CN106381323A - 一种弹性蛋白肽及其制备方法、应用 - Google Patents

一种弹性蛋白肽及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有美容作用的弹性蛋白肽及其制备方法和用途，其制备方法包括以下步骤：取牛颈韧带预处理后，与水混合，调节pH值后，与蛋白酶混合后酶解，灭酶，离心、过滤收集滤液；取滤液，浓缩，干燥，制得所述弹性蛋白肽。本发明方法利用生物酶解技术，从牛颈韧带弹性蛋白中释放出具有美容功效的生物活性肽。采用本发明方法制得的牛颈韧带弹性蛋白肽的抗皱补水功效明显，可显著提高皮肤中的含水量和血清中透明质酸的含量，并能显著增加皮肤中胶原蛋白及弹性蛋白的含量。

Description

一种弹性蛋白肽及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及弹性蛋白的精深加工领域，具体涉及一种弹性蛋白肽及其制备方法、应用。
背景技术
弹性蛋白(Elastin)是人体组织器官(如动脉、肺部、皮肤)中重要的结构蛋白，其特殊的交联和疏水结构赋予其良好的弹性、延展性，使组织器官维持良好的延展性和弹性。皮肤中的成纤维细胞在青春期前能够合成分泌弹性蛋白，而青春期后则几乎不再合成弹性蛋白。随着年龄的增长，皮肤中的弹性蛋白酶被激活，弹性蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂之间的平衡被打破，弹性蛋白被不断降解，因此皮肤逐步出现松弛和皱纹。
此外，皮肤中75％的水分储存在真皮层中，由胶原蛋白和弹性蛋白形成的胶原纤维和弹性纤维是真皮层中细胞间质的重要成分，纤维间质中充满了丰富的粘多糖和蛋白质复合体，如透明质酸等，对保持肌肤水润具有重要意义。因此，当弹性蛋白被降解时，其构成的弹性纤维的结构发生改变甚至导致永久性损伤，降低了对粘多糖和蛋白质复合体的保持作用，皮肤中水分含量下降，使皮肤干燥、暗哑，导致皱纹的产生。
当今社会老龄化情况加剧，及快节奏的生活工作导致早衰的发生，人们对抗衰老的护肤品、保健品的需求不断增加。而在皮肤衰老防治中，目前采取的方法主要是从外界补充胶原蛋白以达到减少胶原蛋白的降解和流失，延缓皱纹的产生和皮肤的进一步老化的目的。此外，还有利用一些天然抗氧化剂(如维生素E)和天然提取物的抗氧化活性减少自由基对皮肤的损伤。
上述方法都能在一定程度上起到抗皱、抗衰老的功效。如胶原蛋白能够补充皮肤中羟脯氨酸和胶原蛋白的含量，能起到一定的保湿作用；而抗氧化活性物质主要通过清除体内的过氧自由基，减少其对细胞膜等细胞结构的攻击以达到修复皮肤的目的。但其作用较为单一，不能多方面共同作用。因此，寻找抗皱功效显著、安全的抗皱保水产品已成为必然的趋势。
食源性蛋白多肽具有安全、健康的优势，是食品配料和潜在药物的重要来源，且小分子多肽容易被人体吸收而发挥特殊的生理功能。弹性蛋白不仅是皮肤中重要的结构蛋白，其衍生物弹性蛋白肽更能作为信号因子与弹性蛋白受体蛋白结合，影响成纤维细胞、角质细胞的分化，促进成纤维细胞合成分泌胶原蛋白和弹性蛋白。但是弹性蛋白结构稳定，不溶于稀酸、稀碱、水和乙醇等溶剂，因此较难被利用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种弹性蛋白肽及其制备方法、应用，该方法的要点在于采用生物酶解技术释放牛颈韧带中蛋白多肽的美容活性成分。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种弹性蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取牛颈韧带预处理后，与水混合，调节pH值后，与蛋白酶混合后酶解，灭酶，离心、过滤收集滤液；
步骤2：取步骤1获得的滤液，浓缩，干燥，制得所述弹性蛋白肽。
其中所述蛋白酶可以来自微生物蛋白酶。
牛颈韧带中弹性蛋白含量丰富(约为75％)，且较易取得，利用多种商业蛋白酶共同作用，实现对牛颈韧带中弹性蛋白的生物酶解，制取其中的活性多肽，不仅可以提高其附加值，更能拓宽其应用范围，具有积极的社会意义和广阔的市场前景。在本发明提供的一些具体实施方案中，所述的制备方法步骤1中所述蛋白酶为蛋白酶A和/或蛋白酶B，所述蛋白酶A选自木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶Alphalase NP或中性蛋白酶Neutrase，所述蛋白酶B选自复合蛋白酶Protamex或动物蛋白水解酶。
在本发明提供的一些具体实施方案中，所述的制备方法步骤1中所述蛋白酶A的添加量为所述牛颈韧带质量的0.5～1.0％，所述蛋白酶B的添加量为所述牛颈韧带质量的0.4～0.8％。
在本发明提供的一些具体实施方案中，所述的制备方法步骤1中所述酶解的条件为：在pH值为7.0，50-60℃下酶解10～20小时。
在本发明提供的一些具体实施方案中，所述的制备方法步骤1中所述预处理为取所述牛颈韧带清洗，在碱性条件下，于40～50℃下浸泡1～2小时，去除表面脂肪及杂质，水洗至中性后沥干、绞碎。
作为优选，所述碱性条件为加入相对于牛颈韧带2～3倍质量的0.1MNaOH溶液。
在本发明提供的一些具体实施方案中，所述的制备方法步骤1中所述水的添加量与所述牛颈韧带的质量比为(2～3):1；
步骤1中所述调节pH值采用的pH值调节剂为0.5mol/L的NaOH溶液或0.5mol/L的HCl溶液；
步骤1中所述离心为5000r/min离心15min；所述过滤为透过500目绢布进行过滤。
在本发明提供的一些具体实施方案中，所述的制备方法步骤2中所述浓缩为浓缩至固形物的质量百分含量为35～45％。
本发明还提供了所述的制备方法制得的弹性蛋白肽。
本发明还提供了所述弹性蛋白肽在制备具有美容功效的护肤品和/或保健品中的应用。
本发明还提供了一种具有美容功效的护肤品和/或保健品，包括所述的弹性蛋白肽和可接受的辅料。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)由于牛颈韧带表面含有大量的油脂和杂质(如黏膜和牛肉)，不仅会影响蛋白酶解效果，还会降低弹性蛋白肽的纯度，增加产品油脂氧化变质的机率。本发明方法首先对牛颈韧带在碱性条件下加热处理，促使牛颈韧带的油脂和其他非弹性蛋白成分分离出来，从而达到纯化牛颈韧带蛋白原料的目的。
(2)本发明方法利用生物酶解技术，利用不同蛋白酶活性位点的协同作用，从牛颈韧带蛋白中释放出具有美容作用的生物活性肽。采用本发明方法制得的牛颈韧带弹性蛋白肽的抗氧化、保湿、抗皱功效明显，可显著提高皮肤中的含水量以及胶原蛋白含量。
(3)本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染，所得弹性蛋白肽的抗衰老活性强。
具体实施方式
本发明公开了一种弹性蛋白肽及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的在于提供由上述方法制得的具有美容功效的弹性蛋白多肽。
本发明的再一目的在于提供上述弹性蛋白多肽的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有美容功效的弹性蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)弹性蛋白肽的制备：牛颈韧带洗净，加入其2-3倍质量的0.1M NaOH溶液，在40～50℃下浸泡1-2小时，去除表面脂肪及杂质，水洗至中性后沥干、绞碎。加入软化水，调节体系pH值至7.0，搅拌加热至50-60℃，加入蛋白酶50-60℃下保温10～20小时，灭酶，离心并过滤取上清液。
(2)将上清液真空浓缩至固形物约为35-45％，喷雾干燥得弹性蛋白多肽。
作为优选，步骤(1)中，加水是加入牛颈韧带碎肉质量2～3倍的水；
作为优选，步骤(1)中，调节体系pH值是用0.5mol/L的NaOH溶液或HCl溶液调节；
作为优选，步骤(1)中，所述的离心是5000r/min离心15min；透过500目绢布进行过滤。
作为优选，步骤(1)中，所述蛋白酶为蛋白酶A和/或蛋白酶B，所述蛋白酶A选自木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶Alphalase NP或中性蛋白酶Neutrase，所述蛋白酶B选自复合蛋白酶Protamex或动物蛋白水解酶。优选诺维信公司的中性蛋白酶(Neutrase)和复合蛋白酶(Protamex)。蛋白酶A的添加量为牛颈韧带肉糜质量的0.5～1.0％，蛋白酶B的添加量为牛颈韧带肉糜质量的0.4～0.8％。
由上述方法制得的牛颈韧带弹性蛋白肽可用于制备具有美容功效的护肤品和保健品，在应用时，可以将其与具有抗氧化作用的天然提取物复配使用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)由于牛颈韧带表面含有大量的油脂和杂质(如黏膜和牛肉)，不仅会影响蛋白酶解效果，还会降低弹性蛋白肽的纯度，增加产品油脂氧化变质的机率。本发明方法首先对牛颈韧带在碱性条件下加热处理，促使牛颈韧带的油脂和其他非弹性蛋白成分分离出来，从而达到纯化牛颈韧带蛋白的目的。
(2)本发明方法利用生物酶解技术，利用不同蛋白酶活性位点的协同作用，从牛颈韧带蛋白中释放出具有美容作用的生物活性肽。采用本发明方法制得的牛颈韧带弹性蛋白肽的抗氧化、保湿、抗皱功效明显，可显著提高皮肤中的含水量以及胶原蛋白含量。
(3)本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染，所得弹性蛋白肽的抗衰老活性强。
本发明实施例中所涉及的试验指标其实验方法如下：
(1)还原力的测定
2mL样品加到2mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.6)和2mL 1％(g/L)的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2mL 10％(g/L)的三氯乙酸，混合后以3000r/min离心10min，取2mL上清液与2mL蒸馏水以及0.4mL 0.1％(g/L)氯化铁溶液在反应试管中反应，10min后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大则表明该样品的还原力越强。
(2)氧自由基清除能力(ORAC)测定方法
基于ORAC反应在75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)环境中进行，FL(荧光素钠盐)、AAPH(自由基产生剂)、标准抗氧化物质Trolox(维生素E水溶性类似物)以及待测样品均用该缓冲液溶解和稀释。具体测定操作为：在96孔板各微孔中分别加入待测样品20μL后添加缓冲溶液20μL及FL(70nmol/L)20μL，在37℃下预置15min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH(12.8mmol/L)140μL启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37℃下以激发波长485nm，发射波长528nm进行连续测定，每2min测定一次各孔荧光强度，测定108min，荧光强度分别记为f0，f1，f2···f54。将记录的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据fi与初始荧光强度f0相比，折算成相对荧光强度，并根据公式如下公式统计荧光熄灭曲线下面积(AUCsample)值，
AUC = 1 + Σ i = 1 54 f i / f 0
然后根据公式：net AUC＝AUCsample-AUCblank分别计算不同浓度Trolox和抗氧化剂net AUC值，其中AUC blank为没有抗氧化剂存在时自由基作用对照的AUC值。
(3)ABTS·+清除能力测定
ABTS·+储备液的制备：以去离子水将ABTS和过硫酸钾K2S2O8分别溶解并混合，使其终浓度分别为7mmol/L和2.45mmol/L，在室温避光条件下静置12-16h。测定时，将ABTS·+储备液以磷酸盐缓冲液(0.2M,pH 7.4)稀释，使其在734nm时吸光度达0.70±0.02，形成ABTS·+测定液。取4.0mLABTS·+测定液，加入40μL样品稀释液或Trolox，准确振荡30s，测定反应6min后在734nm处的吸光值。Trolox浓度在0-4mmol/L时具有较好的线性关系。每个样品至少测定三个浓度并呈线性关系，计算平均Trolox当量，即TEAC值。
(4)小鼠功效验证试验
(a)实验材料
动物：KM小鼠，SPF级，体重18～22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证为SCXK(粤)2013-0020。
BALBc-nu裸小鼠，SPF级，3-4周龄，雄性。繁育单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号为：11400700127555。药品与试剂：硫化钠(广州化学试剂厂，生产批号：20101004-2)，D-半乳糖(Sigma-Aldrich公司，生产批号：101622565)，羟脯氨酸碱水解试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号：20150418)，透明质酸ELISA试剂盒(武汉俊泰生物科技技术公司，生产批号：15041605)，弹性蛋白ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，生产批号：201511)。
仪器：离心机(湘仪，TG16-WS台式离心机)，匀浆机(天根，1001110)，分析天平(METTLER TOLEDO，EL204)，电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司DHG-9070A)，恒温水浴箱(精宏XMTD-8222)，全波长酶标仪(Thermo scientific multiskango 1510)。
(b)实验方法：
i：正常小鼠功效验证实验
KM小鼠，雌雄各半，随机分成空白组、胶原蛋白肽组和弹性蛋白肽组(3组，分别为弹性蛋白肽A、弹性蛋白肽B及弹性蛋白肽C)每组10只。受试样品给药剂量均为250mg/kg。灌胃给药28天，空白对照组给予同体积蒸馏水，实验前一天背部用电动剃毛刀去毛约4cm×4cm。末次给药1h后，眼眶静脉丛取血，离心(3500g，5min)取其血清，用透明质酸ELISA试剂盒检测透明质酸含量。
动物处死，取1cm×1cm皮肤，称重，置于80℃的烘箱中，12h后称取其重量，用湿重减去干重得到其含水量；另取部分皮肤，刮除皮下脂肪，用乙醚吸干，剪成碎块，称取80mg置10ml试管中，加入水解液，检测皮肤中羟脯氨酸含量，根据羟脯氨酸含量计算皮肤胶原蛋白含量(胶原蛋白含量＝羟脯氨酸含量/0.13)。取100mg的无毛皮肤进行组织匀浆，离心后取其上清液进行皮肤透明质酸含量检测。
ii：皮肤衰老模型小鼠功效验证实验
取BALBc-nu裸鼠，在实验环境下(屏障系统)正常喂养检疫观察7天。随机分为6组，每组8只，分别为：正常对照组(0.2ml/10g蒸馏水)、模型对照组(0.2ml/10g蒸馏水)、胶原蛋白肽组(0.83g/kg胶原蛋白)、弹性蛋白肽A组(0.0125g/kg弹性蛋白肽A)、弹性蛋白肽B组(0.0125g/kg弹性蛋白肽B)和弹性蛋白肽C组(0.0125g/kg弹性蛋白肽C)。除空白组外每日颈背皮下注射10％D-gal1.0g·kg-1，空白组每日颈背部皮下注射等体积的生理盐水(normalsaline,NS)，同时进行UV照射，UV照射波长为350～400nm,照射时间是40min·d-1，光源距鼠约40cm垂直高处，持续造模40d。空白组裸鼠正常光照词养，于造模第11d开始，除空白组和模型组外每日按剂量灌胃给予相应样品，空白组和模型组则每日灌胃等体积的蒸馏水，连续喂食30d。
测定皮肤中胶原蛋白肽的含量。
统计学处理：所有数据均以表示，采用spss16.0统计软件处理，各组组间差异比较采用t检验方法，P<0.05为差异具有统计学意义。
本发明提供的弹性蛋白肽及其制备方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，Alphalase NP购自杰能科公司，Protamex购自诺维信公司，Neutrase购自诺维信公司，动物蛋白水解酶购自南宁庞博生物工程有限公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一种具有美容功效的弹性蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)牛颈韧带洗净，加入2倍质量的0.1MNaOH溶液，在50℃下浸泡1小时，去除表面脂肪及杂质，水洗至中性后沥干、绞碎。
(2)加入2倍水，调节体系pH值至7.0，水浴搅拌加热至50℃，加入牛颈韧带肉糜质量1.0％的Neutrase 0.8L(诺维信公司)和牛颈韧带肉糜质量0.4％的Protamex(诺维信公司)，在50℃下保温20小时，95℃下加热15min灭酶，5000r/min下离心15min并过500目绢布进行分离，取透过液，得到弹性蛋白肽液。
(3)将弹性蛋白肽液真空浓缩至固形物约为35％，喷雾干燥得弹性蛋白肽A。
弹性蛋白肽A的抗氧化值(还原力、ORAC值和ABTS·+清除率)如表1。
弹性蛋白肽A对KM小鼠皮肤含水量和血清透明质酸含量的影响如表2。
弹性蛋白肽A对KM小鼠皮肤胶原蛋白和羟脯氨酸含量的影响如表3。
弹性蛋白肽A对模型裸鼠皮肤弹性蛋白含量的影响如表4。
实施例2
一种具有美容作用的牛颈韧带弹性蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)牛颈韧带洗净，加入3倍质量的0.1MNaOH溶液，在40℃下浸泡1小时，去除表面脂肪及杂质，水洗至中性后沥干、绞碎。
(2)加入3倍水，调节体系pH值至7.0，水浴搅拌加热至60℃，加入牛颈韧带肉糜质量0.5％的Alphalase NP 0.8L(杰能科公司)和牛颈韧带肉糜质量0.8％的Protamex(诺维信公司)，在60℃下保温10小时，95℃下加热15min灭酶，5000r/min下离心15min并过500目绢布进行分离，取透过液，得到弹性蛋白肽液。
(3)将弹性蛋白肽液真空浓缩至固形物约为45％，喷雾干燥得弹性蛋白肽B。
弹性蛋白肽B的抗氧化值(还原力、ORAC值和ABTS·+清除率)如表1。
弹性蛋白肽B对KM小鼠皮肤含水量和血清透明质酸含量的影响如表2。
弹性蛋白肽B对KM小鼠皮肤胶原蛋白和羟脯氨酸含量的影响如表3。
弹性蛋白肽B对模型裸鼠皮肤弹性蛋白含量的影响如表4。
实施例3
一种具有美容作用的牛颈韧带弹性蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)牛颈韧带洗净，加入2.5倍质量的0.1MNaOH溶液，在45℃下浸泡1.5小时，去除表面脂肪及杂质，水洗至中性后沥干、绞碎。
(2)加入2.5倍水，调节体系pH值至7.0，水浴搅拌加热至60℃，加入牛颈韧带肉糜质量0.8％的Neutrase 0.8L(诺维信公司)和0.6％Protamex(诺维信公司)，在55℃下保温15小时，95℃下加热15min灭酶，5000r/min下离心15min并过500目绢布进行分离，取透过液，得到弹性蛋白肽液。
(3)将弹性蛋白肽液真空浓缩至固形物约为40％，喷雾干燥得弹性蛋白肽C。
弹性蛋白肽C的抗氧化值(还原力、ORAC值和ABTS·+清除率)如表1。
弹性蛋白肽C对KM小鼠皮肤含水量和血清透明质酸含量的影响如表2。
弹性蛋白肽C对KM小鼠皮肤胶原蛋白和羟脯氨酸含量的影响如表3。
弹性蛋白肽C对模型裸鼠皮肤弹性蛋白含量的影响如表4。
对比例
一种胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)取罗非鱼皮洗净，沥干，绞碎。
(2)加入2倍水，调节体系pH值至7.0，水浴搅拌加热至55℃，加入鱼皮肉糜质量0.5％的Neutrase 0.8L(诺维信公司)和0.8％Protamex(诺维信公司)，在60℃下保温10小时，95℃下加热15min灭酶，5000r/min下离心15min并过500目绢布进行分离，取透过液，得到胶原蛋白肽液。
(3)将胶原蛋白肽液真空浓缩至固形物约为45％，喷雾干燥得胶原蛋白肽。
胶原蛋白肽的抗氧化值(还原力、ORAC值和ABTS·+清除率)如表1。
胶原蛋白肽对KM小鼠皮肤含水量和透明质酸含量的影响如表2。
胶原蛋白肽对KM小鼠皮肤胶原蛋白和羟脯氨酸含量的影响如表3。
胶原蛋白肽对模型裸鼠皮肤弹性蛋白含量的影响如表4。
实施例5
动物实验结果见表1～表4。
表1 实施例及对照例产品的抗氧化活性
注：**表示与胶原蛋白肽组比较p<0.01。
由表1可发现，对比例中的胶原蛋白肽有一定的抗氧化性(还原力、ORAC值和ABTS·+清除率)，但抗氧化活性较弱，而在同样制备条件下的弹性蛋白肽(A、B和C)的抗氧化能力优于胶原蛋白肽，且ORAC值稍高于胶原蛋白肽，还原力和ABTS·+清除率远优于胶原蛋白肽(p<0.01)。这是因为原料中氨基酸组成不同，蛋白酶酶解后得到的抗氧化肽的数量和抗氧化活性均不同，从而导致对比例胶原蛋白肽抗氧化性能明显弱于实施例弹性蛋白肽(A、B和C)。
表2 实施例及对照例产品对KM小鼠皮肤含水量和血清中透明质酸含量的影响
注：*表示与模型组比较p<0.05,**表示与模型组比较p<0.01。
表3 实施例及对照例产品对KM小鼠皮肤中羟脯氨酸和胶原蛋白含量的影响
注：*表示与空白组比较p<0.05,**表示与空白组比较p<0.01。
抗氧化活性为体外检测指标，并不能直接反映体内的美容功效。而利用KM小鼠实验进行美容功效验证实验可直接体现实施列(弹性蛋白肽A、B和C)和对比例(胶原蛋白肽)的抗皱补水功效。
表2和表3体现出本发明实施例和对比例产品对成年KM小鼠皮肤含水量、血清透明质酸含量以及皮肤中羟脯氨酸和胶原蛋白含量的影响。皮肤含水量可直观表达皮肤的湿润度，而透明质酸是皮肤中重要的保湿因子，血液中透明质酸的含量可侧面反应皮肤的保水能力。因此本实验测定皮肤含水量和血清透明质酸含量表征皮肤的持水能力。实施例1～3制得的弹性蛋白肽(A、B和C)在处理第30天后，均可明显增加皮肤的含水量(p<0.05，p<0.01)。弹性蛋白肽A和弹性蛋白肽C可极显著增加KM小鼠血清透明质酸的含量(p<0.01)，弹性蛋白B有增加血清透明质酸的趋势(p>0.05)。与弹性蛋白肽相比，胶原蛋白肽的补水效果较差，对KM小鼠皮肤的含水量没有明显提升作用；血清中透明质酸有一定的增加趋势，但并无显著变化(p>0.05)。说明对比例制得的胶原蛋白肽补水效果差，而实施例制得的弹性蛋白肽能够具有显著的补水功效。
表4 实施例及对照例产品对模型裸鼠皮肤中弹性蛋白含量的影响
注：*表示与空白组比较p<0.05,**表示与空白组比较p<0.01。
胶原蛋白是皮肤中重要的结构蛋白，与弹性蛋白一起组成了皮肤的“支架”，而羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸成分。通过表征羟脯氨酸能够间接表征胶原蛋白和胶原蛋白肽的含量，而胶原蛋白含量能够反应皮肤的弹性。通过测定羟脯氨酸和胶原蛋白的含量能够显示抗皱功效。
表3显示，服用对比例的胶原蛋白肽后，KM小鼠皮肤中胶原蛋白含量有增加趋势(p>0.05)，而服用实施例的弹性蛋白肽(A、B和C)后，可显著增加皮肤中胶原蛋白的含量(p<0.05)，说明实施例1、2和3制得的弹性蛋白肽抗皱功效优于对比例胶原蛋白肽。
弹性蛋白是细胞外基质中不溶性、大分子纤维状蛋白质，它同一种名为“微纤维”的结构糖蛋白共同组成结缔组织中的弹性纤维。弹性蛋白可拉伸数倍于原来的长度，因此享有“人体橡胶”的美称，弹性蛋白也因此而被命名，弹性蛋白主要的生物学特性是使组织赋有弹性，而且可以作为细胞外基质的主要成分起着细胞间黏附与支持作用，它与胶原等一起维持这组织机构的稳定性。表4显示，与正常对照组相比，模型组裸鼠皮肤中弹性蛋白含量明显降低(p<0.01)。服用对比例的胶原蛋白肽后，裸鼠皮肤中弹性蛋白含量无明显增加，而服用实施例的弹性蛋白肽(A、B和C)后，可显著增加皮肤中弹性蛋白的含量(p<0.05orp<0.01)，说明实施例1、2、和3的弹性蛋白肽增强皮肤弹力的功效显著优于胶原蛋白肽。
综上所述，对比例胶原蛋白肽具有一定的美容护肤的作用，而实施例1、2、和3的弹性蛋白肽具有显著的补水抗皱功效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种弹性蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取牛颈韧带预处理后，与水混合，调节pH值后，与蛋白酶混合后酶解，灭酶，离心、过滤收集滤液；
步骤2：取步骤1获得的滤液，浓缩，干燥，制得所述弹性蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述蛋白酶为蛋白酶A和/或蛋白酶B，所述蛋白酶A选自木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶Alphalase NP或中性蛋白酶Neutrase，所述蛋白酶B选自复合蛋白酶Protamex或动物蛋白水解酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶A的添加量为所述牛颈韧带质量的0.5～1.0％，所述蛋白酶B的添加量为所述牛颈韧带质量的0.4～0.8％。
4.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述酶解的条件为：在pH值为7.0，50～60℃下酶解10～20小时。
5.根据权利要求1至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述预处理为取所述牛颈韧带清洗，在碱性条件下，于40～50℃下浸泡1～2小时，去除表面脂肪及杂质，水洗至中性后沥干、绞碎。
6.根据权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述水的添加量与所述牛颈韧带的质量比为(2～3):1；
步骤1中所述调节pH值采用的pH值调节剂为0.5mol/L的NaOH溶液或0.5mol/L的HCl溶液；
步骤1中所述离心为5000r/min离心15min；所述过滤为透过500目绢布进行过滤。
7.根据权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述浓缩为浓缩至固形物的质量百分含量为35～45％。
8.根据权利要求1至7任一项所述的制备方法制得的弹性蛋白肽。
9.根据权利要求8所述的弹性蛋白肽在制备具有美容功效的护肤品和/或保健品中的应用。
10.一种具有美容功效的护肤品和/或保健品，其特征在于，包括如权利要求8所述的弹性蛋白肽和可接受的辅料。
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