CN112057361A - 一种预防uvb诱导的皮肤光老化组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种预防UVB诱导的皮肤光老化组合物及其应用。所述预防UVB诱导的皮肤光老化组合物包括胶原蛋白和表没食子儿茶素没食子酸酯。将所述组合物制成预防皮肤光老化液，所述预防皮肤光老化液中，所述胶原蛋白的浓度为1.4‑1.6mg/mL，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为18‑22mg/mL。所述组合物应用于制备预防皮肤光老化护肤品和预防皮肤光老化药物。本发明预防UVB诱导的皮肤光老化组合物采用表没食子儿茶素没食子酸酯和胶原蛋白协同抵抗UVB诱导的皮肤光老化，可以有效保护皮肤免受UVB诱导的皮肤光老化，起到预防皮肤损伤的作用，并可应用于制备抗光老化的产品。

Description

一种预防UVB诱导的皮肤光老化组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种预防UVB诱导的皮肤光老化组合物及其应用。

背景技术

紫外线(UV)是皮肤受损，引起光老化的主要危险因素之一。根据波长，紫外线可分为三种类型：UVA(320-400nm)，UVB(280-320nm)和UVC(100-280nm)。尽管UVC对生物体有害，但由于其波长短，因此难以通过大气到达地球表面。与UVA相比，由于UVB的波长较短且具有更强的生物学效应，因此由UVB引起的皮肤损害更为严重。UVB辐射会刺激活性氧(ROS)的产生，从而引起氧化应激和皮肤的炎症反应，从而导致组织损伤。ROS的过量生成会通过消耗内源性抗氧化剂并降低抗氧化剂酶的活性来破坏氧化应激的动态平衡，例如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。在UVB诱导的组织损伤期间，丙二醛(MDA)是由过量产生的ROS诱导的脂质过氧化物。MDA的积累会引起蛋白质和核酸的氧化损伤，从而导致细胞毒性。MDA的增加会激活细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管粘附分子(VCAM)因子，从而引起炎症性肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达增加。此外，过量的ROS与炎性细胞因子会通过增加基质金属蛋白酶(MMP)的产生和激活来分解细胞外基质成分，从而导致皮肤结构受损。紫外线辐射对人体有多种有害影响，长期暴露在阳光下是导致光老化的主要原因。

为了减少和防止由UVB辐射引起的皮肤损害，使用光化学保护剂对皮肤光老化的干扰已成为研究热点。然而现有技术中，大多预防UVB诱导的皮肤光老化药物抗光老化效果不明显，其效果有待进一步提高。因此，开发具有更有效的抗光老化配方产品，如生产出具有预防皮肤光老化的有益性能的治疗药物或化妆品，保护皮肤免受UVB诱导的皮肤光老化，且具有低抗原性和良好的生物相容性，具有十分重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预防UVB诱导的皮肤光老化组合物及其应用，该组合物采用表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和胶原蛋白协同抵抗UVB诱导的皮肤光老化，可以有效保护皮肤免受UVB诱导的皮肤光老化，起到预防皮肤损伤的作用，并可应用于制备抗光老化配方产品。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，包括表没食子儿茶素没食子酸酯和胶原蛋白。

进一步的，所述的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，包括如下重量份的原料：胶原蛋白1.4-1.6份、表没食子儿茶素没食子酸酯18-22份。

本发明通过采用胶原蛋白和EGCG协同作用，可以减轻氧化应激，保护皮肤表皮和胶原结构免受辐射损伤，可以有效预防皮肤免受UVB诱导的皮肤光老化。胶原蛋白和EGCG使用联合使用对UVB引起的皮肤氧化损伤的优异和较为全面保护的作用，可明显减轻UVB所致的氧化损伤，恢复SOD和GSH-Px活性，减少MDA和TNF-α的产生，恢复胶原含量。此外，胶原蛋白能维持皮肤胶原纤维的排列和完整性，局部应用结构完整的胶原对病理性光老化具有良好的抑制作用。EGCG是茶叶中主要的多酚成分具有很强的抗氧化性。EGCG的有效抗氧化作用包括直接清除ROS是由于苯环上的二羟基或三羟基，允许电子离域和自由基猝灭。本发明通过将胶原蛋白与EGCG协同作用，可以有效保护皮肤免受UVB诱导的皮肤光老化，起到预防皮肤损伤的作用，有望成为皮肤抗光老化的潜在剂型。本发明的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物具有低抗原性和良好的生物相容性。

进一步的，所述胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：

(1)将经过粉碎的动物组织粉碎置于醋酸-胃蛋白酶溶液中，进行搅拌提取，得到混合物A；

(2)将混合物A离心后，收集上清液后加入NaOH溶液使pH至中性，将胶原沉淀析出，析出的胶原水洗后再用醋酸溶解后，得到胶原液；

(3)采用超滤纯化柱对胶原液纯化，并不断加入去离子水直至得到pH为4.8-5.2的纯化后胶原蛋白液。

现有技术中通常采用水解胶原蛋白，即胶原蛋白肽代替完整的胶原蛋白，而且胶原蛋白肽的应用多为口服给药，而本申请采用完整的胶原具有完整的三螺旋结构，其优越的功能意义使其有利于各种生物医学应用，可用于组织修复中最有前途的生物材料。

进一步的，所述步骤(1)中，所述动物组织为牛跟腱组织，所述搅拌和提取温度为18-22℃，搅拌提取时间为70-74h。本发明的胶原蛋白采用未水解的胶原，保留了牛肌腱胶原蛋白的完整结构，在UVB诱导的光老化过程具有良好的抗氧化作用。提取方法工艺简单，提取效率高。

进一步的，所述步骤(2)中，利用等电点沉淀使胶原沉淀析出。本发明通过采用等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离，有利于提高胶原蛋白的纯度。

进一步的，所述步骤(3)中，采用超滤纯化柱对胶原液进行纯化。有利于提高胶原蛋白的纯度。

本发明还提供一种上述预防UVB诱导的皮肤光老化组合物的应用，将所述组合物制成预防皮肤光老化液，所述预防皮肤光老化液中，所述胶原蛋白的浓度为1.4-1.6mg/mL，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为18-22mg/mL。

进一步的，所述组合物应用于制备预防皮肤光老化护肤品和预防皮肤光老化药物。

本发明通过将胶原蛋白和EGCG的组合，具有良好的协同预防皮肤损伤的作用，以生产出具有预防皮肤光老化的有益性能的护肤品和药物。

本发明的有益效果：本发明预防UVB诱导的皮肤光老化组合物采用表没食子儿茶素没食子酸酯和胶原蛋白协同抵抗UVB诱导的皮肤光老化，可以有效保护皮肤免受UVB诱导的皮肤光老化，起到预防皮肤损伤的作用，并可应用于制备抗光老化的产品。

附图说明

图1为提取胶原蛋白的鉴定与结构分析图，其中图1a为电泳图谱，图1b为Ⅰ型胶原的紫外光谱。

图2为紫外线照射及药物治疗对裸鼠皮肤外观的影响。

图3为抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)(a)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(b)活性检测图(n＝3；^***P<0.001，^**P<0.01，与MC比较；^###P<0.001，^##P<0.01)。

图4为裸鼠皮肤组织中丙二醛(MDA)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的检测曲线图。丙二醛(MDA)含量(a)；TNF-α测定采用ELISA(b)和Western Blot(c)。(n＝3；^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05，与MC比较。)

图5为裸鼠皮肤组织中胶原相关指标的曲线图。羟脯氨酸(HYP)含量测定(a)；基质金属蛋白酶-1(MMP-1)ELISA分析(b)和Western Blot(c)。(n＝3；^**P<0.01，^*P<0.05，与MC比较)。

图6为裸鼠皮肤组织的组织病理学特征。在紫外线照射30天后，对皮肤组织进行H&E染色(a)和Masson染色(b)分析。测量并绘制表皮厚度(c)。(n＝3；^***P<0.001，与NC比较；^####P<0.001，^#P<0.05。)

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

在本发明一种典型的实施方式中，一种预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，包括表没食子儿茶素没食子酸酯和胶原蛋白。

进一步的，所述的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，包括如下重量份的原料：胶原蛋白1.4-1.6份、表没食子儿茶素没食子酸酯18-22份。

进一步的，所述胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：

(1)将经过粉碎的动物组织粉碎置于醋酸-胃蛋白酶溶液中，进行搅拌提取，得到混合物A；

(2)将混合物A离心后，收集上清液后加入NaOH溶液使pH至中性，将胶原沉淀析出，析出的胶原水洗后再用醋酸溶解后，得到胶原液，

(3)采用超滤纯化柱对胶原液纯化，并不断加入去离子水直至得到pH为4.8-5.2的纯化后胶原蛋白液。

进一步的，所述步骤(1)中，所述动物组织为牛跟腱组织，所述搅拌和提取温度为18-22℃，搅拌提取时间为70-74h。本发明的胶原蛋白采用未水解的胶原，保留了胶原蛋白的完整结构，在UVB诱导的光老化过程具有良好的抗氧化作用。提取方法工艺简单，提取效率高。

进一步的，所述步骤(2)中，利用等电点沉淀使胶原沉淀析出。所述步骤(3)中，采用超滤纯化柱对胶原液进行纯化。有利于提高胶原蛋白的纯度。

本发明还提供一种上述预防UVB诱导的皮肤光老化组合物的应用，将所述组合物制成预防皮肤光老化液，所述预防皮肤光老化液中，所述胶原蛋白的浓度为1.4-1.6mg/mL，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为18-22mg/mL。

进一步的，所述组合物应用于制备预防皮肤光老化护肤品和预防皮肤光老化药物。

实施例1

1.1材料

胶原提取自牛跟腱(陕西秦宝牧业有限公司)，以实验室现有成熟工艺进行胶原提取与纯化。EGCG、Masson染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、羟脯氨酸(HYP)试剂盒和H&E染色试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所。BCA蛋白浓度测定试剂盒来自上海碧云天生物科技有限公司。MMP-1、TNF-αELISA试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司。MMP-1、TNF-α抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。其他试剂均为市售分析纯级。裸鼠购于南方医科大学实验动物中心，合格证明编号：44002100021245。

1.2胶原提取纯化与分析

1.2.1胶原提取与纯化

所述胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：将粉碎的牛跟腱组织置于醋酸-胃蛋白酶溶液中，在20℃环境中搅拌提取72h，低温离心收集上清液后加入1mol/L NaOH溶液使pH至中性，利用等电点沉淀使胶原沉淀析出，析出的胶原水洗3次后再用稀醋酸溶解为1mg/mL的胶原液，在低温环境中用超滤纯化柱对胶原液纯化，并不断加入去离子水直至得到pH≈5的纯化胶原液。

1.2.2胶原分析

紫外光谱法对纯化胶原进行鉴定，将纯化胶原液用紫外-可见分光光度计(日本岛津)在190-600nm进行波谱扫描，并与标准品图谱对比最大紫外吸收光谱进行鉴定。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对纯化胶原进行结构分析，配制体积分数为10％分离胶和体积分数为5％浓缩胶，80V恒压电泳。电泳结束后将分离胶置于考马斯亮蓝染色液中染色，乙酸-乙醇脱色液脱色至分离胶背景色透明。电泳条带与标准品对比分析。

实施例2

本实施例中，所述预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，包括如下重量份的原料：胶原蛋白1.5份、表没食子儿茶素没食子酸酯20份。

进一步的，所述胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：

(1)将经过粉碎的动物组织粉碎置于醋酸-胃蛋白酶溶液中，进行搅拌提取，得到混合物A；

(2)将混合物A离心后，收集上清液后加入NaOH溶液使pH至中性，将胶原沉淀析出，析出的胶原水洗后再用醋酸溶解后，得到胶原液，

(3)采用超滤纯化柱对胶原液纯化，并不断加入去离子水直至得到pH为5的纯化后胶原蛋白液。

进一步的，所述步骤(1)中，所述动物组织为牛跟腱组织，所述搅拌和提取温度为20℃，搅拌提取时间为72h。

进一步的，所述步骤(2)中，利用等电点沉淀使胶原沉淀析出。所述步骤(3)中，采用超滤纯化柱对胶原液进行纯化。

本实施例还提供一种上述预防UVB诱导的皮肤光老化组合物的应用，将所述组合物制成预防皮肤光老化液，所述预防皮肤光老化液中，所述胶原蛋白的浓度为1.5mg/mL，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为20mg/mL。

进一步的，所述组合物应用于制备预防皮肤光老化护肤品和预防皮肤光老化药物。

实施例3

本实施例中，所述预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，包括如下重量份的原料：胶原蛋白1.4份、表没食子儿茶素没食子酸酯18份。

进一步的，所述胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：

(1)将经过粉碎的动物组织粉碎置于醋酸-胃蛋白酶溶液中，进行搅拌提取，得到混合物A；

(2)将混合物A离心后，收集上清液后加入NaOH溶液使pH至中性，将胶原沉淀析出，析出的胶原水洗后再用醋酸溶解后，得到胶原液；

(3)采用超滤纯化柱对胶原液纯化，并不断加入去离子水直至得到pH为4.8的纯化后胶原蛋白液。

进一步的，所述步骤(1)中，所述动物组织为牛跟腱组织，所述搅拌和提取温度为18℃，搅拌提取时间为74h。

进一步的，所述步骤(2)中，利用等电点沉淀使胶原沉淀析出。所述步骤(3)中，采用超滤纯化柱对胶原液进行纯化。

本实施例还提供一种上述预防UVB诱导的皮肤光老化组合物的应用，将所述组合物制成预防皮肤光老化液，所述预防皮肤光老化液中，所述胶原蛋白的浓度为1.4mg/mL，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为18mg/mL。

进一步的，所述组合物应用于制备预防皮肤光老化护肤品和预防皮肤光老化药物。

实施例4

本实施例中，所述预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，包括如下重量份的原料：胶原蛋白1.6份、表没食子儿茶素没食子酸酯22份。

进一步的，所述胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：

(1)将经过粉碎的动物组织粉碎置于醋酸-胃蛋白酶溶液中，进行搅拌提取，得到混合物A；

(2)将混合物A离心后，收集上清液后加入NaOH溶液使pH至中性，将胶原沉淀析出，析出的胶原水洗后再用醋酸溶解后，得到胶原液；

(3)采用超滤纯化柱对胶原液纯化，并不断加入去离子水直至得到pH为5的纯化后胶原蛋白液。

进一步的，所述步骤(1)中，所述动物组织为牛跟腱组织，所述搅拌和提取温度为22℃，搅拌提取时间为70h。

进一步的，所述步骤(2)中，利用等电点沉淀使胶原沉淀析出。所述步骤(3)中，采用超滤纯化柱对胶原液进行纯化。

本实施例还提供一种上述预防UVB诱导的皮肤光老化组合物的应用，将所述组合物制成预防皮肤光老化液，所述预防皮肤光老化液中，所述胶原蛋白的浓度为1.6mg/mL，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为22mg/mL。

进一步的，所述组合物应用于制备预防皮肤光老化护肤品和预防皮肤光老化药物。

实施例5

5.1裸鼠皮肤光老化研究

各分组具体处理方法：将25只雄性裸鼠随机分成5组，每组5只。

1.空白对照组(NC)：正常喂养，不给予药物和紫外线照射处理。

2.UVB辐射模型组(MC)：裸鼠背部涂布蒸馏水，每只裸鼠每天涂布剂量约为0.5mL。在涂布完成后30分钟，将裸鼠暴露于强度为80μW/cm²的UVB照射41分钟(即UVB辐射剂量为200mJ/cm²)。每天涂布蒸馏水和UVB辐射处理1次。

3.EGCG处理后UVB辐射组(T-EGCG)：配制20mg/mL的EGCG溶液，将其涂布于裸鼠背部皮肤，每只裸鼠每天涂布剂量约为0.5mL。在涂布完成后30分钟，将裸鼠暴露于强度为80μW/cm²的UVB照射41分钟(即UVB辐射剂量为200mJ/cm²)。每天涂布药物和UVB辐射处理1次。

4.胶原溶液处理后UVB辐射组(T-Col)：使用实验室提取纯化所得1.5mg/mL胶原溶液，将其涂布于裸鼠背部皮肤，每只裸鼠每天涂布剂量约为0.5mL。在涂布完成后30分钟，将裸鼠暴露于强度为80μW/cm²的UVB照射41分钟(即UVB辐射剂量为200mJ/cm²)。每天涂布药物和UVB辐射处理1次。

5.胶原与EGCG混合液处理后UVB辐射组(T-Comb)：将1.5mg/mL胶原溶液与20mg/mL的EGCG溶液混合，然后涂布于裸鼠背部皮肤，每只裸鼠每天涂布剂量约为0.5mL。在涂布完成后30分钟，将裸鼠暴露于强度为80μW/cm²的UVB照射41分钟(即UVB辐射剂量为200mJ/cm²)。每天涂布药物和UVB辐射处理1次。

药物治疗和UVB照射每天一次，每天拍摄数码照片记录皮肤形态变化。30天后处死裸鼠，分离背部皮肤组织进行病理生化分析。

5.2 GSH-Px、SOD、MDA和HYP测定

皮肤标本浸泡于9mL生理盐水(4℃)中，用玻璃匀浆管在冰水浴中均质10％组织匀浆，然后在4℃下离心(中国上海安亭科学仪器厂)。收集上清液进行GSH-Px、MDA和HYP测定，剩余部分用生理盐水稀释，得到1％组织匀浆用于SOD和蛋白质含量分析。所有生化指标的检测都是按照试剂盒说明书进行的。

5.3 TNF-α和MMP-1测定

根据试剂盒说明书，使用ELISA试剂盒(中国武汉基因美)用5.2方法获得的10％组织匀浆上清液，测定裸鼠皮肤组织中MMP-1和TNF-α的浓度。

5.4蛋白免疫印迹分析

用Western Blot法检测MMP-1和TNF-α在裸鼠皮肤组织中的表达。将5.2中所述的10％组织匀浆上清液添加到SDS-PAGE样品装载缓冲液中，并煮沸使蛋白质变性。蛋白质样品经SDS-PAGE分离，用电印迹法将蛋白质转移到0.22μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜置于封闭缓冲液(150mM NaCl、20mM Tris HCl、0.1％吐温20和5％脱脂牛奶)中室温下2小时，然后与制备的抗体(MMP-1抗体，TNF-α抗体，武汉三鹰)溶液在4℃下孵育过夜。用TBST(150mM NaCl、20mM Tris-HCl和0.1％吐温20)洗涤3次，并在室温下用二级抗体(HRP标记的山羊抗兔，中国)溶液培养2小时。在PVDF膜上加入增强化学发光溶液(ECL)后，用KwikQuant成像仪进行观察，并用Image Pro Plus软件进行分析。

5.5皮肤组织病理学分析

从裸鼠背部采集的皮肤样本在4％多聚甲醛中浸泡24小时，在一系列分级乙醇中脱水，包埋在石蜡中，用旋转切片机切成薄片(德国莱卡)。用H&E染色和Masson染色对约5μm的切片进行表皮厚度和真皮胶原结构分析。在光学显微镜(日本奥林巴斯公司)下观察每个染色皮肤样本，放大100倍。

5.6统计检验

所有实验均在三个独立试验(n≥3)中进行，结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。使用GraphPad

6软件通过单因素方差分析和Tukey的多重比较对数据进行分析。P<0.05视为具有统计学显著性差异。

实施例6

6.1提取胶原蛋白的鉴定与结构分析

天然胶原蛋白呈三螺旋结构，相对分子量约为300kDa。从动物肌腱中提取的Ⅰ型胶原通常以异三聚体(两条α1链和1条α2链)出现。在图1a中，α1带、α2带、β带(二聚体)和γ带(三聚体)的成分清楚地显示出来。130kDa附近有两条带，一条带代表α1肽链，另一条带代表α2肽链。β带是α肽链的二聚体，其相对分子质量约为250kDa。250kDa以上的带为α肽链三聚体的γ带。电泳图谱符合胶原蛋白标准，说明提取的胶原蛋白结构完整，纯度较高。Ⅰ型胶原的紫外光谱如图1b所示，胶原的最大紫外吸收峰在235nm附近。峰的形状和最大吸收峰的位置与文献报道的Ⅰ型胶原的紫外吸收特征峰一致。

6.2 UVB辐射及药物处理对裸鼠皮肤的影响

如图2所示，NC组皮肤较光滑，无明显皱纹。然而，暴露于UVB的小鼠(MC组)出现明显的片状红斑，皮肤较粗糙，有皱纹和脱皮。T-EGCG、T-Col和T-Comb组也有明显皱纹和轻微红斑。但与MC组比较，表皮粗糙度减轻，无明显皮屑。此外，T-Comb组皮肤表现出优于T-EGCG和T-Col的性能。

6.3皮肤组织中SOD和GSH-Px活性测定

紫外线辐射对皮肤的光损伤，产生氧自由基，会刺激抗氧化酶活性的降低。因此，对裸鼠皮肤组织中抗氧化酶SOD(图3a)和GSH-Px(图3b)的活性水平进行评估。UVB照射后，MC的SOD和GSH-Px酶活性均显著降低。与MC组比较，T-EGCG组SOD活性显著升高，GSH-Px酶活性无显著性差异。而T-Col和T-Comb均表现出明显的SOD和GSH-Px酶活性的提高。此外，T-Comb的SOD活性高于T-EGCG和T-Col，在GSH-Px活性方面，T-Comb高于T-EGCG，但与T-Col相比无显著性差异。

6.4皮肤组织MDA和TNF-α水平的评估

MDA是自由基诱导的组织损伤过程中产生的脂质过氧化物，MDA的积累会引起蛋白质和核酸的修饰，导致细胞毒性和TNF-α等炎性细胞因子的表达增加。作为过氧化反应的有害产物，测定皮肤组织中MDA(图4a)和TNF-α(图4b，c)的水平。

UVB照射后MC中MDA含量显著增加。药物治疗后，T-EGCG、T-Col和T-Comb组的MDA水平低于MC组。如图4b所示，用ELISA法测定裸鼠皮肤组织匀浆中TNF-α的含量。UVB照射引起TNF-α含量显著增加。MC组比NC组增加51.39％。T-EGCG、T-Col和T-Comb与MC相比，TNF-α水平显著降低。用Western印迹分析进一步测定裸鼠皮肤匀浆中TNF-α的蛋白表达(图4c)。与ELISA结果一致，MC组受UVB照射后TNF-α表达显著增加。另外，药物治疗后，T-Col和T-Comb组与MC组相比有降低的趋势，而T-EGCG和MC之间无明显变化。

6.5皮肤组织中HYP和MMP-1的检测

胶原蛋白是真皮的主要成分，HYP和MMP-1水平可分别代表胶原纤维和胶原降解。为了研究裸鼠皮肤组织中胶原蛋白的含量，本发明评估了HYP(图5a)和MMP-1(图5b，c)的水平。

在图5a中，与NC组相比，UVB照射后MC组的HYP含量显著降低，表明组织中的胶原蛋白正在流失。与MC相比，T-EGCG组、T-Col组和T-Comb组的HYP含量显著增加，胶原水平得到恢复。如图5b所示，用ELISA法测定裸鼠皮肤组织匀浆中MMP-1的含量。UVB照射使MMP-1含量显著增加，MC的MMP-1含量与NC相比增加到161.01％。T-EGCG和T-Col组与MC相比无明显变化，但T-Comb组MMP-1含量明显低于MC组。用Western Blot法检测了MMP-1在裸鼠皮肤组织匀浆中的表达，与ELISA结果吻合良好。同样，UVB照射后MMP-1蛋白表达显著增加。T-EGCG和T-Col与MC相比无明显变化，但MMP-1蛋白在T-Comb中的表达明显低于MC。

6.6皮肤组织的组织病理学特征

用H&E染色法分析裸鼠皮肤组织的组织学结构(图6a)。发现MC皮肤表皮明显增厚、剥落、皱纹明显、角化、真皮纤维排列紊乱、腺体异常增多，说明UVB辐射对皮肤组织结构有显著影响。NC组皮肤细胞排列紧密，表皮无明显皱褶，皮肤结构完整，纤维排列均匀。与正常对照组相比，T-EGCG、T-Col、T-Comb表皮较厚，微皱。虽然药物治疗不能完全保护皮肤组织免受光损伤，但损伤程度明显减轻，T-Comb损伤程度最低。测量各组表皮厚度，并与NC比较(图3c)。MC、T-EGCG和T-Col具有显著的表皮厚度，但T-Comb和NC之间没有显著差异。T-EGCG的表皮厚度也显著高于T-Comb。

用Masson三色染色进一步对皮肤组织进行形态学表征(图6b)，皮肤胶原染色为蓝色。MC真皮层胶原纤维排列较疏松。同时，药物治疗组与NC组无明显差异，NC组胶原纤维排列均匀，排列紧密。

光老化皮肤具有明显的组织学和临床特征，包括明显的表皮增厚、表皮破裂、表皮细胞异常、真皮成熟胶原减少、纤维排列紊乱、皮肤松弛、皱纹增多。MC组可见皮肤皱褶、基质成分降解(由HYP降低和MMP-1升高)和表皮真皮增厚，表明UVB暴露成功地建立了裸鼠皮肤光老化动物模型。通过药物治疗，这些UVB引起的组织损伤得以恢复。同时，胶原蛋白和EGCG的联合应用也显示出最小的皮肤损伤，与正常皮肤相比，恢复的胶原蛋白含量和可比的表皮厚度证明了这一点。本发明通过动物实验和分子生物学分析，检测相关指标，说明胶原蛋白和EGCG联合应用对抑制或减轻UVB辐射引起的光老化十分有效。

本发明制得的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物为EGCG-胶原蛋白复合制剂，能维持皮肤胶原纤维的排列和完整性，应用结构完整的胶原对病理性光老化具有良好的抑制作用，与EGCG协同作用，可以减轻氧化应激，如上述结果所示，可以保护皮肤表皮和胶原结构免受辐射损伤，有望成为皮肤抗光老化的潜在制剂。

本实施例中的所有技术特征均可根据实际需要而进行自由组合。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，其特征在于：包括胶原蛋白和表没食子儿茶素没食子酸酯。

2.根据权利要求1所述的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，其特征在于：包括如下重量份的原料：胶原蛋白1.4-1.6份、表没食子儿茶素没食子酸酯18-22份。

3.根据权利要求1所述的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，其特征在于：所述胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：

(1)将经过粉碎的动物组织粉碎置于醋酸-胃蛋白酶溶液中，进行搅拌提取，得到混合物A；

(2)将混合物A离心后，收集上清液后加入NaOH溶液使pH至中性，将胶原沉淀析出，析出的胶原水洗后再用醋酸溶解后，得到胶原液；

(3)采用超滤纯化柱对胶原液纯化，并不断加入去离子水直至得到pH为4.8-5.2的纯化后胶原蛋白液。

4.根据权利要求3所述的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，其特征在于：所述步骤(1)中，所述动物组织为牛跟腱组织，所述搅拌和提取温度为18-22℃，搅拌提取时间为70-74h。

5.根据权利要求3所述的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，其特征在于：所述步骤(2)中，利用等电点沉淀使胶原沉淀析出。

6.根据权利要求3所述的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物，其特征在于：所述步骤(3)中，采用超滤纯化柱对胶原液进行纯化。

7.一种如权利要求书1-6任意一项所述的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物的应用，其特性在于：将所述组合物制成预防皮肤光老化液，所述预防皮肤光老化液中，所述胶原蛋白的浓度为1.4-1.6mg/mL，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为18-22mg/mL。

8.一种如权利要求书1-6任意一项所述的预防UVB诱导的皮肤光老化组合物的应用，其特征在于：所述组合物应用于制备预防皮肤光老化护肤品和预防皮肤光老化药物。

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