CH692408A5

CH692408A5 - Wasserlösliche Organextrakte mit verbessertem biochemischem Wirkungsgrad, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Info

Publication number: CH692408A5
Application number: CH01644/96A
Authority: CH
Inventors: Prof Dr Dr Rando Riemschneider
Original assignee: Randolph Riemschneider Prof Dr
Priority date: 1996-06-19
Filing date: 1996-06-19
Publication date: 2002-06-14
Also published as: DE19624476C2; WO1997048404A1; DE19624476A1; DE29610769U1

Description


  



  Die Erfindung betrifft wässrige Organextrakte mit verbessertem biochemischem Wirkungsgrad, die aus Zelllinien der entsprechenden Organe von Tieren bzw. Teilen von Pflanzen (nachstehend allgemein als "Organe" bezeichnet) gewonnen worden sind, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung einzeln oder in Form von Extraktkombinationen in pharmazeutischen, kosmetischen und sonstigen Zusammensetzungen. 



  Organextrakte besitzen als Grundstoffe für Pharmaka und Kosmetika eine grosse Bedeutung. Fraktionierte Milz-, Blut-, Plazenta- und Thymusextrakte zum Beispiel werden als Wirkstoffe in Pharmaka und Kosmetika eingesetzt ("Seifen - \le - Fette - Wachse" 112, 215-218 (1986)), wobei sie in vielen Fällen durch niedermolekulare Zusätze ergänzt werden. 



  Organextrakte zeichnen sich durch eine Vielzahl von lnhalts- bzw. Wirkstoffen aus, die entweder als vollständiger Extrakt oder in Form daraus solierter Einzelsubstanzen Verwendung finden. Für Plazenta-Extrakte wurden beispielsweise über 100 Komponenten nachgewiesen (vgl. "Kosmetik International" 6, 1-8 (1978)). Für einen Teil bestimmter Einzelsubstanzen der Organextrakte ist die Synthese bisher nicht gelungen, zumal der dazu nötige Aufwand oft zu gross ist. 



  Zahlreiche Organextrakte stehen heute in mehr oder minder naturbelassener Form zur Verfügung, beispielsweise Plazenta-Extrakte, Blut-Extrakte, Thymus-Extrakte, Kollagen-Extrakte, Bindegewebs-Extrakte, Amnion-Extrakte und dgl., die aus frischem Organmaterial hergestellt werden. Dabei wird das frische Organmaterial, beispielsweise frische Plazenten, Leber, Nieren, Milz, Thymus, Blut und dgl., gewaschen, zerkleinert (zuletzt in Kolloidmühlen), und extrahiert durch Behandlung des dabei erhaltenen Organbreis bei -10 bis -20 DEG C in organischen Lösungsmitteln für 6 bis 12 Tage. Im Falle von Blut wird beispielsweise bei -15 DEG C mit der 3fachen Menge Wasser (Nipagin-haltig) längere Zeit hämolysiert. Im Falle der Gewinnung eines Rogen-Extrakts (Kaviar- Extrakts) müssen zunächst bei geeignetem pH-Wert die Geruchsstoffe durch Wasserdampfdestillation entfernt werden.

   Für Bindegewebsextrakte sowie für pflanzliche Extrakte sind wieder andere vorbereitende Massnahmen erforderlich (vgl. auch die weiter unten folgenden Beispiele 8, 9 und 10). 



  Nach der Gewinnung des wässrigen Rohextrakts durch Zentrifugieren bzw. Filtration oder andere geeignete Massnahmen wird dieser weiterverarbeitet zu reinen proteinhaltigen oder proteinfreien Organextrakten, die vor dem Einfrieren bis zur weiteren Verwendung sterilfiltriert werden, beispielsweise unter Verwendung eines 0,2  mu m Millipore< TM >-Filters. Solche Präparate enthalten meist noch Proteine oder hochmolekulare Protein-Abbauprodukte, die pathogene und immunogene Eigenschaften aufweisen können und bei regelmässiger oder wiederholter Verabreichung - meistens verbunden mit langen Inkubationszeiten - zu schwerwiegenden Erkrankungen führen können. Bekannt sind insbesondere die durch unkonventionelle Viren, d.h. Prionen, verursachten Krankheitsbilder, wie TSE (transmissible spongioforme Encephalopathien), insbesondere BSE (Rinderwahnsinn), und das Jacob-Creutzfeld-Syndrom.

   Es sind aber auch proteinhaltige Plazenta-Extrakte bekannt, die bei ihrer Anwendung auf den Menschen krebserregend sein können [Lit. 1]. 



  Vor allem durch die mit Prionen, insbesondere mit BSE-Prionen, zusammenhängenden Probleme sind tierische Organextrakte weltweit in Verruf geraten. Der Nachweis, dass Organmaterial von Herden stammt, die BSE-frei waren, ist im Falle der Verwendung grosser Organmengen bestimmten Alters kaum durchzuführen. Um BSE-Freiheit eines Endprodukts experimentell im Goldhamster-Modell-Versuch zu beweisen, bedarf es mindestens 9 Monate Zeit - in vielen Fällen undurchführbar. Ein BSE-Schnelltest fehlt bisher. 



  Aus DE-OS 2 405 983 und DE-OS 2 021 969 sind Kombinationen niedermolekularer Komponenten mit aus natürlichem, frischem Organmaterial gewonnenen Organextrakten bekannt, die jedoch ebenfalls die vorstehend geschilderten Nachteile haben. 



  Um solche Komplikationen zu vermeiden, wurde in EP-A-0 552 516 ein Weg zur Herstellung wasserlöslicher synthetischer Organextrakte aufgezeigt, bei dem auf synthetischem Wege gewonnene niedermolekulare Komponenten, wie sie auch in natürlichen Organextrakten vorkommen, miteinander kombiniert werden. 



  Während die natürlichen Organextrakte die oben geschilderten Nachteile aufweisen, haben die synthetischen Organextrakte den Nachteil, dass sie grossenteils den vollen biochemischen Wirkungsgrad der natürlichen Organextrakte nicht entwickeln, weil ihnen bestimmte Komponenten fehlen. 



  Aufgabe der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Erfindung ist es, Organextrakte zu schaffen, die das biochemische Wirkungsprofil von natürlichen und synthetischen Organextrakten mindestens erreichen, vorzugsweise jedoch wesentlich verbessern, insbesondere frei von unerwünschten Substanzen, speziell immunogenen und pathogenen Proteinen und Proteinabbauprodukten, wie sie in natürlichen Organextrakten zu finden sind, und deren unerwünschten Wirkungen sind. 



  Zwar lassen sich durch Anwendung von ausschliesslich synthetischen Organextrakten, wie sie in EP-A-0 552 516 beschrieben sind, die weiter oben geschilderten Nachteile vermeiden, deren biochemisches Wirkungsprofil ist jedoch nicht immer zufriedenstellend. Eine Steigerung des biochemischen Wirkungsprofils ist nun erfindungsgemäss möglich durch Herstellung von wasserlöslichen Organextrakten aus Zelllinien der entsprechenden Organe, die gegebenenfalls mit synthetisch hergestellten oder natürlichen Organextrakten kombiniert werden und die frei von allergologischen Effekten sind, wie sie beispielsweise mithilfe des Patch-Tests nachgewiesen werden können. 



  Gemäss einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung wässrige Organextrakte mit verbessertem biochemischem Wirkungsgrad, die aus Zelllinien der entspre chenden Organe von Tieren bzw. Teilen von Pflanzen hergestellt worden sind, sowie beliebige Kombinationen derselben und deren Verwendung als Wirkstoffe in pharmazeutischen, kosmetischen und sonstigen Zusammensetzungen. 



  Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von wässrigen Organextrakten mit verbessertem biochemischem Wirkungsgrad aus Zelllinien der entsprechenden Organe von Tieren bzw. Teilen von Pflanzen, das durch die folgenden Stufen gekennzeichnet ist:
 a) Aktivierung der gewählten tierischen bzw.

   pflanzlichen Zellen in einem Wasserbad von vorzugsweise 25 bis 30 DEG C,
 b) Zugabe eines vorgewärmten, für die jeweils gewählten Zellen vorgeschriebenen Kulturmediums unter Vermischung und anschliessendes Inkubieren in an sich bekannter Weise, vorzugsweise bei etwa 37 DEG C und vorzugsweise in einer etwa 5% CO2 enthaltenden Atmosphäre,
 c) Gewinnung der dabei gebildeten Zellen als Ausgangsmaterial für Grosskulturen auf Oberflächen oder in Suspension durch Dekantieren des Nährmediums, Waschen des entstandenen Zellrasens mit einem geeigneten Puffer und Aufnahme der Zellen in einem kompletten Medium unter Einstellung einer für die Massenproduktion geeigneten Verdünnung,
 d) Kultivierung der Zellen auf Oberflächen, vorzugsweise in Perfusionssystemen, auf festen Medien und/oder unter Anwendung der Plastikfilm-Kultur-Methode (für tierische Zellen) bzw.

   in Suspensionskultur (für pflanzliche Zellen) im Grossmassstab auf an sich bekannte Weise durch Beimpfen der Kultivierungsapparatur mit einer Zellsuspension in einem sterilen CO2/Luft-Gemisch,
 e) Herstellung eines Extrakts durch Behandlung des suspendierten geernteten Zellmaterials in einem organischen Lösungsmittel und/oder Wasser, Gewinnung der wässrigen Phase vorzugsweise durch Zentrifugieren, Entfernung von restlichen Lipidanteilen aus der wässrigen Phase durch mehrmaliges Behandeln mit dem organischen Lösungsmittel un ter Bildung eines wässrigen Rohextrakts, gegebenenfalls in Form einer Suspension,
 f) Reinigung bzw.

   Behandlung des Rohextrakts je nach Ausgangsmaterial und anschliessendes Dialysieren, vorzugsweise unter Verwendung einer Membran Visking C 150, gegen eine Nipagin oder ein anderes Konservierungsmittel enthaltende wässrige Lösung zur Gewinnung eines von hochmolekularen Verbindungen freien Extrakts als Dialysat und
 g) Sterilfiltration des Extrakts, vorzugsweise unter Verwendung eines 0,2 bzw. 0,1  mu m (Millipore< TM >)-Filters oder einer PALL-Kerze nach Einstellung des Extrakts auf den gewünschten pH-Wert, vorzugsweise 5,0 bis 7,2. 



  Die erfindungsgemässen wasserlöslichen Organextrakte lassen sich sowohl mit synthetischen Organextrakten, wie sie in EP-A-0 552 516 beschrieben sind, als auch mit natürlichen Organextrakten oder beiden kombinieren. Auch im Falle dieser Kombinationen werden verbesserte biochemische Wirkungsprofile erzielt, die besser sind als diejenigen der synthetischen Organextrakte allein und frei sind von den unerwünschten Nebenwirkungen der natürlichen Organextrakte. Erfindungsgemäss ist es insbesondere möglich, auf technisch einfache und besonders elegante Weise garantiert virusfreie und prionenfreie Kombinationen von synthetischen Organextrakten und Zelllinienextrakten herzustellen, was besonders bedeutsam ist im Zusammenhang mit den heute sehr akuten TSE-Problemen, speziell BSE. 



  Bevorzugte Ausführungsformen des vorstehend beschriebenen erfindungsgemässen Verfahrens sind dadurch charakterisiert, dass
 eine in der Stufe (d) gewonnene tierische Zellmasse in Ethylether oder Chloroform suspendiert und etwa 8 bis etwa 15 Tage lang bei etwa -10 bis etwa -20 DEG C im Kälteraum stehen gelassen und dann zur Gewinnung der wässrigen Phase zentrifugiert wird; 
 die letzten Spuren von Ether oder Chloroform aus dem Dialysat (Aussenlösung) in der Stufe (f) durch Stickstoff-Durchblasen bei pH 7,2 bis 7,5 entfernt werden; und/oder
 in der Stufe (a) Zellkulturen aus handelsüblichen Zelllinien einschliesslich der in der Beschreibung genannten nichthandelsüblichen speziellen Zelllinien einzeln oder im Gemisch eingesetzt werden. 



  Zur Herstellung der erfindungsgemässen Organextrakte und zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden vorzugsweise
 als tierische Zelllinien mindestens eine der Zelllinien MDBK (Rindernierenzellen DSM ACC 174 aus der Niere eines normal ausgewachsenen Rindes), P1-1A3 (Thymus-Epithel-Zellen DSM ACC 280 aus dem Thymusepithel eines 6 Monate alten Kindes), EBL (Rinderlungenzellen DSM ACC 192 aus der Lunge eines 7 Monate alten Rinderfötus, gefrorene 110.

   Passage), AM-C6SC8 (Schweinenieren-Zellen DSM ACC 152 aus einem Subklon von der Zelllinie Am II, die von einer normalen Schweineniere gewonnen wurde), BeWo (weibliche Human-Plazenta-Zellen ATCC CCL 98), AV 3 (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 21), WISH (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 25), B 95.8 (Blut-Zellen, Monkey, ATCC CRL 1612 ECACC 8501 1419, PK (15) (Schweinenieren-Zellen) ATCC CCL 33) und FL (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 62 IZSBS BSCL 46); 3A-subE (Human-Plazenten-Zellen) ATCC CRL-1584; BVDV + EJG (Rinder-Kapillarzellen) ATCC CRL-8659; P-17 (Kalbsthymus-Epithelzellen) Brastone von Dr. F. R. Pesserl, Curitiba, Paranà, Brasilien; FB 5.Bm (Rinder-Knochenmark) ATCC CRL-6043; R.Sp. (Rind) ATCC CRL-6019; RPL 10 (Rinder-Plazenten-Zellen von Prof. Dr.

   Mariano da Rocha Filho, UFSM, Faculdade de Medicina, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasilien, SPI.K (Delphin) ATCC CRL-6556; CF 37 Mg (Beagle-Hund, Mammary gland) ATCC CRL 6230, SRC (Rogenzellen vom Stör, Acipenser huso von Dr. F. R. Pesserl, 80 000 Curitiba, Paranà, Brasilien), Kalbsthymus-Zelllinie WANK und N. M. FARIA, 10 000 S. Paolo, SP, Brasil, von Prof. Dr. Dr. R. Riemschneider, Instituto Central de Quimica da UFSM, S. Maria RS, Brasilien); XTH-2 (Zellen vom südafrikanischen Krallenfrosch Xenopus leavis DAUDIN, South African clawed toad) DSM ACC 190
 und/oder
 als pflanzliche Zelllinien mindestens einer der Zelllinien Acer pseudoplatanus L.

   (Sycamore), Phaseolus vulgaris (aus Hypocotyl of Pole Bean), Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum (tetraploider Stamm), Ginkgo biloba, Pisum sativum (root), Centaurus cyanus, Daucus carota, Apium graveolens, Daucus catora, Apium graveolens, Arthrospira und/oder Saccharomaces cerevisiae oder andere Actinomyceten verwendet. 



  Die aus tierischen Zelllinien gewonnenen, sterilfiltrierten erfindungsgemässen Organextrakte werden einzeln oder im Gemisch vorzugsweise mit mindestens einem synthetisch hergestellten Extrakt oder mit mindestens einem aus frischen Organen hergestellten Extrakt oder mit beiden kombiniert, wobei das Gewichts-Mengenverhältnis zwischen dem aus tierischen Zelllinien gewonnenen, steril filtrierten Organextrakt und dem synthetisch hergestellten Organextrakt und/oder dem aus frischen Organen hergestellten Extrakt vorzugsweise (1 bis 99):(99 bis 1), insbesondere (1 bis 50):(50 bis 1), speziell (1 bis 20):(99 bis 80), beträgt. Die gleichen Gewichts-Mengenverhältnisse werden vorzugsweise auch angewendet bei Kombination eines oder mehrerer der vorstehend beschriebenen tierischen Zellextrakte mit einem oder mehreren der aus einer pflanzlichen Zelllinie gewonnenen Extrakte. 



  Bei Verwendung von pflanzlichen Zelllinien wird in der Stufe (e) das in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel suspendierte Zellmaterial, wenn es auf das Zellwandmaterial ankommt, vorzugsweise in einem Ultraschallgenerator zerbrochen und das aufgeschlossene Material wird nach dem Zentrifugieren und Waschen mit Wasser durch chemische und/oder enzymatische Partialhydrolysen aufgeschlossen und dialysiert. 



  Weitere bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemässen Verfahrens ergeben sich aus den Ansprüchen 10 bis 20. 



  Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen wässrigen Organextrakte einzeln oder in Form von Gemischen oder Kombinationen derselben als Ersatz oder Ergänzung für Plazenta-, Thymus-, Blut-, Serum-, Milz-, Leber-, Kollagen-, Bindegewebs-, Amnionflüssigkeits-, Quallen-, Rogen- und Euterextrakte bzw. Kombinationen davon sowie zur Herstellung von kosmetischen Formulierungen und zur Herstellung medizinischer Präparate für die Stärkung des Immunsystems, für die Aktivierung des Zellstoffwechsels oder für die Behandlung gastroenterologischer Erkrankungen, insbesondere Ulcera, und für die topische, subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Applikation zum Zwecke der äusseren oder inneren Wundheilung, zur Behandlung von Arteriosklerose oder von Strahlungsschäden.

   Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemässen wässrigen Organextrakte und Extrakt-Kombinationen eignen sich auch zur Herstellung von Präparaten mit aphrodisiakatischer Wirkung. Dies gilt insbesondere für die aus pflanzlichen Zelllinien von vorzugsweise Ginkgo biloba, Sycamore, Saccharomyces, Torula oder Cyanophyten gewonnenen Extrakte und ihre Kombinationen mit auf tierischen Zelllinien basierenden Extrakten, die als Wirkstoffe in Präparaten mit aphrodisiakatischer Wirkung verwendet werden können. 



  Ausserdem betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemässen Extrakte und Extraktgemische einschliesslich der Rohextrakte, Rohextraktgemische und ihrer Vorstufen zur Stabilisierung und Haltbarmachung von gefärbten Geweben, Farbanstrichen und Lackierungen, insbesondere solchen mit Lacken auf Wasserbasis, sowie zur Herstellung von Kulturlösungen, Nährlösungen und diätetischen Lösungen. 



  Die Erfindung, insbesondere die einzelnen Stufen des erfindungsgemässen Verfahrens, werden nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. 



  Ad 1) Auftauen von tiefgefrorenen Zellkulturen aus kompetenten Quellen, aus eigener Zucht oder Zelllinien, wie sie im Handel sind (vgl. z.B. [Lit. 13, 14, 15]), z.B. von tierischen Zelllinien, wie
 MDBK (Rindernierenzellen DSM ACC 174 aus einer Niere eines normal ausgewachsenen Rindes in einem Medium aus 95% Dulbecco's MEM + 5% FCS (fötales Kälberserum) wie von Martin und Darby in "Proc. Soc. Expr. Biol. Med." 98, 574 (1958) beschrieben, hinterlegt bei Dr. R. Riebe, BFA, Insel, Riems (Deutschland),
 P1-1A3 (Thymus-Epithel-Zellen DSM ACC 280 aus dem Thymusepithel eines 6 Monate alten Kindes in einem Medium aus 80% RMPI 1640 + 20% FCS, wie von Fernandez in "Blood", 83, 3245-3254 (1994), beschrieben, hinterlegt bei E. Fernandez, Dr. Toribio, Universität Madrid (Spanien),
 EBL, Rinderlungenzellen DSM ACC 192 aus der Lunge eines 7 Monate alten Rinderfötus, gefrorene 110.

   Passage, in einem Medium aus 85% RPMI 1640 oder MEM + 15% FCS, wie von Bechman und Schöss in "Deutsche Tieräztl. Wochenschrift." 95, 283 (1988) und ibid., 98, 310 (1992), sowie von Rutter und Luther in "Vet. Rec." 114, 393 (1984) beschrieben, hinterlegt bei Dr. V. \ppling, Paul Ehrlich-Institut Langen (Deutschland),
 AM-C6SC8, Schweinenieren-Zellen DSM ACC 152 aus einem Subklon von der Zelllinie Am II, die von einer normalen Schweineniere gewonnen wurde, in einem Medium aus 80% Medium 199 (Hanks-Salze) + 20% FCS), wie von Limezewski in "Mycotoxin Res." 3, 69-76 (1967), beschrieben, hinterlegt bei Dr.

   Limezewski, Bundesanstalt für Milchforschung (Kiel),
 BeWo, weibliche Human-Plazenta-Zellen ATCC CCL 98 in einem Medium aus Waymouth's + Gey's BBS + 10% Newborn Calf-Serum [Lit. 13],
 AV 3, Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 21 in einem Medium aus M199 mit Earle's BBS + 20% FCS [Lit. 13],
 WISH, Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 25 in einem Medium aus Eagle's MEM mit Eagle's-BSB + 10% FCS*, und PK (15), Schweinenieren-Zellen ATCC CCL 33 in einem Medium aus Eagle's MEM mit Eagle's BSS + 10% FCS + Na-Pyruvat [Lit. 13], 
 B95.8 (Blood-Zellen, Strain Marmaset, Suspensions-Kultur ATCC CRL 1612 ECAGC 85011419. Medium: RPMI 1640 + 10% FCS + L-Glutamin + Na-Pyruvat + nichtessentielle Aminosäuren + 2-Mercaptoethanol, hinterlegt bei G. B.

   Ferrara, Servizia di lmmunogenetica, Istituto Nazionale per la Ricerca, 16132 Genua (Italien),
 FL (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL62 IZSBS BSCL46 in einem Medium Eagle's MEM mit Earle's BSS + 10% FCS, beschrieben in "Proc. Soc. Exp. Biol. Medicine", 94, 532 (1957), hinterlegt bei: M. Ferrari, Istituto Zooprofilattico Sperimentale, 25100 Brescia, Italien);
 RPL 10 (Rinderplazenten-Zellen, bos taurus, in einem Medium aus Waymouth's + Gey's BBS + 8% Newborn Calf-Serum, Herkunft: Professor Dr. Mariano da Rocha Filho, Reitor da UFSM, Faculdade de Medicina, Santa Maria Rio Grande do Sul, Brasilien, und Dr. G. da Roche Filho da UFSM, Bioquìmica, lstituto Central de Química, Santa Maria, RS, Brasilien;
 SRC, Rogenzellen vom Stör, Acipenser huso, Wolga, in einem Medium aus 85% Dulbecco's MEM + 10% Gay's BBS + 5% FCS, hinterlegt bei Brastone, Dr. F. R.

   Pesserl, 82500 Curitiba, Paranà, Brasilien;
 P-17, Thymus-Epithelzellen aus Thymusepithel eines 4 Monate alten Kalbs in einem Medium aus 80% RMPI 1640 + 20% FCS, hinterlegt bei Dr. F. R. Pesserl, Brastone, 82500 Curitiba, Paranà, Brasilien;
 CHSE-214 Fish: Chinook Salmon Embryo NBL-4 (EB Tr) Bovine embryonic trachea [Lit. 15];
 3A-sub E (Human Plazenta-Zellen) ATCC-CRL-1584 in einem Medium aus Waymouth's + Gay's BBS + 15% Newborn Calf-Serum, Katalog: "ATCC Cell lines and Hybridomas", Rockville, MD 20852, USA, 1996;
 BVDV + EJG (Rind, bos taurus, Kapillarepithel ATCC CRL-8659 im Medium Eagle's MEM + 20% FCS;
 Katalog: "ATCC Cell lines and Hybridomas", USA 1996 (siehe oben));
 FB 3 Sp/Thy (Rind, bos taurus, normal) ATCC-CRL 6039, Katalog wie oben;
 B Sp.

   (Rind, bos taurus, normal) ATCC-CRL 6019, Katalog wie oben;
 CF 37 Mg (Hund, Canis familiaris, Beagle ATCC CRL 6230, Mammary gland, normal), Katalog wie oben; 
 PTI.Sp. (Schimpanse, Pan troglodytes Milz) ATCC CRL 6315, Katalog wie oben;
 FB5.BM (Rind, bos taurus, Knochenmark, normal) ATCC CRL 6043, Katalog wie oben;
 DBI. Tes (Delphin, Pacific common, Delphinus bairdi, Testes, normal) ATCC CRL 6258, Katalog wie oben;
 Spl.K (Delphin, stenella plagiodon, Niere, normal) ATCC CRL 6262, Katalog wieoben; und
 L01.HT (Seeschildkröte, Lepidochelys olivacea, Herz) ATCC CRL 6556, Katalog wie oben, oder
 von geeigneten pflanzlichen Zelllinien, die z.B. in Suspensionskulturen gezüchtet werden können, wie
 Acer pseudoplatanus L. (Sycamore) nach D. T. A. Lamport & D. H. Northcote, "Nature (London)" 188, 665-666 (1960) und L. G. Nickell, "Proc. U.S. Nat. Acad.

   Sci." 42, 848 (1956), (vgl. auch das weiter unten folgende Beispiel 8),
 Phaseolus vulgaris (aus Hypocotyl of Pole Bean) im modifizierten White's Medium, gezüchtet nach L. G. Nickell, "Proc. U.S. Nat. Acad. Sci." 42, 848-850 (1956),
 Nicotiana tabacum nach D. K. Dougall & K. Shimbayshi, "Plant Physiology" 33, 396-404 (1960),
 Solanum tuberosum (tetraploider Stamm) nach D. T. A. Lamport, "Adv. Bot.

   Research" 2, 168 (1965): Michigan State University Atomic Energy Commission Plant Research Laboratory,
 Ginkgo biloba, Pisum sativum (root), Centaurus cyanus, Daucus carota, Apium graveolens (wie oben),
 Saccharomyces cerevisiae Hansen von der Hefefabrik Asmussen, Elmshorn bei Hamburg (Backhefen, Brennereihefen, obergärige Bierhefen), handelsübliche Brauerei- und Bäckerhefen oder Hefen wie Torula utilis, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus (Weinhefen), Saccharomyces carlsbergensis (untergärige Bierhefen), Saccharomyces fragilis und Saccharomyces lactis (Milchzucker vergärende Hefen), Candida utilis (früher Torulopsis utilis) und Candida tropicalis (technische Futter- und Nährhefen) und andere, 
 Nostoc commune VAUCHER und andere Cyanophyten wie Arthrospira, Nostoc mucosum etc. Rabenhorst, Algae. Eur. Nr. 28 etc. Wittr. Nordst., Alg. exsicc. Nr. 497 etc.

   Vorkommen: kosmopolitisch, am Rande von Salzsümpfen [Lit. 11];
 Zellen von Baumpollen: Acer negundo (Box Elder);
 Betual alba (White Birch; Olea europeae (Evergreen olive);
 Ulmus pumila (Chinese Elm); Quercus rubra (Nothern Red Oak).
 Pollen (Gras-Pollen): Cynodon dectylon (Bermuda);
 Poa pratensis (Kentucky Blue); Secale cerate (Cultivated Rye).
 Werd Pollen: Artemisia absinthum (Wormwood); Iva xantifolia (Giant Poverty);
 Ambrosia elatior (Short Rogweed).
 Rivularia bullata (poir), Berkeley, Glean, Brit. Alg. S. 1833.
 Vorkommen: kosmopolitisch, in der Ebbe-Flut-Zone; [Lit. 11],
 Calothrix pulvinata Kg., Syth. Alg., S. 71, 1824. Vorkommen auf Felsen, Holz, Algen (Europa, Nordamerika, Australien); [Lit. 11], und
 Romeria elegans Wollszynska, gefunden in Koczw, in einem Teich bei Lwòw. 



  Ad 2) lnkubieren der jeweiligen Zellkulturen nach den Vorschriften des Lieferanten. 



  Ad 3) Gewinnung von Zellen als Ausgangsmaterial für Grosskulturen auf Oberflächen bzw. in Suspension auf an sich bekannte Weise, und zwar tierische Zellen auf Oberflächen, pflanzliche Zellen in Suspension. 



  Kultivierung der Zellen auf Oberflächen z.B. in Perfusionssystemen (nach Weiss und Schleicher [Lit. 2]), auf festen Medien und/oder nach der Plastik-Film-Kultur-Methode (nach House, Scherer und Maroudas [Lit. 3]) im Grossmassstab. 



  Extraktion durch Behandlung des suspendierten geernteten Zellmaterials bei vorzugsweise -10 bis   -20 DEG C in organischen Lösungsmitteln für vorzugsweise 6 bis 12 Tage. 



  Ad 4) Herstellung eines Extrakts durch Gewinnung des wässrigen Rohextrakts vorzugsweise durch Zentrifugieren mit beispielsweise 3000 UpM und
 weitere Verarbeitung zu reinen, proteinhaltigen oder proteinfreien Organextrakten, die vor ihrer Lagerung sterilfiltriert werden. 



  Für den Fall, dass die gewählte Zelllinie in Suspensionskultur wächst, wird mit der "Rotary Shaker Technique", z.B. in der Roller-Flaschen-Apparatur (gemäss beiliegender Fig. 1), begonnen und dann wird in Suspensionskulturflaschen, z.B. gemäss beiliegenden Fig. 2 und 3, weiter gearbeitet. 



  Die Suspensionskulturen in sehr grossem Massstab werden dann in 50 L- bis zu 1500 L-Fermentern, z.B. nach Moore et al. [Lit. 5], durchgeführt. 



  Bewährt haben sich auch Rohrschlangen-Kultivatoren IGV von 50 L bis zu 2000 L zur Biomasse-Produktion pflanzlicher Zellen gemäss beiliegender Fig. 6. 



  Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen: 
 
   Fig. 1 eine Burler- oder Roller-Flaschen-Apparatur, in der die Zellen auf der inneren Oberfläche der Winchester- oder Baxter-Flaschen wachsen, die durch Rollen oder Räder, auf denen sie liegen, langsam gedreht werden [Lit. 4]; 
   Fig. 2 eine Suspensionskulturflasche, die aus einer Saugflasche hergestellt ist. Um zwischendurch Kulturmedium zugeben und Proben entnehmen zu können, sind der Schlauch zur Erneuerung des Kulturmediums und der Probenschlauch mit einer Klemme abgequetscht. Zum "Füttern" wird die Klemme vom Schlauch zur Erneuerung des Kulturmediums entfernt und Kulturmedium wird durch die Gummiverschlusskappe injiziert. Zur Proben-Entnahme wird die Klemme vom Probenschlauch entfernt. Da nach wird der Universalbehälter durch einen sterilen ersetzt.

   Das Gefäss sollte nicht mehr als zu einem Viertel gefüllt sein. Es sei darauf hingewiesen, dass der "Kragen" um den Magnetstab dazu dient, den Kontakt zwischen dem Magneten und dem Boden der Flasche möglichst klein zu halten; 
   Fig. 3 ein Gefäss, das zur Zucht von Zellen in Suspension dient. Der mit Kunststoff überzogene Magnet wird durch einen ausserhalb des Gefässes befindlichen Magnetrührer gedreht; 
   Fig. 4 eine Gewebekultur-Apparatur mit vielfach vergrösserter Oberfläche nach Weiss und Schleicher [Lit. 2] (erhältlich in den Abbot-Laboratorien), in der ebenfalls das Prinzip eines Perfusionssystems mit fester Matrix nach McCoy et al. [Lit. 6] angewendet wird.

   Die übereinander gesetzten Titanplatten werden von einem Stützgestell innerhalb eines Glaskulturgefässes zusammengehalten. 
   Schichten aus Titanplatten werden mit Metallenstangen in einem zylindrischen Kulturgefäss zusammengehalten. Die Zellimpfmenge wird in das Gefäss durch das Zugangsrohr gepumpt. Das Medium wird innerhalb des Gefässes durch eine Luftpumpe umgepumpt (wenn das Gas durch das Gasrohr gelangt ist, steigen die Bläschen im Pumpenrohr empor, wobei sie Medium mit sich reissen). Nach der Beimpfung zirkulieren die Zellen einige Zeit auf diese Weise, dann stoppt man die Pumpen einige Stunden lang, damit die Zellen sich absetzen können. Das Gasumpumpen kann dann erneuert werden. Medium kann durch das Einfüllrohr zugegeben oder entnommen werden. Am Ende des Umlaufs wird alles Medium entnommen und durch Trypsin ersetzt.

   Die Zellsuspension wird dann durch das Einfüllrohr entnommen. 
   Die Apparatur wird beimpft, indem man eine Zellsuspension einpumpt. Der Apparat wird mit einem sterilen Kohlendioxid-Luft-Gemisch mithilfe der Luftpumpe beschickt, um die Zellen gleichmässig zu verteilen. Die kohlensaure Luftzufuhr wird 2 h lang gestoppt, damit sich die Zellen absetzen, dann wird sie fortgesetzt. Sobald eine ausreichende Zelldichte erreicht ist, wird das Kulturmedium herausgepumpt und durch eine Trypsin-Lösung ersetzt. Nach einer lnkubation kann die Zellsuspension aus der Maschine herausgepumpt werden.

   Dieser Apparate-Typ hat den Vorteil, dass er sich selbst zu einem sehr einfachen, geschlossenen Kreislaufsystem eignet. 
   Fig. 5 eine Apparatur nach House, Scherer und Maracoudas [Lit. 3] in der mit einer Spirale aus flexiblem Kunststoff in Form eines Polystyrolfilms gearbeitet wird, um eine grosse Oberfläche zu schaffen. Kulturmedium und Gas werden durch die \ffnungen eingeführt. Die Zellen wachsen auf der Plastikspirale. 
   Eine Spirale aus flexiblem Kunststoff mit einer Steigung von etwa 4 cm wird mit einem passenden Former hergestellt und vertikal in einen zylindrischen Behälter eingesetzt mit einer Luftpumpe, die durch die Mitte der Spirale läuft. Um den Apparatur zu beimpfen, wird Kulturmedium mit der Zell-Suspension zugegeben.

   Dann lässt man die Zellen absitzen und verteilt sie gleichmässig über beide Oberflächen des Films, indem man sie mit einer Geschwindigkeit von 2 Uph horizontal auf einem Roller-Gestell rotieren lässt. Sobald die Zellen vollkommen haften (nach 3 bis 18 h, abhängig von Zelltyp), werden die Flaschen vom Roller genommen und zur Begasung aufrecht hingestellt. Um eine genaue Begasung mit kohlendioxidhaltiger Luft zu gewährleisten, ist es erforderlich, ein Antischaummittel (z.B. Midland-Silicone, Antifoam Emulsion RD) zuzusetzen.

   Wenn das Wachstum abgeschlossen ist, können die Zellen mithilfe von Trypsin geerntet werden, wie bei einer normalen Roller-Flasche oder durch Abkratzen; 
   Fig. 6 einen Rohrschlangen-Kultivator IGV zur Produktion von pflanzlichen Zellen in Suspensions-Kulturen; 
   Fig. 7a eine Vorrichtung zur Messung der Hautfeuchtigkeit (Corneometer CM 820 PC); 
   Fig. 7b den Messfühler des Corneometers CM 820 PC mit einem flachen Kondensator als Stirnfläche, der auf die Haut gedrückt wird zur Messung der Hautfeuchtigkeit; 
   Fig. 8 eine grafische Darstellung des Feuchtigkeitshaltevermögens der Haut (in h) nach einmaliger Applikation einer Hautcreme ohne Zusätze (Kontrolle) bzw. einer Hautcreme mit zugesetztem Amnion-Extrakt IIb oder IIa gemäss dem weiter unten folgenden Beispiel 4;

   
   Fig. 9 eine grafische Darstellung der Veränderung der Oberflächenstruktur menschlicher Haut bei mikroskopischer Betrachtung anhand der prozentualen Änderung der Profillinienareale (FA) und der Profillinienlänge (LL) in Abhängigkeit von der Verwendung von Plazenta-Extrakt enthaltenden Emulsionspräparaten gemäss dem weiter unten folgenden Beispiel 5; 
   Fig. 10 das DC-Fertigplatten-Laufbild des in dem weiter unten folgenden Beispiel 7 beschriebenen Blutextrakts nach zweidimensionaler Entwicklung, aus dem die in dem Blutextrakt enthaltenden unterschiedlichen Aminosäuren ersichtlich sind;

   
   Fig. 11 eine grafische Darstellung der Gärungssteigerung von Hefe durch das Hefeextrakt-Dialysat (gemäss Beispiel 9) und 
   Fig. 12 eine grafische Darstellung der Hydroxyl-Radikal-Hemmungen durch Organextrakte als Radikalfänger (Scavengers on the viscosity of hyaluronic acid) (gemäss Beispiel 10). 
 



  In allen Fällen ist es wichtig, dass sterile Bedingungen streng eingehalten werden, und zwar sowohl hinsichtlich der Apparaturen als auch hinsichtlich der in beträchtlichen Mengen erforderlichen, vorher zu testenden und sterilisierenden Kulturmedien. 



  Hinsichtlich der Zellvermehrung kann auf Grund arithmetischer Überlegungen erwartet werden, dass die beschriebenen Grosskultur-Verfahren innerhalb verhältnismässig kurzer Zeiten ausreichende Zellmaterial-Mengen, ausgehend von einer gefrorenen Zellkultur, liefern werden. Langsam wachsende Zellen vermehren sich in einer Woche auf das 10fache, in 6 Wochen auf das 10<6>fache. Aus einer Zelle können innerhalb von 12 Wochen 10<1><2> Zellen (4 kg), innerhalb von 15 Wochen 10<1><5> Zellen (4000 kg) entstehen. 



  Bei der Entwicklung und beim Einsatz von geeigneten Nährlösungen ist darauf zu achten, dass nur Komponenten zum Einsatz kommen, die in dem angestrebten Organextrakt später keine pharmakologisch-toxikologischen und dermatologisch unerwünschten Effekte verursachen. Dies gilt vor allem im Falle einer medizinischen Anwendung der erfindungsgemäss hergestellten Organextrakte. 



  Die erfindungsgemäss hergestellten wasserlöslichen Organextrakte lassen sich sowohl mit synthetischen Organextrakten wie sie in EP-A-0 552 516 beschrieben sind, als auch mit natürlichen Organextrakten oder beiden kombinieren. Auch im Falle dieser Kombinationen werden verbesserte biochemische Wirkungsprofile erzielt, die besser sind als diejenigen der synthetischen Organextrakte und frei sind von den unerwünschten Nebenwirkungen der natürlichen Organextrakte. Die Erfindung erlaubt insbesondere eine technisch einfache und besonders elegante Herstellung von garantiert virusfreien und prionenfreien Organextrakten, die eine Kombination von synthetischen und Zelllini enextrakten darstellen, was besonders bedeutsam ist im Zusammenhang mit den TSE-Problemen, speziell BSE. 



  Die Gewichts-Mengenverhältnisse, die bei der Kombination von Zellextrakten aus tierischen und/oder pflanzlichen Zelllinien mit entsprechenden synthetischen Zellextrakten anzuwenden sind, können in weiten Bereichen variiert werden, z.B. zwischen (1 bis 50):(98 bis 50), vorzugsweise (1 bis 20):(99 bis 80), insbesondere (1 bis 10):(99 bis 90), liegen. Entsprechendes gilt auch für die Extrakt-Kombination, die aus frischen Organen und zugehörigen Zelllinien hergestellt werden. Auch Kombinationen aller drei Extrakt-Arten sind von Interesse, und zwar in vielen Bereichen von beispielsweise (1 bis 20):(1 bis 10):(Rest synthetischer Extrakt), vorzugsweise (1 bis 10):(1 bis 5):(Rest synthetischer Extrakt), insbesondere (1 bis 5):(1 bis 5):(Rest synthetischer Extrakt), für Zelllinien-Extrakt zu entsprechendem natürlichem Organextrakt zu entsprechendem synthetischem Organextrakt.

   Die angegebenen Mengenverhältnisse sollen die Erfindung besser verständlich machen, die Erfindung ist darauf aber nicht beschränkt. 



  Wie in der mehrfach zitierten EP-A-0 552 516 ausgeführt, lassen sich durch Erhöhung der Anteile an bestimmten Komponenten, z.B. Glycin bis auf 4,5%, durch Erhöhung der Anteile an Sorbit, Mannit bis auf 6% und durch Erhöhung der Anteile an Panthenol bis auf 35%, besondere kosmetische Effekte erzielen, die Naturextrakten fehlen (vgl. Beispiel 2, Tabelle 11, von EP-A-0 552 516). Im weiter unten folgenden Beispiel 8 ist für den Sycamore-Extrakt VI eine entsprechende Massnahme beschrieben. 



  In der nachstehenden Tabelle I sind einige der zur Extraktherstellung in den weiter unten beschriebenen Beispielen herangezogenen, erfindungsgemäss verwendbaren tierischen Zelllinien zusammengestellt. 



  Die Herstellung eines Rindernieren-Extrakts aus der Zelllinie MDBK ist in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben. 



  Die Herstellung einer Kombination des im Beispiel 1 erhaltenen Extrakts mit einem wässrigen synthetischen Rindernieren-Extrakt ist im Beispiel 2 beschrieben. 



  Die Kombination des in Beispiel 1 gewonnen Extrakts mit einem aus frischen Rindernieren hergestellten Extrakt ist in Beispiel 3 beschrieben. 



  Weitere Extraktherstellungen, in denen z.B. auch pflanzliche Zelllinien eingesetzt werden, sind in den Beispielen 4 bis 11 beschrieben. 
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle I 
<tb>Head Col 1: Nr. 
<tb>Head Col 2: Zelllinie 
<tb>Head Col 3: Zelllinien-Typ 
<tb>Head Col 4: Beschreibung 
<tb>Head Col 5: Kulturmedium
<tb><SEP>1<SEP>MDBK<SEP>Rindernierenzellen
 DSM ACC 174<SEP>von einer Niere eines normal ausgewachsenen Rindes<SEP>95% Dulbecco's MEM +
 5% FCS<1)>
<tb><SEP>2<SEP>P1-1A3<SEP>Thymus-Epithelzellen
 DSM ACC 280<SEP>vom Thymusepithel eines
 6 Monate alten Kindes<SEP>80% RPMI 1640 +
 20% FCS<2)>
<tb><SEP>3<SEP>EBL<SEP>Rinderlungenzellen
 DSM ACC 192<SEP>von der Lunge eines 7 Monate alten Rinderfötus; gefroren, 110.

   Passage<SEP>85% RPMI 1640 oder MEM + 15% FCS<3)>
<tb><SEP>4<SEP>AM-C6SC8<CEL AL=L>Schweinenieren-Zellen
 DSM-ACC 152<SEP>von einem Subklon von der Zelllinie AM II, die von einer normalen Schweineniere gewonnen wurde<SEP>80% Medium 199 (Hanks-
 Salze) + 20% FCS<4)>
<tb><SEP>5<SEP>BeWo<SEP>Human-Plazentazellen,
 weiblich ATCC CCL 98<SEP>Waymouth's + Gay's BBS + 10% Newborn Calf Serum<5)>
<tb><SEP>6<SEP>AV 3<CEL AL=L>Human-Amnion-Zellen
 ATCC CCL 21<SEP>Medium:

   M199 mit Eagle's-BBS + 20% FCS<5)>
<tb><SEP>7<SEP>WISH<CEL AL=L>Human-Amnion-Zellen
 ATCC CCL 25<SEP>Eagle's MEM mit Eagle's BSB + 10% FCS<5)>
<tb><SEP>8<SEP>PK (15)<CEL AL=L>Schweinenieren-Zellen ATCC CCL 33<SEP>Eagle's MEM mit Eagle's BSS + 10% FCS + Na-Pyruvat<5)>
<tb><CEL AL=L>9<SEP>B95.8<SEP>Blutzellen
 Strain Marmoset
 ATCC CRL 1612
 ECACC 85011419<SEP>RPMI 1640 + 10% FCS +
 L-Glutamin + Na-Pyruvat + nichtessentielle Aminosäuren + 2-Mercaptoethanol<6)>
<tb><SEP>10<SEP>FL<SEP>Human-Amnionzellen
 ATCC CCL 62
 IZSBS BSCL46<SEP>Eagle's MEM mit Earle's BSS + 10% FCS<7)>
<tb>
 <1)> Madin & Darby, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", 98, 574 (1958). Hinterlegung: Dr. R. Riebe, BFA, Insel, Riems, Deutschland
 
 <2)> Fernandez, "Blood", 83, 3245-3254 (1994). Hinterlegung: E. Fernandez, Dr.

   Toribio, Universität 
 Madrid, Spanien
 
 <3)> Beckmann und Schöss, "Deutsche Tierärztliche Wochenschrift", 95, 283 (1988); ibid, 98, 310, Rutter und Luther, "Vet. Rec.", 114, 393 (1984). Hinterlegung: Dr. V. \ppling, Paul Ehrlich-Institut, Langen, Deutschland
 
 <4)> Limezewski, "Mycotoxin Res.", 3, 69-76 (1987). Hinterlegung: Dr. Limezewski, Bundesanstalt für Milchforschung, Kiel
 
 <5)> CRC-IST Ansaldo, Data Bank for Biochemical Research, Animal Cell Lines Katalog 1990 von Manniello, Parodi, Aresu, Romano, Mailand 1990
 
 <6)> Hinterlegung: G.B. Ferrara, Servizion di Immunogenetica, Istituto Nazionale per la Ricerca, 
 16132 Genova, Italien
 
 <7)> "Proc. Soc. Exp. Biol. Medicine", 94, 532 (1957): Hinterlegung: M. Ferrari, Istituto Zooprofilattico Sperimentale, 25100 Brescia, Italien.
 
<tb> 
<tb></TABLE> 



  Die Extrakte werden üblicherweise durch die folgenden Kennzahlen charakterisiert:
 pH-Wert, Trockenrückstand (5 h bei 105 DEG C), N-Gehalt (nach Kjeldahl), Aminosäurebestimmung: qualitativ mittels Ninhydrin und mittels Dünnschichtchromatografie (TLC), Peptidnachweis: mittels Biuret-Reagens, Protein-Freiheit (mittels Sulfosalicylsäure), Nucleinsäurekomponenten: TLC, Kohlenhydrat-Komponenten: TLC, UV-Spektrum (1:50 oder 1:100), HPLC, Sterilitätsprüfungen nach DAB 10. 



  Im Falle medizinischer Anwendung von Extrakten ist Prüfung auf Pyrogene im Kaninchen- bzw. LAL-Test erforderlich. Besondere Kennzahlen, die zur Charakterisierung von Extrakten herangezogen werden, sind die Hydroxyprolin-Bestimmung z.B. für Bindegewebsextrakte und pflanzliche Extrakte, wie sie aus Cyanophyten gewonnen werden können, oder wie sie im Beispiel 8 dieser Erfindung für Colla 120 beschrieben worden ist. Rogenextrakte können durch entsprechende Fettsäurebestimmungen charakterisiert werden. Der im Beispiel 9 behandelte proteinfreie Hefeextrakt lässt sich durch seine hohe Gärungssteigerungs-Aktivität im WARBURG-Versuch charakterisieren (vgl. Fig. 11). Entsprechendes gilt auch für dessen Atmungssteigerung. 



  Die dermatologische Verträglichkeit und die Toxikologie wurden in üblicher Weise nach folgenden Methoden geprüft: 


 Tabelle II 
 



  Akute Toxizitätsprüfung nach intravenöser Applikation an der Maus. 



  Kumulative Toxizitätsprüfung nach 7-tägiger peroraler Applikation an der Maus. 



  Klinisch-toxikologische Beobachtungen nach intravenöser Verabreichung bei der Maus (Screening nach R. T. Turner): 2 g/kg, 10 g/kg, 20 g/kg Maus. 



  Offener epikutaner Sensibilisierungstest am Meerschweinchen über 3 Wochen (nach Bühler). 



  Augenreiztest am Kaninchen in Anlehnung an "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" von The Staff of Division of Pharmacology, FDA, Bewertung von Augen-Läsionen nach Draize, 1959. 



  Prüfung auf primäre Hautreizung beim Kaninchen in Anlehnung an "Appraisal of the Safety of Chemicals in Foods, Drugs and Cosmetics" von The Staff of Division of Pharmacology, FAD, Hautgiftigkeit nach Draize, 1959. 



  Klinisch-allergologische Prüfung im Patch-Test beim Menschen. 



  Ames-Test: Zur Prüfung auf mutagene Wirkung wird der Ames-Test ohne und mit metabolischer Aktivierung herangezogen: Mutagenitätsprüfung (Screening). 



  Abwesenheit von Viren und Prionen: Sie kann durch den Einsatz von Zellkulturen aus kompetenten Quellen garantiert werden. Die in der Beschreibungseinleitung weiter oben (S. 2) erwähnten Probleme mit frischem Organmaterial entfallen erfindungsgemäss vollkommen. 



  Die lege artis d.h. nach GMP (good manufacturing practice) hergestellten erfindungsgemässen Organextrakte passierten sämtliche genannten Tests problemlos - wie es auch für die bereits bekannten synthetischen Organextrakte sowie auch für die aus frischem Organmaterial gewonnen Organextrakte beobachtet worden ist, sachgemässe Produktion vorausgesetzt. Weitere Angaben sind in den weiter unten folgenden Beispielen enthalten. 



  Die Wirkungsweise aller oben genannten Extrakte wurde mithilfe folgender Untersuchungen verglichen und gestützt (biochemische und biologische Tests): 
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle III
 Methoden zur Prüfung der Wirkung von Organextrakten 
<tb>Head Col 1: Nr. 
<tb>Head Col 2: Methode 
<tb>Head Col 3: Beschreibung [Lit.]
<tb><SEP>1<SEP>Messung der Steigerung der Gewebsatmung z.B. von Leberhomogenat einer Ratte oder eines Meerschweinchens im Warburg-Test zur Bestimmung des 
 Atmungssteigerungsfaktors (die Atmung des Leberhomogentas wird auf 1,0 festgesetzt):

   Faktorangabe<SEP>ab S. 41 [Lit. 8]
<tb><SEP>2<SEP>Wachstumstest zur Beurteilung der Steigerung der Stoffwechselaktivität beispielsweise durch Messung des Wachstums von
<tb><SEP>a) Guppy-Fischen durch Längenmessung in mm nach 20 Tagen [Tp 80-100], (Kontrollwerte in runden Klammern)<SEP>S. 74/75
<tb><SEP>b) Kaulquappen von Xenopus laevis DAUDIN durch Längenmessung,
 Gewichtszunahme und Vorverlegung der Metamorphose (Beginn und Ende bei der Umwandlung zum Frosch) in Tagen<SEP>S. 73-74
<tb><SEP>3<SEP>Messung der Hautglättung nach der modifizierten PADBERG-Methode unter Verwendung von 3%igen W/\-Emulsionen nach 14-tägiger Anwendung; 
 Messung der Fotometerwerte in % von "behandelt" im Vergleich zum Ausgangszustand (Kontrollwerte in Klammern)<SEP>ab S. 62 [Lit. 10]
<tb><SEP>4<SEP>Profillinien-Messung nach der Bildanalyse;

   beurteilt werden die Profillinienflächen FA und die Linienlänge LL<SEP>ab S. 55
 (vgl. auch Fig. 9)
<tb><SEP>5<SEP>Vergleich des Fibroblasten-Wachstums mittels Thymidin-Einbaurate mit und ohne Formalinschädigung; Prüfung einer Kompensation der formalingeschädigten Fibroblasten nach 6 Tagen<SEP>ab S. 71/72 
<tb><SEP>6<SEP>Messung des Wasserrückhaltevermögens mittels eines Corneometers<SEP>ab S. 49 
<tb><SEP>7<CEL AL=L>Patch-Test am Menschen, d.h. allergologische Prüfung<SEP>ab S. 84
<tb><SEP>8<SEP>Messung der Steigerung der Hautspannung im Wundheilungstest 
 nach 21 Tagen ( DELTA -Werte)<SEP>S. 39/40 
<tb></TABLE> 



  Einige der dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV und V zusammengestellt, die sich auf die Beispiele 1 bis 4 der vorliegenden Anmeldung beziehen. 


 Tabelle IV
 Vergleich der Wirksamkeit der nach den Beispielen 1, 2 und 3 hergestellten Rindernieren-Extrakte la, lb und Ic 
 



  Die laufenden Nummern in der linken Spalte beziehen sich auf die in Tabelle III unter Nr. 1-8 aufgeführten Testmethoden: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>la:<SEP>Rindernieren-Extrakt aus der Zelllinie MDBK
<tb><SEP>lb:<SEP>Zelllinien-Extrakt la kombiniert mit einem synthetischen Rindernieren-Extrakt
<tb><SEP>lc:<SEP>Zelllinien-Extrakt la kombiniert mit einem natürlichen Rindernieren-Extrakt aus frischen Rindernieren 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Head Col 1: Nr. 
<tb>Head Col 2: (gemäss Tabelle III) 
<tb>Head Col 3: la 
<tb>Head Col 4: lb 
<tb>Head Col 5:

   Ic
<tb><SEP>1<SEP>Faktor<SEP>1,9<SEP>2,4<SEP>1,7
<tb><SEP>2a<SEP>Länge in mm <CEL AL=L>22,0 (18,0)<SEP>23,2 (18,0)<SEP>21,0 (18,0)
<tb><SEP>2b<SEP>Metamorphose abgekürzt auf<SEP>6 Tage<CEL AL=L>10 Tage<SEP>4 Tage
<tb><SEP>3<SEP>70 (85)<SEP>60 (85)<SEP>70 (85)
<tb><SEP>4 <CEL CB=3 AL=L>FA + 6
 LL -2,8<SEP>+10
 -2<SEP>+4
 -4
<tb><SEP>5<SEP>Thymidin-Einbaurate nach 6 Tagen
<tb><SEP>ohne HCHO<SEP>350 x 10<3><SEP>350 x 10<3><CEL AL=L>350 x 10<3>
<tb><SEP>mit HCHO<SEP>10 x 10<3><SEP>10 x 10<3><SEP>10 x 10<3>
<tb><SEP>mit HCHO+Zusatz von<SEP>la<SEP>lb<SEP>lc
<tb><SEP>kompensiert:<SEP>280 x 10<3><SEP>330 x 10<3><SEP>250 x 10<3>
<tb><SEP>6 <SEP>++<SEP>+++ (SEP)<+>(TB><SEP>7<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>8<SEP> DELTA -Wert<SEP>290<SEP>320<SEP>230*
<tb>
 * vgl. auch Tabelle VIII auf Seite 19
  
<tb></TABLE> 



  Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, dass das Optimum an Wirksamkeit erreicht wird durch die Kombination von synthetischem Extrakt mit dem aus einer Zelllinie gewonnen Extrakt: Daten unter lb. 


 Tabelle V
 Vergleich der Wirksamkeit der nach Beispiel 4 hergestellten Amnion-Extrakte lIa und llb 
 



  Die laufenden Nummern in der linken Spalte beziehen sich auf die in Tabelle III aufgeführten Testmethoden 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>Ila:<SEP>Amnion- Extrakt aus der Zelllinie WISH (human) 
<tb><SEP>Ilb:<SEP>Zelllinien-Extrakt lIa kombiniert mit einem synthetischen Human-AmnionExtrakt 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Head Col 1: Nr. 
<tb>Head Col 2: (gemäss Tabelle III) 
<tb>Head Col 3: Ila 
<tb>Head Col 4:

   Ilb
<tb><SEP>1<SEP>2,0<SEP>2,3
<tb><SEP>2a<SEP>21,0 (17,0)<SEP>22,5 (17,0)
<tb><SEP>2b<SEP>Metamorphose abgekürzt auf<SEP>2 Tage<SEP>6 Tage
<tb><SEP>3<SEP>60 (80)<SEP>55 (80)
<tb><SEP>4<SEP>keine Messungen
<tb><SEP>5<SEP>ohne HCHO<SEP>360 x 10<3><CEL AL=L>360 x 10<3>
<tb><SEP>mit HCHO<SEP>20 x 10<3><SEP>20 x 10<3>
<tb><SEP>mit HCHO, kompensiert<CEL AL=L>280 x 10<3><SEP>340 x 10<3>
<tb><SEP>6 <SEP>++ <SEP>++
<tb><SEP>7<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>8<SEP> DELTA -Wert<SEP>260<SEP>300 
<tb></TABLE> 



  Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, dass eine optimale Wirksamkeit bei der Kombination (lIb) eines synthetischen Extrakts mit dem aus einer Zelllinie gewonnenen Extrakt (Ila) erreicht wird: Daten unter Ilb. 



  Während vorstehend vorwiegend über wasserlösliche Organextrakte aus Zelllinien entsprechender tierischer Organe, aus frischen tierischen Organen bzw. auf dem Syntheseweg gewonnenen Extrakten und Kombination davon gesprochen worden ist - vor allem in Hinsicht auf ihre kosmetische Verwendung als kosmetische Additive und in Hinblick auf ihren medizinischen Einsatz - soll im Folgenden auf pflanzliche Extrakte eingegangen werden, die ebenfalls aus entsprechenden pflanzlichen Zelllinien gewonnen werden können (vgl. auch S. 7). Hierbei wird, wie bereits erwähnt, im Allgemeinen in Suspensionskulturen gearbeitet, was am nachstehenden Beispiel von Sycamore-Zellkulturen (Acer pseudoplatanus L.) und von Hefen gezeigt werden soll (siehe auch die weiter unten folgenden Beispiele 8, 9, 10). 



  Die Weiterverarbeitung der in grossem Massstab gewonnenen pflanzlichen Zellmasse hängt dann sehr von dem angestrebten pflanzlichen Extrakt selbst ab. Im Falle der aus Sycamore gewonnenen Extrakte interessiert vor allem das Zellwandmaterial, das Glycoproteine in einem Protein-Kohlenhydrat-Verhältnis von ca. 50:50 enthält und dessen Proteinanteile sich durch einen hohen Gehalt an Hydroxyprolin, Serin, Glycin usw. auszeichnen und dadurch dem tierischen Kollagen nahekommen (Hydroxyprolin ist ja bekanntlich die für Kollagene typische Aminosäure, die viele Besonderheiten aufweist; Hydroxyprolin ist nicht Baustein der Proteinbiosynthese, nur Prolin). 



  Das Produktionsschema für einen "kollagenähnlichen Pflanzen-Extrakt" aus Sycamore-Kulturen ist in Tabelle VI dargestellt. Eine Beschreibung der Arbeitsweise findet sich in Beispiel 8. 
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle VI
 Schema der Gewinnung eines Pflanzenextrakts (Colla 120) aus Sycamore-Zellkulturen (Acer pseudoplatanus L.) und Verwendung als pflanzliches kosmetisches Additiv im Sinne von Kollagen-Ersatz
<tb><SEP>1) <SEP>Gewinnung von Sycamore-Pflanzenmaterial aus Suspensionkulturen:

  
<tb><SEP>Sycamore in Zellkultursuspension (50 ml)
<tb><CEL CB=3 AL=L> &darr& 
<tb><SEP>Vermehrung nach der Rotary-Shaker-Technik (500 ml)
<tb><SEP> &darr& 
<tb><CEL CB=2 CE=3 AL=L>in Suspensionskulturflaschen (Bekkico Glass Inc.) (5-20 L)
<tb><SEP> &darr& 
<tb><SEP>in 50 L bis 4000 L-Fermentern oder in 2000 L Rohrschlangen-Kultivatoren 
<tb><SEP> &darr& 
<tb><SEP>Ernte von Sycamore-Zellmaterial als Pulver bzw.

   Suspension
<tb><CEL AL=L>2)<CEL CB=2 CE=3 AL=L>Zellwand-Brechen:
<tb><SEP> &darr& 
<tb><SEP>suspendiertes Sycamore-Zellmaterial im Kilowatt-Ultrasonic-Generator zerbrochen
<tb><SEP> &darr& 
<tb><SEP>Zentrifugieren des aufgeschlossenen Materials und Waschen mit Wasser
<tb><SEP> &darr& 
<tb><SEP>3)<SEP>Splitting und Deproteinisierung:
<tb><CEL CB=3 AL=L> &darr& 
<tb><SEP>durch chemische und enzymatische Partialhydrolysen
<tb><SEP> &darr& 
<tb><CEL CB=2 CE=3 AL=L>Konzentration im Vakuum auf 10- bis 15%igen Extrakt
<tb><SEP> &darr& 
<tb><SEP>Einsatz als kosmetisches Additiv analog Kollagen in Cremes, Lotionen, Masken und dgl. 
<tb></TABLE> 



  In ähnlicher Weise kann auch vorgegangen werden, wenn von Solanum tuberosum, und zwar einem tetraploiden Stamm in Suspensions-Kulturen ausgegangen wird. 



  Das Molekulargewicht der erhaltenen kosmetischen Additive liegt unter 3000. Feuchtigkeitshaltevermögen und andere kosmetische Effekte dieser Hydrolysate dürften mit den darin enthaltenen niedermolekularen Peptiden zusammenhängen, beispielsweise mit Oligopeptiden, entsprechend DE-OS 4 127 790 oder konstitutionell ähnlichen Derivaten. 



  Die erfindungsgemässen Organextrakte und/oder ihre Kombinationen lassen sich nicht nur kosmetisch und medizinisch nutzen. Es gibt weitere Anwendungsmöglichkeiten, wenn man bedenkt, dass die als Atmungssteigerung (oder durch andere Systeme) nachweisbare Zellstoffwechselaktivierung gleichzeitig eine Aktivierung des Sauerstoffs bedeutet sowie, damit zusammenhängend, auch eine Beeinflussung radikalbildender Systeme (Radikalfängerwirkung). Infolgedessen war der Einfluss von Organextrakten der verschiedenen Art auch in Bereichen zu erwarten, wo eine Stabilisierung und Haltbarmachung erwünscht ist. Entsprechende Versuche mit Farbanstrichen und gefärbten Geweben haben positive Effekte gezeigt: 



  Farbanstriche von Farblösungen, denen tierische oder pflanzliche Extrakte oder Extraktgemische gemäss der Erfindung zugefügt worden sind, gegebenenfalls aufkonzentriert auf 10-15% Feststoff und gegebenenfalls unter Zusatz von Lösungsvermittlern oder Lösungsmitteln, erwiesen sich in mehrjährigen Dauerversuchen sowie auch in Modellversuchen unter UV-Bestrahlung als farbbeständiger als die Kontrollversuche ohne Zusätze. Entsprechende Ergebnisse sind auch mit eingefärbten Geweben und Autolacken auf Wasserbasis verschiedener Art erzielt worden: längere Beständigkeit der Farben und weniger empfindlich gegen Auswaschen. Besonders gute Effekte sind mit den im weiter unten folgenden Beispiel 11 genannten Extrakten erzielt worden. 



  Die für biologische Systeme ermittelte Radikalfängerwirkung der erfindungsgemässen pflanzlichen und tierischen Organextrakte dürfte auch bei den oben beschriebenen Effekten eine Rolle spielen. Es sei hier nachdrücklich auf die im weiter unten folgenden Beispiel 10 beschriebenen Modellversuche über die Radikalfängerwirkung von Hydroxyl-Radikalen auf Hyaluronsäure und ihre Hemmung durch die Organextrakte verwiesen (vgl. Fig. 12). 



  Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. 


 Beispiel 1 
 


 Herstellung eines Rindernieren-Extrakts aus der Zelllinie MDBK 
 



  1.1 Bereitstellung der Zellmaterials 



  1.2 Extraktion und Aufarbeitung zum eiweissfreien bzw. eiweisshaltigen Rindernieren-Extrakt 


 Ad 1.1 
 



  Als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines Rindernieren-Extrakts dient die Zelllinie MDBK (DSM ACC 174). 



  Die Zellen stammen von einer Niere eines normal ausgewachsenen Stiers aus dem Jahre 1957. Die Zellen sind BVD-frei. Es handelt sich dabei um adhärente epithelähnliche Zellen. 



  Als Kulturmedium ist vorgeschrieben: 95% Dulbecco's + 5% FCS. 



  Für die Subkultur-Routine gilt: optimale Teilungsrate 1:4 bis 1:6 mit Trypsin/EDTA. Die Zellen wachsen innerhalb von 2 bis 3 Tagen zusammen. Aussaat: (2-4) x 10<5> Zellen/80 cm<2>; Ernte (4-6) x 10<6> Zellen/80 cm<2>; 5% CO2, 37 DEG C. 



  Ausgehend von der gefrorenen Zellkultur der Linie MDBK wird diese zunächst im Wasserbad bei 30 DEG C aufgetaut und in ein 15-ml-Röhrchen überführt. Es werden 10 ml vorgewärmtes Kulturmedium hinzugegeben, damit vermischt, bebrütet (37 DEG C, 5% CO<2>). Nach der Ausbildung des Zellrasens wird in folgender Weise weitergearbeitet unter Vermeidung von Zentrifugationen, um Zellschädigungen zu vermeiden:
 Dekantieren des Mediums, einmaliges Waschen des Zellrasens mit einem Phosphatpuffer, Benetzung des Zellrasens mit Trypsin/EDTA (1 ml pro 25-cm<2>-Flasche) durch 3- bis 4-maliges Schwenken der Zellkulturflasche, Absaugen von Trypsin, 2 bis 3 min lnkubieren bei 37 DEG C; 
 nach Ablösung des Zellrasens (leichtes Schütteln oder Klopfen an das Kulturgefäss) werden die Zellen in komplettem Medium aufgenommen;

   die erwünschte Zellkonzentration von 4 x 10<5> Zellen pro 80 cm<2> wird durch mikroskopische Auszählung und entsprechende Verdünnung hergestellt. 



  In dieser Weise wird in einer grösseren Anzahl von Flaschen das Ausgangsmaterial für eine Grosskultur von Zellen auf Oberflächen bereitgestellt. 



  Es wird mit einem Perfusionssystem mit fester Matrix nach McCoy, Wittle, Conway und Weiss [Lit. 6], Schleicher, Weiss [Lit. 2] aus den Abott-Laboratorien weiter gearbeitet. 



  Die Kulturoberflächen bestanden aus Schichten übereinander gesetzter Titanplatten, die von einem Stützgestell innerhalb des Kulturgefässes zusammengehalten werden (vgl. Fig. 4). Es kann eine einfache Luftpumpe verwendet werden. 



  Die Apparatur wird beimpft mit einer Zellsuspension, die aus den Kulturflaschen eingepumpt wird. Die Apparatur wird dann - immer alles unter streng sterilen Bedingungen - mit einem sterilen CO2-Luft-Gemisch mithilfe der Luftpumpe beschickt, um die Zellen gleichmässig zu verteilen. Die CO2-haltige Luftzufuhr wird 2 h lang gestoppt, damit sich die Zellen absetzen können, dann wird das Beschicken fortgesetzt. Sobald eine ausreichende Zelldichte erreicht ist (siehe Ernte), wird das Kulturmedium abgepumpt und durch eine Trypsin-Lösung ersetzt. Nach einer Inkubation kann die Zellsuspension aus der Apparatur herausgepumpt werden. Bei jedem Zyklus werden bis zu 20 g Zellmaterial gewonnen. 



  Parallel dazu wurde auch nach der Plastik-Film-Kultur-Methode im grosstechnischen Massstab gearbeitet. 



  Auf diese Weise war es kein Problem, innerhalb einer verhältnismässig kurzen Zeit 10 kg Rindernierenzellen zu züchten, die dann zur Extraktgewinnung weiterbehandelt wurden, wobei man wie mit frischem Rindernieren-Organmaterial nach dem Waschen und Zerkleinern in Kolloidmühlen verfährt. 


 Ad 1.2 
 



  10 kg aufgetautes Zellmaterial gemäss Abschnitt 1.1 werden in Ethylether suspendiert und etwa 10 Tage lang bei -20 DEG C im Kälteraum stehen gelassen. Nach dem Zentrifugieren in einer geeigneten Apparatur, beispielsweise einer explosionssicheren Trommelzentrifuge, werden 4 l Rohextrakt erhalten, die zur weiteren Reinigung zunächst filtriert, mindestens zweimal intensiv ausgeethert und dann gegen eine 0,3% Nipagin enthaltende Lösung dialysiert werden. 



  Etherreste lassen sich aus dem Dialysat (Aussenlösung) durch Stickstoff-Durchblasen bei pH 7,2 entfernen. Das Dialysat ist ein eiweissfreier Rindernieren-Extrakt. In den Dialyseschläuchen befindet sich ein eiweisshaltiger Rindernieren-Extrakt. 



  Die Ausbeute an eiweissfreiem Rindernieren-Extrakt la betrug 25 L. Eine Ultrafiltration des Extrakts la ist nicht erforderlich, da das Ausgangsmaterial BSE-frei war und keine Prionen enthielt. 



  Der mit einem 0,2  mu m-(Millipore< TM >)-Filter sterilfiltrierte Rindernieren-Extrakt la hat nach der pH-Wert-Einstellung die folgenden Kennzahlen: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,8
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>7 mg/ml
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>N-Gehalt (Kjeldahl) (SEP)<>0,03%
<tb><SEP>Aminosäuren (Ninhydrin)<SEP>positiv
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Peptide (Biuret)<SEP>positiv
<tb><SEP>Proteine<SEP>negativ 
<tb><SEP>Stoffwechselaktivität:
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor nach Warburg (Homogenat, Ratte)
 <SEP>1,9
<tb><SEP>Schwermetalle<SEP><10 ppm
<tb><SEP>Arsen<SEP><2 ppm
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei sowie frei von Hormonen, Prionen und Viren 
<tb></TABLE> 


 Beispiel 2 
 


 Kombination eines wässrigen synthetischen Rindernieren-Extrakts mit einem aus der Zelllinie MDBK nach Beispiel 1 hergestellten Rindernieren-Extrakt 
 



  5 L des nach Beispiel 1 hergestellten sterilen eiweissfreien Rindernieren-Extrakts la werden mit 19,8 L wässrigem synthetischem Rindernieren-Extrakt, hergestellt nach EPA 92 250 349.5, kombiniert, nach pH-Wert-Einstellung auf 6,8 auf 25 L aufgefüllt und mit einem 0,2  mu m-(Millipore< TM >)-Filter sterilfiltriert (kombinierter Rindernieren-Extrakt lb). 



  Die Herstellung von 20 l wässrigem synthetischem Rindernieren-Extrakt wurde wie folgt durchgeführt: 



  Die in der folgenden Tabelle angegebenen Bestandteile wurden unter sterilen Bedingungen und unter Rühren in 8 L bidestilliertem Wasser gelöst, wobei der pH-Wert der Lösung während der Herstellung zwischen 6,0 und 7,5 gehalten wurde (Teillösung I, deren pH-Wert zum Schluss auf 6,7 eingestellt wurde). 


 Tabelle VII 
 


 Zur Herstellung der Teillösung I werden in 8 L bidestilliertem Wasser gelöst (die angegebenen Mengen sind für eine Endlösung von 20 L berechnet):

   
 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>L-Glutaminsäure<SEP>6,0 g
<tb><SEP>D-Ornithin<SEP>1,6
<tb><SEP>L-Asparaginsäure<CEL AL=L>3,0
<tb><SEP>L-Tyrosin<SEP>0,6
<tb><SEP>L-Hydroxyprolin<SEP>4,0
<tb><SEP>Kreatinin<CEL AL=L>0,2
<tb><SEP>L-Isoleucin<SEP>0,02
<tb><SEP>L-Leucin<SEP>1,0
<tb><SEP>Cystein<CEL AL=L>0,04
<tb><CEL AL=L>Glycin<SEP>12,0
<tb><SEP>L-Serin<SEP>6,0
<tb><SEP>L-Lysin<SEP>7,0
<tb><SEP>Harnstoff<CEL AL=L>1,6
<tb><SEP>L-Histidin<SEP>1,2 g
<tb><SEP>L-Asparagin<SEP>1,0
<tb><SEP>L-Valin<CEL AL=L>1,0
<tb><SEP>DL-Threonin<SEP>0,8
<tb><SEP>L-Phenylalanin<SEP>0,8
<tb><SEP>L-Methionin<CEL AL=L>0,4
<tb><SEP>L-Tryptophan<SEP>0,4
<tb><SEP> beta -Alanin<SEP>0,7
<tb><SEP>L-Alanin<CEL AL=L>4,8
<tb><CEL AL=L>L-Prolin<SEP>4,8
<tb><SEP>L-Arginin<SEP>7,0
<tb><SEP>Hippursäure<SEP>0,02 
<tb><SEP>Adenin<SEP>0,4 g
<tb><SEP>Guanin<SEP>0,2
<tb><SEP>Hypoxanthin<SEP>0,4
<tb><CEL AL=L>Uracil<SEP>0,

  4
<tb><SEP>Harnsäure<SEP>0,02
<tb><SEP>AMP<SEP>0,2
<tb><SEP>Glucose<CEL AL=L>3,0
<tb><SEP>Adenosin<SEP>0,4 g
<tb><SEP>Cytosin<SEP>0,6
<tb><SEP>Inosin<CEL AL=L>2,0
<tb><CEL AL=L>Uridin<SEP>0,6
<tb><SEP>Orotsäure<SEP>0,02
<tb><SEP>Sorbit<SEP>40,0
<tb><SEP>Cytidin<CEL AL=L>0,8 g
<tb><SEP>Guanosin<SEP>0,4
<tb><SEP>Thymin<SEP>0,8
<tb><SEP>Xanthin<SEP>0,2
<tb><CEL AL=L>Cycl.

   AMP<SEP>0,8
<tb><SEP>Mannit<SEP>3,0
<tb><SEP>Bernsteinsäure<SEP>30,0 g
<tb><CEL AL=L>Ethanol<CEL AL=L>40 ml
<tb><SEP>Apfelsäure<SEP>0,2 g
<tb><SEP>Citronensäure<SEP>2,0 g
<tb><CEL AL=L>Benzylalkohol<SEP>3 ml
<tb><SEP>Thiamindichlorid<SEP>0,04 g
<tb><SEP>Ca-pantothenat<CEL AL=L>0,04
<tb><SEP>Pyridoxol HCI<SEP>0,08 
<tb><SEP>Tocopherolsuccinat<SEP>0,08
<tb><SEP>Panthenol<SEP>20,0
<tb><SEP>Mg-aspartat<CEL AL=L>0,4
<tb><SEP>Mn-gluconat<SEP>0,2
<tb><SEP>N-Methylglucamin<SEP>8,0
<tb><CEL AL=L>p-Hydroxybenzoesäuremethylester Na-Salz<SEP>14
<tb><SEP>Nikotinsäureamid<SEP>0,2
<tb><CEL AL=L>myo-Inosit<SEP>1,0
<tb><SEP>Biotin<SEP>0,2
<tb><SEP>MgSO47H2O<SEP>2,0
<tb><SEP>Co-gluconat<CEL AL=L>0,01
<tb><SEP>NaH2PO4H2O<SEP>1,0
<tb><SEP>Na-Iaktat 50%ig<SEP>20,0 
<tb></TABLE> 



  Parallel dazu wurde eine Teillösung II hergestellt, indem eine aus Soja, Mais und partiell dehydratisierter Hefe im Gewichtsverhältnis 1:1:10 gewonnene Peptonmenge von insgesamt 80 g zur Desodorierung und Entfärbung in 9 L bidestilliertem Wasser unter starkem Rühren gelöst und über Nacht mit 15 g frischer Aktivkohle behandelt wurde. 



  Die so erhaltene Lösung wurde nach dem Abnutschen und Sterilfiltrieren durch ein 0,2  mu m-(Millipore< TM >)-Filter mit der Teillösung I vereinigt. Anschliessend wurden dem Ansatz die synthetischen Peptidfragmente Glutathion (180 mg) und Gly-His-Lys (2,3 mg) sowie 0,2 mg H-Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-Ser-OH + 0,08 mg H-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH + 5 ml Renin-Hydrolysat hinzugefügt und nach der pH-Wert-Einstellung auf 20 L aufgefüllt, mit einem 0,2  mu m-Filter sterilfiltriert und analysiert:

   
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,7
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>1,6%
<tb><SEP>N-Gehalt (Kjeldahl) (SEP)<> 0,05% 
<tb><SEP>Warburg-Faktor (Atmungssteigerung)<SEP>2,0
<tb><SEP>Aminosäuren (Ninhydrin)<SEP>positiv
<tb><CEL AL=L>Peptid (Biuret)<SEP>positiv
<tb><SEP>Schwermetalle<SEP>< 10 ppm
<tb><SEP>Arsen<SEP>< 2 ppm
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei 
<tb></TABLE> 



  Bei der Herstellung der Teillösung I ist zu beachten, dass von den in der Tabelle I genannten Bestandteilen die Aminosäuren L-Glu, L-Asp, L-Val, L-Tyr, L-Phe, L-Isoleu in 2 n NAOH vorgelöst werden müssen. Anschliessend erfolgt dann die Zugabe der Carbonsäuren, Citronensäure, Bernsteinsäure und Apfelsäure. Nach der pH-Wert-Einstellung auf 6,4 werden die anderen Komponenten zugegeben. Die Bestandteile Xanthin und Guanin müssen in 3 n NAOH bzw. 3 n HCI vorgelöst und vor der Zugabe neutralisiert werden. 



  Über eine technische Anwendung eines synthetischen Rindernieren-Extrakts, der nur aus Teillösung I und II besteht, konserviert, aber nicht sterilfiltriert ist, vgl. das weiter unten folgende Beispiel 11. 



  Entsprechendes gilt für den im folgenden Beispiel 3 beschriebenen, aus frischen Rindernieren hergestellten konservierten, aber nicht dialysierten Roh-Extrakt. 


 Beispiel 3 
 


 Kombination eines aus frischen Rindernieren hergestellten Extrakts mit einem aus der Zelllinie MDBK nach Beispiel 1 hergestellten Rindernieren-Extrakt 
 



  5 L des nach Beispiel 1 hergestellten sterilfiltrierten Rindernieren-Extrakts la werden mit 19,8 L wässrigem Rindernieren-Extrakt kombiniert, der wie nachstehend beschrieben aus frischen Rindernieren hergestellt worden ist. Nach der pH-Wert-Einstellung auf 6,8 wird auf 25 L aufgefüllt und mit einem 0,2- mu m-Filter sterilfiltriert, wobei man den kombinierten Rindernieren-Extrakt Ic erhält. 



  Der Rindernieren-Extrakt aus frischen, gewaschenen, zerkleinerten Rindernieren von BSE-freien Herden wurde wie folgt hergestellt: 



  Die vorbereiteten und zerkleinerten (zuletzt in einer Kolloidmühle) Rindernieren werden in Ethylether suspendiert und etwa 10 Tage lang bei -20 DEG C im Kälteraum belassen. Nach dem Zentrifugieren in einer geeigneten Apparatur, beispielsweise einer (explosionssicheren) Trommelzentrifuge, werden aus 100 kg Rindernieren etwa 25 L wässriger Rohextrakt erhalten. Dieser wird zur weiteren Reinigung zunächst filtriert, mindestens zweimal intensiv ausgeethert und dann gegen eine 0,3% Nipagin enthaltende Lösung dialysiert. 



  Nach 4-tägigem Stehenlassen bei 5 DEG C wird das aussen stehende eiweissfreie Dialysat durch Hindurchleiten von Stickstoff bei pH 7,2 von letzten Etherspuren befreit und nach erneuter Einstellung des pH-Wertes auf 6,8 ultrafiltriert (Filtron, Centrasette, Typ OMEGA, NMWL 8K). 



  Dieses eiweissfreie sterile Dialysat ist der Rindernieren-Extrakt, der mit dem Zelllinien-Extrakt la kombiniert wird unter Bildung des kombinierten Rindernieren-Extrakts Ic. 



  Der in den Dialyseschläuchen befindliche eiweisshaltige Rindernieren-Extrakt kann anderweitig Verwendung finden, beispielsweise um nach partieller Hydrolyse zu Rindernieren-Peptiden zu gelangen, die für die Herstellung von synthetischen Extrakten von Bedeutung sind. Der im Dialyseschlauch verbleibende Rindernieren-Extrakt, sein Dialysat und eine Kombination Ic sind auf Radikalfängerwirkung geprüft worden, wobei in allen Fällen positive Ergebnisse erzielt worden sind (vgl. das weiter unten folgende Beispiel 10 und Fig. 12). 



  Für den kombinierten Rindernieren-Extrakt Ic sind folgende Kennzahlen ermittelt worden: <SEP> 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,8
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>8 mg/ml
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>N-Gehalt (Kjeldahl) (SEP)<>0,03%
<tb><SEP>Aminosäuren (Ninhydrin)<SEP>positiv
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Peptide (Biuret)<SEP>positiv
<tb><SEP>Proteine<SEP>proteinfrei
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Stoffwechselaktivität:
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor
 (Leber-Homogenat, Ratte)<SEP>1,7
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei 
<tb></TABLE> 



  Das zur Kombination zur Herstellung des kombinierten Extrakts lc verwendete eiweissfreie Dialysat hatte einen Warburg-Faktor von 1,55. 



  Mit den nach Beispiel 1, 2 und 3 hergestellten Rindernieren-Extrakten verschiedener Art sind umfangreiche Wirksamkeitsprüfungen durchgeführt worden, über deren Ergebnisse in Tabelle IV (nach dem Schlüssel der Tabelle III) zusammenfassend berichtet worden ist. 



  Unter anderem waren zur Demonstration der Wirksamkeit des erfindungsgemässen Extraktes Wundheilungsversuche bei Ratten gemäss DE-PS 3 711 054 sowie anschliessend Hautspannungsmessungen durchgeführt worden (vgl. auch EP-A-0 552 516, Tabelle 11). Diese Ergebnisse sind in Tabelle VIII aufgeführt: 
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle VIlI 
<tb>Head Col 1: Zeit nach dem Setzen
 der Wunde 
<tb>Head Col 2:  Versuchsgruppe 
<tb>Head Col 3: Kontrollgruppe 
<tb>Head Col 4:

   Differenz  DELTA 
<tb><SEP>a) Rindernieren-Extrakt nach Beispiel 1 (la), hergestellt aus Zelllinie MDBK
<tb><SEP>5 Tage<SEP>240<SEP>142<SEP>98
<tb><SEP>12 Tage<SEP>490<SEP>412<CEL AL=L>78
<tb><SEP>21 Tage<SEP>1630<SEP>1340<SEP>290*
<tb><SEP>b) Rindernieren-Extrakt nach Beispiel 2 (1b), hergestellt durch Kombination von Zelllinien-Extrakt mit synthetischem Rindernieren-Extrakt
<tb><SEP>5 Tage<SEP>250<SEP>140<SEP>110
<tb><SEP>12 Tage<SEP>530<CEL AL=L>429<CEL AL=L>101
<tb><SEP>21 Tage<SEP>1800<SEP>1480<SEP>320*
<tb><SEP>c) Rindernieren-Extrakt nach Beispiel 3, hergestellt aus Zelllinien-Extrakt und natürlichem Rindernieren-Extrakt aus frischen Rindernieren
<tb><SEP>5 Tage<SEP>190<SEP>110<SEP>80
<tb><SEP>12 Tage<SEP>460<CEL AL=L>390<CEL AL=L>70
<tb><SEP>21 Tage<SEP>1530<SEP>1300<SEP>230*
<tb>
 * Werte in Tabelle IV unter Nr. 8
  
<tb></TABLE> 



  Die in der Tabelle VIII aufgeführten Ergebnisse der Hautspannungsmessungen dokumentieren die überlegene Wirksamkeit der erfindungsgemässen Präparate unter a) und b) und in allen Fällen gegenüber den Kontrollgruppen. 



  Die in Tabelle IV unter Nr. 1 und alle weiteren in der Anmeldung angegebenen Atmungssteigerungs-Faktoren sind nach folgender Arbeitsvorschrift über "Wirksamkeitsprüfung von Testlösungen auf Atmungssteigerung im Rattenleberhomogenat (Warburg-Methode)" gewonnen worden [Lit. 8]. 


 Methode und Arbeitsplan 
 


 A. Lösungen 
 



  1. Sörensen-Puffer, pH 7,4 aus 80,4 ml einer Lösung von 11,87 g Na2HPO4.2H2O/l und 19,6 ml einer Lösung von 9,08 g KH2PO4/l. 



  Nach Zusammengeben der genannten Lösungsmengen wird der pH-Wert überprüft und, falls erforderlich, durch Zusatz der einen oder anderen Lösung korrigiert. 



  2. Rattenleberhomogenat: Einer 24-h-Hungerratte wird nach Dekapitation und Ausbluten die Leber entnommen und sofort auf Eis gekühlt. Nach dem Waschen und Abtrocknen mit Zellstoff werden 6 g zerkleinerte Leber im Homogenisator nach Potter-Elvehjem mit leicht gängigem Teflonpistill auf 30 ml mit gekühltem Sörensenpuffer aufgefüllt und unter Eiswasserkühlung für 2 bis 3 min homogenisiert. Das fertige Homogenat lässt man für ca. 3 min unter Eiskühlung stehen, um die beim Homogenisieren eingequirlte Luft entweichen zu lassen. 



  3. KOH 6n 



  4. Testlösungen, z.B. die Rindernieren-Extrakte la, lb und Ic siehe Tabelle IV u.a. 



  5. Aqua dest. 


 B. Versuchsdurchführung 
 



  Kegelförmige Warburg-Gefässe mit einem Zylindereinsatz (ZE) und einem Seitenarm (SA) und einem Volumen von ca. 13 ml werden wie folgt gefüllt: 
<tb><TABLE> Columns=6 Füllplan, die Angaben erfolgen in ml 
<tb>Head Col 1: Gläser-Nr. 
<tb>Head Col 3 AL=L: 1/2 
<tb>Head Col 2: 3/4 
<tb>Head Col 3: 5/6 
<tb>Head Col 4: 7/8
<tb><SEP>Lösung<SEP>Füllort
<tb><SEP>1<SEP>HR*)<SEP>3,0<SEP>1,5<CEL AL=L>3,0<CEL AL=L>1,5
<tb><SEP>5<SEP>SA<SEP>0,25<SEP>0,25<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>4<SEP>SA<SEP>-<CEL AL=L>-<SEP>0,25<SEP>0,25
<tb><SEP>3<SEP>ZE<SEP>0,2<SEP>0,2<SEP>0,2<SEP>0,2
<tb><CEL AL=L>2<SEP>HR<SEP>-<SEP>1,5<SEP>-<SEP>1,5
<tb><SEP>*) HR = Hauptraum 
<tb></TABLE> 



  Die Lösungen werden in der angegebenen Reihenfolge einpipettiert. Zur Erhöhung der KOH-Oberfläche werden in die Zylindereinsätze gefaltete Filterstreifen eingesetzt. Sofort nach Beendigung der Füllung werden die Gefässe mit den passenden Schlauchventilstopfen am Seitenarmansatz dicht verschlossen, die Gefässe an den Manometern befestigt und mit Klammern oder Paketgummis gesichert. Die Manometer werden bei geöffneten Hähnen in die auf 37 DEG C temperierte Apparatur eingehängt und 60 Minuten geschüttelt, um die Reaktionslösung zu temperieren und die anfänglich sehr schnelle Atmung abklingen zu lassen.

   Danach werden die rechten Manometerschenkel mithilfe des Quetschhahns auf die Marke "5" eingestellt, die Differenz der linken Schenkel zu "15" notiert, die Manometerhähne geschlossen und die Lösungen aus den Seitenarmen durch Kippen in die Haupträume überführt (0-Zeit). Nach je 20 Minuten wird die Schüttelvorrichtung abgestellt, die rechten Manometerschenkel auf "15" eingestellt (V = konst.) und die Differenz der linken Schenkel zu "15" notiert. 



  Der Versuch läuft bis zu einer Messdauer von 100 Minuten. Sollte in einigen Gläsern der Sauerstoffverbrauch so gross sein, dass die Manometerlänge nicht ausreicht, wird rechtzeitig ein Druckausgleich geschaffen, indem man sofort nach der Ablesung den Manometerhahn öffnet, den rechten Schenkel wieder auf "15" einstellt, die Differenz des linken Schenkels zu "15" notiert und den Manometerhahn sofort wieder schliesst. Nach der letzten Ablesung werden die Manometerhähne geöffnet und die Volumen der Gefässe und der dazugehörigen Manometer notiert. 


 C. Auswertung 
 



  Zunächst werden die Gefässe 3/4 und 7/8 mit den entsprechenden Thermobarometern (TB: Gefäss 1/2 bzw. 5/6) abgeglichen, um Luftdruck- und Temperaturschwankungen während des Versuches auszugleichen. Danach werden die Gefässkonstanten für O2 der Gläser 3/4 und 7/8 nach folgender Gleichung berechnet: 
EMI43.1
 
 
 



  Vg = Volumen der Gasphase (Volumen des Gefässes und des Manometers bis zur Marke "15" abzüglich Vf). Vf = Volumen der im Gefäss enthaltenen Gesamtflüssigkeit. T = Versuchstemperatur in  DEG K.  alpha  = Bunsenscher Absorptionskoeffizient (O2 37 DEG C = 0,0239).
 P0 = 1 atm, gemessen in mm Brodie'sche Lösung (Manometerfüllung) bei 0,1 MPa (760 mm Hg) = 10 000 Brodie'sche Lösung. 



  Der verbrauchte Sauerstoff kann nun direkt nach der Gleichung
 
 X ( mu l O2) = h . k
 
 berechnet werden, da die durch die Atmung entstandene Kohlensäure durch die KOH vollständig absorbiert wurde (h = manometrische Differenz). Dividiert man die verbrauchten  mu l O2 der Gläser 7/8 durch die der Gläser 3/4, so erhält man einen Faktor, der das Mass der Atmungssteigerung darstellt. [Lit. 8]. 


 Beispiel 4 
 


 Herstellung eines wässrigen Amnion-Extrakts durch Kombinieren eines Extrakts aus der Zelllinie WISH mit einem synthetischen Amnion-Extrakt analog zu EPA 0 522 516 
 



  4.1 Bereitstellung des Zellmaterials, ausgehend von der Amnion-Zelllinie WISH (human) 



  4.2 Extraktion des Amnion-Zellmaterials und Aufarbeitung zu einem eiweissfreien Amnion-Extrakt Ila 



  4.3 Herstellung eines synthetischen Amnion-Extrakts gemäss EP-A-0 522 516 



  4.4 Kombination der beiden Amnion-Extrakte zu dem Extrakt lIb 



  4.5 Testversuche mit Ila und lIb. 


 Ad 4.1 
 



  Als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Amnion-Extrakts diente die Zelllinie WISH, ATCC CCL 25, IZSBS BS C192. 



  Als Kulturmedium ist vorgeschrieben: Eagle's MEM mit Earle's BSS + 10% FCS (Einzelheiten sind zu finden in "Exp. Cell. Res.", 23, 14 (1961)). 



  Es wurde verfahren wie in Beispiel 1.1 beschrieben. Hinsichtlich der Herstellung einer Grosskultur wurde nach der Plastik-Film-Kultur-Methode im Grossmassstab gearbeitet. Das gewonnene Zellmaterial wurde bis zur Weiterverarbeitung tiefgefroren. 


 Ad 4.2 
 



  1 kg aufgetautes Zellmaterial gemäss 4.1 wird in Ethylether suspendiert und 12 Tage lang bei -20 DEG C im Kälteraum stehen gelassen. Der durch Zentrifugieren erhaltene Rohextrakt wird vor der Weiterverarbeitung filtriert, mehrmals intensiv mit Diethylether (hier stets "Ether" genannt) und/oder Chloroform behandelt und dann gegen eine 0,3% Nipagin enthaltende Lösung dialysiert. Das eiweissfreie Dialysat wird ultrafiltriert (FILTRON< TM >): Ausbeute 2,4 L. 



  Die analytischen Daten des erhaltenen Amnion-Extrakts Ila sind folgende: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,7
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>1,0%
<tb><SEP>N-Gehalt (Kjeldahl)<CEL AL=L>0,02%
<tb><SEP>Aminosäure<SEP>positiv
<tb><SEP>Proteine<SEP>negativ
<tb><SEP>Peptide<CEL AL=L>positiv
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor<SEP>2,0
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei 
<tb></TABLE> 


 Ad 4.3 
 



  Die Herstellung des synthetischen Amnion-Extrakts erfolgt auf folgende Weise: 



  Die in der folgenden Tabelle aufgezählten Bestandteile werden unter sterilen Bedingungen und unter Rühren in 300 ml bidestilliertem Wasser gelöst zur Herstellung der Teillösung I mit einem pH-Wert von 6,7. 


 Tabelle IX 
 



  Zur Herstellung der Teillösung I werden in 300 ml bidestilliertem Wasser die folgenden Komponenten gelöst (die angegebenen Mengen sind für eine Endlösung von 1000 ml berechnet). 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>L-Glutaminsäure<SEP>0,3 g
<tb><SEP>L-Histidin<SEP>0,06 g
<tb><SEP>L-Ornithin<SEP>0,08 g
<tb><SEP>L-Asparagin<SEP>0,05 g
<tb><SEP>L-Asparaginsäure<SEP>0,15 g
<tb><SEP>L-Valin<SEP>0,05 g
<tb><SEP>L-Tyrosin<SEP>0,03 g
<tb><SEP>DL-Threonin<SEP>0,04 g
<tb><SEP>L-Hydroxyprolin<SEP>0,2 g
<tb><SEP>L-Phenylalanin<SEP>0,04 g
<tb><SEP>Kreatinin<SEP>0,01 g
<tb><SEP>L-Methionin<SEP>0,02 g
<tb><SEP>L-Isoleucin<SEP>0,001 g
<tb><SEP>L-Tryptophan<SEP>0,02 g
<tb><SEP>L-Leucin<SEP>0,05 g
<tb><SEP> beta -Alanin<SEP>0,035 g
<tb><SEP>Cystein<SEP>0,2 g
<tb><SEP>L-Alanin<SEP>0,24 g
<tb><CEL AL=L>Glycin<SEP>4,0 g
<tb><SEP>L-Prolin<SEP>0,24 g
<tb><SEP>L-Serin<SEP>0,

  26 g
<tb><CEL AL=L>L-Arginin<CEL AL=L>0,3 g
<tb><SEP>L-Lysin<SEP>0,3 g
<tb><SEP>Harnstoff<SEP>0,8 g 
<tb><SEP>Adenin<SEP>0,02 g
<tb><SEP>Adenosin<SEP>0,02 g
<tb><SEP>Cytidin<SEP>0,04 g
<tb><CEL AL=L>Guanin<SEP>0,01 g
<tb><SEP>Cytosin<SEP>0,03 g
<tb><SEP>Guanosin<SEP>0,02 g
<tb><CEL AL=L>Hypoxanthin<SEP>0,02 g
<tb><SEP>lnosin<SEP>0,1 g
<tb><SEP>Thymin<SEP>0,04 g
<tb><CEL AL=L>Uracil<CEL AL=L>0,02 g
<tb><SEP>Uridin<SEP>0,03 g
<tb><SEP>Xanthin<SEP>0,01 g
<tb><SEP>Orotsäure<SEP>0,001 g
<tb><SEP>cyclisches AMP<SEP>0,04 g
<tb><SEP>Adenosinmonophosphat<SEP>0,01 g
<tb><SEP>Glucose<CEL AL=L>0,45 g
<tb><SEP>Sorbit<SEP>4,0 g
<tb><SEP>Mannit<SEP>0,5 g
<tb><SEP>Bernsteinsäure<CEL AL=L>1,5 g
<tb><SEP>Apfelsäure<SEP>0,01 g
<tb><SEP>Citronensäure<SEP>0,1 g
<tb><SEP>Ethanol<SEP>2,0 ml
<tb><SEP>Glycerin<SEP>0,4 ml
<tb><SEP>Thiamindichlorid<SEP>0,002 g
<tb><SEP>Nikotinsäureamid<CEL AL=L>0,

  01 g
<tb><SEP>Calciumpantothenat<SEP>0,002 g
<tb><SEP>myo-Inosit<SEP>0,05 g
<tb><SEP>Pyridoxol. HCI<SEP>0,6 mg 
<tb><SEP>Biotin<SEP>0,1 mg
<tb><SEP>Tocophenolsuccinat<SEP>0,002 g
<tb><SEP>Magnesiumsulfat<CEL AL=L>0,05 g
<tb><SEP>Magnesiumaspartat<SEP>0,05 g
<tb><SEP>Mangangluconat<SEP>0,01 mg
<tb><CEL AL=L>NaH2PO4H2O<SEP>0,05 g
<tb><SEP>N-Methylglucamin<SEP>0,2 g
<tb><SEP>Natriumlactat, 50%ige Lösung<CEL AL=L>2,0 g 
<tb></TABLE> 


 Konservierungsstoffe 
 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>p-Hydroxybenzoesäuremethylester-Natriumsalz (Nipagin)
 <SEP>0,2 g 
<tb><SEP>Dehydracetsäure<SEP>3,5 g 
<tb></TABLE> 



  Zur Herstellung der Teillösung II werden 2 g Collagel Sol (Firma Stoess) und 2 g partiell dehydratisierte Hefe in 300 ml bidestilliertem Wasser unter starkem Rühren gelöst und über Nacht mit 2 g Aktivkohle behandelt. Nach dem Abnutschen und Sterilfiltrieren wird dieser Ansatz (Teillösung II) mit der Teillösung I vereinigt und vor dem Auffüllen auf 750 ml mit 0,02 mg Tripeptiden Gly-His-Lys, Gly-Pro-His und Gly-Ala-Lys im Verhältnis 1:1:1 und 0,4 g Glutathion versetzt. 


 Ad 4.4 
 



  250 ml des nach Abschnitt 4.2 hergestellten sterilen eiweissfreien Amnion-Extrakts lIa werden mit 725 ml wässrigem synthetischem Amnion-Extrakt gemäss Abschnitt 4.3 nach Einstellung des pH-Wertes auf 6,7 kombiniert und auf 1000 ml aufgefüllt unter Bildung des kombinierten Extrakts lIb. 



  Die analytischen Daten des Extrakts Ilb sind folgende: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>pH-Wert<SEP>6,7
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>1,72% 
<tb><SEP>N-Gehalt (Kjeldahl) (SEP)<> 0,03
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor<SEP>2,3
<tb><CEL AL=L>Aminosäuren<SEP>positiv
<tb><SEP>Peptide<SEP>positiv
<tb><SEP>Proteine<SEP>negativ
<tb><CEL AL=L>Sterilität<SEP>keimfrei 
<tb></TABLE> 


 Ad 4.5 
 



  Ein Wirksamkeitsvergleich der Amnion-Extrakte Ilb und Ila ist Tabelle V zu entnehmen. Zur Demonstration der kosmetischen Effekte in Cremes, in die Ila und Ilb eingearbeitet worden sind, werden die folgenden Versuchsergebnisse angeführt: 



  Der hergestellte Amnion-Extrakt lIb wurde zu 4% in eine Tagescreme der folgenden Zusammensetzung eingearbeitet: Es handelt sich um eine Feuchtigkeitscreme vom \l-in-Wasser-Typ: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb><SEP>Cetylalkohol<SEP>3%
<tb><SEP>Myrj 51<SEP>3%
<tb><SEP>Arlatone 983<CEL CB=3 AL=L>2%
<tb><SEP>Arlamol HD<SEP>2%
<tb><SEP>Miglyol 812<SEP>6%
<tb><CEL AL=L>1,2-Propylenglycol<SEP>3%
<tb><SEP>Glycerin<SEP>0,5%
<tb><SEP>Nipasteril 30K<CEL CB=3 AL=L>0,2%
<tb><SEP>Amnion-Extrakt Ilb<SEP>4%
<tb><SEP>Parfüm-\l<SEP>0,2%
<tb><SEP>Wasser<CEL AL=L>ad<SEP>100% 
<tb></TABLE> 



  Die ölige Phase einschliesslich Miglyol wird auf 75 DEG C erhitzt und homogenisiert. Zur gleichen Zeit werden Propylenglycol, Glycerin und Nipasteril 30 K in Wasser gelöst und auf 75 DEG C erhitzt. 



  Die Emulgierung wird ausgeführt durch Zugabe der Wasserphase zur \lphase unter starkem Rühren. Dann wird bei schwächerem Rühren 5 min auf Temperatur gehalten und dann auf 35 DEG C abgekühlt. Unter Rühren werden Amnion-Extrakt und Parfümöle hinzugefügt. Alle Operationen müssen unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt werden. 



  In entsprechender Weise werden dann Cremes unter Verwendung von Amnion-Extrakt lIa und eine Kontrollcreme ohne Amnion-Extrakt hergestellt und hinsichtlich Feuchthaltevermögen mit der lIb-Creme verglichen: 



  Zur Messung der Hautfeuchtigkeit wurde das Corneometer CM 820 PC (Courage & Khazaka GmbH, Köln) gemäss Fig. 7a verwendet. Das Gerät nutzt die relativ hohe Dielektrizitätskonstante von Wasser. Der Messfühler gemäss Fig. 7b besitzt als Stirnfläche einen flachen Kondensator. 



  Wird der Messkopf auf die Haut gedrückt, gelangt die Hornschicht in den Streubereich des Kondensatorfeldes. Proportional zum Wassergehalt stellt sich eine bestimmte Kapazität des Kondensators ein. Das Gerät wurde gewählt, weil es in Sekunden einen zuverlässigen Messwert liefert. Der Messkopf ist durch die Glasbedampfung so robust, dass er mit Alkohol gereinigt werden kann. Einflüsse durch Verschmutzung sind dadurch nahezu ausgeschlossen. 


 Durchführung der Messungen 
 



  A. 10 weibliche Probanden im Alter von 40 bis 76 Jahren (X = 58,2; s = 13,0) wurden 30 Minuten bei 20 DEG C und 65% relative Luftfeuchte akklimatisiert. 



  B. Zur Bestimmung der Ausgangswerte wurden 3 Messergebnisse von unterschiedlichen Stellen je Testfeld gemittelt. Als Testfelder dienten die volaren Seiten der Unterarme. 



  C. Nach einmaliger Applikation einer verbrauchergerechten Produktmenge wurde im 15-Minuten-Takt die Feuchtigkeit gemessen. Es wurde die Zeit notiert, nach der die Feuchtigkeit wieder auf den Ausgangswert abgesunken war. Während der gesamten Messperiode sassen die Probanden auf speziellen Ruhestühlen im Klimalabor. 



  D. Ein 14-tägiger Anwendungstest folgte. Die Produkte wurden mit der Anweisung ausgegeben, diese verbrauchergerecht über eine Dauer von 14 Tagen morgens und abends auf den zugewiesenen Arealen anzuwenden. 



  E. Nach Ablauf der Anwendungsphase, 12 Stunden nach der letzten Applikation, wurde wiederum 30 Minuten akklimatisiert und die Feuchtigkeit gemessen. 


 Ergebnisse: 
 



  a) Hautfeuchtigkeitsmessungen nach einmaliger Applikation: dargestellt ist die Zeit in Stunden nach dem Auftragen, nachdem die Ausgangsfeuchtigkeit wieder erreicht ist: vgl. Fig. 8 und Tabelle X. 



  Der Unterschied zwischen der Kontrollcreme ohne Zusätze und Cremes mit 4% lla und 4% lIb ist im paarweisen t-Test [Lit. 9] hochsignifikant und mit der lrrtumswahrscheinlichkeit p < 0,01. 



  b) Anwendungstest über 14 Tage: Tabelle XI: 



  Die zweite Messung erfolgte 12 h nach der letzten Applikation. 
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle X
 Hautfeuchtigkeitsmessungen nach einmaliger Applikation der Amnion-Extrakt llb und lIa enthaltenden Cremes 
<tb>Head Col 1: getestet 
<tb>Head Col 2: Hautfeuchtigkeitshaltevermögen in Stunden*
<tb><SEP>Basis (Kontrollcreme)<SEP>4,1
<tb><SEP>Basis + 4% Ilb<SEP>6,0
<tb><SEP>Basis + 4% Ila<SEP>5,8
<tb><SEP>* Zeitangabe in Stunden nach Anwendung der Testcremes, wenn der Anfangsfeuchtigkeitswert wieder erreicht ist. 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle XI
 Hautfeuchtigkeitsmessungen nach 14-tägiger Applikation der Amnion-Extrakt Ilb und lIa enthaltenden Cremes 
<tb>Head Col 1: getestet 
<tb>Head Col 2: Verbesserung der Hautfeuchtigkeit in %
<tb><SEP>Basis (Kontrollcreme)<SEP>9,2
<tb><SEP>Basis + 4% Ilb<CEL AL=L>25,0
<tb><SEP>Basis + 4% Ila<SEP>24,0 
<tb></TABLE> 



  Für den Amnion-Extrakt lIb konnte im Melanin-Inhibitor-Test unter Verwendung von Sarcoma B 16-Zellen eine starke positive Wirkung nachgewiesen werden. Bei Anwendung von 5% Ilb wurde ein "whitening effect " von +++ (whitening degree: white-greyish white) gefunden entsprechend einem authentischen Handelspräparat. [Lit. 19]. 


 Beispiel 5 
 


 Herstellung eines wässrigen Plazenta-Extrakts Illb durch Kombination eines Extrakts aus der Plazenta-Zelllinie JAR mit einem synthetischen Plazentaextrakt nach EP-A-0 552 516. 
 



  5.1. Bereitstellung des Zellmaterials ausgehend von Plazenta-Zelllinie JAR-Plazenta-Zelllinie ATCC HTB 144 



  5.2 Extraktion des Plazentazellmaterials und Aufarbeitung zu eiweissfreiem Plazenta-Extrakt lIla 



  5.3. Herstellung des synthetischen Plazenta-Extrakts analog zu EP-A-0 552 516 



  5.4. Kombination der beiden Plazenta-Extrakte aus 5.2 und 5.3 zu Illb 



  5.5 Testergebnisse mit lIla, Illb und llIc (Plazenta-Extrakt aus frischen Plazenten) 


 Ad 5.1 
 



  Als Ausgangsmaterial zur Herstellung von lllb diente die Zelllinie JAR. Epithelähnliche Morphologie. 



  Medium: RPMI 1640 + 10% FCS. Split: 1: 4-6. 



  Bibliographie: "In Vitro", 6, 398 (1971). 



  Hinterlegung: Paolo Paolucci, Lb. lmmunologia-Citogenetica e Biologia Cellulare, III Clinica Pediatrica Osp. S. Orsola-Malpighi, 40138 Bologna, Italien. 



  Es wurde verfahren wie im Beispiel 1.1 beschrieben. Hinsichtlich Grosskultur wurde nach der Plastik-Film-Kultur-Methode gearbeitet. Die gewonnene Zellmasse wurde bis zur Weiterverarbeitung tiefgefroren. 


 Ad 5.2 
 



  10 kg aufgetautes Zellmaterial aus 5.1. werden in Ethylether suspendiert und 2 Wochen bei -15 DEG C im Kälteraum stehengelassen. Der durch Zentrifugation erhaltene Rohextrakt wird vor der Weiterverarbeitung filtriert, mindestens dreimal intensiv ausgeethert und dann gegen eine 0,3%ige Nipagin enthal tende Lösung dialysiert. Das eiweissfreie Dialysat wird ultrafiltriert (FILTRON< TM >). Ausbeute 35 L: Illa. Die analytischen Daten des erhaltenen Plazenta-Extrakts sind: pH 6,5; Trockenrückstand: 0,9%; N: 0,08%; Aminosäuren: positiv (TLC: 18 Aminosäuren); Proteine: negativ; Peptide: positiv; Atmungssteigerungsfaktor: 1,8; Sterilität: keimfrei. 


 Ad 5.3 
 



  Die Herstellung des synthetischen Plazenta-Extrakts erfolgte nach EP-A-0 552 516. 



  Für den Fall, dass der nach Beispiel 1 von EP-A-0 552 516 hergestellte synthetische Plazenta-Extrakt alkalische Phosphatase enthalten soll, kann pro Liter Endvolumen die Menge von 0,03 g alkalische Plazenta-Phosphatase hinzugefügt werden. Um auch für diesen Fall die BSE-Freiheit zu garantieren, muss die Phosphatase aus Plazenten isoliert werden, die von Herden stammen, in denen kein BSE aufgetreten ist (am besten aus Ländern wie Neuseeland oder Brasilien). 



  Die angegebene Phosphatase-Menge bringt den synthetischen Plazenta-Extrakt auf einen King-Armstrong-Wert von mehr als 180 U. 



  Eine geeignete Vorschrift für die Gewinnung von alkalischer Phosphatase aus Rinderplazenten und die Stabilisierung der Phosphatase durch Magnesiumsalze wie Magnesiumgluconat, Magnesiumacetat und dgl. haben R. Riemschneider und V. Schulz in [Lit. 16] entwickelt. 



  Die Bedeutung der alkalischen Phosphatase für die Kosmetik ist umstritten. Nach einschlägiger Literatur wurde der Gehalt an alkalischer Phosphatase als Kriterium für die lege artis erfolgte Herstellung von Plazenta-Extrakten gewertet, nicht aber als Charakteristikum für die kosmetischen Eigenschaften von Plazenta-Extrakten, die als kosmetische Additive eingesetzt werden [Lit. 17]. 


 Ad 5.4 
 



  30 L des nach 5.2 hergestellten eiweissfreien Plazenta-Extrakts lIla werden mit 90 L wässrigem synthetischem Plazenta-Extrakt aus 5.3. kombiniert, nach pH-Einstellung auf 6,7 bei 0,2 mu m als Extrakt Illb filtriert. 



  Analytische Daten von lllb: pH 6,7; Trockenrückstand: 1%. 



  N: 0,1%; alle weiteren Daten wie lIla. 


 Ad 5.5 
 



  Testergebnisse der Bildanalyse mit Emulsions-Präparaten, welche die Plazenta-Extrakte lIla, Illb und lllc (Plazenta-Extrakt aus frischen Plazenten, hergestellt analog Beispiel 3, Seite 38, Zeilen 5 bis 20) in Mengen von 1%, 1,5% und 2% enthielten. 



  Die Bildanalyse gestattet eine Beurteilung der Beeinflussung der Oberflächenstruktur menschlicher Haut durch die Plazenta-Extrakt enthaltenden Emulsionspräparate. 



  Zur Prüfung wurden 35 Probandinnen im Alter von 39 bis 61 Jahren herabgezogen. Sie wurden angewiesen, 4 Tage vor Beginn des Tests und während der Dauer des Tests keine anderen Kosmetika auf den Testarealen (Unterarme) zu verwenden. Bei jeder Probandin wurden 12 Testfelder auf beiden Unterarmen (6 je Arm) markiert. Die Areale waren so zugewiesen, dass die Präparate gleich häufig bei 35 Probandinnen auf die Testfelder verteilt wurden (gleichförmige Permutation). Neben den Testemulsionen wurde ein Leerfeld mitgeprüft. Nachdem die Leerwerte aller Areale bestimmt worden waren, wendeten die Probandenen die Präparate selbst an in einem Zeitraum von 2 Wochen, morgens und abends. 4 Stunden nach der letzten Anwendung wurde mit der Bildanalyse geprüft. 



  Methode: Nach 45 min Akklimatisierung der Probandinnen bei 22 DEG C und 65% relativer Luftfeuchtigkeit wurden mit einer Siliconmasse bestrichene Objektträger (Schichtdicke 500  mu m) auf die Testareale gedrückt. Die Abdruckmasse härtete innerhalb von 2 min aus. Die gleiche Prozedur wurde nach 2 Wochen Anwendung wiederholt, Die so gewonnenen Abdrücke wurden unter dem Transmissions-Lichtmikroskop bildanalytisch ausgewertet. Das über eine TV-Kamera in den Bildrechner eingezogene Bild wird elektronisch so umgeformt, dass sich die Fläche der im Mikroskop dunkel erscheinenden Profillinien eines Bildes (entsprechend Parameter FA = Flächenareal, Profillinienareal, Profillinienfläche) und deren Länge (als Gesamtlänge) in diesem Bild (Parameter LL = Linienlänge) bestimmen lassen. 



  Diese bildanalytische Methode erfasst relativ makroskopische Oberflächeneigenschaften der Haut, nämlich die Veränderungen der Profillinien, wie sie bei Austrocknungs- und Befeuchtungsvorgängen auftreten. Verarmung des Profils, d.h. Abnahme von FA und LL, deuten auf Hautaustrocknung hin, während bei verbesserter Durchfeuchtung der gegenteilige Effekt auftritt. Das Profil wird reicher an Profillinien.  4 h nach der letzten Anwendung kann für die Produkte ein sich überlagernder "Zuschmiereffekt" ausgeschlossen werden, sodass das tatsächliche Hautprofil zum jeweiligen Zeitpunkt erfasst und gemessen wurde. Die prozentuale Änderung von FA und LL ist in Fig. 9 in Abhängigkeit von der Konzentration der Präparate wiedergegeben.

   Um genügend Daten zu ermitteln, die statistisch auswertbar sind, wurden von jedem Hautabdruck 5 Bilder (an unterschiedlichen Stellen) genommen, sodass genügend FA- und LL-Daten je Restsubstanzkonzentration zum Zeitpunkt "unbehandelt" und auch zum Zeitpunkt "behandelt" ermittelt und gespeichert wurden (für 3 Präparate insgesamt mehr als 6000 Daten). Da die Daten häufig nicht die Bedingungen der Normalverteilung erfüllen, wurden die unbehandelten Daten je Produkt paarweise in einem Wilcoxon-Test auf signifikante Unterschiede hin geprüft. Für die Parameter FA und LL wurden je Produkt für alle 35 Probandinnen Mittelwerte und Standardabweichungen ermittelt. Dann wurde die prozentuale Veränderung von "unbehandelt" gegenüber "behandelt" berechnet und die mit dem Leerwert korrigierten Werte bestimmt.

   Die Formulierungen mit 1,5% und 2% Plazenta-Extrakt Illb zeigen eine deutliche Verbesserung der Hautstruktur. Die FA-Daten sind besser differenziert: (Fig. 9) 



  In analoger Weise ist auch ein Plazenta-Extrakt, ausgehend von einer Rinderplazenten-Zelllinie RPL 10, hergestellt worden, die gezüchtet und hinterlegt ist bei Prof. Dr. Mariano da Rocha Filho, Reitor da UFSM (Universidade de Santa Maria), Faculdade de Medicina, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasilien, und Dr. G. da Rocha Filho, UFSM, Bioquìmica, lstituto Central de Quimica, Santa Maria RS, Brasilien. 


 Beispiel 6 
 


 Herstellung eines wässrigen Thymus-Extrakts durch Kombinieren eines Extrakts aus Zelllinie P1-1A3 (Thymus-Epithelzellen DSM ACC 280) oder einer Zelllinie aus Kalbsthymus (A. Wank) mit einem synthetischen Thymus-Extrakt analog zu EP-A-0 552 516 
 



  6.1. Bereitstellung des Zellmaterials, ausgehend von der Thymus-Zelllinie P1-1A3 bzw. aus der Thymus-Zelllinie Kalb WANK 



  6.2. Extraktion des Thymus-Zellmaterials und Aufarbeitung zu einem eiweissfreien Thymus-Extrakt IVa 



  6.3. Herstellung eines synthetischen Thymus-Extrakts IVb gemäss EP-A-0 552516 



  6.4. Kombination der beiden Thymus-Extrakte aus 6.2 und 6.3 zu dem Extrakt lVc 



  6.5. Testversuche mit dem unter 6.4 erhaltenen Thymus-Extrakt IVc und Vergleich mit synthetischem Thymus-Extrakt lVb und mit Thymus-Extrakt IVd aus frischen Thymus-Drüsen vom Kalb. 


 Ad 6.1 
 



  Als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Thymus-Extrakts lVa diente die Zelllinie P1-1A3, Thymus-Epithelzellen DSM ACC 280. 



  Als Kulturmedium ist vorgeschrieben 80% RPMI + 20% FCS [Einzelheiten sind zu finden in "Blood" 83, 3245-3254 (1994)"]. 



  Zur Zucht der erwähnten Kalbsthymus-Epithelzellen WANK ist in Brasilien im Oktober 1973 von einem 2-2,5 Monate alten Kälbchen ausgegangen worden. Kulturmedium analog P1-1A3. 



  Es wurde verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben. Hinsichtlich der Grosskultur wurde nach der Plastik-Film-Kultur-Methode im Grossmassstab gearbeitet. Das gewonnene Zellmaterial wurde bis zur Weiterverarbeitung tiefgefroren. Ausbeute in 5 Wochen: 25 kg Masse. 



  Im Falle des Arbeitens mit der Kalbsthymus-Zelllinie (bos taurus) WANK konnte völlig analog verfahren werden, Ausbeute 30 kg. Herkunft der genannten Zelllinie: Hwa Sook Chang und A. Wank, Bethesda, Md. 20014, Clarandon, USA, und N. M. Faria, Pc. Carlos Gomez, 10000 S. Paolo, SP, Brasilien. Prof. Dr. Dr. R. Riemschneider, Istituto Central de Quimica da UFSM, Santa Maria, RS, Brasilien. 


 Ad 6.2 
 



  25 kg aufgetautes Zellmaterial aus P1-1A3, nach 6.1 hergestellt, wurden in Ethylether suspendiert und 10 Tage lang bei -15 DEG C in einer Kältezelle stehen gelassen. Der durch Zentrifugieren erhaltene Rohextrakt wird vor der Weiterverarbeitung filtriert, intensiv ausgeethert und dann gegen 0,3% Nipagin (p-Hydroxybenzoesäuremethylester-Natriumsalz) in Wasser dialysiert. Das eiweissfreie Dialysat wird ultrafiltriert (FILTRON< TM >): Ausbeute 30 L. 



  Die analytischen Daten des erhaltenen Thymus-Extrakts IVa sind folgende: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb><SEP>pH<SEP>6,8
<tb><SEP>Trockenrückstand<SEP>2,8%
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>N (Kjeldahl)<SEP>0,6%
<tb><SEP>Aminosäuren (Ninhydrin)<SEP>positiv und TLC
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Peptide (Biuret)<SEP>positiv und TLC
<tb><SEP>Nucleinsäurekomponenten<SEP>positiv TLC (9 Komponenten nachgewiesen)
<tb><SEP>Stoffwechselaktivität
<tb><SEP>(Warburg-Faktor)<CEL CB=3 AL=L>>2,3
<tb><SEP>Schwermetalle<SEP><10 ppm
<tb><SEP>As<SEP><2 ppm
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei
<tb><SEP>Haltbarkeit (SEP)<>2 Jahre
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>akute Toxizität an Mäusen (60 Tiere)
<tb><SEP>DL50<SEP>i.v. > 20 ml/kg
<tb><CEL CB=2 AL=L>DL50<CEL AL=L>i.p. > 30 ml/kg
<tb><SEP>DL50<SEP>p.o. > 25 ml/kg
<tb><SEP>Studie der chronischen Toxizität an Albinoratten (40 Tage):

  <SEP>keine Toxizität
<tb><SEP>Toxizität bei Hunden (10 Beagle-Hunde, 26 Wochen):<SEP>keine Toxizität 
<tb></TABLE> 


 Ad 6.3 
 



  Die Herstellung des synthetischen Thymus-Extrakts IVb erfolgt wie nachstehend beschrieben:
 150 g p-Hydroxybenzoesäuremethylester in 0,7 L Ethanol (94%ig) und
 20 g Benzylalkohol werden in bidestilliertem Wasser auf 20 L gelöst bzw. verdünnt. In der angegebenen Reihenfolge werden unter Rühren und sterilen Bedingungen hinzugegeben: 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>Kontrollgruppe I:<SEP>ungeschädigte Fibroblasten und Epithelzellen
<tb><SEP>Gruppe II:<SEP>mit CHOH geschädigte Fibroblasten und Epithelzellen (reversibel geschädigt),
<tb><SEP>Gruppe III:<SEP>mit CHOH geschädigte und durch Zusatz von synthetischem Serumextrakt behandelte Fibroblasten und Epithelzellen,
<tb><SEP>Gruppe IV:<SEP>mit CHOH geschädigte und durch Zusatz von V. 
<tb></TABLE> 


 Ergebnisse 
 
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle XV 
<tb>Head Col 1: Gruppe 
<tb>Head Col 2 to 5 AL=L:

   Thymidineinbauraten 1 x 10<3>/min 
<tb>Head Col 2 AL=L: Tag 0 
<tb>Head Col 2: Tag 2 
<tb>Head Col 3: Tag 4 
<tb>Head Col 4: Tag 6
<tb><SEP>I Kontrolle<SEP>0<SEP>35<SEP>200<SEP>450
<tb><SEP>II<SEP>0<CEL AL=L>3<SEP>30<SEP>30
<tb><SEP>III<SEP>0<SEP>25<SEP>90<SEP>350
<tb><SEP>IV<SEP>0<CEL AL=L>30<SEP>120<SEP>410 
<tb></TABLE> 



  Die angegebenen Werte repräsentieren Mittelwerte aus jeweils 10 Versuchen. Sie machen deutlich, dass die durch CHOH geschädigte Fibroblastenkultur sowohl mit den Zusätzen in Gruppe III als auch IV hinsichtlich ihrer DNA-Syntheserate der als Kontrolle dienenden Kulturgruppe I angepasst werden konnte. 


 7.5.2. Einfluss von V
 auf das Wachstum und die Metamorphose von Kaulquappen (Xenopus laevis DAUDIN) 
 



  Das Wachstum von Kaulquappen wurde vom Tag 1 (vom Froschpaar abgelegter Laich) bis zum Tag 67 beobachtet und ab Tag 3 gemessen, nachdem die frei schwimmenden Kaulquappen erhalten worden waren. Wassertemperatur 24 DEG C. Am Tag 7 wurden die Kaulquappen in 5 Gruppen aufgeteilt, um einen Test mit Blutextrakt V und 3 Kontrollen durchzuführen. Jede Versuchsgruppe umfasste ca. 100 Kaulquappen. 



  Die Wassermenge wurde gesteigert auf 2,5 L bis zum Tag 21, auf 5 L bis zum Tag 35 und auf 7,5 L pro Gruppe ab Tag 36 bis 67. Belüftung mittels handelsüblicher poröser Aquariensteine. Wasserwechsel der Becken alle 7 Tage. 



  Futter ab Tag 7 Brennnesselpulver, vorher Liquifry. 



  Zugabe von V pro Woche in 3 Portionen, Menge 0,2%. 



  Längenmessungen hier nicht notiert. 



  *Beginn der Metamorphose bei V am Tag 51, bei den Kontrollen erst ab Tag 56: Tabelle XVII. 



  Die Frösche von Xenopus laevis sind Carnivoren und erhalten frische Leber als Futter. 
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle XVI
 Metamorphosen und Frösche, d 51-67 
<tb>Head Col 1: Versuchsgruppe 
<tb>Head Col 2: 1 
<tb>Head Col 3: 2 
<tb>Head Col 4: 3 
<tb>Head Col 5: 4
<tb><SEP>d51<SEP>1 + 0<SEP>1 + 0
<tb><SEP>d53<SEP>1 + 1<SEP>1 + 0
<tb><CEL AL=L>d56<SEP>0 + 2<SEP>1 + 1<SEP>1 + 2
<tb><SEP>d58<SEP>0 + 3<SEP>0 + 1<SEP>1 + 1<CEL AL=L>1 + 2
<tb><SEP>d60<SEP>0 + 3<SEP>0 + 1<SEP>1 + 2<SEP>1 + 2
<tb><SEP>d63<SEP>0 + 4<SEP>1 + 1<SEP>2 + 2<SEP>2 + 4
<tb><SEP>d65<SEP>1 + 3<SEP>1 + 1<SEP>2 + 3<SEP>2 + 4
<tb><CEL AL=L>d67<CEL AL=L>2 + 2<SEP>1 + 0<SEP>2 + 5<SEP>3 + 4
<tb>
 Erste Zahl: Anzahl der Frösche.
 Zweite Zahl: Anzahl der Metamorphosen (die Metamorphose ist beendet, wenn der Schwanz vollständig oder fast vollständig resorbiert worden ist).
 1, 2: Kontrollen. 3, 4:

   Blutextrakt V
  
<tb></TABLE> 


 7.5.3 Bericht über den Einfluss von Blut-Extrakt V
 auf das Wachstum von Guppy-Fischen von Tag 75 bis 100 
 



  Sämtliche eingesetzten Guppy-Fische waren gleich alt. 



  115 Guppys wurden in 5 Gruppen zu je ca. 22 bis 24 in 5-L-Aquarien getestet, Wasser-Temperatur 24,0-24,6 DEG C. 



  Die Zugabe der zu testenden Proben erfolgte jeden zweiten Tag. 



  Menge pro Woche ist in der Tabelle angegeben. 



  Die Ergebnisse des Längenwachstums x in mm nach 100 Tagen (Versuchsbeginn am Tag 75) sind in der Tabelle XVII zusammengestellt. 
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle XVII
 Mittelwerte d<1><0><0> 
<tb>Head Col 1: Gruppe 
<tb>Head Col 2: 1 
<tb>Head Col 3: 2 
<tb>Head Col 4: 3
<tb><SEP>Zugabe Probe/Woche (absolut)<SEP>0 per 1000  Kontrolle<SEP>1 per 1000  V<SEP>1 per 1000 V
<tb><CEL AL=L>Zugabe Probe/Woche (Trockenrückstand)<SEP>0 per 1000  Kontrolle<SEP>0,95 per 1000  V<SEP>0,94 per 1000  V
<tb><SEP>x (mm)<CEL AL=L>19,91<CEL AL=L>23,24<SEP>22,95 
<tb></TABLE> 


 7.5.4. Über die Radikalfängerwirkung von Blut-Extrakt V vgl.

   Fig. 12 und bezüglich der Methodikbeschreibung siehe in dem weiter unten folgenden Beispiel 10. 
 


 Beispiel 8 
 


 Herstellung eines pflanzlichen Extrakts VI aus der Sycamore-Zelllinie (Acer pseudoplatanus L.) (Colla 120) und Verwendung als kosmetisches Additiv im Sinne eines Kollagenersatzes (siehe auch obige Tabelle VI) 
 



  Das Ausgangsmaterial ist eine Sycamore-Zellkultur (Herkunft: Botanisches Institut der UFSM, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasilien. Die Sycamore-Zellkultur wurde abgeleitet vom Kallusgewebe, das ursprünglich von Explantaten sekundärer Kambialgewebe des Sycamore-Baumes stammt). 



  Die Kulturen von Sycamore (Acer pseudoplatanus L.) wurden in Suspension gezüchtet, wie es Stoddart, Barrett und Northcode in "Biochemical Journal", 102, 194 (1967), beschrieben haben. Das Gewebe in Suspension wurde geerntet durch Zentrifugation und mit Wasser gewaschen. 



  Das Kulturmedium war ein modifiziertes White's Medium, das in g/L folgende Bestandteile enthielt: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>Ca(NO3)2<SEP>0,2 g
<tb><SEP>MgSO4.7H2O<SEP>0,36 g
<tb><SEP>KCI<SEP>0,055 g
<tb><CEL AL=L>KNO3<SEP>0,08 g
<tb><SEP>Na2SO4<SEP>0,2 g
<tb><SEP>MnSO4.4H2O<SEP>0,009
<tb><CEL AL=L>ZnSO4.7H2O<CEL AL=L>0,003
<tb><SEP>H3BO3<SEP>0,003
<tb><SEP>KJ<SEP>0,0015
<tb><SEP>NaH2PO4.H2O<CEL AL=L>0,0165
<tb><CEL AL=L>Fe2(SO4)3.6H2O<SEP>0,0025
<tb><SEP>Thiamin.HCI:<SEP>0,0001,
<tb><SEP>Ca-Pantothenat<CEL AL=L>0,0001
<tb><SEP>Glycin<SEP>0,003
<tb><SEP>Cystein-HCI<SEP>0,001 g
<tb><SEP>Saccharose<SEP>20,0 g
<tb><SEP>dazu: Kokosnussmilch 20%
 (deproteinisiert [15 min 15 at] und sterilisiert). 
<tb></TABLE> 



  Zur weiteren Extraktherstellung sei zweckmässig auf das Schema in obiger Tabelle VI verwiesen. 



  Die Zellvermehrung erfolgt zunächst mittels Rotary-Shaker-Technik, dann in einer Anzahl von Bekkino-Glas-Suspensionskultur-Flaschen von 10 L, im Grossmassstab dann in Fermentern (1000-4000 L) bzw. Rohrschlangen-Kultivatoren (1000-2000 L). 



  Das geerntete Zellmaterial wird getrocknet und in Chargen von 10 kg Wasser suspendiert und in einem Kilowatt-Ultraschall-Generator, der eine starke Oszillation liefert, bearbeitet. 



  Der gewonnene Zentrifugenrückstand enthält das gewünschte Zellwandmaterial, das als Basis für die folgenden enzymatischen und chemischen Hydrolyse-Prozesse dient. 



  Nach 4-tägiger Behandlung mit 10% Cellulase bei 35 DEG C wird zentrifugiert: Rückstand I wird bei 4 DEG C für die weitere Behandlung gelagert. Die überstehende Lösung I wird mit Schwefelsäure auf eine Konzentration von 2 N gebracht und zur partiellen Hydrolyse 4 Tage bei 15 at autoklaviert. Die Trennung führt zu Rückstand II (gelagert wie 1 bei 4 DEG C) und Lösung II, die auf pH 5,3 gebracht wird. Arbeitstemperaturen bei 4 bis 10 DEG C. 



  Die Rückstände I und II werden partiell im Autoklaven in 3 N HCI partiell hydrolysiert und dann mit dem Hydrolysat II (aus I) vereinigt und dialysiert. 



  Konzentrierung des Dialysats im Vakuum bei 20 DEG C auf ca. 10% Trockenrückstand, Einstellen auf pH 5,3. Sterilfiltration durch ein 0,2- mu m-Millipore< TM >-Filter. 



  Das resultierende proteinfreie kosmetische Additiv VI (Colla 120) weist die folgenden analytischen Kennzahlen auf: 



  pH: 5,3, Trockenrückstand: 10,5%; N: 0,95%; Aminosäuren: 4,5% (nach Hydrolyse); Hydroxyprolin: 0,3%; Kohlenhydrate: 5,2% (nach Hydrolyse); Stoffwechselaktivität: 1,8 (Warburg-Faktor): Sterilität: keimfrei; Konservierungsmittel: 0,3% Phenonip-Proteine: proteinfrei. 



  Gegebenenfalls kann durch Zusatz von 5% Mannit und 10% Panthenol der Trockenrückstand auf 25% erhöht werden, wodurch sich die kosmetischen Effekte des Feuchthaltevermögens der Haut und die Radikalfängerwirkung von Extrakt VI verbessern lassen (vgl. auch Fig. 12). 



  Der Sycamore-Extrakt VI mit 10,5% Trockenrückstand, im Folgenden "Colla 120" genannt, wurde in einer Reihe von kosmetischen Formulierungen eingesetzt und mit einem Kollagen-Präparat verglichen.
 1) Hautfeuchtigkeitsmessungen nach einmaliger und nach 14-tägiger Applikation von VI enthaltender Creme (Corneometer)
 2) Hautrauigkeitsmessungen nach der modifizierten PADBERG-Methode
 3) Einfluss einer VI enthaltenden \l-Wasser-Emulsion auf die Hauttemperatur von Probanden mit trockener Haut
 4) Hautkonditionierung durch VI enthaltende Formulierungen
 5) Patch-Test zur Prüfung auf allergologische Wirkung. 


 Ad 1) 
 



  Colla 120 (VI) wurde zu 5% in die folgende Rezeptur eingearbeitet: 



  Phase I Schmelzen auf 70 DEG C: C: 10% Cetiol V, 10% Lanette N; 5% Miglyol 812,2% Adeps lanae; 0,3% Phenonip, 



  Phase II auf ca. 70 DEG C erwärmen, enthaltend: 0,3% Phenonip; 5% Karion fl., Karion F; 62,3% Wasser,
 Phase II in Phase I einrühren, weiterrühren, bis die Mischung auf 32 DEG C abgekühlt ist, dann Colla 120 5% (VI) und Parfümöle einrühren und homogenisieren. 



  Analog eine Creme mit 5% Kollagen (1%ig) herstellen, ebenso eine Kontrollcreme ohne Zusatz eines Additivs. 



  Die Messungen, durchgeführt analog Beispiel 4.5, ergaben für das Feuchtigkeitshaltevermögen: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Head Col 1: nach einmaliger Applikation getestet 
<tb>Head Col 2: Hautfeuchtigkeitshaltevermögen in Stunden
<tb><SEP>Basis (Kontrollcreme)<SEP>4,5
<tb><SEP>Basis + 5% VI Colla 120<SEP>6,5
<tb><SEP>Basis + 5% Kollagen<SEP>6,3 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Head Col 1: nach 14-tägiger Applikation getestet 
<tb>Head Col 2: Verbesserung der Hautfeuchtigkeit in %
<tb><SEP>Basis (Kontrollcreme)<SEP>8,4
<tb><SEP>Basis + Colla 120 VI 5%<SEP>22
<tb><SEP>Basis + Kollagen 5%<SEP>19 
<tb></TABLE> 


 Ad 2) 
 


 Beschreibung der Padberg-Methode 
 


 Padbergmethode: 
 



  Im Padberg-Test wird die Rauigkeit einer Haut anhand derjenigen Menge Methylenblau bewertet, die in Abhängigkeit von den Hautkonditionen von der Haut absorbiert wird. Studien mit "subjektiv rauer Haut" bzw. mit "durch Tenside geschädigter Haut" ergaben, dass die absorbierte Methylenblau-Menge der Hautrauigkeit proportional ist. Gute Haut bzw. gut gepflegte Haut absorbiert demgegenüber nur eine geringe Menge Methylenblau. 



  Für den Test wurden 10 Probandinnen im Alter von 40 bis 66 Jahren herangezogen. Die Versuchspersonen stellten sich freiwillig für diesen Test zur Verfügung. Sie wurden angewiesen, drei Tage vor Beginn des Tests und während der gesamten Testdauer keine anderen Kosmetika auf den Testarealen (der Unterarme) zu verwenden. Bei jeder Probandin wurden sechs Testfelder auf beiden Unterarm-Innenseiten (also drei je Arm) markiert. Die Areale waren so zugewiesen, dass die Produkte gleich häufig bei den zehn Probandinnen auf die sechs Testfelder verteilt waren (gleichförmige Permutation). Neben den fünf Emulsionen wurde ein Leerfeld mitgeprüft. Nachdem die Leerwerte aller Areale nach beiden Methoden bestimmt waren, wendeten die Probandinnen die Produkte selbst zu Hause in einem Zeitraum von 14 Tagen morgens und abends an.

   Danach wurde 4 Stunden nach der letzten Anwendung erneut nach Padberg geprüft. 



  Zur Durchführung des Padberg-Tests werden folgende Schritte angewendet:
 (1) Markierung der Testfelder
 (2) Vorbehandlung der Testfelder mit einer 1%igen Lösung eines nichtionischen Tensids in Wasser
 (3) Nachwaschen mit Leitungswasser von 35 DEG C
 (4) Abtupfen der Testfelder
 (5) nach 30-minütigem Akklimatisieren der Probanden bei 22 DEG C und 60% relativer Luftfeuchte
 (6) Auftragen von 20  mu l Farblösung (die Farblösung besteht aus 0,5%igem Methylenblau (20%) und 80% einer 1%igen Lösung eines nichtionischen Tensids) und 30 s verteilen lassen
 (7) Antrocknenlassen der Farbe für 30 s
 (8) Entfernen des Farbüberschusses mit 2 ml einer 0,25%igen nichtionischen Tensidlösung
 (9) Extraktion mit 2 x 2 ml einer Mischung aus:

  
 2,0% Natriumlaurylsulfat
 48,0% Wasser
 50,0% lsopropylalkohol
 jeweils nach 60 s
 (10) Messen des Eluats im Spektralphotometer bei 660 nm gegen Luft
 (11) Ergebnis = Extinktion Haut (Ausgangswert)
 (12) es erfolgte nun die Ausgabe der Produkte mit der Anweisung, diese 14 Tage lang morgens und abends auf den vorgesehenen markierten Stellen aufzutragen. 



  Zuvor wurde sichergestellt, dass 3 Tage vor Beginn der Prüfung und während der gesamten Prüfdauer keine anderen kosmetischen Produkte auf den Testrealen angewendet wurden.
 (13) Wiederholung der Schritte (1) bis (9) am 15. Tag. Die letzte Anwendung vor dem Test erfolgte 4 Stunden zuvor.
 Ergebnis = Extinktion nach der Anwendung
 (14) 
EMI81.1
 


 Diskussion der Padberg-Methode: 
 



  Die Padberg-Methode liefert Daten über die Adsorption von Methylenblau auf der Haut. Je nach Hautzustand stehen dem Farbstoff mehr oder weniger Bindungsstellen auf der Haut zur Verfügung. Jahrelange Erfahrungen haben immer wieder bestätigt, dass subjektiv "raue" Haut oder beispielsweise durch Detergentien geschädigte Haut mehr Bindungsstellen für Methylenblau aufweist, und zwar in Abhängigkeit vom Schädigungsgrad. Umgekehrt zeigt eine mit Cremes verbesserte Haut eine Abnahme der Bindungsstellen, und proportional zur Anwendungsdauer. Die Differenzierung bei verschiedenen Produkten ist sehr gut und verlässlich; auch hier wird stets eine Korrelierung mit der subjektiven Begutachtung erzielt. Bezüglich weiterer Einzelheiten siehe [Lit. 10]. 


 Ergebnisse des Padberg-Tests: 
 



  Die Fotometer-Werte, ausgedrückt in Prozent des Wertes bei behandelter Haut und bezogen auf den Ausgangszustand, sind in der folgenden Tabelle XVIII zusammengefasst. In der Tabelle sind auch die errechneten Mittelwerte angegeben. 



  Die Ergebnisse zeigen, dass mit den Testemulsionen eine Glättung der Haut erzielbar ist. 
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle XVIII
 Rauigkeitstest nach der Padberg-Methode mit Wasser/\I-Emulsionen mit und ohne Zusatz von Tripeptiden (Anwendungsdauer 14 Tage) 
<tb>Head Col 1: Alter der Probanden 
<tb>Head Col 2: Plazebo 
<tb>Head Col 3 to 4 AL=L:

   Wasser-\l-Emulsionen der Erfindung Colla 120 (VI)
<tb><SEP>46<SEP>81,0<CEL AL=L>50,1<SEP>60,0
<tb><SEP>41<SEP>91,0<SEP>64,4<SEP>64,9
<tb><SEP>47<SEP>80,0<CEL AL=L>76,5<CEL AL=L>40,0
<tb><SEP>50<SEP>76,6<SEP>33,0<SEP>41,2
<tb><SEP>51<SEP>75,3<SEP>56,8<CEL AL=L>70,0
<tb><SEP>40<SEP>95,0<SEP>37,5<SEP>40,5
<tb><SEP>65<SEP>89,0<SEP>72,5<CEL AL=L>68,0
<tb><SEP>66<SEP>97,8<SEP>57,8<SEP>55,0
<tb><SEP>62<SEP>92,6<SEP>70,0<CEL AL=L>60,0
<tb><SEP>45<SEP>76,9<SEP>60,7<SEP>62,7
<tb><SEP>Mittelwerte:<SEP>85,6<SEP>58,2<CEL AL=L>56,4 
<tb></TABLE> 


 Ad 3) 
 


 Einfluss einer Colla-120-Sycamore-Extrakt (VI) (hergestellt nach Beispiel 8) \l/Wasser-Emulsion auf die Hauttemperatur von Probanden 
 



  Der Einfluss der Emulsion auf die Hauttemperatur wurde an 30 Probandinnen im Alter von 40 bis 60 Jahren mit trockener Haut getestet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XIX angegeben. 
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle XIX 
<tb>Head Col 1: Temperatur ( DEG C)
 vor Applikation 
<tb>Head Col 2: \l-Wasser-Emulsion 
<tb>Head Col 3: Temperatur ( DEG C)
 nach Applikation 
<tb>Head Col 4:  DELTA T
<tb><SEP>30,6-33,0<SEP>Colla 120 (VI)<SEP>32,7-32,9<SEP>0,2
<tb><CEL AL=L>30,5-34,0<CEL AL=L>Kontrollemulsion<SEP>30,5-33,6<SEP>3,1 
<tb></TABLE> 



  Ohne Colla 120 (VI) konnte keine merkliche Stabilisierung (kleiner  DELTA T-Wert) der Hauttemperatur festgestellt werden, daher hoher  DELTA T-Wert bei Verwendung der Kontrollemulsion. 


 Ad 4) 
 



  Nach folgender Vorschrift wurde eine Lanolin enthaltende Handcreme formuliert, in der Colla 120 (VI) inkorporiert wurde. Die End-Zusammensetzung der Cremeformulierung war folgende: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb><SEP>lösliches Lanolinderivat<SEP>1,0 Gew.-%
<tb><SEP>acetylierte Lanolinalkohole<SEP>5,0 Gew.-%
<tb><SEP>flüssiger Multisterol-Extrakt<SEP>5,0 Gew.-%
<tb><SEP>Vaseline<SEP>5,0 Gew.-%
<tb><CEL AL=L>Polyvinylalkohol-Gel<SEP>0,75 Gew.-%
<tb><SEP>10%iges NaOH<SEP>2,25 Gew.-%
<tb><SEP>Colla 120 (VI)<SEP>6,0 Gew.-%
<tb><SEP>ethoxylierte Fettamine<SEP>3,75 Gew.-%
<tb><SEP>Parfümöl<CEL CB=3 AL=L>0,3 Gew.-%
<tb><SEP>Wasser, bidest.<SEP>ad<SEP>100,00 Gew. -% 
<tb></TABLE> 



  Zur Herstellung dieser Handcreme wurden die Fettphasen-Bestandteile und Vaseline auf ca. 75 DEG C erwärmt. Gleichzeitig wurde das PVA-Gel in heissem Wasser von ca. 80 DEG C dispergiert und allmählich gelöst. Zur letzteren Dispersion wurden das ethoxylierte Fettamin (mit ca. 25 EO-Einheiten) und gegebenenfalls noch ein Emulgator gegeben, wonach die vorher angesetzte erwärmte Fettphase darin emulgiert wurde. Nach 5 Minuten Rühren bei der Mischungstemperatur wurde auf 60 DEG C abgekühlt, dann mit 10%iger Natronlauge versetzt und weiter bis auf unter 40 DEG C gekühlt. Unter langsamem Rühren wurden dann 6% Colla 120 (VI) sowie das Parfüm zugesetzt. Der Ansatz wurde gut homogenisiert. Die Handcreme war stabil konfektioniert und zeigte eine verbessernde Hautkonditionierung, verglichen mit einem Ansatz ohne Colla 120 (VI). 



  Aus der folgenden Zusammensetzung wurde ein Baby-Shampoo hergestellt: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>Sulfobernsteinsäure-halbester-Natriumsalz, verdünnt (Steinapol SBFA 30 und Steinapol SBZ)
 
 <SEP>700 g
<tb><SEP>Alkylethersulfat<SEP>10 g
<tb><SEP>Colla 120 (VI)<SEP>50 g
<tb><SEP>Gummi arabicum<SEP>5 g
<tb><SEP>Oberflächenfett<SEP>10 g
<tb><SEP>Wasser<SEP>275 g
<tb><CEL AL=L>Kaliumsorbat<CEL AL=L>1,5 g
<tb><SEP>Manganacetat<SEP>1,0 g 
<tb></TABLE> 



  Der pH-Wert der Mischung wurde auf einen Endwert von 6,5 eingestellt. 



  Eine Creme-Grundlage wurde wie folgt compoundiert: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb><SEP>Vaseline<SEP>40 Gew.-%
<tb><SEP>Cetanol<SEP>18 Gew.-%
<tb><CEL AL=L>Sorbitansesquioleat<CEL CB=3 AL=L>5 Gew.-%
<tb><SEP>Polyoxyethylenlaurylether<SEP>0,5 Gew.-%
<tb><SEP>p-Hydroxyalkylbenzoat<CEL CB=3 AL=L>0,2 Gew.-%
<tb><SEP>Colla 120 (VI)<SEP>5,0 Gew.-%
<tb><SEP>Wasser<SEP>ad<SEP>100,00 Gew. -% 
<tb></TABLE> 


 Ad 5) 
 


 Klinisch-allergologische Prüfung von Colla 120 (Sycamore-Extrakt VI) im Patch-Test am Menschen 
 



  Zusammenfassung: Colla 120 ist im Patch-Test auf allergisierendes Potenzial geprüft worden. In einer präklinischen Prüfung wurde die lokale Verträglichkeit abgeklärt. Diese Prüfung zeigte keine Bedenken für den Einsatz des Produkts in einer klinischen Prüfung am Menschen (vgl. auch die obige Tabelle II). 



  Die klinische Prüfung im Patch-Test ergab für die Frage des Einsatzes von Colla 120 im Gesicht des Menschen vom allergologischen Standpunkt keine Bedenken, da bei den 60 geprüften Probanden dahingehend keinerlei Reaktion auftrat. 



  Testmethode: Diese wurde durchgeführt unter den Bedingungen eines epikutanen Läppchentests. Eine kleine Menge Testsubstanz wird auf hygroskopische Testplättchen aufgebracht und mittels Heftpflaster auf der Rückenhaut der Patienten, die wegen des Verdachts auf das Vorliegen einer Kontaktallergie im allergologischen Labor der Klinik getestet wurden, befestigt. Nach 24 Stunden wurden die mit der Testsubstanz beschickten Plättchen entfernt und die örtliche Hautreaktion an der Anliegestelle der Testplättchen eine halbe Stunde nach Abnahme der Testpflaster abgelesen. Weitere Ablesungen erfolgten nach 48 h und 72 h: Tabelle XIX 



  Bewertung: 0 = negativ, (-) = fraglich positiv, + = schwach positiv, ++ = positiv, +++ = stark positiv 



  Die Prüfung erfolgt unter einer extremen Belastung, die unter normalen Bedingungen nicht gegeben ist. 
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle XX 
<tb>Head Col 1: Patient Nr. 
<tb>Head Col 2: Testreaktion auf andere Stoffe 
<tb>Head Col 3 to 5 AL=L: Reaktionen von Colla 120 
<tb>Head Col 3 AL=L: nach 24 
<tb>Head Col 3: 48 
<tb>Head Col 4:

   72 h
<tb><SEP>1<SEP>p-Phenylendiamin<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>2<CEL AL=L>Kaliumbichromat<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>3<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>4<CEL CB=3 AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>5<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>6<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>7<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>8<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>9<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>10<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>11<CEL AL=L>Zimtaldehyd<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>12<SEP>Kolophonium<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>13<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>14<SEP>Nickelsulfat<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>15<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>16<SEP>Epoxydharz<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>17<SEP>Eucerin<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>18<SEP>Perubalsam<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>19<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>20<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>21<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>22<SEP>Formaldehyd<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL 

  AL=L>23<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>24<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>25<CEL AL=L>Kobaltchlorid<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>26<SEP>Chloramphenocol<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>27<SEP>Quecksilber<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>28<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>29<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>30<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>31<SEP>Lanette N<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>32<SEP>Bufexamac<SEP>0<SEP>0<CEL AL=L>0
<tb><SEP>33<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>34<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>35<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>36<SEP>Formaldehyd<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>37<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>38<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>39<CEL CB=3 AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>40<SEP>Hydroxycitronellal<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>41<CEL AL=L>Abitol<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>42<SEP>Kolophonium<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><CEL AL=L>43<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>44<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>45<CEL CB=3 

  AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>46<SEP>Formaldehyd<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>47<CEL CB=3 AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>48<SEP>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>49<SEP>Clotriazol<CEL AL=L>0<SEP>0<SEP>0
<tb><SEP>50-50<SEP>0<SEP>0<SEP>0 
<tb></TABLE> 



  Ergebnisse: Colla 120 wurde von allen 60 Patienten im Epikutantest reaktionslos vertragen bei unverdünnter Anwendung. 



  Wie aus dem Testprotokoll hervorgeht, erwiesen sich 20 der 60 getesteten Personen als kontaktallergisch gegenüber verschiedenen Allergenen des Alltags und des Berufslebens. 


 Beispiel 9 
 


 Herstellung eines proteinfreien Hefeextraktes VII aus partiell dehydratisierten Zellen von Saccharomyces cerevisiae Hansen 
 



  10 kg einer ca. 20%igen Suspension von frisch gezüchteter Hefe Saccharomyces cerevisiae in Wasser (sog. Hefemilch) werden mit 200 g stoffwechselaktivem Extrakt VIl (als Anlasser) und mit 150 g einer Mischung aus 114 g NaCl, 20 g MgSO4.7H2O, 1 g Aktivator und 15 g Rohrzucker unter schwachem Rühren in einer Teigmaschine rasch auf 65 DEG C erhitzt und nach ca. 100 Minuten auf 15 DEG C abgekühlt: VII-Rohprodukt. In der Kälte wird gegen eine 0,2%ige p-Hydroxybenzoesäuremethylester-Natriumsalz-Lösung dialysiert. Die Wassermenge wird so gewählt, dass der Feststoffgehalt des Dialysats bei 4% liegt. 



  Nach Desodorierung mit Aktivkohle und Sterilfiltration des Dialysats wird ein eiweissfreier Hefeextrakt VIl erhalten, der folgende analytischen Kennzahlen (a) und Eigenschaften (b) aufweist: 


 a) Kennzahlen: 
 



  pH 6,5; N: 0,4%; Trockenrückstand: 4,2%; Aminosäuren: positiv, TLC: Peptide: positiv (Biuret); 



  Nucleinsäure-Komponenten: TLC; Proteinnachweis; negativ. 



  Schwermetalle: < 10 ppm: As < 2 ppm; Sterilität: keimfrei. 


 b) Eigenschaften: 
 
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle XXI
<tb><SEP>WARBURG-Test
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor (Rattenleber-Homogenat) (S. 41-44)<SEP>4,07
<tb><SEP>Gärungssteigerungs-Faktor: Fig. 11<SEP>3,9
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Schwimmtest Maus:
<tb><SEP>Erhöhung der Überlebenszeit bis zum Ertrinken<SEP>von 10 auf 13 min
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Padberg-Test (S. 62-65)<SEP>60 (83)*
<tb><SEP>Wachstumstests:
<tb><SEP>Guppyfische in mm Länge nach 100 Tagen, wenn über 25 Tage Extraktgaben<SEP>24 (17)*
<tb><SEP>Kaulquappen (Xenopus laevis D.) Beginn der Metamorphose vorverlegt:

  
 Tage gegenüber Kontrollen<SEP>16 Tage
<tb><SEP>Corneometer-Test (Methode S. 50-52)
<tb><CEL CB=2 AL=L>Verbesserung des Hautfeuchtigkeitshaltevermögens nach 14-tägiger Anwendung<SEP>22% (8%)
<tb><SEP>Radikalfänger-Test (Fig. 12 + S. 98-100)<SEP>76%
<tb>
 * Kontrollen ohne Zusatz von Extrakt VII in Klammern
  
<tb></TABLE> 



  Die im Dialyseschlauch verbleibende Zellmasse inkl. Eiweiss zeigt ebenfalls hohen Wachstumseffekt bei Kaulquappen, Fischen und Nutztieren und eignet sich als umweltverträglicher Futtermittelzusatzstoff, wie auch das gesamte nicht dialysierte Produkt aus Beispiel 9: VII-Rohprodukt. 


 Bestimmung des Gärungssteigerungsfaktors des oben genannten Hefeextrakt-Dialysats VII: 
 



  Die Messung des Gärungssteigerungsfaktors erfolgt in einem Warburggefäss bestimmten Volumens, das mit einer aus 2,5 g Glucose, 0,4 g Caseinpepton, 50 Mg MgSO4, 7 H2O und 50 mg Bäckerhefe ad 50 ml Leitungswasser bestehenden Lösung beschickt wird. Das Gefäss wird dann mit einer bestimmten Menge der Testpräparation entsprechend einem Füllplan gefüllt. Die bei 30 DEG C abgegebene CO2-Menge wird in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt, auf Normalbedingungen umgerechnet und durch die standardisierte CO2-Menge dividiert, die im Kontrollversuch unter ansonsten gleichen Bedingungen, jedoch ohne Testpräparation, erzeugt wird. 



  Die messbare Gärungsaktivierung ist für die erfindungsgemässen Präparationen bemerkenswert: Faktor 3,8. 



  Fig. 11 zeigt den Verlauf der CO2-Bildung im Warburg-Versuch in Abhängigkeit von der Zeit, wobei zwei Gruppen von Vergleichsversuchen einbezogen sind, d.h. die präparationsfreie Testlösung, die den Verlauf der konventionellen Gärung kennzeichnet, und die hefefreie Testlösung mit dem Präparat, die keine nennenswerte Beeinflussung der Gärung ergibt. 



  Die Zusammensetzung der Lösungen war wie folgt: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>Lösung l:<SEP>50 ml Grundmedium + 50 mg Bäckerhefe
<tb><SEP>Lösung II:<SEP>10 ml Lösung 1 + 50  mu l Extrakt VII
<tb><SEP>Lösung III:<SEP>10 ml Lösung 1 + 50  mu l Extrakt VII
<tb><SEP>Lösung lV:<SEP>10 ml Grundmedium + 50  mu l Extrakt VII
<tb><SEP>Lösung V:<SEP>10 ml Grundmedium + 50  mu l Extrakt VII 
<tb></TABLE> 


 Beispiel 10 
 


 Kombination eines stoffwechselaktiven eiweissfreien tierischen Extrakts mit einem stoffwechselaktiven eiweissfreien pflanzlichen Extrakt, und zwar Kombination von Blutextrakt V (Beispiel 7) mit Hefeextrakt VII (Beispiel 9) unter Bildung von Extrakt VIll 
 



  Blutextrakt V und Hefeextrakt VII werden im Verhältnis 3:10 vermischt und nach pH-Einstellung auf 6,7 sterilfiltriert (0,1  mu m-Filter). Die analytischen Kennzahlen und Eigenschaften sind folgende: Extrakt VIII 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb><SEP>pH<SEP>6,7
<tb><SEP>N<SEP>0,34%
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Trockenrückstand<SEP>4,2%
<tb><SEP>Atmungssteigerungsfaktor (Warburg)<SEP>4,07
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Aminosäuren<SEP>positiv
<tb><SEP>Peptide<SEP>positiv
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Nucleinsäurekomponenten<SEP>positiv
<tb><SEP>Sterilität<SEP>keimfrei
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Pyrogenität<SEP>pyrogenfrei
<tb><SEP>Vorverlegung der Metamorphose von Xenopus laevis<CEL CB=3 AL=L>16 Tage
<tb><SEP>Kompensation KCN-geschädigter Zellatmung von Leberhomogenat<SEP>siehe Beschreibung ab S. 91
<tb><SEP>Padberg-Test<SEP>59 (80)
<tb><SEP>Corneometer-Test:

  
<tb><CEL CB=2 AL=L>Hautfeuchtigkeitshaltevermögen<SEP>24% Verbesserung 
<tb></TABLE> 



  Der im Folgenden beschriebene Test zeigt, dass der hier untersuchte Extrakt VIll eine durch KCN geschädigte Zellatmung von Rattenleberhomogenat z.T. kompensieren kann: 



  Im Warburg-Modell wurde der Einfluss des Extrakts VIll auf ein mit KCN vergiftetes Leberhomogenat geprüft: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb><SEP>1.1<SEP>Leberhomogenat mit dem Atmungsfaktor<SEP>F = 1,00
<tb><SEP>wird durch einen KCN-Gehalt von 3 nM (End-Konzentration im Ansatz) in seiner
 Atmungsfähigkeit gemindert auf<SEP>F = 0,75
<tb><SEP>1.2<SEP>Durch Zusatz des atmungssteigernden Extrakts VIll mit dem Wert<SEP>F = 4,07
<tb><SEP>kann die Zellatmung des teilweise durch KCN vergifteten Leberhomogenats von<SEP>F = 0,75
<tb><SEP>angehoben werden auf den Wert<SEP>F = 3,22 
<tb></TABLE> 


 Versuchsdurchführung: (vgl. auch Atmungssteigerungs-Test auf Seite 41-44 Lösungen ebenda) 
 



  Kegelförmige Warburg-Gefässe mit einem Zylindereinsatz (ZE) und einem Seitenarm (SA) und einem Volumen von ca. 13 ml werden gemäss Füllplan gefüllt (Angaben in ml): Tabelle XXII. 



   
<tb><TABLE> Columns=11 Tabelle XXII 
<tb>Head Col 2 to 3 AL=L: Thermobarometer TB 
<tb>Head Col 4 to 5 AL=L: Atmung
 normal 
<tb>Head Col 6 to 7 AL=L: Atmung
 + VIII 
<tb>Head Col 8 to 9 AL=L: Atmung
 + KCN 
<tb>Head Col 10 to 11 AL=L: Atmung
 + KCN + VIll 
<tb>Head Col 2 AL=L: 1 
<tb>Head Col 1: 2 
<tb>Head Col 2: 3 
<tb>Head Col 3: 4 
<tb>Head Col 4: 5 
<tb>Head Col 5: 6 
<tb>Head Col 6: 7 
<tb>Head Col 7: 8 
<tb>Head Col 8: 9 
<tb>Head Col 9:

   10
<tb><SEP>Puffer [HR]<SEP>3,00<SEP>3,00<SEP>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50<CEL AL=L>1,50<SEP>1,40<SEP>1,40<SEP>1,40<SEP>1,40
<tb><SEP>Puffer [SA]<SEP>0,25<SEP>0,25<CEL AL=L>0,25<SEP>0,25<SEP>0,25<SEP>0,25
<tb><SEP>KCN [HR]<SEP>0,10<SEP>0,10<SEP>0,10<CEL AL=L>0,10
<tb><SEP>6 N KOH (ZE)<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<CEL AL=L>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20<SEP>0,20
<tb><SEP>VIll<SEP>0,25<SEP>025<SEP>0,25<CEL AL=L>0,25
<tb><SEP>Leberhomogenat [HR]<SEP>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50<CEL AL=L>1,50<SEP>1,50<SEP>1,50
<tb><SEP>Messwerte<SEP>siehe S. 94-97
<tb>
 * KCN-Konzentration 3,0 nM im Gemisch (Ansatz)
  
<tb></TABLE> 



  Die Lösungen werden in der angegebenen Reihenfolge einpipettiert. Zur Erhöhung der KOH-Oberfläche werden in die Zylindereinsätze gefaltete Filterstreifen eingesetzt. Sofort nach Beendigung der Füllung werden die Gefässe mit den passenden Schlauchventilstopfen am Seitenarmansatz dicht verschlossen, die Gefässe an den Manometern befestigt und mit Klammern oder Paketgummis gesichert. Die Manometer werden bei geöffneten Hähnen in die auf 37 DEG C temperierte Apparatur eingehängt und 60 Minuten geschüttelt, um die Reaktionslösung zu temperieren und die anfänglich sehr schnelle Atmung etwas abklingen zu lassen.

   Danach werden die rechten Manometerschenkel mithilfe des Quetschhahns auf die Marke "15" eingestellt, die Differenz der linken Schenkel zu "15" notiert, die Manometerhähne geschlossen und die Lösungen aus den Seitenarmen durch Kippen in die Haupträume überführt (0-Zeit). Nach je 20 Minuten wird die Schüttelvorrichtung abgestellt, die rechten Manometerschenkel auf "15" eingestellt (V = konst.) und die Differenz der linken Schenkel zu "15" (Druckdifferenz h bei konstantem Volumen und konstanter Temperatur) notiert. 



  Der Versuch läuft bis zu einer Messdauer von 100 Minuten. Nach der letzten Ablesung werden die Manometerhähne geöffnet und die Volumina der Gefässe und der dazugehörigen Manometer notiert. 



  Die für die Druckdifferenzen als Folge des Sauerstoffverbrauchs gemessenen h-Werte in mm sind in den folgenden Versuchsprotokollen a-d zusammengefasst. 


 Auswertung 
 



  Zunächst werden die Gefässe 3 bis 10 min den Thermobarometern (Gefäss 1/2) abgeglichen, um Luftdruck- und Temperaturschwankungen während des Versuchs auszugleichen. Danach werden die Gefässkonstanten für O2 der Gläser 3 bis 10 nach folgender Gleichung berechnet: 
EMI93.1
 
 
 



  Vg = Volumen der Gasphase (Volumen des Gefässes und des Manometers bis zur Marke "15" abzüglich Vf). Vf = Volumen der im Gefäss enthaltenen Gesamtflüssigkeit. T = Versuchstemperatur in  DEG K.  alpha  = Bunsenscher Absorptionskoeffizient ( alpha  O2 37 DEG C = 0,0239). P0 = 1 atm, gemessen in mm Brodie'sche Lösung (Manometerfüllung) 760 mm Hg = 10 000 mm Brodie'sche Lösung. 



  Der verbrauchte Sauerstoff kann nun direkt nach der Gleichung
 



  X ( mu l O2) = h . K
 



  berechnet werden, da die durch Atmung entstandene Kohlensäure durch die KOH vollständig absorbiert wurde (h = manometrische Differenz). 


 Versuchsprotokoll a 
 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Head Col 1 to 2 AL=L: Atmungssteigerung des Leberhomogenats ohne Zusätze (AT-Faktor 1,0)
 
<tb>Head Col 3 AL=L: 1
 
<tb>Head Col 1: 2
 
<tb>Head Col 2: 3
 
<tb>Head Col 3:

   4
<tb><SEP>Manometervol.<SEP>1332<SEP>1409
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Gefässvolumen<CEL CB=5 AL=L>14218<SEP>13950
<tb><SEP>Zeit<SEP>0 Min.<SEP>-<SEP>-<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>20 Min.<SEP>8<SEP>5<SEP>32<SEP>30
<tb><SEP>40 Min.<SEP>12<SEP>11<SEP>55<CEL AL=L>51
<tb><SEP>60 Min.<SEP>17<SEP>14<SEP>70<SEP>67
<tb><SEP>80 Min.<SEP>21<CEL AL=L>18<SEP>86<SEP>82
<tb><SEP>100 Min.<SEP>23<SEP>21<SEP>99<SEP>95
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>h-korrigiert<SEP>   22<SEP>77<SEP>73
<tb><SEP>KO2<SEP>1,074<CEL AL=L>1,057
<tb><SEP> mu l O2<SEP>82,7<SEP>77,2
<tb><SEP>Mittelwerte<CEL CB=5 CE=6 AL=L>80,0  mu l O2
<tb><SEP>AT-Faktor<SEP>F = 1,00 
<tb></TABLE> 


 Versuchsprotokoll b 
 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb> 
<tb>Head Col 1 to 2 AL=L:

   Atmungssteigerung des Leberhomogenats (AT-Faktor 1,0) durch Zusatz von Extrakt VIII
 
<tb>Head Col 3 AL=L: 1
 
<tb>Head Col 1: 2
 
<tb>Head Col 2: 5
 
<tb>Head Col 3: 6
<tb><SEP>Manometervol.<SEP>1323<SEP>1346
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Gefässvolumen<CEL CB=5 AL=L>13432<SEP>14514
<tb><SEP>Zeit<SEP>0 Min.<SEP>-<SEP>-<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>20 Min.<SEP>8<SEP>5<SEP>163<SEP>158
<tb><SEP>40 Min.<SEP>12<SEP>11<SEP>67<CEL AL=L>61
<tb><SEP>60 Min.<SEP>17<SEP>14<SEP>119<SEP>108
<tb><SEP>80 Min.<SEP>21<CEL AL=L>18<SEP>36<SEP>32
<tb><SEP>100 Min.<SEP>23<SEP>21<SEP>61<SEP>55
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>h-korrigiert<SEP>  22<SEP>321<SEP>299
<tb><SEP>KO2<SEP>1,004<CEL AL=L>1,101
<tb><SEP> mu l O2<SEP>322,3<SEP>329,2
<tb><SEP>Mittelwerte<SEP>325,8  mu l O2
<tb><SEP>AT-Faktor von Extrakt VIII<SEP>F = 0,75 (Steigerung 
 > 300%)

   
<tb></TABLE> 


 Versuchsprotokoll c 
 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Head Col 1 to 2 AL=L: Hemmung der Atmung von Leberhomogenat (AT-Faktor 1,0) durch Zusatz von 3 nM KCN 
<tb>Head Col 3 AL=L: 1 
<tb>Head Col 1: 2 
<tb>Head Col 2: 7 
<tb>Head Col 3: 8
<tb><SEP>Manometervol.<SEP>1263<SEP>1329
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Gefässvolumen<CEL CB=5 AL=L>14415<SEP>14293
<tb><SEP>Zeit<SEP>0 Min.<SEP>-<SEP>-<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>20 Min.<SEP>8<SEP>5<SEP>20<SEP>21
<tb><SEP>40 Min.<SEP>12<SEP>11<SEP>36<CEL AL=L>39
<tb><SEP>60 Min.<SEP>17<SEP>14<SEP>-50<SEP>50
<tb><SEP>80 Min.<SEP>21<CEL AL=L>-18<SEP>-65<SEP>-65
<tb><SEP>100 Min.<SEP>-23<SEP>-21<SEP>-77<SEP>-77
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>h-korrigiert<SEP>  22<SEP>55<SEP>-55
<tb><SEP>KO2<SEP>1,103<CEL AL=L>1,080
<tb><SEP> mu l O2<SEP>60,7<SEP>59,4
<tb><SEP>Mittelwerte<CEL CB=5 AL=L>60,1 mu l O2
<tb><SEP>AT-Faktor von KCN<SEP>F = 0,75 (Abnahme 25%)

   
<tb></TABLE> 


 Versuchsprotokoll d 
 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Head Col 1 to 2 AL=L: Atmungssteigerung der durch KCN
 gehemmten Leberhomogenat-Atmung
 nach Zusatz von Extrakt VIII
 
 
<tb>Head Col 3 AL=L: 1
 
 
<tb>Head Col 1: 2
 
 
<tb>Head Col 2: 9
 
 
<tb>Head Col 3: 10
<tb><SEP>Manometervol.<SEP>1514<SEP>1323
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Gefässvolumen<CEL CB=5 AL=L> 14535<SEP>13007
<tb><SEP>Zeit<SEP>0 Min.<SEP>-<SEP>-<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>20 Min.<SEP>8<SEP>5<SEP>67<SEP>64
<tb><SEP>40 Min.<SEP>12<SEP>11<SEP>151<CEL AL=L>148
<tb><SEP>60 Min.<SEP>-17<SEP>-14<SEP>-46<SEP>-76
<tb><SEP>80 Min.<CEL AL=L>-21<CEL AL=L>-18<SEP>-76<SEP>-101
<tb><SEP>100 Min.<SEP>-23<SEP>-21<SEP>-102<SEP>-142
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>h-korrigiert<SEP>  -22<SEP>-233<SEP>-268
<tb><SEP>KO2<CEL CB=5 AL=L>1,102<SEP>0,966
<tb><SEP> mu l O2<SEP>256,8<SEP>258,

  9
<tb><CEL CB=1 CE=2 AL=L>Mittelwerte<CEL CB=5 AL=L>257,9  mu l O2
<tb><SEP>AT-Faktor<SEP>F = 3,22
 (Steigerung ca. 275%) 
<tb></TABLE> 



  Der Extrakt VIII zeigte ausserdem aphrodisiakatische Wirkung, wie die folgenden Versuche erkennen lassen: 



  Der Extrakt VIII wurde zur Gewinnung des Feststoffes eingeengt und männlichen Ratten, die nicht besonders paarungsfreudig waren, 14 Tage lang täglich in Mengen von 0,15 g pro kg Extrakt VIII (fest) verabreicht. Die Ratten zeigten vom 10. Tag an eine vermehrte Ejakulation, verglichen mit den Kontrolltieren. Dieser Effekt hielt ca. 3 Wochen an und konnte verstetigt werden. 



  In einem anderen Versuch mit 5000 Mäusen wurde die Potenz männlicher Mäuse durch Gabe von Torula-Hefe ins Trinkwasser gehemmt, was aus der Literatur seit langem bekannt ist [Lit. 12]. Diese Potenzhemmung konnte durch Gaben des Extrakts VIII aufgehoben werden, sodass die Anzahl der neugeborenen Mäuse wieder auf ein normales Niveau anstieg. Diese Versuche sind mit 1000 männlichen und 4000 weiblichen Mäusen durchgeführt worden. 



  Im Folgenden wird gezeigt, dass der Extrakt VIII auch eine bemerkenswerte Radikalfängerwirkung besitzt. 


 Nachweismethode: 
 



  Zur Bestimmung der Radikalfängerwirkung in vitro lässt sich das System "Hyaluronsäure, Xanthin, Xanthinoxydase" (nachstehend als "HXX-System" bezeichnet) heranziehen. 


 Prinzip: 
 



  Es ist bekannt, dass Hyaluronsäure in Phosphatpuffer 7,4 schnell durch Hydroxyl-Radikale abgebaut wird, die durch Einwirkung des Enzyms Xanthinoxydase auf Xanthin freigesetzt werden. Die Depolymerisation der Hyaluronsäure lässt sich durch Messung der Viskositätsabnahme messen. Zusatz von Radikalfängern hemmt den Hyaluronsäure-Abbau und führt zu einer Hemmung der Viskositätsabnahme. Der Viskositätsabfall der Hyaluronsäurelösung ist ein Mass für die Wirkung freier Hydroxyl-Radikale. 



  Dies ergibt sich aus der beiliegenden Fig. 12, in der die Depolarisation der Hyaluronsäure, bestimmt durch Messung der Viskositätsabnahme des HXX-Systems mit verschiedenen Zusätzen grafisch dargestellt ist. 



  In der Fig. 12 bedeuten:
 1. System HXX ohne Enzym
 2. System HXX mit Enzym
 3. System HXX mit Extrakt VIII (Beispiel 10)
 4. System HXX mit Hefeextrakt VIl (Beispiel 9)
 5. System HXX mit Thymus-Extrakt lVc (Beispiel 6)
 6. System HXX mit Blutextrakt V (Beispiel 7)
 7. System HXX mit Colla 120 VI mit Zusätzen (Beispiel 8)
 8.

   System HXX mit Extrakt Ic und proteinhaltiger Rindernieren-Extrakt (konserviert) 


 Versuchsansätze: 
 
<tb><TABLE> Columns=4 Hyaluronsäurelösung 
<tb>Head Col 1: Reagentien (Prüflösung pH 7,4) 
<tb>Head Col 2: ohne Hydroxyl-Radikale (ml) 
<tb>Head Col 3: mit Hydroxyl-Radikalen (ml) 
<tb>Head Col 4: mit Hydroxyl-Radikalen
 + VIII (ml)
<tb><SEP>Hyaluronsäure<SEP>10,00<SEP>10,00<SEP>10,00
<tb><CEL AL=L>Phosphatpuffer/Xanthin-Lösung<CEL AL=L>-<SEP>2,50<SEP>2,50
<tb><SEP>Xanthinoxydase<SEP>0,15<SEP>0,15<SEP>0,15
<tb><CEL AL=L>Phosphatpuffer<SEP>2,50<SEP>- (SEP)<->(TB><SEP>VIII (Testlösung)<SEP>0,15<SEP>-<CEL AL=L>0,15
<tb><SEP>Aqua. dest.<SEP>2,20<SEP>2,35<SEP>2,20 
<tb></TABLE> 



  Endkonzentrationen der wässrigen Prüflösungen: 0,425% Hyaluronsäure, 66,0 mM Phosphatpuffer 7,4; Xanthin 0,6 mM, Xanthinoxydase: 0,10 U/ml (vgl. auch: Lengenfelder, E., Fink, R., "Der oxydative Hyaluronsäureabbau, Mechanismus und Konsequenzen", Springer-Verlag, Berlin 1986). 



  Die Prüfungslösungen werden 40 min bei 37 DEG C inkubiert, 10 min auf 20 DEG C im Wasserbad abgekühlt; nach weiteren 35 min erfolgen die Viskositätsmessungen bei 20,00 DEG C mithilfe eines Präzisionsviskosimeters. 



  Ergebnisse in Fig. 12, für VIII vgl. Nr. 1, 2 und 3. 


 Beispiel 11 
 


 Verwendung tierischer und/oder pflanzlicher Organextrakte mit atmungssteigerndem, d.h. sauerstoffaktivierendem Effekt und mit Radikalfängerwirkung in der Technik 
 



  In der obigen Beschreibung ist bereits darauf hingewiesen worden, dass die für kosmetische und medizinische Anwendungen wichtige Zellstoffwechselaktivität, die unter anderem eine gesteigerte Energieproduktion zur Folge hat, weitere Anwendungsmöglichkeiten erwarten liess, und zwar auf Grund der mit der Stoffwechselaktivierung gleichzeitig einhergehenden Sauerstoffaktivierung und Radikalfängerwirkung. 



  Die in den vorstehenden Beispielen für biologische Anwendungen hergestellten Organextrakte sind meist stark gereinigt, z.B. auch desodoriert und sterilfiltriert worden. In einigen Fällen wurde sogar Pyrogenfreiheit angestrebt. Eine so intensive Behandlung bzw. Reinigung der Extrakte erscheint im Falle technischer Anwendungen, z.B. als Stabilisatoren für Farblösungen, insbesondere Lacken auf Wasserbasis (wie sie heute bevorzugt in der Automobilindustrie eingesetzt werden), oder gefärbte Systeme meist nicht erforderlich. Es wurden sowohl mit Roh-Organextrakten als auch mit proteinhaltigen und proteinfreien Extrakten positive Resultate erzielt. An Stelle einer Sterilfiltration reichte gute Konservierung mit Phenonip oder ähnlichen Konservierungsmitteln sowie Zugabe von geeigneten Lösungsmitteln und Lösungsvermittlern wie Propylenglycolen aus.

   Auch Farbanstriche an Wänden konnten dauerhafter gemacht werden, wie entsprechende Langzeit-Reihenversuche über 1 bis 3 Jahre ergeben haben. 



  Eingesetzt worden sind folgende Organextrakte aus den Beispielen und analog hergestellten: 



  a) Der im Beispiel 2 beschriebene synthetische Roh-Nierenextrakt, hergestellt aus Teillösung I und Teillösung II, aber ohne Zusatz von Peptidkomponenten, ohne Sterilfiltration, konserviert mit 0,8% Phenonip und gegebenenfalls weiteren Konservierungsmittel(n). 



  Bei Farblösungen erwies sich die Zugabe von Lösungsvermittlern als vorteilhaft. Gearbeitet wurde auch mit schnell trocknender Alkydharzfarbe auf verschiedenen Materialien. 



  b) Die im Beispiel 3 beschriebenen eiweissfreien und eiweisshaltigen Rindernieren-Extrakte aus frischen Rindernieren und Zelllinien. 



  c) Der im Beispiel 6 beschriebene synthetische Thymus-Extrakt lVb, und zwar vor Sterilfiltration und ohne Peptidzusätze, konserviert. Ebenso eine Kombination aus IVa und lVc, analog IVb behandelt. 



  d) Der im Beispiel 7 beschriebene Serum-Blut-Extrakt synthetisch allein sowie auch in Kombination mit Blutextrakt aus frischem Kälberblut nach DE-OS 2 405 983, Seite 3, aber ohne im Vakuumrotationsverdampfer zur Trockne einzudampfen. 



  e) Der im Beispiel 8 beschriebene pflanzliche Extrakt Colla 120 VI und seine Rohform. 



  f) Die in den Beispielen 9 und 10 beschriebenen Extrakte VIl und VIll sowie das VII-Rohprodukt, wie es vor der Dialyse anfällt (Beispiel 9, erster Absatz). 



  In diesem Zusammenhang sei auch auf die im Beispiel 10 beschriebenen Versuche über den Nachweis der Radikalfängerwirkung von VIII und anderen hergestellten Organextrakten hingewiesen (vgl. auch Fig. 12). 


 Literaturverzeichnung [Lit.] 
 



  [1] Riemschneider R. und Quelle G., "Carcinogenity of Placenta-Extracts" in "Fragrance Journal", 57, 4, 115-122 (1982); 57, 6, 105-112 (1982). 



  [2] Weiss und Schleicher J. B., "A multisurface tissue propagator for mass-scale growth of cell monolayer culture" in "Biotechnol. Bioeng." 10, 601 (1968) und ibid, 10, 617 (1968). 



  [3] House Shearer M. & Maroudas N. G., "Method for bulk Culture of animal Cells on Plastic film" in "Exp. Cell. Research", 71, 293 (1972). 



  [4] Paul J. "Zell- und Gewebekulturen", W. de Gruyter, Berlin, 1980. 



  [5] Moore, George, E., Hasenpusch, Peter, Gerner, Robert E. & Burns, A. Alex, "A pilot plant for mammalian cell culture" in "Biotechnol. Bioengng." 10, 625 (1968). 



  [6] McCoy, T. A, Whittle, W. & Conway, E., "A glass helix perfusion chamber for massive growth of cells in vitro" in "Proc. Soc. Exp. Biol. (N. Y.)", 109, 235 (1962). 



  [7] Ubertini, B., Nardelli, L., Santero, G. & Panona, G., "Process report: Large-scale production of foot- und mouse decease virus" in "J. Biochem. Microbiol. Technol. Eng.", 2, 327 (1960). 



  [8] Riemschneider, R., und Hennig, K., "Nachweis von Stoffwechsel-Aktivierungen durch Organextrakte" in "RAK (Riechstoffe, Aromen, Kosmetika)", 1977, Heft 9 und 10, 12 Seiten. 



  [9] Sachs, L., "Angew. Statistik", 6. Aufl. Springer 242 (1944). 



  [10] Padberg, G., "J. Soc. Cosmetic Chemists", 20, 719-728 (1969). 



  [11] Seitler, L., Cyanophytaceae, Kryptogamen-Flora nach L. Rabenhorst, Vol. 14, VI + 1196, Academ. Verlagsgesellschaft, Leipzig 1932. 



  [12] Riemschneider, R., Veröffentlichungsreihe: Mitteilungen des physiologisch-chemischen Instituts der Universität Berlin, 1946. 



  [13] CRT-IST Ansaldo, Data Bank for Chemical Research, Animal Cell Lines Catalogue 1990 von Maniello, Parodi, Aresu und Romano, Mailand 1990. 



  [14] DSM Catalogue of Human and Animal Cell Lines, 5. Ausgabe 1995, Drexler, Dirks, MacLeod, Quentmeier, Steube, Braunschweig. 



  [15] ICN "Cell Biology Catalogue" 1995/96, ICN Biomedicals GmbH, 3340 Meckenheim. 



  [16] Reference Guide to ATCC Cell Lines and Hybridomas, 8. Ausgabe 1994, Rockville, MD 20852, USA, in Verbindung mit 1996 Ordering Catalog ATCC Cell Lines and Hybridomas. 



  [17] Riemschneider, R., Schulz, V., "Alkalische Phosphatase aus Rinderplazenten und ihre Stabilisierung durch zweiwertige Metallionen und Tripeptide" in "Mitt. d. Physiolog.-chem. Instituts der Universität Berlin", R 33 b, Januar 1950. 



  [18] Riemschneider, R., "Untersuchungen über Plazenta-Extrakte", Druckschrift aus dem Institut für Biochemie der FU-Berlin vom Januar 1962, Vortrag in Tokyo am 22. 01. 1962 im PULA-Kolloquium (in japanischer Sprache). 



  [19] Schachtschnabel, D., Fischer, R.-D., Zilliken, F., "Untersuchungen zur Kontrolle der Melaninsynthese in Zellkulturen", in "Z. für Physiologische Chemie", 351, 1402-1410 (1970).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Organextrakten aus Zelllinien der entsprechenden Organe von Tieren bzw. Teilen von Pflanzen, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen: a) Aktivierung der gewählten tierischen bzw. pflanzlichen Zellen in einem Wasserbad von vorzugsweise 25 bis 30 DEG C, b) Zugabe eines vorgewärmten, für die jeweils gewählten Zellen vorgeschriebenen Kulturmediums unter Vermischung und anschliessendes Inkubieren in an sich bekannter Weise, vorzugsweise bei etwa 37 DEG C und vorzugsweise in einer etwa 5% CO2 enthaltenden Atmosphäre, c) Gewinnung der dabei gebildeten Zellen als Ausgangsmaterial für Grosskulturen auf Oberflächen oder in Suspension durch Dekantieren des Nährmediums,

Waschen des entstandenen Zellrasens mit einem geeigneten Puffer und Aufnahme der Zellen in einem kompletten Medium unter Einstellung einer für die Massenproduktion geeigneten Verdünnung, d) Kultivierung der Zellen auf Oberflächen, vorzugsweise in Perfusionssystemen, auf festen Medien und/oder unter Anwendung der Plastikfilm-Kultur-Methode (für tierische Zellen) bzw.

in Suspensionskultur (für pflanzliche Zellen) im Grossmassstab auf an sich bekannte Weise durch Beimpfen der Kultivierungsapparatur mit einer Zellsuspension in einem sterilen CO2/Luft-Gemisch, e) Herstellung eines Extrakts durch Behandlung des suspendierten geernteten Zellmaterials in einem organischen Lösungsmittel und/oder Wasser, Gewinnung der wässrigen Phase vorzugsweise durch Zentrifugieren, Entfernung von restlichen Lipidanteilen aus der wässrigen Phase durch mehrmaliges Behandeln mit dem organischen Lösungsmittel unter Bildung eines wässrigen Rohextrakts, gegebenenfalls in Form einer Suspension, f) Reinigung bzw.

Behandlung des Rohextrakts je nach Ausgangsmaterial und anschliessendes Dialysieren, vorzugsweise unter Verwendung einer Dialyse-Membran aus Celluloseregenerat gegen eine ein Konservierungsmittel auf Basis von 4-Hydroxybenzoesäure oder ein anderes Konservierungsmittel enthaltende wässrige Lösung zur Gewinnung eines von hochmolekularen Verbindungen freien Extrakts als Dialysat und g) Sterilfiltration des Extrakts, vorzugsweise unter Verwendung eines Membranfilters mit einer Porengrösse von 0,2 mu m oder einer Ultrafiltrationskerze nach Einstellung des Extrakts auf den gewünschten pH-Wert, vorzugsweise 5,0 bis 7,2.

2.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine in der Stufe (d) gewonnene tierische Zellmasse in Ethylether oder Chloroform suspendiert und etwa 8 bis etwa 15 Tage lang bei etwa -10 bis etwa -20 DEG C im Kälteraum stehen gelassen und dann zur Gewinnung der wässrigen Phase zentrifugiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die letzten Spuren von Ether oder Chloroform aus dem Dialysat (Aussenlösung) in der Stufe (f) durch Stickstoff-Durchblasen bei pH 7,2 bis 7,5 entfernt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Stufe (a) Zellkulturen aus Zelllinien einschliesslich der in der Beschreibung genannten speziellen Zelllinien einzeln oder im Gemisch eingesetzt werden.

5.

Verfahren nach einem der Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als tierische Zelllinien mindestens eine der Zelllinien MDBK (Rindernierenzellen DSM ACC 174 aus der Niere eines normal ausgewachsenen Rindes), P1-1A3 (Thymus-Epithel-Zellen DSM ACC 280 aus dem Thymusepithel eines 6 Monate alten Rindes), EBL (Rinderlungenzellen DSM ACC 192 aus der Lunge eines 7 Monate alten Rinderfötus, gefrorene 110.

Passage), AM-C6SC8 (Schweinenieren-Zellen DSM ACC 152 aus einem Subklon von der Zelllinie Am II, die von einer normalen Schweineniere gewonnen wurde), BeWo (weibliche Human-Plazenta-Zellen ATCC CCL 98), AV 3 (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 21), WISH (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 25), B 95.8 (Blut-Zellen, Monkey, ATCC CRL 1612 ECACC 8501 1419); PK (15) (Schweinenieren-Zellen ATCC CCL 33) und FL (Human-Amnion-Zellen ATCC CCL 62 IZSBS BSCL 46); 3AsubE (Human-Plazenten-Zellen ATCC CRL-1584); BVDV+EJG (Rinder-Kapillarzellen ATCC CRL-8659); FB5.Bm (Rinder-Knochenmark) ATCC CRL-6043); R.Sp. (Rind ATCC CRL-6019); SPI.K (Delphin ATCC CRL-6556); CF 37 Mg (Beagle-Hund, Mammary gland, ATCC CRL-6230); XTH-2 (Zellen vom südafrikanischen Krallenfrosch Xenos leavis DAUDIN, DSM ACC 190) und/oder als pflanzliche Zelllinien mindestens eine der Zelllinien Acer pseudoplatanus L.

(Sycamore), Phaseolus vulgaris (aus Hypocotyl of Pole Bean), Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum (tetraploider Stamm), Ginkgo biloba, Pisum sati vum (root), Centaurus cyanus, Daucus carota, Apium graveolens, Daucus carota, Apium graveolens, Arthrospira und/oder Saccharomyces cerevisiae oder andere Actinomyceten verwendet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Gemische von aus mehreren unterschiedlichen tierischen Zelllinien gewonnenen, sterilfiltrierten Extrakten oder Gemische von aus mehreren unterschiedlichen pflanzlichen Zelllinien gewonnenen, sterilfiltrierten Extrakten hergestellt und gegebenenfalls miteinander kombiniert werden und gegebenenfalls weiter kombiniert werden mit mindestens einem synthetisch hergestellten Extrakt oder mit mindestens einem aus frischen Organen hergestellten Extrakt oder beiden.

7.

Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der aus tierischen Zelllinien gewonnene, sterilfiltrierte Extrakt mit mindestens einem synthetisch hergestellten oder mit mindestens einem aus frischen Organen hergestellten Extrakt oder mit beiden im Gewichts-Mengenverhältnis (1 bis 99):(99 bis 1), vorzugsweise von (1 bis 50):(50 bis 1), insbesondere von (1 bis 20):(99 bis 80), kombiniert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein nach Anspruch 6 oder 7 gewonnener Extrakt mit mindestens einem aus einer pflanzlichen Zelllinie gewonnen Extrakt in einem Gewichts-Mengenverhältnis von (1 bis 99):(99 bis 1), vorzugsweise von (1 bis 50):(50 bis 1), insbesondere von (1-20):(80-99) kombiniert wird.

9.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung von pflanzlichen Zelllinien in der Stufe (e), wenn es auf das Zellwandmaterial ankommt, das in Wasser oder in dem organischen Lösungsmittel suspendierte Zellmaterial vorzugsweise in einem Ultraschallgenerator zerbrochen und das aufgeschlossene Material nach dem Zentrifugieren und Waschen mit Wasser durch chemische und/oder enzymatische Partialhydrolysen aufgeschlossen und dialysiert wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung eines Blutextrakts ein synthetischer Blutserum-Extrakt kombiniert wird mit einem Blutextrakt, der aus der Zelllinie B95.8 oder FB5.Bm oder aus einer Kälberblutzelle in Suspensionskultur hergestellt worden ist.

11.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Rinderplazenta-Extrakt aus einer Zelllinie von bos taurus in Kombination mit synthetischem Rinderplazenta-Extrakt zur Einarbeitung in kosmetische Präparate hergestellt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Rinderplazenta-Extrakt aus einer Zelllinie von bos taurus in Kombination mit einem synthetischen Rinderplazenta-Extrakt hergestellt wird, dem 0,02 bis 0,06 g BSE-freie alkalische Rinderplazenten-Phosphatase pro Liter Endvolumen zugesetzt worden sind, zur Einarbeitung in kosmetische Präparate.

13.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein pyrogenfreier Kälberblutextrakt aus einer Zelllinie vom Kalb kombiniert wird mit einem synthetischen Kälberserum-Extrakt und/oder mit einem Kälberserum-Extrakt, der aus natürlichem Kälberblut gewonnen worden ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kalbsthymus-Extrakt aus einer Zelllinie vom Kalb kombiniert wird mit einem synthetischen Kalbsthymus-Extrakt und/oder mit einem Kalbsthymus-Extrakt, der aus natürlichem Kalbsthymus gewonnen worden ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Milz-Extrakt aus einer Zelllinie vom Rind kombiniert wird mit einem synthetischen Rindermilz-Extrakt und/oder mit einem Rindermilz-Extrakt, der aus natürlicher Rindermilz gewonnen worden ist.

16.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Amnion-Extrakt aus einer tierischen Zelllinien kombiniert wird mit einem synthetischen und/oder natürlichen Amnion-Extrakt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hydroxyprolin enthaltender Pflanzenextrakt aus pflanzlichen Zelllinien hergestellt und als Kollagen-Ersatz verwendet wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass wie bei der Gewinnung von Zelllinien-Extrakten auch bei der Herstellung von synthetischen bzw. natürlichen Organextrakten ohne Konservierungsmittel gearbeitet wird zur Herstellung von konservierungsmittelfreien Endprodukten bzw. Kombinationen davon.

19.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung der Zelllinie Saccharomyces cerevisiae in Suspension in Stufe (e) diese vor der Dialyse in Stufe (f) durch gleichzeitige Anwendung osmotischer und thermischer Effekte, vorzugsweise bei 50 bis 65 DEG C, abgetötet und partiell deproteiniert wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein stoffwechselaktiver Hefeextrakt mit mindestens einem der in Anspruch 13 genannten Kälberblutextrakte kombiniert wird.

21. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 20 hergestellten Extrakte und Extraktgemische als Ersatz oder Ergänzung für Plazenta-, Thymus-, Blut-, Serum-, Milz-, Leber-, Kollagen-, Bindegewebs-, Amnion-Flüssigkeits-, Quallen-, Rogen-, Kaviar-, Hefe- und Euterextrakte bzw. Kombinationen davon.

22.

Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 20 hergestellten Extrakte und Extrakt-Gemische zur Herstellung einer kosmetischen Formulierung.

23. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 20 hergestellten Extrakte und Extraktgemische zur Herstellung eines Präparats mit Radikalfängerwirkung, insbesondere für kosmetische und/oder technische Zwecke.

24. Verwendung des nach Anspruch 16, hergestellten Amnion-Extrakts, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Organextrakten, zur Herstellung einer kosmetischen Formulierung mit die Melaninbildung hemmenden Eigenschaften.

25.

Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 20 hergestellten Extrakte und Extraktgemische zur Herstellung eines medizinischen Präparats für die topische, subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Applikation zum Zwecke der äusseren oder inneren Wundheilung, zur Behandlung von Arteriosklerose oder von Strahlungsschäden.

26. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 20 hergestellten Extrakte und Extraktgemische zur Herstellung eines medizinischen Präparats für die Stärkung des Immunsystems, für die Aktivierung des Zellstoffwechsels oder die Behandlung gastroenterologischer Erkrankungen, insbesondere Ulcera.

27. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 20 hergestellten Extrakte und Extraktgemische zur Herstellung eines Präparats mit aphrodisiakatischer Wirkung.

28.

Verwendung der aus pflanzlichen Zelllinien von vorzugsweise Ginkgo biloba, Sycamore, Saccharomyces, Torula oder Cyanophyten gewonnenen Extrakte sowie ihrer Kombinationen mit auf tierischen Zelllinien basierenden Extrakten, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Herstellung eines Präparats mit aphrodisiakatischer Wirkung.

29. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 20 hergestellten Extrakte und Extraktgemische und der darin enthaltenen Rohextrakte und Vorstufen zur Stabilisierung und Haltbarmachung von gefärbten Geweben und Farbanstrichen, insbesondere Lackierungen.

30. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 20 hergestellten Extrakte und Extraktgemische zur Herstellung von Kulturlösungen, Nährlösungen und diätetischen Lösungen.

31. Organextrakte, hergestellt aus Zelllinien der entsprechenden Organe von Tieren bzw.

Teilen von Pflanzen nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

32. Organextrakte und Organextraktgemische, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 20.

33. Organextrakte und Organextraktgemische, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, für die Herstellung medizinischer, kosmetischer und diätetischer Präparate und zur Stabilisierung und Haltbarmachung gefärbter Gewebe und Farbanstriche, insbesondere Lackierungen mit Lacken auf Wasserbasis.