CN117965666A - 一种具有抗皮肤衰老功效的鱼鳔低聚肽及其深度精制方法和应用 - Google Patents
一种具有抗皮肤衰老功效的鱼鳔低聚肽及其深度精制方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抗皮肤衰老功效的鱼鳔低聚肽及其深度精制方法和应用。本发明通过对干制的大黄鱼鱼鳔进行预处理、系统性免疫原性清除、限制性酶解、有机膜分子量逐层筛分、基于重组3D皮肤模型的抗衰老功能定向筛选、包装及灭菌，得到一种大黄鱼鳔低聚肽。所述深度精制方法制备的大黄鱼鳔低聚肽的肽段分子量小、总蛋白含量高、端肽清除率高、且纯度高、免疫原性低、无皮肤刺激性，还能有效地保护人皮肤细胞的氧化损伤以及对光老化细胞具有显著保湿作用，进而起到延缓衰老的作用抗衰老活性高。因此，大黄鱼鳔低聚肽能够从内源性及外源性两方面综合发挥抗衰功效，为鱼鳔低聚肽护肤品及医美产品的开发提供物质基础和技术保证。
Description
技术领域
本发明属于原料制备技术领域，具体涉及一种具有抗皮肤衰老功效的鱼鳔低聚肽及其深度精制方法和应用。
背景技术
随着生活水平不断提高和技术的发展，人类寿命在逐渐延长，老龄化现象也日趋严重。皮肤作为人体的外部器官，是机体抵御外界刺激的第一道防线，更易受到外部侵袭损伤老化。皮肤衰老(Skin aging)也称为皮肤老化，是皮肤组织在内外环境的不断作用下细胞结构和功能发生退化，出现皮肤质地改变(如弹性、张力、厚薄及表面纹理等)、色素改变、血管萎缩或增生的生理现象。皮肤衰老通常分为内源性老化(自然衰老)和外源性老化(光老化等)。为了保持年轻的肌肤状态，越来越多的消费者开始关注具有抗衰老功效的功能产品。
大黄鱼(Larimichthys crocea)是石首鱼科、黄鱼属鱼类，在其生产加工过程中会产生大量副产物，鱼鳔就是其中一种重要的副产物。鱼鳔中含有丰富的营养物质，包括蛋白质、多糖、无机盐及维生素，鱼鳔中含量最高的蛋白质包括胶原蛋白、肌原纤维蛋白、弹性蛋白及糖蛋白等，其中胶原蛋白、弹性蛋白等蛋白是多种护肤活性肽的良好材料来源。糖蛋白含有表面抗原，会引起过敏等免疫原反应。蛋白酶酶解技术已被广泛应用于鱼鳔、鱼皮等海洋生物组织为原料的海洋生物肽的制备中，但现有的蛋白酶解技术却存在酶切位点不确定、水解程度不可控、制得活性肽在混合肽中占比低、活性成分特异性低及糖蛋白和内毒素等过高的问题。因此，在医药、化妆品等领域中，低免疫原性、高护肤活性海洋活性肽的制备成为近年来学者和相关从业者的关注，对抗衰老等特定功效和活性肽的需求也越发迫切。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗皮肤衰老功效的鱼鳔低聚肽及其深度精制方法和应用。本发明以富含胶原蛋白的大黄鱼鱼鳔为原料，通过基于免疫原去除技术、内毒素清除技术的系统性免疫原去除手段、基于体外重组3D皮肤模型与有机膜分子量逐层筛分技术、活性肽功能定向筛选制备技术的合理配合，有效除去大黄鱼鱼鳔天然组织中的免疫原性物质，实现特定抗光老化及抗皱功效的高活性肽段的综合定向筛选，优选出了一种免疫原性低、安全性好，并能够从内源性及外源性两方面综合发挥抗衰功效的大黄鱼鳔低聚肽及其深度精制技术。、为实现上述发明目的，本发明予采用的技术方案如下：
本发明提供了一种具有抗皮肤衰老功效的鱼鳔低聚肽的深度精制方法，其包括以下步骤：
(1)取鱼鳔清洗、泡发，然后加入表面抗原去除液搅拌，搅拌结束后使用纯水清洗鱼鳔表皮，匀浆，得到除去端肽、表面糖蛋白及内毒素的鱼鳔匀浆；
(2)在所述步骤(1)的鱼鳔匀浆中加入纯水，再加入菠萝蛋白酶酶解，得到鱼鳔低聚肽酶解液；
(3)将所述步骤(2)的鱼鳔低聚肽酶解液过膜，然后加入活性炭脱色，离心收集上清并超滤至鱼鳔低聚肽酶解液澄清透明，得到鱼鳔低聚肽脱色液；
(4)将所述步骤(3)的鱼鳔低聚肽脱色液使用有机膜进行纳滤，收集得到鱼鳔低聚肽过膜液；
(5)将所述步骤(4)的鱼鳔低聚肽过膜液进行脱盐，收集得到鱼鳔低聚肽脱盐液；
(6)将所述步骤(5)的鱼鳔低聚肽脱盐液经冷冻干燥、包装、辐照，得到鱼鳔低聚肽。
进一步的，所述步骤(1)中表面抗原去除液与鱼鳔的表皮的液料比为15:1-30:1；加入表面抗原去除液的搅拌温度为2-8℃，搅拌时间为4-12h。
进一步的，所述表面抗原去除液是由浓度为0.5-1.5％的脱氧胆酸钠、浓度为0.05-0.10mol/L的磷酸二氢钠和酶活力为80-240U/g胃蛋白，混合配制而成的。
进一步的，所述步骤(2)中菠萝蛋白酶的添加量为2000-4000U/g，其酶解温度为45-50℃，酶解时间为200-360min。
进一步的，所述步骤(3)中活性炭的粒径位60-120目，其添加量为所述鱼鳔低聚肽酶解液体积的0.3％-0.5％，脱色温度为50-65℃，脱色时间为30-50min。
进一步的，所述步骤(3)中超滤采用的是100μm的陶瓷膜，陶瓷膜分离实验机的运行温度为20-25℃，压力为0.30MPa-0.38MPa，流速为27-45mL/min。
进一步的，所述步骤(4)中纳滤使用的是700Da的有机纳滤膜，有机膜分离实验机的压力为0.21MPa-0.26MPa，流速为27-45mL/min，温度为20-25℃；当过膜液体体积与未过膜液体积达到5:1时，停止有机膜实验机工作，收集得到鱼鳔低聚肽过膜液。
进一步的，所述步骤(5)中脱盐使用的是200Da的有机纳滤膜，有机膜分离实验机的压力为0.21MPa-0.26MPa，流速为30-60mL/min，温度为20-25℃。
进一步的，所述鱼鳔为大黄鱼鱼鳔。
本发明还提供了所述的深度精制方法制备得到的鱼鳔低聚肽，其蛋白含量高于91％，重均分子量＜1kDa。
本发明还提供了所述的鱼鳔低聚肽在制备具有抗衰老和/或保湿功效的化妆品和/或护肤品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
1、本发明首次以大黄鱼鱼鳔为原料，针对性的对高抗衰老活性鱼鳔肽进行了筛选，综合抗光老化、抗氧化等多因素筛选高活性抗衰老肽段，得到了一种大黄鱼鱼鳔来源的免疫原性低、综合抗衰老活性高的鱼鳔肽的深度精制方法，该方法简单、高效，操作性强。
2、本发明在传统酶解制备过程中针对原料大黄鱼鳔中蛋白质的结构组成特点，引入合理的系统性免疫原去除手段，能够有效除去鱼鳔天然组织中存在的内毒素及端肽等免疫原性物质，降低免疫原性，提高生物安全性，使其更适于化妆品的应用；并通过体外重组3D皮肤模型与有机膜分子量逐层筛分技术的合理配合，达到特定抗光老化及抗皱功效的高活性肽段的综合定向筛选，优选出具有高抗衰老活性大黄鱼鳔低聚肽段；且在免疫原清除剂清除过程中，能够较好提升活性肽品质，进一步获得颜色纯白、流动性好、活性更高的大黄鱼鳔低聚肽。
3、本发明的深度精制方法制备的大黄鱼鳔低聚肽的肽段分子量小、总蛋白含量高、端肽清除率高、且纯度高、免疫原性低、无皮肤刺激性，还能有效地保护人皮肤细胞的氧化损伤以及对光老化细胞具有显著保湿作用，进而起到延缓衰老的作用抗衰老活性高。因此，大黄鱼鳔低聚肽能够从内源性及外源性两方面综合发挥抗衰功效，为鱼鳔低聚肽护肤品、化妆品及医美产品的开发提供物质基础和技术保证。
附图说明
图1为大黄鱼鳔低聚肽HSBP对人表皮Hacat细胞增殖率影响。
图2为大黄鱼鳔低聚肽HSBP的眼刺激实验结果图；其中，图2a为HSBP眼刺激实验给药前；图2b为HSBP眼刺激实验给药过程中；图2c为HSBP眼刺激实验给药5min后。
图3为大黄鱼鳔低聚肽HSBP1-3的皮肤刺激结果。
图4为大黄鱼鳔低聚肽HSBP1-3对氧化损伤细胞胶原分泌的影响；其中，图4a为Ⅰ型胶原分泌；图4b为Ⅲ型胶原分泌；图4c为Ⅳ型胶原分泌。
图5为大黄鱼鳔低聚肽HSBP1-3对氧化损伤细胞β-半乳糖苷酶的影响。
图6为大黄鱼鳔低聚肽HSBP1-3对光老化细胞透明质酸分泌的影响。
图7为大黄鱼鳔低聚肽HSBP1-3对光老化细胞AQP3表达的影响。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
一种具有抗皮肤衰老功效的大黄鱼鱼鳔低聚肽的深度精制方法，步骤如下：
(1)鱼鳔的免疫原性去除：取干制大黄鱼鱼鳔，清洗除沙后，隔水蒸10-30min，4℃泡发48-72h，切成小块，称重，按鱼鳔表皮与表面抗原去除液的料液比为1:15-1:30(w/v)加入表面抗原去除液(脱氧胆酸钠浓度为0.5-1.5％、磷酸二氢钠浓度0.05-0.10mol/L、胃蛋白酶活力80-240U/g，混合配制而成)，2-8℃搅拌4h-12h，然后滤去表面抗原去除液，并按照1：4(m/w)比例加入纯水漂洗0.5h，重复3-5次至鱼鳔表皮洗至中性，匀浆，得到除去端肽、表面糖蛋白及内毒素的大黄鱼鱼鳔匀浆；
(2)鱼鳔的限制性酶解：大黄鱼鱼鳔匀浆加入纯水，调节料液比为1:20～1：25，并再次调节pH至中性，按照2000-4000U/g的比例加入菠萝蛋白酶，45-50℃，酶解200-360min，灭酶，得到HSBP酶解液；
(3)HSBP的脱色：HSBP粗酶解液过0.45μm滤膜，按照总体积的0.3％-0.5％加入60-120目的中性粉末活性炭，在50-65℃脱色30-50min，冷却后，10000r/min离心10min，收集上清，并过100μm陶瓷膜，陶瓷膜分离实验机的运行温度20-25℃，压力0.30MPa-0.38MPa，流速27-45mL/min，超滤至澄清透明，得到HSBP脱色液；
(4)HSBP的分子量筛选：HSBP脱色液，在25℃，利用有机膜分离实验机通过700Da有机膜进行纳滤，全程压力控制在0.21MPa-0.26MPa，以27-45mL/min流速过膜，过膜期间，分两次对脱色液进行两倍稀释，当过膜液体体积与未过膜液体积达到5:1时，停止有机膜分离实验，收集HSBP过膜液；
(5)HSBP的脱盐：HSBP过膜液进行脱盐，在有机膜分离实验机中装配200Da有机纳滤膜，在20-25℃过膜，压力0.21MPa-0.26MPa，流速30-60mL/min，收集浓液，得到HSBP脱盐液；
(6)干燥及内毒素清除：HSBP脱盐液经真空冷冻干燥、包装、然后用剂量为12-20kGy的γ射线辐照，获得具有低免疫原性、高抗皮肤衰老活性的大黄鱼鳔低聚肽HSBP。
实施例1大黄鱼鳔低聚肽HSBP-1的制备
一种具有抗皮肤衰老功效的大黄鱼鱼鳔低聚肽HSBP-1的制备步骤如下：
取干制大黄鱼鱼鳔，清洗除沙后，隔水蒸25min，4℃泡发60h，切成小块，称重，按1:25(w/v)料液比加入表面抗原去除液(脱氧胆酸钠浓度为0.8％、磷酸二氢钠浓度0.08mol/L、胃蛋白酶活力200U/g)，4℃搅拌10h，然后滤去表面抗原去除液，并按照1:4(m/w)比例加纯水漂洗0.5h，重复5次至鱼鳔表皮洗至中性，匀浆，加入纯水，调节料液比为1:20，按照4000U/g的比例加入菠萝蛋白酶，47℃，酶解360min，95℃灭酶，冷却后过0.45μm滤膜，按照总体积的0.5％加入120目的中性粉末活性炭，在65℃脱色30min，冷却后，10000r/min离心10min，收集上清，并过100μm陶瓷膜，运行温度20℃，压力0.32MPa-0.35MPa，流速35mL/min，超滤至澄清透明，收集HSBP脱色液加入700Da有机膜的有机膜分离实验机，全程压力控制在0.22 -0.24MPa，以35mL/min流速过膜，过膜期间，分两次对脱色液进行两倍稀释，当过膜液体积与未过膜液体积达到5:1时停止，收集HSBP过膜液加入装配200Da有机纳滤膜有机膜分离实验机中，进行脱盐，压力0.25MPa，流速30mL/min，收集浓液，并于真空冷冻干燥机中干燥，进行包装及γ射线辐照，得到大黄鱼鳔低聚肽HSBP-1。
实施例2大黄鱼鳔低聚肽HSBP-2的制备
一种具有抗皮肤衰老功效的大黄鱼鱼鳔低聚肽HSBP-2的制备步骤如下：
取干制大黄鱼鱼鳔，清洗除沙后，隔水蒸15min，4℃泡发72h，切成小块，称重，按1:20(w/v)料液比加入表面抗原去除液(脱氧胆酸钠浓度为1.2％、磷酸二氢钠浓度0.1mol/L、胃蛋白酶活力160U/g)，4℃搅拌8h，然后滤去表面抗原去除液，并按照1:4(m/w)比例加纯水漂洗0.5h，重复5次至鱼鳔表皮洗至中性，匀浆，加入纯水，调节料液比为1:25，按照4000U/g的比例加入菠萝蛋白酶，47℃，酶解320min，95℃灭酶，冷却后过0.45μm滤膜，按照总体积的0.4％加入120目的中性粉末活性炭，在65℃脱色40min，冷却后，10000r/min离心10min，收集上清，并过100μm陶瓷膜，运行温度20℃，压力0.32MPa-0.35MPa，流速42mL/min，超滤至澄清透明，收集HSBP脱色液加入700Da有机膜的有机膜分离实验机，全程压力控制在0.24MPa，以38mL/min流速过膜，过膜期间，分两次对脱色液进行两倍稀释，当过膜液体体积与未过膜液体积达到5:1时停止，收集HSBP过膜液加入装配200Da有机纳滤膜有机膜分离实验机中，进行脱盐，压力0.27MPa，流速36mL/min，收集浓液，并于真空冷冻干燥机中干燥，进行包装及γ射线辐照，得到大黄鱼鳔低聚肽HSBP-2。
实施例3大黄鱼鳔低聚肽HSBP-3的制备
一种具有抗皮肤衰老功效的大黄鱼鱼鳔低聚肽HSBP-1的制备步骤如下：
取干制大黄鱼鱼鳔，清洗除沙后，隔水蒸30min，4℃泡发70h，切成小块，称重，按1:20(w/v)料液比加入表面抗原去除液(脱氧胆酸钠浓度为1.0％、磷酸二氢钠浓度0.06mol/L、胃蛋白酶活力120U/g)，4℃搅拌8h，然后滤去表面抗原去除液，并按照1:4(m/w)比例加纯水漂洗0.5h，重复5次至鱼鳔表皮洗至中性，匀浆，加入纯水，调节料液比为1:20，按照3600U/g的比例加入菠萝蛋白酶，47℃，酶解300min，95℃灭酶，冷却后过0.45μm滤膜，按照总体积的0.,3％加入60目的中性粉末活性炭，在65℃脱色50min，冷却后，10000r/min离心10min，收集上清，并过100μm陶瓷膜，运行温度20℃，压力0.35MPa，流速42mL/min，超滤至澄清透明，收集HSBP脱色液加入700Da有机膜的有机膜分离实验机，全程压力控制在0.27MPa，以45mL/min流速过膜，过膜期间，分两次对脱色液进行两倍稀释，当过膜液体体积与未过膜液体积达到5:1时停止，收集HSBP过膜液加入装配200Da有机纳滤膜有机膜分离实验机中，进行脱盐，压力0.25MPa，流速30mL/min，收集浓液，并于真空冷冻干燥机中干燥，进行包装及γ射线辐照，得到大黄鱼鳔低聚肽HSBP-3。
实施例4大黄鱼鳔低聚肽的物质基础分析
本实施例为实施例1-3制备得到的3种大黄鱼鳔低聚肽的物质基础表征相关实验研究资料。
1.重均分子量及分子量分布
利用凝胶渗透色谱GPC法测定经优化后的实施例1-3制备得到的3种HSBP的分子量及分子量分布。结果如表1所示，三种大黄鱼鳔低聚肽的分子量均主要分布在＜1kDa范围内，HSBP-1和HSBP-2的＜1kDa肽段，分别占总量的92.49％和91.24％，HSBP-3中肽段分子量主要也分布在1kDa以下，占80.47％，1-3kDa之间占比18.72％，可见，经过本发明的精制大黄鱼鱼鳔中的胶原蛋白已经充分酶解成利于皮肤吸收的大黄鱼鳔低聚肽。
表1大黄鱼鱼鳔低聚肽的分子量及分子量分布
| Mw/Da | ＞3kDa | 1-3kDa | 0.5-1kDa | ＜500Da | |
| HSBP-1 | 480 | 0 | 7.550 | 21.448 | 71.045 |
| HSBP-2 | 511 | 0 | 8.759 | 25.290 | 65.950 |
| HSBP-3 | 738 | 0.813 | 18.724 | 36.593 | 43.879 |
2.蛋白含量分析
本实验按照GB 5009.5-2016的凯氏定氮法对分离纯化组分进行总蛋白含量测定。结果显示，HSBP-1、HSBP-2和HSBP-3的蛋白含量分别为：93.0±0.42％、92.6±0.45％和91.6±0.24％。
3.免疫原性分析
端肽是引起胶原免疫原性的主要物质。端肽清除率越高其免疫原性越低。本实验按照NCBI中大黄鱼I型胶原蛋白的氨基酸序列，利用鱼类I型胶原端肽检测试剂盒，对实施例1-3制备得到的三种大黄鱼鳔低聚肽中存在的端肽比例进行检测。按照下式计算端肽清除率：
对比后，可直观看到本发明中的大黄鱼鳔低聚肽制备工艺确实起到了良好的端肽清除效果。针对三个实施例的端肽清除率如表2所示，通过本发明制备的大黄鱼鳔低聚肽的端肽清除率可达95.50％-100％。
表2三种大黄鱼鳔低聚肽的端肽清除率(％)
| HSBP-1 | HSBP-2 | HSBP-3 | |
| 端肽清除率 | 100％ | 97.55％ | 95.50％ |
实施例5大黄鱼鳔低聚肽护肤的安全性评价
本实施例为实施例1-3制备得到的3种大黄鱼鳔低聚肽的安全性评价相关实验研究资料。
1.细胞毒性评价
为评价其生物安全性，采用CCK-8法来检测HSBP对人表皮细胞HaCaT的增殖率影响。
结果如图1所示，与空白对照组相比，浓度为50μg/mL、100μg/mL、2000μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的实施例1制备的大黄鱼鳔低聚肽HSBP对细胞的增殖率均超过100％，说明HSBP对细胞增殖有极显著促进作用，并且无细胞毒性。
2.眼刺激、腐蚀性评价
依据SN/T 2329-2009《化妆品眼刺激性，腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》进行眼刺激/腐蚀性评估。采用鸡胚绒毛膜尿囊膜刺激评分法(irritation score，IS)对大黄鱼鳔低聚肽进行眼刺激/腐蚀性评估。
评估结果如图2所示，按照标准方法评估，选用推荐最高浓度，取0.3ml，100mg/mlHSBP直接作用于CAM，确保至少50％的CAM表面被受试物覆盖，作用3min后，用生理盐水轻轻冲洗，在30s冲洗后观察结果，观察毒性效应变化的程度，可得HSBP的IS＝0，当刺激评分IS＜1时说明无刺激性，因此，可判定HSBP为无刺激性。
3.皮肤刺激性评价
依据SN/T 4577-2016《化妆品皮肤刺激性检测重建人体表皮模型体外测试方法》进行活性成分皮肤刺激/腐蚀性评估。对大黄鱼鳔低聚肽进行皮肤刺激/腐蚀性评估。采用皮肤刺激性(SIT-Skin Irritation Test)测试，HSBP组流程为：Episkin3D重组人皮肤模型孵育18±3h过夜，加25μL PBS润湿模型表面，加25mg HSBP粉末，超净台中反应30±1min后，PBS洗瓶清洗15次，换孔并加入0.9mL EpiRecovery孵育24h换液，共孵育42h后，将模型转移至24孔板0.3mL MTT工作液中孵育3h，吸弃MTT溶液，每孔加200μL PBS洗3次，转到新24孔板在模型内表面加2mL异丙醇密封4℃过夜，枪头刺穿模型混匀吸200μL异丙醇浸提液OD570nm。阴性对照采用0.9％氯化钠溶液，阳性对照则采用1％SDS溶液。
结果如图3和表3所示，大黄鱼鳔低聚肽对体外重组3D皮肤细胞增殖有促进作用，并且无细胞毒性；细胞存活率均高于50％，说明大黄鱼鳔低聚肽无刺激性。
表3HSBP的皮肤刺激性评价结果判断
实施例6大黄鱼鳔低聚肽的抗氧化损伤活性
本实施例为实施例1-3制备得到的3种大黄鱼鳔低聚肽的抗衰老性能表征相关实验研究资料。利用人皮肤细胞HACAT建立氧化损伤衰老皮肤模型，分析HSBP对内源氧化损伤修复活性，对优选出的鱼鳔低聚肽的抗氧化衰老功效进行评价。
利用1.0mmol/L H2O2建立HACAT细胞衰老模型。取生长状态良好的HACAT细胞，将细胞浓度调整至1×104/mL，取100μL加入96孔板中培养。观察细胞生长面积达到50％左右，向各孔中加入10μL含有H2O2的DMEM培养基诱导刺激，在二氧化碳培养箱中诱导2h后吸出含有H2O2的DMEM培养基，除空白对照组外各组进行H2O2诱导处理，空白对照组和氧化模型组加入100μL DMEM培养基，药物干预组加入含有HSBP的DMEM培养基，使终浓度为100μg/mL；在二氧化碳培养箱中37℃条件继续培养24h。
在H2O2诱导的氧化损伤模型中，ELISA法检测两种鱼鳔低聚肽对氧化衰老损伤细胞的I型胶原、Ⅲ型胶原及Ⅳ型胶原分泌的影响。结果如图4所示，分别给予氧化损伤皮肤细胞三种HSBP后，氧化损伤衰老细胞的Ⅰ型胶原含量与模型组相比均有着不同程度的显著的提升，说明HSBP能够显著促进氧化损伤皮肤Ⅰ型细胞胶原分泌。HSBP对氧化诱导后的衰老模型细胞的Ⅲ型胶原含量有一定程度的提高，但差异不显著(p＞0.05)，但HSBP能够显著促进(p＜0.01)氧化损伤细胞的Ⅳ型胶原分泌，可见，HSBP可显著促进氧化损伤皮肤细胞内I型胶原和Ⅳ型胶原的分泌。
研究大黄鱼鳔低聚肽对皮肤细胞β-半乳糖苷酶的影响。β-半乳糖苷酶是一种源于溶酶体的衰老标志物，能够在衰老细胞中增加溶酶体生物合成，是细胞衰老特异性标志物。将HACAT细胞接种到6孔板中。细胞经1.0mmol/L H2O2诱导完成后，加入含有各组药品的DMEM培养基，继续培养24h。按照β-半乳糖苷酶染色说明书中方法，对不同处理组的细胞进行固定和染色，染色工作液现用现配。固定完成后将孔板周围封好放在恒温培养箱中孵育过夜(染色过程不能在37℃的二氧化碳培养箱中进行)。孵育过夜后除去染色液加入2mL PBS缓冲液，置于倒置显微镜下选取五个区域进行蓝色染色细胞计数，计算阳性细胞所占总细胞数量的百分比，结果如图5所示，空白组的阳性染色细胞数量较少，大约占细胞总数量的15.5％，与空白组相比，经1.0mmol/L H2O2诱导的细胞阳性染色率明显上升(p<0.0001)，达到60.8％。经3种HSBP处理后被染色细胞数量均有显著下降(p<0.0001)。以上结果表明，3种大黄鱼鳔低聚肽均能有效地保护人皮肤细胞的氧化损伤，起到延缓衰老的作用。
实施例7大黄鱼鳔低聚肽的抗光老化活性
本实施例为实施例1-3制备得到的3种大黄鱼鳔低聚肽的抗衰老性能表征相关实验研究资料。利用体外重组3D人皮肤模型建立光老化模型，分析HSBP对外源光损伤的修复活性，对优选出的鱼鳔低聚肽的抗光老化功效进行评价。
利用暗箱式紫外仪照射UVA和UVB光，建立HACAT细胞光老化衰老模型。取生长状态良好的HACAT细胞，将细胞浓度调整至1×104/mL，取1000μL加入6孔板中培养。观察细胞生长面积达到50％左右，吸出各孔DMEM培养基，除空白对照组外，各组在暗箱式紫外仪中按照30J/cm2 UVA和50mJ/cm2 UVB剂量照射，诱导后在空白对照组和光老化模型组加入1mL DMEM培养基，药物干预组加入含有100μg/mL的3种HSBP的DMEM培养基，在二氧化碳培养箱中37℃条件继续培养24h，收集细胞培养上清，ELISA法检测三种大黄鱼鳔低聚肽对光老化损伤细胞的I型胶原分泌的影响，并研究其在促进透明质酸分泌中的作用。结果如图6，光老化模型组中透明质酸含量有一定程度下降，但空白组与模型组相比差异不显著(p＞0.05)，说明光损伤会使皮肤细胞HA含量下降，但下降不显著。但经过HSBP处理后，氧化损伤细胞透明质酸含量提升极显著(p＜0.001)，相较于模型组提升了37.3％，甚至透明质酸含量回升至高于空白组15％，说明HSBP可显著促进光老化皮肤细胞内透明质酸分泌。
通过qPCR对水通道蛋白(APQ3)表达水平进行了评价，研究鱼鳔低聚肽对水通道蛋白的作用。结果如图7所示，HSBP-1、HSBP-2和HSBP-3在促进光老化细胞APQ3表达上有显著促进作用，即对光老化细胞具有显著保湿作用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种具有抗皮肤衰老功效的鱼鳔低聚肽的深度精制方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取鱼鳔清洗、泡发，然后加入表面抗原去除液搅拌，搅拌结束后使用纯水清洗鱼鳔表皮，匀浆，得到除去端肽、表面糖蛋白及内毒素的鱼鳔匀浆；
(2)在所述步骤(1)的鱼鳔匀浆中加入纯水，再加入菠萝蛋白酶酶解，得到鱼鳔低聚肽酶解液；
(3)将所述步骤(2)的鱼鳔低聚肽酶解液过膜，然后加入活性炭脱色，离心收集上清并超滤至鱼鳔低聚肽酶解液澄清透明，得到鱼鳔低聚肽脱色液；
(4)将所述步骤(3)的鱼鳔低聚肽脱色液使用有机膜进行纳滤，收集得到鱼鳔低聚肽过膜液；
(5)将所述步骤(4)的鱼鳔低聚肽过膜液进行脱盐，收集得到鱼鳔低聚肽脱盐液；
(6)将所述步骤(5)的鱼鳔低聚肽脱盐液经冷冻干燥、包装、辐照，得到鱼鳔低聚肽。
2.根据权利要求1所述的深度精制方法，其特征在于：所述步骤(1)中表面抗原去除液与鱼鳔的表皮的液料比为15:1-30:1；加入表面抗原去除液的搅拌温度为2-8℃，搅拌时间为4-12h。
3.根据权利要求1所述的深度精制方法，其特征在于：所述表面抗原去除液是由浓度为0.5-1.5％的脱氧胆酸钠、浓度为0.05-0.10mol/L的磷酸二氢钠和酶活力为80-240U/g胃蛋白，混合配制而成的。
4.根据权利要求1所述的深度精制方法，其特征在于：所述步骤(2)中菠萝蛋白酶的添加量为2000-4000U/g，其酶解温度为45-50℃，酶解时间为200-360min。
5.根据权利要求1所述的深度精制方法，其特征在于：所述步骤(3)中活性炭的粒径位60-120目，其添加量为所述鱼鳔低聚肽酶解液体积的0.3％-0.5％，脱色温度为50-65℃，脱色时间为30-50min。
6.根据权利要求1所述的深度精制方法，其特征在于：所述步骤(3)中超滤采用的是100μm的陶瓷膜，陶瓷膜分离实验机的运行温度为20-25℃，压力为0.30MPa-0.38MPa，流速为27-45mL/min。
7.根据权利要求1所述的深度精制方法，其特征在于：所述步骤(4)中纳滤使用的是700Da的有机纳滤膜，有机膜分离实验机的压力为0.21MPa-0.26MPa，流速为27-45mL/min，温度为20-25℃；当过膜液体体积与未过膜液体积达到5:1时，停止有机膜实验机工作，收集得到鱼鳔低聚肽过膜液。
8.根据权利要求1所述的深度精制方法，其特征在于：所述步骤(5)中脱盐使用的是200Da的有机纳滤膜，有机膜分离实验机的压力为0.21MPa-0.26MPa，流速为30-60mL/min，温度为20-25℃。
9.权利要求1-8任一项所述的深度精制方法制备得到的鱼鳔低聚肽，其特征在于：所述鱼鳔低聚肽的蛋白含量高于91％，重均分子量＜1kDa。
10.权利要求9所述的鱼鳔低聚肽在制备具有抗衰老和/或保湿功效的化妆品和/或护肤品中的应用。
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