TSAs enthalten, zu erzeugen.
I. (a) Mit chirurgisch herausgeschnittenem, aseptisch gehandhabtem, geschnittenem Krebsgewebe oder solchem, das
von durch Autopsie entnommenen Organen erhalten wurde, wird ein Volumen Tumorgewebe (z.B. 30 Gramm) befreit von Binde-
und Fettgewebe, sichtbarem nekrotischem Gewebe und Blut in eine chemisch inerte Kunststofflasche gegeben, die zwei
Volumen (60 ml) steriles RPMI-1640 Kulturmedium (pH 7,4)
enthält; oder (b) in vitro gezüchtete Massen (z.B. 1000 χ
15, maligne Zellen) von Krebszellen oder (c) 1 Volumen von leukämischen
Zellen (z.B. 1000 χ 10 maligne Zellen) in 1 Volumen sterilem Kulturmedium werden in die Kunststofflasche gegeben
und jeweils elektromagnetischer Hochfrequenz oder Mikrowellenenergie ausgesetzt. Dielektrische elektromagnetische
strahlung wird erzeugt, z.B. bei 13,56 MHz oder 2450 MHz
kristallgesteuerter Frequenz durch ein Gerät, das 300 W einstellbarer Ausgangsleistung liefern kann, um Strahlung
auf eine Kunststofflasche zu richten, die von einem Applikator
umgeben ist und gebrauchstüchtiges Krebsgewebe in einem Elektrolyten, z.B. Gewebekulturmedium, welches Proteaseinhibitorsubstanz
(0,1mM Phenyl-Methylsul-fonylfluorid oder Epsilon-Aminocapronsäure 0,25 mg/ml) enthält. Wärmemessung
des eingeschlossenen und bestrahlten Krebsgewebes wird durchgeführt mittels eines Fernthermometers, das mit
Thermistor-Fühlern verbunden ist, die in das in der Flasche befindliche Tumorgewebe eingesetzt sind. Die gesteuerte und
aufrechterhaltene Temperatur wird gemessen und angezeigt während kurzer Perioden, in denen die Bestrahlung und das
mechanische Schütteln für einen Augenblick unterbrochen
* 5 werden.
Vorzugsweise wird ein fester, mit Elektrolyt gefüllter
weicher biegsamer Applikatorbeutel verwendet, der an seiner Arbeitsfläche die chemisch inerte Kunststoffflasche
umschließt, welche das Krebsgewebe in RPMI-1640 Kulturmedium enthält. Der Beuteltyp-Applücator wird elektrisch
abgestimmt auf die eingesetzte, tumorenthaltende
Kunststofflasche, d.h. er ist so ausgelegt, daß er die Reflexion elektromagnetischer Strahlung von der Grenzfläche
zwischen dem Applikator und der Flasche mit ihrem inhalt auf ein Mindestmaß herabsetzt. Es ist gewöhnlich
nötig, den Applikator mit einem getrennten koaxialen Tuner abzustimmen, indem man den Beuteltyp-Applikator gegen die
Kunststofflasche drückt, welche das Tumormaterial enthält, das durch Hochfrequenzenergie erhitzt und vibriert werden
soll. Das wird bewirkt, indem man den Tuner einstellt, bis die vom Tumor reflektierte Energie ihr Minimum erreicht.
Beuteltyp-Applikatoren, die vorzugsweise mit festen Dielektrika
gefüllt sind, werden für diesen Zweck bevorzugt. Elektromagnetisch erzeugte Energie wird vom Verstärker zu
einem Impedanzabstimmkreis und von dort zu zwei isolierten Koaxialkabeln übertragen, die fest an der Außenseite des
Applikator-Beutels angebracht sind, der an seiner Oberfläche mit absorbierendem Material bedeckt ist. Das von
der Flasche eingeschlossene feuchte Tumorgewebe wird,
während es in dem gepufferten Gewebekulturmedium suspendiert ist, bei geregelten Temperaturen von nicht weniger
als 22° und nicht mehr als 55°C und £ür Perioden von nicht
weniger als 20 und nicht mehr als 180 Minuten bei einer Bestrahlung gehalten. Lösliches Krebszelleneluat, welches
infolge der Bestrahlung mit elektromagnetischen Wellen in die Pufferlösung eintritt, wird abgenommen und konzentriert,
denn während der Bestrahlung wird das wäßrige Kulturmedium allmählich angereichert an TSAs, die aus bestrahlten
Krebszellmembranen austreten. Solche TSAs können durch die Hohlfaserextraktionsmethode konzentriert werden.
Nach der Bestrahlung mit elektromagnetischer Strahlung
wird das feuchte Tumorgewebe mit Skalpell und Scheren zerschnitten,
und die feingeschnittenen Tumorteilchen werden durch Metallsiebe von zunächst 0,42 mm und dann 0,25 mm
lichte Maschenweite (40 bzw. 60 mesh) geseiht. Die Tumorteilchen und Zellen werden dreimal mit steriler phosphatgepufferter
Salzlösung gewaschen und dann in 40 ml eines hypotonischen Puffers suspendiert (10 mM Tris HCl, pH 7,5,
der 0,1 mM Phenylmethylsul-f onylfluorid (PMSF) zur Inhibierung
endogener Protease-Aktivität enthält). Zur chemischen Extraktion und Reinigung von TSAs wird vom Anmelder
die Methode von K. Sikora et al, Br. J. Cancer, Vol. 40, pages 831-838 (1979) bevorzugt, welche die folgenden Stufen
aufweist:
5 A. Krebszellenmembran Isolierung und Löslichmachung
Die Suspension von Tumorteilchen und Zellen erhält 20 Schläge in einem Dounce-Homogenisator und wird in einer
Schwingbecherzentrifuge bei 108.000xg 1 Stunde bei 4°C auf einer Schicht von 45/6 Sucrose zentrifugiert. Die Membranfraktion
bildet Schichten auf der Sucrose und wird gesammelt, erneut suspendiert in 0,01 M phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS) und durch Zentrifugieren während 30 Minuten bei 108.000xg als Pellet erhalten. Das Pellet wird aufgebrochen
durch Pipettieren mit einer Pasteur-Pipette und gelöst in 2 ml von 1% Desoxycholat (DOC) in 0,01 M phosphatgepufferter
Salzlösung (?BS) mit einem Gehalt von 0,1 mM PMSF. Nach zwei Stunden schwachem Mischen bei 4°C werden 2 ml 0,01 M
PBS zugefügt, um die DOC-Konzentration auf 0,53t zu bringen. Diese Mischung wird 30 Minuten bei 108.000xg zentrifugiert,
und die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt.
Das überstehende wird in Visking-Schläuchen 8-1/32 bei 4° 48 Stunden lang mit 3 Wechseln im Dialysat (0,01 M
PBS und 0,1 mM PMSF) dialysiert. Das ist wirksam zur Entfernung
der Hauptmenge des Desoxycholats. Aliquots von dialysiertem Krebszellenmembranextrakt können wenigstens
einen Monat lang bei -20°C gelagert werden.
Das dialysierte überstehende, welches TSAs enthält,
kann weitergereinigt werden, indem man es durch Säulen von
Sepharose-Perlen leitet, die mit einem immobilisierten Lectin (Weizenkeimagglutinin) gekoppelt sind. Weizenkeimagglutinin
in kovalenter Kopplung an Säulen von Sepharose-Perlen ist wirksam zur Glycoprotein-Trennung und kann in
Gegenwart von niedrigen Konzentrationen von Detergentien gebraucht werden.
Wäßrige, TSAs und HLAs enthaltende Extrakte, die man durch solche Säulen laufen läßt, binden TSAs an das Lectin
auf den Perlen, jedoch nicht die HLAs. So werden die TSAs durch ein verhältnismäßig einfaches Einstufenverfahren gereinigt.
B. Herstellung von Weizenkeimagglutinin-Säulen Weizenkeimagglutinin (erhältlich von Pharmacia Fine
Chemicals, Piscataway, Nj/USA) wird an cyanbromid-aktivierte
Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals) gekoppelt. 2 g cyan-aktiviertes Sepharose 4B-GeI wird gequollen und 1 5 Minuten
in 500 ml 1mM HCl auf einem Glasfritten-Filter gewaschen.
10 - 50 mg Weizenkeimagglutinin werden in 10 ml des Kupplungspuffers (0,1 M NaHCO3, 0,1 M NaCl, pH 8,3)
gelöst,welcher 2% N-Acetylglucosamin enthält.
Das gewaschene gequollene Gel wird dem Kupplungspuffer
zugesetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur (19°C) gemischt. Ungebundenes Material wird mit dem Kupp lungspuffer abgewaschen,
und alle verbleibenden aktiven Gruppen werden mit 1 M Ethanolamin (pH 8,0) 1 Stunde lang umgesetzt. Drei Waschzyklen
werden angewandt, um nicht kovalent absorbiertes Protein zu entfernen, wobei jeder Zyklus aus einer Waschung
bei pH 4,0 (0,1 M Natriumacetat, 1,0 M NaCl) und einer anschließenden Waschung im Kupplungspuffer besteht. Dieses
Verfahren bewirkt die Bindung von 70 - 80 % des Lectins an der Sepharose, wie abgeschätzt nach der optischen Dichte
bei 280 nm (OD 280) von zugesetztem und ungebundenem Lectin. C. Elution von gereinigtem TSA-Extrakt
5 ml von gewaschenem lectingekuppeltem Gel werden in eine Kunststoffspritze auf ein kleines Stück Glaswolle gegeben.
Die Säule wird mit Beladungspuffer (0,01 M NaHPO4,
:··:"»: 3Ί52851
1O-5M CaCl2, 10'5M MnCl2, 0,1 mM PMSF, 0,85% NaCl, 0,2%
DOC, pH 7,3) ins Gleichgewicht gebracht und bei 25°C betrieben. Löslich gemachter Krebszellmembranextrakt, der
durch Dialyse von Desoxycholat befreit ist, wird in ein 2 ml Volumen geladen und 30 Minuten lang ins Gleichgewicht
gesetzt. Die Säule wird dann mit Beladungspuffer gewaschen, bis kein weiteres Protein (bestimmt durch OD 280 des Ausflusses)
nachgewiesen wird. Drei Waschungen, welche ungebundene Bestandteile enthalten, werden zusammengegeben.
Dann läßt man den Elutionspuffer, der 2% N-Acetylglucosamin
enthält, in die Säule laufen.
Nach 30 Minuten Gleichgewichtseinstellung wird die Säule mit Elutionspuffer gewaschen, und die Waschlösungen
werden wieder aufgefangen, zusammengegeben und dann 48 Stunden gegen 0,01 M PBS dialysiert und durch Vakuumdialyse konzentriert.
Der dialysierte gereinigte löslich gemachte TSA-Extrakt kann in einem wäßrigen Medium, z.B. in RMPI-1640-Gewebekulturmedium-Aliquots,
aufbewahrt und bei -200C gelagert werden. TSA kann in Einzel-Aliquots unterteilt werden
durch O.H. Loyry's Proteinbestimmungsmethode (j. of Biol.
Chem. 193 Σ 265-709, 1971).
II. Herstellung von KrebsZellmembranen mit starkem
spezifischem Antigen-Effekt Brauchbare Krebszellen, die gewonnen sind von feingeschnittenem
und fein gesiebtem, frischem, chirurgisch entferntem, brauchbarem menschlichem Krebs oder brauchbaren
in vitro kultivierten menschlichen Krebszellenmassen von bekannter pathohistologischer Definition werden dreimal
mit steriler Salzlösung gewaschen und dann in Salzlösung, die 0,1 mM Phenyl-Methylsulfonylfluorid enthält, suspendiert.
Nach 15 Minuten Stehen bei Raumtemperatur und einer
Schlußwäsche mit Salzlösung werden die sedimentierten Krebszellen
in ein wäßriges Medium gegeben, das aus 1 50 mM NaCl, 1 ,0 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2 und 50 mM Natriumborat bei 7,2 pH
besteht und eingestellt, um am Ende ein Pellet von etwa 1,2 ml zu geben. Jedes Pellet wird dann in 5 ml 2,5 mM
Natriumborat und 0,2 mM EDTA bei pH 9,6 suspendiert und
rasch mit 200 ml der gleichen Lösung gemischt. Nach einer
Zeitdauer von 10 Minuten, während der die Zellen platzen
und Oberflächenmembranabtrennung erfolgt, wird die Extraktion durch Zugabe von Natriumborat bei pH 9,6 bis zu einer Endkonzentration
von 20 mM gestoppt. Das hauptsächlich aus gefälltem Kernmaterial bestehende weiße Gel wird mit einem
Sieb entfernt, und Zentrifugieren bei 5000xg während 10 Minuten konzentriert die Oberflachenmembranphantome. Diese
werden in Salzlösung suspendiert und anschließend 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Der überstand wird abgekippt,
und das Pellet in 20 ml Salzlösung suspendiert und anschließend 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Nach dem Dekantieren
werden die Pellets dreimal mit phosphatgepuffertem (pH 7,4) Kulturmedium RPMI-1640 gewaschen und in 5 ml dieses
5 Mediums gleichmäßig suspensiert zur Aufbewahrung im Kühlschrank,
bevor sie als Antigene oder liposomgekapselte Antigene in Krebstests verwendet werden.
III. Extraktion von TSAs aus Krebsgewebe, das durch
Hochfrequenzenergie, äquivalente Mikrowellenenergie oder Ultraschall erhitzt wurde, kann auch durchgeführt werden
gemäß einer Modifizierung der Methode nach Reisfeld und Kahan, Fed. Proc., Vol. 29, page 2034 (1979), wonach 3 M
KCl hypertonisches Salz langsam während 30 Minuten einer Zellsuspension zugesetzt wird, um eine Endkonzentration
von 3 M zu erreichen. Die Extraktionsmischung wird bei 4°C 16 Stunden unter dauerndem Rühren ivikubiert. Unlösliche
Zellbestandteile werden durch Ultrazentrifugieren bei 164.000xg während 50 Minuten sedimentiert. Die überstehende
Flüssigkeit, welche löslich gemachte TSAs enthält, wird durch Dialyse gegen 50% Sucroselösung konzentriert und
dann 16 Stunden gegen 200 Volumen 0,15 M Salzlösung dialysiert. Während der Konzentrierung und Dialyse gebildete
Niederschläge werden durch Zentrifugieren bei 48.000xg entfernt. Die TSAs und HLAs enthaltende überstehende
Flüssigkeit wird mit 1 5 Volumen phosphatgepufferter Salzlösung
verdünnt und weitergereinigt durch Absorbtion an
Weizenkeim-Agglutininsäulen und davon eluiert, wie oben beschrieben.
IV. Humane Fötalantigene, z.B. Humanlungentumor-Fötalassoziiertes
Antigen (LTFA) kann aus Humantumorgewebe extrahiert und gereinigt werden durch eine Kombination von
Salzfällung und Ionenaustausch-Chromatographie gemäß dem Artikel von Ercole Sega et al "Specific Blastogenic Response
of Peripheral Blood Lymphocytes from Lung Cancer Patients to a Fetal Lung Antigen", Journal of the National Cancer
Institute, 64:1001-1006 (1980) ("Spezifische blastogenische Reaktion von peripheren Blutlymphocyten von Lungenkrebspatienten
auf ein Fötal-Lungenantigen·1).
Fötalantigene sind bemerkenswert hitzebeständig,und die bevorzugten Obergrenzen für das Erhitzen anderer oben
5 angegebener Tumorantigene gelten nicht notwendigerweise für die besten TSA-Präparationen, die aus fötalantigenreichen
Tumoren gewonnen werden. Nach dem Erhitzen durch Hochfrequenz oder äquivalentes Erhitzen wird Humanlungenkrebsgewebe
oder Lungengewebe von 3 bis 5 Monats-Fötussen in destilliertem Wasser homogenisiert. Nachdem das Homogenat
30 Minuten bei 25.000xg zentrifugiert worden war, wurde der überstehenden Flüssigkeit Ammoniumsulfat zugesetzt,
bis 40 % Sättigung erreicht waren, wonach der Niederschlag verworfen wurde. Dann wurde die Salzkonzentration der überstehenden
Flüssigkeit auf 60 % erhöht; der zweite Niederschlag wurde in 0,01 M K2HPO4 gelöst, ausgiebig dialysiert
und schließlich bei -200C aufbewahrt. Die Proteinkonzentration
der aufbewahrten Lösung (30 mg/ml) wurde nach der Methode von Lowry et al durch Verwendung von Rinderserumalbumin
als ein Standard bestimmt.
1 ml einer Lösung von Protein, das bei 60 % Ammoniumsulfat-Sättigung
aus beiden Tumor- und Fötalextrakten gefällt worden war, wurde durch extraktive DEAE-Ze Hu los e-Chromatographie
(DE52 Whatman) auf einer 1x30cm-Säule unter Verwendung von 180 ml eines 0,01 - 0,2 M K2HPO4 Linear-
Gradienten (pH 8,2) als Eluent fraktioniert. Der Durchsatz war 7 ml/stunde, und 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt.
Die optische Dichte des Eluats wurde bei 280 und 260 nm
mittels eines Geräts LKB Uvicord III (LKB Produkte AB,
Bromma, Schweden) verfolgt.
Die Elution von LTFA wurde verfolgt, indem man Einzelfraktionen
einem Doppel-Immunodiffusionstest unter Verwendung eines anti-LTFA-spezifischen Kaninchen-Antiserums unterwarf.
Fraktionen, welche das antigene Material enthielten, wurden vereinigt, gegen phosphat-(0,01M)-gepufferte
Salzlösung (0,15 M, pH 7,2} dialysiert und unter negativem
Druck auf 2 mg/ml konzentriert. Vor der Verwendung in peripheren Blutlymphocyten-Krebstests wurden die Zubereitungen
sterilisiert auf 0,22 Micron Millipore Filtern (Millipore
Corp., Bedford, Mass.). Höhere Konzentration von TSA-Extrakten können erhalten werden durch Anwendung der Hohlfaser-Konzentrationsmethode
(Bio-Rad Lab.; Richmond, CaIifornia/USA).
Maligne Humantumore, die chirurgisch oder durch
Autopsie erhalten werden, bilden eine begrenzte Quelle für Krebszellenextrakte. Um größere Mengen der von Humankrebszellen
stammenden TSAs von genügender Gleichförmigkeit und in größeren Mengen zu erhalten, sind in vitro Massenkulturen
von bekannten Tumorzellinien notwendig. Fermentiereinrichtungen und/oder der von S.Gräff und H.Moser in "New Interpretations
in Cancer Biology", Journal of the Hospital for Joint Diseases 23:59-79 (1972) ("Neue Interpretationen in
Krebsbiologie") beschriebene Cytogenerator sind verwendbar zum Kultivieren von Krebszellen in großer Zahl. Die oben
beschriebenen TSA-Extraktionsmethoden sind anwendbar auf
in Massenkulturen gezüchtete Krebszellen.
Der Ausdruck "extrahiert aus dem genannten Krebsmaterial" bezeichnet TSAs von gesteigerter Antigen-Aktivität,
die aus bestrahltem Krebsmaterial erhalten wurden, welches Krebszellmembranen enthält. Dieses kann nach Methoden,
wie sie hier angegeben wurden, ausdrücklich extrahiert werden. Die TSAs können auch "extrahiert" werden, einfach
durch Elution aus der Krebszellenmembran in das wäßrige » Kulturmedium während der oben angegebenen Bestrahlung.
Methoden und Materialien zur Herstellung von TSAs enthaltenden Liposomen
Lipidkügelchen (Tröpfchen), die als Liposome bezeichnet
werden, sind bekannt als Träger für Wassermaterialien in wäßriger Zwischenphase seit ihrer ursprünglichen Beschreibung
von A.D. Bangham et al "Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids", Journal
of Molecular Biology, 13:238-252 (1965) ("Diffusion von
einwertigen Ionen durch die Lamellen von gequollenen Phospholipiden"). Neuere Angaben zur Einkapselung in Liposomen
sind enthalten in Veröffentlichungen von W.E. Magee et al, "The Interaction o£ Cationic Liposomes Containing Entrapped
Horseradish Peroxydase with Cells in Culture11, Journal of Cell Biology, 63:492-504 (1974) ("Die Wechselwirkung von
kationischen Liposomen, welche Meerrettich-Peroxydase eingeschlossen
enthalten, mit Zellen in Kultur"); S.Sone et al, "Rat Alveolar Macrophages are Susceptible to Activation by
Free and Liposome-Encapsulated Lymphokines·1, Journal of
Immunology, 124:2197-2002 (1980) ("Alveolen-Makrophagen
der Ratte sind aktivierbar durch freie und in Liposome eingekapselte Lymphokine"); und F.Sakai et al, "Association
of Gross Virus-Associated Cell-Surface Antigen with Liposomes", British Journal of Cancer, 41:227-235 (1980) ('Assoziierung
von mit dem Gross Virus assoziiertem Zelloberflächen-Antigen mit Liposomen").
Liposomteilchen im Rahmen der Erfindung werden hergestellt
durch Dispersion von getrockneten Filmen von Phospholipiden in einer wäßrigen Phase, die TSAs enthält, welche
sich fest an die Lipidschichten der Liposomen anheften.
Sphingomyelin-Liposome können hergestellt werden durch Auflösen von 50 mg Sphingomyelin (hoch gereinigt, aus
Rinderhirn), 10 mg Cholesterol und 6 mg Stearylamin in 18 ml
Chloroform, zusammen mit einer kleinen Menge Methanol. Die Lösung wird aufgeteilt auf sechs 50ml-Rundkolben oder drei
lOOml-Rundkolben, und das Lösungsmittel wird durch Schnellverdampfung
auf einem Drehverdampfer bei Raumtemperatur
entfernt. Die Kolben werden mit N2 gespült, und 0,3 - 0,5 ml
der wäßrigen Suspension, welche die extrahierten TSAs enthält, werden in jede Flasche gegeben.
Eine andere Methode zur Herstellung von Liposomen besteht darin, daß man Ei-Phosphatidylcholin, Rinderhirn-Phosphatidylserin
und Lysolecithin in Molverhältnis 4,95: 4,95:0,01 in einem Gesamtgewicht von 66 mg einsetzt. Diese
Menge wird in 18 ml Chloroform zusammen mit einer kleinen Menge Methanol gelöst. Die Lösung wird auf sechs 50ml-Rundkolben
verteilt, und das Lösungsmittel durch Schnellverdampfung entfernt, die Kolben werden mit N2 gespült, und
in jede Flasche werden 0,3 bis 0,5 ml der TSAs enthaltenden wäßrigen Phase gegeben.
Die Filme werden vom Glas unter Anwendung eines Vortex-Genie-Mischgeräts abgelöst. Zwei oder drei Glasperlen
können zugesetzt werden, um das Lockern des Lipidfilmes zu befördern. Die Liposome werden aus den Kolben entnommen,
und die Kolben werden mit einer kleinen Menge der wäßrigen Phase gespült. Die Liposome werden mit Ultraschall in unterbrochenen
20 Sekunden-Intervallen bei 4 - 100C für eine
Gesamtdauer von 1-2 Minuten mit einem Branson Biosonic III Vibrator, der mit einem Mikroansatz ausgerüstet ist, behandelt.
Die Zubereitung wird mit einer Salzphosphatlösung (0,15 M NaCl und 0,01 M Phosphat, pH 6,9) verdünnt, und die
Liposomen werden durch Zentrifugieren bei 60.000xg während 30 Minuten im 50 Ti-Rotor einer Beckman-Ultrazentrifuge gesammelt.
Die pelletisieren Liposome werden wieder suspendiert und noch zweimal durch Zentrifugieren gewaschen und
bei 0 - 5°C in Salin-Phosphatlösung aufbewahrt zur Verwendung
in verschiedenen Aliquots in den Krebstests. Makrophagenfusionstest
A. Die verwendeten Makrophagen sind Lungenalveolen-Makrophagen, die von Vesuchstieren, vorzugsweise Kaninchen,
erhalten werden. Die Herstellungsmethode folgt dem Verfahren, das in der Veröffentlichung von Q.N. Myrvik et al "Studies
on Pulmonary Alveolar Makrophages from the Normal Rabbit",
J. of Immunology 86:123-132 (1961) ("Untersuchungen an Lungenalveolenmakrophagen vom normalen Kaninchen") beschrieben
ist. Normale erwachsene Kaninchen werden getötet durch Injektion von 4 ml Veterinär-Nembutal i.v. Der Brustkorb
wird geöffnet und durch eine Kanüle in die Trachea werden 40 ml isotonische Gewebekulturflüssigkeit in den
Lungenbronchialast eingeführt. Der Eintritt von Blut in das Operationsfeld wird sorgfältig vermieden. Die Wasch-
- flüssigkeit wird aus der Lunge abgezogen und bei 1500 UpM
20 Minuten zentrifugiert. Aliquots der sedimentierten Alveolenmakrophagen
werden auf Brauchbarkeit (Lebensfähigkeit) getestet, indem man mit 0,02?i Trypanblaulösung färbt.
Brauchbare Makrophagen werden in RPMI-1640 ohne Serum suspendiert,
zweimal gewaschen und nach 10 Minuten Zentrifugieren bei 2000xg gewonnen. Makrophagensuspensionen in
Kulturmedium werden in Hämocytometern gezählt, und ihre
Konzentration auf 9x10 Zellen/ml eingestellt.
B. Lymphocyten von Krebspatienten und anderen, die auf Krebs getestet werden, werden durch Venenpunktion erhalten.
Aus 15 ml mit Heparin versetztem oder defibrinierten
Blut von Krebspatienten oder anderen Personen werden einkernige Zellen abgetrennt nach A. Boyums Methode unter Verwendung
einer Ficoll-Hypaque-Lösung mit einer Dichte von 1,076. Nach Abpipettieren der Grenzflächenzellen, die zurückbehalten
werden, wird die darunterliegende Ficoll-Hypaque-Lösung verworfen. Die Erythrocyten-Pellet-Fraktion
wird wieder suspendiert in Medium in einem Volumen gleich dem Volumen des ursprünglich auf den Gradienten geschichteten
Bluts. Um Lymphocyten zu gewinnen, wird diese Pelletfraktion auf einen frischen Ficoll-Hypaque-Gradienten
(Dichte 1,083) pipettiert und bei 75Oxg 25 Minuten bei
Raumtemperatur zentrifugiert.
Die Zellen der Grenzflächenfraktion der ursprünglichen
1,076-Flotationsschicht und die aus der zweiten 1,083 Ficoll-Hypaque-Flotationsschicht
gewonnene Grenzflächenfraktion werden vereinigt und zweimal mit RPMI-1640-Kulturmedium ge-
waschen. Die sedimentierten Lymphocyten werden in 30 ml
RPMI-Medium, das 10 % hitzeinaktiviertes Humanserum enthält,
suspendiert.
The vorhandenen Monocyten werden entfernt, indem man
die Zellsuspension in 75 cm -Kulturkolben (Falcon Plastics No. 3024) 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Monocyten binden
sich an Gewebekultur-Plastikoberfläche, und die Lymphocyten
werden abgewaschen durch Spülen mit 30 ml Kulturmedium. Nach Prüfung der Brauchbarkeit der Lymphocyten mit
dem Trypanblauausschlußtest werden Aliquots von 10 Lymphocyten/ml
in RPMI-1640-Kulturmedium suspendiert, das mit
15 % Normalhumanserum, 0,1 mM L-Glutamin, 40 Mikrogramm
Gentamicin und 2-Mercaptoethanol in 60 Mikromolar Konzentration ergänzt ist.
Einzelne Lymphocytenproben in Reagenzgläsern, 16x100mm,
mit rundem Boden und Schraubkappe (Kimax 45066, Kimble Prod.,
Toledo, Ohio, USA) in Aliquots von 1 ml werden in 5 % CO2
angefeuchteter Atmosphäre bei 37°C 24 Stunden mit Zusatz von 3 bis 15 bis 25 Mikrogramm TSA/rol oder mit 0,5 ml AIiquots
von gleichmäßig suspendierten Krebszellmembranen/ Phantomen/ml, die wie oben unter II, auf Seite 15/16
beschrieben, hergestellt sind, kultiviert. Nach 24 Stunden werden die Reagenzgläser zentrifugiert (500xg), und das
zellfreie Oberstehende wird entfernt und durch 1 ml frisches
Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung ersetzt, worauf die Inkubation weitere 48 Stunden fortgesetzt wird. Das
überstehende wird dann angesaugt, durch 0,22 Mikron Millipore-Filter
filtriert, und falls nicht sofort verwendet, bei 4°C aufbewahrt.
C. Gewinnung von normalen Alveolen-Makrophagen
Gesunde, nicht sensibilisierte Kaninchen werden getötet,
und ihre Alveolen-Makrophagen werden durch Waschen gewonnen. Die Alveolen-Makrophagen werden zweimal in RPMI-1640
Medium ohne Serum gewaschen und durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 200xg gewonnen. Die Makrophagen-Zellsuspensionen
werden mit einer Hämocytometer-Kammer gezählt und auf eine Konzentration von 9x10 Makrophagenzellen/ml eingestellt.
0,5 Aliquots des erwähnten, durch Millipore-Filter
filtrierten Zellkultur-Uberstehenden werden getrennt in Wasserman-Röhrchen gebracht. Eine 0,1 ml Probe von Kaninchen-Alveolen-Makrophagensuspension
(1,5 x 1Cr Zellen) wird in jedes Wasserman-Röhrchen gegeben. Die erhaltenen Zellsuspensionen
werden in 5 Vertiefungen von Nr. 3034 Mikrotest Gewebekulturplatten (Falcon Plastics, Oxnard, CaIifornia/USA)
verteilt. Die Platten werden dann unter aseptischen Bedingungen in einem CO2-Inkubator (95 % Luft,
5 % CO2) bei 37°C in angefeuchteter Atmosphäre inkubiert
und nach 24 Stunden und danach in Intervallen bis zu 72 Stunden auf Makrophagenfusion untersucht, stattdessen kann
die Lymphocyten-Reaktion auf Antigene gesteigert werden
durch Kultivieren bei 400C, wie beschrieben in der Veröffentlichung
von J.B. Smith et al "Human Lymphocyte Responses are Enhanced by Culture at 400C", The Journal
of Immunology, Vol. 121, No. 2, pages 691-694 (1978)
("Human-Lymphocyten-Reaktionen werden gesteigert durch Kultur bei 40°C"). Als Routine sollte die Inkubation wenigstens
24 Stunden durchgeführt werden (jedoch sollten gelegentlich Inkubationen bis zu 72 stunden durchgeführt
werden). In positiven Kulturen sind nach 24 Stunden Inkubation
am Boden der Kulturvertiefungen verschmolzene Makrophagen oder mehrkernige Riesenzellen vorhanden. Die
Zahl der Einzelmakrophagen nach 1 Stunde Kultur und nach 24 Stunden, sowie die zahl der verschmolzenen (fusionierten)
Makrophagen oder Rieeenzellen (mit mehr als 5 Kernen pro Zelle) wird gezählt und mit 100 mal Vergrößerung photografiert.
Die Verhältnisse und jeweiligen Zahlen von Einzel- und verschmolzenen Makrophagenzellen sowie die Verhältnisse
von Einzel- und Riesenzellen werden aufgezeichnet.
Mehr als 30 % verschmolzene Makrophagen, einschließlich mehrkernige Riesenzellen, die nach 24 Stunden Inkubation
vorhanden sind, werden als stark positive (3+) Ergebnisse angesehen. Tests mit weniger als 10 % verschmolzenen
Makrophagen werden als (1+) angesehen. Kulturen, die 10 % bis 30 % verschmolzene Makrophagen, einschließlich mehr-
kernige Riesenzellen, enthalten, werden als (2+) beurteilt. Jedoch ist die Gegenwart irgendeiner Zahl von mehrkernigen
Riesenzellen ein positives Ergebnis £ür Krebs eines ähnlichen
Tumortyps der Histologie wie die im Test verwendeten TSAs, auf die die Lymphocyten des Patienten durch Bildung
von Lymphokinen reagierten, welche zugesetzte Makrophagen zum Verschmelzen brachten.
Stattdessen kann man Makrophagenzellen in eine wäßrige
Suspension bringen und wäßrige Lösungen von angenommenen Lymphokinen den Zellsuspensionen zusetzen und die
Geschwindigkeit und das Ausmaß der eventuellen Vereinigung von Makrophagen in solchen Medien verfolgen und quantitativ
auswerten durch Verwendung der Aggregometer-Testmethode, die von B. Rouveix et al beschrieben wurde "A sensitive
technique for measuring specific macrophage aggregation", Immunology, 36; 589-594, 1979) ("Eine empfindliche Methode
zur Messung spezifischer Makrophagen-Aggregation"). Eine andere quantitative aggregometrische Methode zur Prüfung
der Gegenwart oder Abwesenheit von Lymphokinen, die erzeugt werden, wenn man sensibilisierte Blutplättchen dem
sensibilisierenden Antigen in wäßrigem Medium aussetzt, wurde beschrieben von K.J. Lavelle et al "Identification
of a New Platelet aggregating Factor Released by Sensitized Leucocytes", Clinical Immunology and Immunopathology,
3; 492-502, 1975) ("Identifizierung eines neuen plättchenaggregierenden Faktors, der von sensibilisierten
Leukocyten abgegeben wird").
Die aggregometrischen Methoden von Rouveix et al oder Lavelle et al werden bevorzugt gegenüber der ursprünglichen
visuellen Methode, die bei der Untersuchung von Makrophagen-Fusionsreaktionen angewandt wurde von B. Galindo et al
"Infection and Immunity" 9; 212-216, 1974). Cytofluorometrischer Test
Die Gegenwart von krebssensibilisierten Lymphocyten im peripheren Blut, das von Krebspatienten abgenommen wurde, kann bestimmt werden unter Verwendung der cytofluorome-
Die Gegenwart von krebssensibilisierten Lymphocyten im peripheren Blut, das von Krebspatienten abgenommen wurde, kann bestimmt werden unter Verwendung der cytofluorome-
trischen Analyse und spezieller durch Flow-Cytofluorometrie.
Der Grad der Lymphocyten-Stimulation durch Tumor-TSAs wird durch das Ergebnis der von Braunstein et al angegebenen
Methode "Quantitation of Transformed Lymphocytes by Flow
Cytofluorimetry", Federation Proceedings, Vol. 34, No. 3
(1975) ("Quantitative Bestimmung von transformierten Lymphocyten
durch Flow-Cytofluorometrie") wie folgt bestimmt:
Einkernige Zellen, die von peripherem Humanblut abgetrennt
sind durch kombinierte Fraktionen, erhalten durch Ficoll-Hypaque-Gradienten, wie oben erwähnt, werden bei
37°C oder bei 400C in 5 !i C02-Atmosphäre in RPMI-1640,
das 20 mM HEPES-Puffer und 10 % Normalhumanserum und 20 mM
L-Glutamin bei einer Zellkonzentration von 100.000 Zellen/ml
in Gegenwart von TSAs in verschiedenen (0,1 bis 100 Mikrogramm) Mengen inkubiert. Die Proben werden in Intervallen
bis zu 72 Stunden geerntet, in 1:1 Ethanol/Aceton fixiert und mit 10-g/ml Acridin-Orange in einem pH 6-Puffer gefärbt.
Cytofluorimetrische Messungen (Cytofluorograf 4801 angeschlossen an Nova 1220 Minicomputer) von Blindproben
von stimulierten Zellen zeigen erhöhte Rotfluoreszenz pro Zelle. Der Prozentanteil transformierter Zellen wird bestimmt
durch Bestimmung der Zahl der Zellen mit Fluoreszenzintensität, die außerhalb des Locus der unstimulierten
Lymphocyten fällt. Die Prozentanteile der stimulierten Zellen steigen mit der Zeit und verändern sich mit der
einzelnen optimalen Sensibilisierungsdosis der TSAs. Eine
Fluoreszenzintensität, die höher als die von nicht reagierenden Zellen liegt, bedeutet einen positiven Test für
Krebs, der in Beziehung steht zum Krebstyp und/oder histologischen Charakter des Krebses hinsichtlich dem von als
Sensibilisatoren verwendeten TSAs.
Die hier beschriebenen Krebsteste zeigen an, ob oder
nicht die in den Tests verwendeten Lymphocyten herrühren von einer Person, die gegenwärtig einen malignen Tumor hat
oder in der Vergangenheit Krebs einen solchen Typs oder histologischen Charakters wie die im Krebstest verwendete
TSA gehabt hat.
3 Ί 528 51
Zusammensetzungen, welche stark antigenwirksame tumorspezifische
Substanzen enthalten, können angewandt werden durch extrakorporeale oder parenterale Aktivierung von
kleinen und/oder großen einkernigen Zellen von immunokompetenten menschlichen Krebspatienten.
Claims (11)
1. Eine wäßrige Stoffzusammensetzung, die Wasser enthält,
welches stark antigene, makromolekulare, tumorspezifische Substanzen enthält, die hergestellt sind nach
einem Verfahren, wobei mit elektromagnetischer strahlung, welche nicht Alpha-Beta- und Gamma-Strahlung ist, Krebsgewebe
oder Krebszellen oder Krebszellmembranen, die von krebsartigen menschlichen Zellen von bekanntem histologischem
Charakter stammen, bestrahlt werden, um den Grad der Antigenaktivität der tumorspezifischen Substanzen zu
steigern, wobei diese Substanzen durch einen Grad von solcher Antigenaktivität gekennzeichnet sind, daß,wenn die
Zusammensetzung in Berührung gebracht wird mit einer Zusammensetzung von sensibilisierten Lymphocyten, die von
einem Wirt genommen sind, der Krebs von verwandtem histologischem Charakter hat, in Gegenwart einer Suspension
von Makrophagenzeilen, die hergestellt sind aus frisch
von Kaninchen erhaltenen Lungenalveolen-Makrophagen, und
die gemischte Zusammensetzung in einem CO2-Inkubator bei
37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre während 24 bis 72 stunden kultiviert wird, Fusion der Makrophagen eintritt.
2. Eine wäßrige Stoffzusammensetzung, die Wasser enthält,
welches stark antigene, makromolekulare, tumorspe-
zifische Substanzen enthält, die hergestellt sind durch
ein Verfahren, wobei mit elektromagnetischer Strahlung, ausgenommen Alpha-Beta- und Gamma-Strahlung, Krebsmaterial,
das ausgewählt ist aus Krebstumor oder -gewebe, Krebszellen und Krebszellmembranen, die von Krebs von bekanntem histologischem
Charakter stammen, bestrahlt wird, um den Grad der Antigen-Aktivität der tumorspezifischen Substanzen zu
steigern, und dann die tumorspezifischen Substanzen aus dem Krebsmaterial extrahiert werden, wobei die Substanzen
gekennzeichnet sind durch einen Grad von solcher Antigen-Aktivität, daß wenn die Stoffzusammensetzung in Berührung
gebracht wird, mit einer StoffZusammensetzung von sensibilisierten
Lymphocyten, die von einem Wirt genommen sind, der Krebs von verwandtem histologischen Charakter hat, in
Gegenwart einer Suspension von Makrophagenzellen, die aus
von Kaninchen frisch erhaltenen Lungenalveolen-Makrophagen
hergestellt sind, und die gemischte Stoffzusammensetzung
in einem CO2-Inkubator bei 37°C in einer angefeuchteten
Atmosphäre zwischen 24 und 72 Stunden kultiviert wird, Fusion von Makrophagen eintritt.
3. Verfahren zur Herstellung stark antigener tumorspezifischer Substanzen, wobei menschliches Krebsgewebe,
Krebszellen oder Krebszellmembranen, die von Krebszellen getrennt sind, einer Hochfrequenz-Schwingungsenergie ausgesetzt
werden, um die Temperatur des Krebsmaterials auf über etwa 22°C und ausreichend zu erhöhen, um darin stark
antigene tumorspezifische Substanzen zu erzeugen, die gekennzeichnet sind durch einen Grad von solcher Antigen-Aktivität,
daß wenn die Substanzen in Berührung gebracht werden mit einer Stoffzusammensetzung von Lymphocyten, die
von einer Person erhalten wurden, welche Krebs von ähnlichem histologischen Charakter hat, wie das Tumormaterial,
in welchem die stark tumorspezifischen Antigensubstanzen durch die Energie erzeugt werden, dann in Gegenwart einer
Suspension von Zellen, die aus von Kaninchen frisch erhaltenen Lungenalveolen-Makrophagen hergestellt sind/und bei
-30-
Kultivieren der gemischten Stoffzusammensetzungen in einem C02-lnkubator bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre zwischen
24 und 72 Stunden Fusion von Makrophagen eintritt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Energie induktive oder dielektrische Anwendung von
hochfrequenter elektromagnetischer Strahlung ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die stark antigenen tumorspezifischen Substanzen in
den bestrahlten Krebszellen oder KrebsZellmembranen erzeugt
werden und aus dem Krebszellmaterial in Wasser austreten oder extrahiert werden, um eine wäßrige Stoffzusammensetzung
zu bilden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Stoffzusammensetzung mit im wesentlichen getrockneten
Filmen eines Materials in Berührung gebracht wird, welches Liposomteilchen bildet, wenn eine wäßrige Phase darin
dispergiert ist, und dann die wäßrige Stoffzusammensetzung, welche stark antigene tumorspezifische Substanzen
enthält, auf dem getrockneten Film dispergiert wird, um Liposome zu bilden, die Lipidkügelchen sind, welche die
wäßrige Stoffzusammensetzung einkapseln.
7. Die lipideingekapselten Stoffzusammensetzungen,
welche nach dem Verfahren von Anspruch 6 herstellbar sind.
8. Verfahren zum Nachweis von Krebs, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lymphocytenprobe von Blut oder Gewebe
eines zu untersuchenden Wirts erhalten wird, die Lymphocytenprobe
im wesentlichen frei von SuppressorzeIlen mit
einer wäßrigen Stoffzusammensetzung von stark antigenem
tumorspezifischem Material in Berührung gebracht wird, das von Krebs von definiertem histopathologischen Charakter
stammt und gemäß dem Verfahren nach Anspruch 4 hergestellt ist, und daß bestimmt wird, ob Lymphokine durch die Lymphocyten
nach dem Kontakt hergestellt werden, wodurch, wenn Lymphokine produziert werden, der Test positiv ist und anzeigt,
daß der Wirt einen Krebs hat, der in histopathologischem Charakter verwandt mit dem Krebs ist, von dem das
stark antigene tumorspezifische Material stammt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die vom zu testenden Wirt entnommene Lymphocytenprobe
mit der stark antigenen tumorspezifischen Substanz oder solchen Substanzen in Gegenwart von Makrophagen in Berührung
gebracht wird und daß bestimmt wird, ob irgendwelche Lymphokine erzeugt wurden, indem bestimmt wird, ob irgendwelche
einzelne Makrophagen anschließend verschmolzen, wodurch, wenn solche Makrophagenfusion eingetreten ist, es
anzeigt, daß die Lymphocyten in der Probe in einem für die spezifische Krebstestsubstanz sensibilisierten Zustand waren,
was anzeigt, daß der Wirt, aus dem die Lymphocyten extrahiert wurden, gegenwärtig Krebs von pathohistologisch
verwandtem Charakter zum in der Reaktion verwendeten stark antigenen tumorspezifischen Material hat oder in der vergangenheit
hatte.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die von dem zu testenden Wirt entnommene Lymphocytenprobe mit den stark antigenen tumorspezifischen Substanzen
in wäßrigem Kulturmedium genügend lange in Berührung gebracht wird, um Lymphokine von den Lymphocyten des Tumorvirts
zu erzeugen, und dann die Lymphocyten durch Filtration oder Zentrifugieren entfernt werden und eine frisch
erhaltene Suspension von dispergierten Blutplättchen oder Makrophagen in Wasser zum wäßrigen Kulturmedium zugefügt
wird, von dem die Lymphocyten entfernt wurden, wodurch, falls Aggregation der Plättchen oder Makrophagen eintritt,
dieses anzeigt, daß die Lymphocyten in der Probe sich in einem hinsichtlich der spezifischen Krebstestsubstanz
sensibilisierten Zustand befanden, was anzeigt, daß der Wirt, von dem die Lymphocyten erhalten wurden, gegenwärtig
Krebs von histopathologischem Charakter, der verwandt mit
dem in der Reaktion verwendeten stark antigenen tumorspezifischen Material ist, hat oder solchen Krebs in der Vergangenheit
hatte.
11. Vorfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphocytenprobe mit den stark antigenen tumorspezifischen
Substanzen in Gegenwart eines fluoreszierenden DNA-RNA-Reagenzes in Berührung gebracht wird, um die DNA-RNA-Anteile
in den Lymphocyten zu bestimmen und den Wert mit Lymphocytenkontrollproben zu vergleichen, wodurch, falls die
getestete Probe einen von Normallymphocytenproben oder solchen
welche gegen einen anderen nicht verwandten Krebs sensibilisiert wurden, verschiedenen Anteil aufweist, dieses zeigt,
daß die Lymphocyten für einen spezifischen Typ von Krebs sensibilisiert waren, was anzeigt, daß der Wirt, von dem
sie extrahiert wurden, gegenwärtig einen spezifischen Typ von Krebs hat oder in der Vergangenheit hatte, der verwandt
ist mit dem Krebs, von dem das im Test verwendete spezifische Antigen stammt.
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