PT800585E - Proteinas ricas em hidroxiprolina e formulacoes farmaceuticas e cosmeticas que as contem - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PROTEÍNAS RICAS EM HIDROXIPROLINA E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E COSMÉTICAS QUE AS CONTÊM" A presente invenção refere-se a glicoproteínas ricas em hidroxiprolina que podem ser obtidas a partir de fontes vegetais e a utilizações farmacêuticas e cosméticas das mesmas.

Mais precisamente, a invenção refere-se a glicoproteínas ricas em hidroxiprolina que podem ser obtidas por extracção com ácido-álcool a partir de culturas de células de Ginqko biloba e Lycopersicum esculentum, com as seguintes características: - peso molecular médio de 20.000 Daltons com um intervalo de variabilidade de 12.000 a 38.000, determinado por permeação em gel e electroforese; - solubilidade em soluções aquosas ácidas.

Algumas glicoproteínas de origem animal, como o colagénio e os proteoglicanos, são conhecidos por exercer uma acção benéfica na pele quando aplicados topicamente, tal e qual, ou incorporados em formulações adequadas. O colagénio, que é uma glicoproteína rica em prolina e hidroxiprolina, é especialmente utilizado tal e qual, ou combinado com outras bases polipeptídicas, no tratamento de rugas e outros defeitos inestéticos ligados a uma fraca hidratação e elasticidade da pele. A origem animal do 1 \ \ colagénio, no entanto, limita a sua utilização, devido aos riscos de contaminação a partir de virus e toxinas. Embora os compostos de origem vegetal não envolvam estes riscos, até agora, a sua utilização na cosmética tem sido bastante limitada: por exemplo, conhecem-se formulações cosméticas que contêm extractos brutos de plantas como o Aloe ou mesmo vegetais inteiros moídos, como o abacate.

Conhecem-se glicoproteínas vegetais, designadas por extensinas, que são produzidas a partir de células vegetais na fase de proliferação e têm uma estrutura semelhante ao colagénio animal. A EP-A-0 533 4078 descreve a utilização cosmética de extensinas com um peso molecular médio acima dos 100.000 Daltons. No Plant Physiology 84, 1987:820-825 descreve-se a extensina-2, uma glicoproteína rica em hidroxiprolina de cenoura, extraível com sal e é sugerido que esta tem um peso molecular aparente de 40.400 Daltons. No entanto, os métodos para a extracção de extensinas, descritos até agora, que envolvem a extracção de materiais vegetais de várias origens por meio de soluções salinas aquosas, seguido de purificação com ácidos fortes como o ácido tricloroacético, não permitem obter produtos adequados para cosméticos, devido a problemas de solubilidade, estabilidade, reprodutibilidade e consistência das suas características químico-fisicas.

Verificou-se agora que é possível obter glicoproteínas ricas em hidroxiprolina, estruturalmente semelhantes às extensinas acima descritas, mas com um peso molecular inferior e uma maior solubilidade em soluções aquosas ácidas, por meio de um processo que compreende a cultura in vitro de células de plantas seleccionadas e a extracção com soluções alcoólicas ácidas, das células crescidas num meio adequado.

As glicoproteínas que se podem obter de acordo com a invenção têm propriedades de hidratação, formação de filme, tonificação e cicatrizantes superiores às do colagénio. As glicoproteínas da presente invenção podem, assim, ser 2 r— L·. ..... ^ \i ' utilizadas em formulações cosméticas ou dermatológicas, para o tratamento de pele seca, psoriase, ictiose, caspa, queratose, rugas, acne, eczema, dermatose inflamatória, envelhecimento da pele e todas as outras aplicações para as quais foi proposta a utilização do colagénio animal.

As soluções aquosas das glicoproteinas da invenção permanecem estáveis, sem que qualquer polimerização das glicoproteinas conduza à formação de produtos insolúveis. Além disso, a viscosidade destas soluções é particularmente elevada e não depende das concentrações; concentrações de 0,1% têm surpreendentemente o mesmo poder de formação de filme e de hidratação igual a colagénio a 1%, ou a soluções de albumina vegetal a 5%. O material vegetal a ser extraído é obtido de culturas em fermentador de células de Gingko biloba e Lycopersicum esculentum. As técnicas de cultura de células são convencionais e incluem a cultura em suspensão a partir de culturas de calo de várias partes das plantas, como as folhas, casca, raízes, tronco ou sementes, como descrito por Dobbs e Roberts, Experiments in Plant Tissue Culture, 2nd ed.

Cambridge University Press, Nova Iorque, 1985. 0 tecido vegetal de calo, após esterilização e adição opcional de agentes antibacterianos, é tipicamente utilizado para o inoculo de meio de cultura líquido adequado, como descrito no Manual de Dobbs e Roberts, acima descrito. Um meio particularmente adequado para esta invenção é o meio de Murashige e Skoog. A adição de aditivos específicos como a prolina, agentes reductores, etileno ou compostos capazes de libertar elileno, como o "Ethephon", ou o ácido L- aminociclopropanocarboxílico, pode ser adequada para aumentar a produtividade, em termos das glicoproteinas desejadas.

Prefere-se a utilização de ácido naftilacético como auxina, 6- (γ,γ-dimetilamino)purina como citoquinina, vitaminas 3 e 3% de sacarose como fonte de carbono. A adição de vitamina C pode ser adequada, dependendo do material escolhido, para evitar que o produto final tome a cor castanha. 0 tempo de fermentação pode variar de 3 a 12 dias e é de preferência entre 5 e 6 dias. No final da fermentação, o meio de cultura é centrifugado e a massa celular é extraída por meio de álcoois, de preferência etanol, na presença de ácidos minerais diluídos, de preferência ácido clorídrico ou sulfúrico. Este processo inactiva algumas enzimas que poderão prejudicar a estabilidade das glicoproteínas da invenção, especificamente a polifenoloxidase e a tirosina oxidase, que favorecem a polimerização das glicoproteínas, com a formação consequente de produtos insolúveis. A extracção com álcool na presença de ácidos minerais, permite a extracção completa das glicoproteínas básicas e provou ser extremamente selectiva para este fim. Podem-se utilizar outros álcoois miscíveis com água, como o metanol ou isopropanol, além do etanol. Os extractos hidroalcoólicos resultantes são neutralizados e em seguida concentrados e aquecidos a umã temperarura^de 70 °C a—HH)—δθ>—de prcfcrcncia-próximo de 80 °C para completar a precipitação das proteínas desnaturadas. A suspensão é então clarificada por concentração e o fluido é submetido a ultrafiltração fraccional para remover substâncias de peso molecular elevado e baixo. A ultrafiltração é realizada por meio de membranas polisulfónicas com uma exclusão de 10.000 Daltons a 40.000 Daltons, como a CentriconR ou RomiconR, cujas fibras podem ser ocas ou, alternativamente, enroladas. O produto filtrado resultante é electrodialisado para remover substâncias indesejáveis, como sais e açúcares de baixo peso molecular. Após a filtração e diálise, a solução resultante pode ser utilizada tal e qual em preparações cosméticas e farmacêuticas, ou pode ser concentrada num volume menor e liofilizada ou atomizada em seguida. 4 f \ L·, ^ t A caracterização analítica dos produtos da invenção foi realizada por permeaçao em yel, utilizando um cromatógrafo líquido de alta pressão, que consiste de uma unidade de bomba Waters e possui uma bateria de coluna Ultrahidrogel Linear WatersR de 30 cm x 0,5 cm e um detector de absorção de UV Waters, modelo 484. Utilizou-se como eluente uma solução aquosa contendo fosfato de monopotássio 0,067 M, NaCl 0,1 M e NaN3 6 x 10-4 M. As amostras de glicoproteínas a ser analisadas são dissolvidas na mesma solução eluente (3 mg/10 ml) e em quantidades escalonadas da substância, bem como de substâncias de referência, seleccionadas como pesos moleculares entre o citocromo C (12.400 Daltons) e o azul de dextrano (2.000.000 Daltons); alternativa ou simultaneamente, os produtos, ou os seus intermediários, podem ser determinados por electroforese em gel de poliacrilamida a 12,5% e gel de empacotamento a 4%. As amostras a ser analisadas são dissolvidas num tampão que contém SDS e mercaptoetanol a 0,1%, depositando ao mesmo tempo quantidades entre 100 mg e 300 mg. A migração é realizada a uma corrente constante a 20 mA, durante 4 horas. Desenha-se uma curva de calibração com 5 pesos padrão (7 kD, 14 kD, 24 kD, 54 kD e 66kD) . Calculam-se pesos de 22,5 kD e 25 kD a partir desta curva de calibração para as duas bandas principais e pesos de 31 kD e 34 kD para as bandas menos intensas. Os processos aqui descritos permitem misturas de produtos com pesos moleculares comparáveis e composições de aminoácidos comparáveis, a ser obtidas a partir de vários explantes celulares, partindo de diferentes plantas. Os resultados das análises de aminoácidos de glicoproteínas extraídas de células de Ginkgo biloba, são apresentados a seguir, como um exemplo. 5 u,

Aminoácido Area do Asp 4,399 Glu 4,328 Hyp 17,505 Ser 7,065 Gly 6, 056 Hys 1,782 Arg 2,471 Thr 4,739 Pro 10,036 Ala CM OO Tyr 2,388 Vai 6,162 Met 1,154 Ile 2,479 Leu 5, 525 Phe 1,862 Lys 14,254

Os dados acima referem-se à percentagem da quantidade total de aminoácidos presente na mistura de glicoproteinas. Os açúcares na mistura são a arabinose e a galactose. A razão entre aminoácidos e açúcares é em média de 2:1, para os vários produtos.

Como acima mencionado, os produtos de acordo com a invenção podem ser utilizados, tanto no campo farmacêutico, como cosmético. Para o campo farmacêutico, o produto pode ser incorporado em geles ou unguentos ou aplicado em gazes medicadas, para o tratamento específico de queimaduras ou feridas. Neste caso, o produto é normalmente submetido a esterilização, ou a filtrações estéreis e liofilizado.

As preparações cosméticas e dermatológicas da invenção podem ser preparadas de acordo com métodos tradicionais. Exemplos de formas de administração incluem pulverizações 6 1 . I___

aquosas, loções, soluções, emulsões, geles, unguentos e cremes.

As preparações cosméticas e dermatológicas da invenção podem conter glicoproteínas ricas em hidroxiprolina, numa percentagem em peso de cerca de 0,01% a cerca de 50%, de preferência de 0,05% a 5%, bem como excipientes convencionais. Devido à elevada estabilidade das glicoproteínas da presente invenção, podem-se obter preparações farmacêuticas e cosméticas contendo acima de 50% de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina, solúveis.

As glicoproteínas da invenção podem ser adicionadas a preparações farmacêuticas e cosméticas tal e qual ou microencapsuladas, de forma a proporcionar uma acção de hidratação de longo prazo. As microcápsulas podem ser ou hidrofílicas ou lipofílicas. As preparações da invenção podem incluir outros princípios activos com actividade complementar, ou útil para os objectivos desejados. A invenção será a seguir melhor ilustrada pelos exemplos que se seguem:

Exemplo 1

Preparação de calo e cultura líquida de Ginqko biloba para a produção de glicoproteínas

Prepara-se um explante de folhas jovens de Gingko biloba por lavagem das folhas numa solução de Tween 80 (R) a 0,1%. As lâminas são seccionadas em fracções de cerca de 0,5 cm e pré-esterilizadas durante 1 minuto, com etanol a 75%. A esterilização é então completada com uma solução de hipoclorito de sódio e lavagem tripla do explante em água estéril. Os explantes resultantes são transferidos para uma placa de Petri em meio Murashige & Skoog contendo 3% de 7 ν ί! y u

sacarose, com a adição de vitaminas de Lynsmeyer & Skoog e hormonas, como o ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido naftilacético. Os produtos são incubados no escuro a 23 °C, durante 20 dias. No final deste periodo, obtêm-se calos friáveis que crescem facilmente e são movidos em filas contínuas, por meio de subculturas nas mesmas condições, dado que podem ser utilizados para a propagação num meio líquido. Estes calos são utilizados para inocular frascos Erlenmeyer contendo 200 ml de meio Murashige & Skoog, com a adição de ácido naftilacético e 6 (γ,γ-dimetilamino)-purina, - vitaminas de Lynsmeyer & Skoog e 3% de sacarose como uma fonte de carbono. Os frascos são incubados com agitação em luz continua durante 4 dias, após o que a biomassa celular é recolhida para a extracção de glicoproteínas.

Exemplo 2

Preparação de glicoproteínas a partir de células de Ginqko biloba

Centrifugam-se a baixa velocidade, 5 litros da cultura obtida de acordo com o Exemplo 1 e em seguida as células recolhidas (1,5 kg de peso fresco) são extraídas com 1,5 1 de etanol a 70%, contendo ácido sulfúrico a 1%. A extracção é repetida duas vezes, recuperando assim quantitativamente as glicoproteínas básicas. Após a neutralização, os extractos são filtrados para remover qualquer turbidez e concentrados sob vácuo, a 50 °C, até se remover completamente o etanol. O concentrado aquoso é aquecido a 85 °C durante 30 minutos e centrifugado mais uma vez para remover o precipitado, o qual é desprezado. A solução límpida resultante é ultrafiltrada por meio de uma membrana CentriconR, com um limite de exclusão de 40.000 Daltons, para excluir os pesos moleculares maiores. 0 produto filtrado é então ultrafiltrado, utilizando uma membrana de fibra oca com uma exclusão de 10.000 Daltons, para 8 Γ remover substâncias de baixo peso molecular, não glicoproteicas. O filtrado é então submetido a diálise e concentrado até 1% de resíduo sólido. Obtêm-se 1,5 litros de um produto ligeiramente viscoso, que pode ser utilizado tal e qual em formulações cosméticas. Na análise electroforética, o produto continha 6 bandas, 4 das quais tinham pesos moleculares de 16.000, 22.000, 33.000 e 36.000 Daltons.

Exemplo 3

Preparação de glicoproteínas a partir de Lycopersicum esculentum

Seguindo o processo do Exemplo 1, prepara-se uma massa celular a partir de botões estéreis de Lycopersicum esculentum num fermentador de 14 litros contendo 10 litros de meio Murashige & Skoog, adicionado com ácido naftilacético e 6 (γ,γ-dimetilamino)purina, vitaminas de Lynsmeyer & Skoog e 3% de sacarose como fonte de carbono. Ά fermentação é realizada durante 5 dias a 23 °C, com agitação a 150 rpm, na presença de extracto de levedura a uma concentração de 0,05% e com uma concentração de aproximadamente 70% de oxigénio dissolvido. No final da fermentação, o caldo é reunido e micro-filtrado através de uma membrana de cerâmica de 0,2 μπι, para concentrar as células. Adiciona-se algum isopropanol contendo ácido clorídrico a 0,5% à pasta celular assim obtida e aplica-se aos extractos o método descrito na Exemplo 2. Obtêm-se 3,5 litros de uma solução com resíduo seco a 0,5%. A análise das soluções liofilizadas originou um conteúdo de 10% de prolina e 31% de hidroxiprolina, respectivamente. 9

Exemplo 4

Formulação cosmética 100 g de emulsão 0/W contêm: SOLUÇÃO DO EXEMPLO 2 OU 3 10,0 g Álcool lanolinico acetilado PEG-10 2,0 g Álcool cetil-estearilico 1, 5 g Palmitato de cetilo 2,0 g Ácido esteárico 7,0 g Octanoato de octilo 7,5 g Fosfato de cetil potássio 0,5 g Conservantes q.b Fragrância q.b Água purificada q.b. para Exemplo 5 Formulação cosmética 100 g da emulsão O/W contêm: SOLUÇÃO DO EXEMPLO 2 OU 3 10,0 g Glucósido de cetil estearilo 5,0 g Óleo de Jojoba 10,0 g Miristato de isopropilo 8,0 g Dimeticona 0, 5 g Antioxidante q.b. Conservantes q.b. Fragrância q.b. Água purificada q.b. para

Lisboa, 19 de Abril de 2001

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Glicoproteínas ricas em hidroxiprolina, que se podem obter por extracção ácido-álcool a partir de células de Gingko biloba e Lycopersicum esculentum, de acordo com um processo que compreende: a) cultura de células de Gingko biloba e Lycopersicum esculentum num meio liquido, durante um período de 3 a 12 dias; b) extracção da massa celular com álcoois miscíveis com água, na presença de ácidos minerais diluídos; c) neutralização, concentração e aquecimento dos extractos a temperaturas entre 70 °C e 100 °C; d) centrifugação com desprezo do precipitado, ultrafiltração fraccional e diálise do sobrenadante, em que a HPRGs tem as seguintes características: um peso molecular médio de 20.000 Daltons com um intervalo de variabilidade de 12.000 a 38.000, determinado por meio de permeação em gel e electroforese; - solubilidade elevada em água.
2. 2. Preparações cosméticas e farmacêuticas contendo as glicoproteínas da reivindicação 1 como princípio activo, com propriedades hidratantes, de formação de filme, tonificantes e cicatrizantes. 1
3. 3. Preparações de acordo com a reivindicação 2 na forma de pulverizações aquosas, loções, soluções, emulsões, geles, unguentos, cremes e gazes medicadas. Lisboa, 19 de Abril de 2001 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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