KR20180080736A

KR20180080736A - 당나귀 사골 저분자 젤라틴 펩타이드를 활용한 피부 광노화 방지 및 주름 억제용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20180080736A
Application number: KR1020170001470A
Authority: KR
Inventors: 장애라; 김정수; 김동욱; 김희진
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2017-01-04
Filing date: 2017-01-04
Publication date: 2018-07-13
Also published as: KR101900717B1

Abstract

본 발명은 당나귀 사골 저분자 젤라틴 펩타이드를 활용한 피부 광노화 방지 및 주름 억제용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 당나귀 사골로부터 가공시간, 에너지 및 열처리 시간을 최소화함으로써 그 물질이 가지고 있는 고유한 기능성 화합물의 파괴를 간소화하고, 효율적으로 젤라틴을 추출하는 방법을 제공한다. 더 나아가, 본 발명은 제조된 당나귀 사골 젤라틴을 활용하여, 기능성이 우수한 저분자 젤라틴 펩타이드 분리함으로써, 피부 광노화 방지 및 주름억제용 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

Description

당나귀 사골 저분자 젤라틴 펩타이드를 활용한 피부 광노화 방지 및 주름 억제용 화장료 조성물 {Cosmetic composition with small molecule gelatin peptide from donkey bone for anti-wrinkle and anti-aging of skin}

본 발명은 피부 광노화 방지 및 주름 억제용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 당나귀 사골 저분자 젤라틴 펩타이드를 활용한 피부 광노화 방지 및 주름 억제용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 우리나라 사회는 젊음과 아름다움, 중장년층과 고령인구의 삶의 질을 추구하는 트렌드로 급속히 확산되고 있다. 이에 따라 건강수명 외에도 아름답게 사는 것 즉, 피부 노화에 대한 관심이 증가하고 있고, 이를 늦추고자 하는데에 끊임없는 투자와 소비를 아끼지 않고 있다.

피부 노화 방지에 대한 관심은 젊은 세대부터 시작하는데, 각 연령대에 맞는 화장품 시장의 개척과 21세기 고령화 사회의 진입으로 인해, 피부미용에 대한 소비자층의 범위는 점점 다양해지고 확대될 것으로 예상된다.

피부 노화의 원인으로는 내인성 노화와 외인성 노화로 나누어 설명할 수 있다. 내인성 노화의 원인은 주로 유전적인 요인이라 할 수 있으며, 외인성 노화의 원인은 외부에서 유래된 요인으로 흡연, 음주, 영양부족, 자외선, 환경 등이 있다. 특히, 안면 피부의 경우, 만성적 자외선 노출이 전체 노화 중 80% 이상 되는 것으로 알려져 있다.

자외선은 그 파장에 따라 UVA, UVB, UVC로 나뉘는데, 이 중 UVB는 인체 내 침투하여 피부 내 활성산소 생성을 유도한다. 생성된 활성산소는 산화적 스트레스 및 항산화 기전의 불균형을 유발하여, 피부 주름, 건조, 피부홍반, 색소침착, 등의 피부손상을 유발한다. 또한, UVB 노출은 피부 세포 내 신호전달 체계에 영향을 주어 DNA 변성을 초래하고, 콜라겐, 엘라스틴과 같은 피부 결체조직을 감소시킨다.

이러한 피부 노화에 대해, 인체는 피부 내 카탈레이스(catalase), 슈페록사이드(superoxide) 및 디스뮤테이스(SOD) 등의 항산화효소를 작용시키고, vitamin E, C 및 폴리페놀류 등의 생리활성 물질은 자외선에 의해 생성된 체내 활성산소 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 이러한 방어 네트워크는 나이가 증가함에 따라 그 기능이 약화되는 문제가 있다.

그러므로, 피부 광노화 방지 및 주름 생성 억제를 위해 활성산소 즉, 자유라디칼을 소거할 수 있는 항산화 기능 소재의 개발이 요구되며, 콜라게네이스 및 엘라스테이스 활성 억제, 자외선에 대한 피부 보호 효과 기능을 통해 피부 광노화 및 주름과 같은 피부질환을 예방하기 위한 소재 개발이 요구된다.

예로부터 당나귀는 사육하기 쉽고 온순하여 사람 및 사물을 운반하는 데 이용되어 왔으며, 기계화된 현대에서 조차 당나귀의 존재는 홍보, 교육, 치료, 등 그 가치가 지속적으로 증가하고 있다. 특히, 동의보감에 의하면, 당나귀의 아교는 피부미용 및 피부질환 개선에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 자유라디칼을 소거할 수 있는 항산화 기능이 있는 것으로 알려져 있다.

하지만, 당나귀 부산물인 사골을 이용한 소재 개발 및 연구는 아직까지 미흡한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0000142호 (공개일자 2016.01.04)에는, 말 사골 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 또는 피부 노화 억제용 화장료 조성물 및 말 사골 추출물을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 대한민국 공개특허 제10-1525876호 (등록일자 2015.05.29)에는, 당나귀 껍질로부터 아교를 제조하는 방법 및 그 아교를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 기재되어 있다.

본 발명은 고온고압추출을 이용하여 당나귀 부산물인 사골로부터, 효율적으로 젤라틴을 추출할 수 있는 방법 및 기능성이 우수한 저분자 젤라틴 펩타이드를 분리할 수 있는 방법을 이용하여, 피부 광노화 방지 및 주름 생성 억제 효과를 갖는 화장료 조성물을 개발함으로써, 당나귀 부산물인 사골의 부가가치를 상승시키고자 하였다.

본 발명은 당나귀 사골로부터 젤라틴을 추출하는 단계 (a); 상기 단계 (a)에서 추출한 젤라틴에 단백질분해효소를 첨가하여 가수분해하는 단계 (b); 상기 단계 (b)의 가수분해 후, 3 kDa 이하의 저분자펩타이드 분리하는 단계 (c);를 포함하는 과정으로부터 분리된 저분자펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부주름생성억제용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 당나귀 사골로부터 젤라틴을 추출하는 단계 (a); 상기 단계 (a)에서 추출한 젤라틴에 단백질분해효소를 첨가하여 가수분해하는 단계 (b); 상기 단계 (b)의 가수분해 후, 3 kDa 이하의 저분자펩타이드 분리하는 단계 (c);를 포함하는 과정으로부터 분리된 저분자펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부광노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 단계 (a)는, 바람직하게 동일한 당나귀 사골에 대해 반복해서 수행하는 것이 좋다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 가수분해는, 바람직하게 서로 다른 종류의 단백질분해효소를 사용하여 복수 회 수행하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게 푸드프로알칼린프로테아제(FoodPro Alkaline Protease, Dupont genencor) 및 프로테아제엠(Protease M, Amano)의 2종류 효소를 사용하되, 먼저 푸드프로알칼린프로테아제 효소를 처리하고, 그 후, 프로테아제엠 효소를 처리하는 것이 좋다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 단계 (b)는, 바람직하게 가수분해 후, 단백질분해효소를 불활성화시키는 것이 좋다 .

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 당나귀 사골은, 바람직하게 물에 담궈 놓아 핏물을 제거한 것이 좋다. 더욱 바람직하게 상기 당나귀 사골은, 핏물을 제거한 후, 가열하여 지방을 제거한 것이 좋다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 젤라틴 추출은, 바람직하게 당나귀 사골에 물을 첨가한 후, 100℃ 이상의 온도에서, 1 kgf/cm² 이상의 압력을 가하여 추출하는 것이 좋다 .

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 단계 (a)에서 추출한 젤라틴은, 바람직하게 단백질분해효소 첨가 전에 농도를 3.5~5.0 brix로 조정하는 것이 좋다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 3 kDa 이하의 저분자펩타이드는, 바람직하게 가수분해물을 여과막에 통과시킴으로써 분리하는 것이 좋다.

본 발명은 당나귀 사골로부터 가공시간, 에너지 및 열처리 시간을 최소화함으로써 그 물질이 가지고 있는 고유한 기능성 화합물의 파괴를 간소화하고, 효율적으로 젤라틴을 추출하는 방법을 제공한다. 더 나아가, 제조된 당나귀 사골 젤라틴을 활용하여, 기능성이 우수한 저분자 젤라틴 펩타이드 분리함으로써, 피부 광노화 방지 및 주름억제용 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

도 1은 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 제조 과정 모식도이다.
도 2는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한, 피부세포 내 독성 실험 측정 결과이다.
도 3은 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한, 자외선 조사에 따른 세포 회복률 측정 결과이다.
도 4는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한, 자외선 조사에 따른 피부세포의 형태학적 특성 관찰 결과이다.

도 1은 본 발명 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 제조 과정 모식도인데, 이를 참조하여 본 발명의 화장료 조성물에 대해 하기에서 각 단계별로 구체적으로 설명하기로 한다.

<단계 (a): 젤라틴 추출>

본 단계는 당나귀 사골로부터 젤라틴을 추출하는 단계이다.

본 단계에서 사용하는 당나귀 사골은 바람직하게 전처리로써, 물에 담궈 놓아 핏물을 제거한 것을 사용하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 핏물을 제거한 후, 가열하여 지방을 제거한 것을 사용하는게 좋다.

상기 당나귀 사골의 전처리는, 당나귀 사골을 찬물에 침수하여 핏물(혈액) 제거과정을 진행한 뒤, 수세 및 가열함으로써, 불순물, 지방을 제거하기 위함이다.

상기 핏물 제거과정은 당나귀 사골을 바람직하게 4℃ 찬물에 12시간 이상 침수시켜 사골 내 존재하는 혈액을 제거하는 과정이며, 상기 수세는 당나귀 사골을 흐르는 찬물에 수세하여 사골 표면에 존재하는 불순물을 제거하는 과정이다.

또한, 상기 가열은 수세된 당나귀 사골을 95~105℃ 끓는 물에 투입하여 15~25분 동안 가열함으로써, 당나귀 사골에 붙어있는 살점, 불순물 및 지방을 제거하는 과정이다. 또한, 살점, 불순물 및 지방층이 제거된 후에는 다시 흐르는 찬물에 수세하는 것이 바람직하다.

상기의 과정을 통해 혈액, 불순물 및 지방 등이 제거된 당나귀 사골은, 하기 가수분해단계에서 진행되는 효소분해 과정에서, 효소의 기질로써 젤라틴을 제외한 외부물질에 대한 단백질가수분해 작용이 발생하지 않기 때문에, 단백질분해효소를 이용하여 높은 수율의 젤라틴 가수분해물을 획득할 수 있다.

한편, 본 단계의 상기 젤라틴 추출은, 바람직하게 당나귀 사골에 물을 첨가한 후, 100℃ 이상의 온도에서, 1 kgf/cm² 이상의 압력을 가하여 추출하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게 100℃ 이상의 온도이되, 추출용기가 열에 의해 녹지 않을 정도의 온도를 가하는 것이 좋고, 더욱 바람직하게 '1 kgf/cm² 이상의 압력이되, 추출용기가 압력에 의해 터지지 않을 정도의 압력을 가하는 것이 좋다. 일 예로는 100~200℃의 온도에서 1~3 kgf/cm²의 압력을 가하여 추출하는 것이 좋다.

본 단계 (a)의 젤라틴 추출은 바람직하게 동일한 당나귀 사골에 대해 반복해서 수행하는 것이 좋고, 더욱 바람직하게 3회에 걸쳐 반복수행하는 것이 좋다. 일 예로써 1~3차 (총 3회)에 걸쳐 젤라틴을 수득하는 과정을 설명하자면 하기와 같다. 1차 젤라틴 추출 단계는 상기 당나귀 사골 전처리 단계를 통해 전처리된 당나귀 사골 400 g을 물 600 mL와 혼합하여 고온고압 조건하에 젤라틴을 추출하고 여과하는 단계로, 121℃에서 1.5 kgf/cm²의 압력으로 1시간 동안 추출 및 여과하는 단계이다. 2차 젤라틴 추출 단계는 상기 1차 젤라틴 추출 단계를 통해 1차 젤라틴을 추출하고, 1차 여과된 당나귀 사골은 동일한 조건으로 다시 물 600 mL과 혼합하고 121℃의 온도와 1.5 kgf/cm²의 압력으로 1시간 동안 추출 및 여과하는 단계로 이루어진다. 3차 젤라틴 추출 단계는 상기 2차 젤라틴 추출 단계를 통해 2차 젤라틴을 추출하고, 2차 여과된 당나귀 사골 또한 동일한 조건으로 물 600 mL와 혼합하여, 121℃의 온도와 1.5 kgf/cm²의 압력으로 1시간 동안 추출 및 여과하는 단계로 이루어진다.

상기 1~3차 젤라틴 추출 단계를 통해 수득된 젤라틴을 혼합하여 사용하는데, 상기와 같이 젤라틴 추출과정을 3차에 걸쳐 반복하게 되면, 당나귀 사골에 함유된 젤라틴의 추출 효율성이 향상되며, 당나귀 사골 젤라틴 추출에 있어, 가공시간, 에너지 및 열처리 시간을 최소화함으로써, 그 물질이 가지고 있는 고유한 기능성 화합물의 파괴를 최소화할 수 있다.

상기 1~3차 젤라틴 추출 단계에서 진행되는 여과과정은 150 μm의 입자를 걸러낼 수 있는 여과장치를 사용하는 것이 바람직하다.

<단계 (b): 가수분해>

본 단계는 상기 단계 (a)에서 추출한 젤라틴에 단백질분해효소를 첨가하여 가수분해하는 단계이다.

바람직하게는 상기 1~3차 젤라틴 추출물의 혼합 단계로부터 수득된 젤라틴 혼합물을 3.5~5 Brix로 맞춘 뒤, 단백질분해효소를 첨가하여 가수분해 과정을 실시하는 것이 좋다.

또한, 본 단계의 상기 가수분해는, 바람직하게 서로 다른 종류의 단백질분해효소를 사용하여 복수 회 수행하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 푸드프로알칼린프로테아제(FoodPro Alkaline Protease, Dupont genencor) 및 프로테아제엠(Protease M, Amano)의 2종류 효소를 사용하되, 먼저 푸드프로알칼린프로테아제 효소를 처리하고, 그 후, 프로테아제엠 효소를 처리하는 것이 좋다.

푸드프로 알칼린 프로테아제(FoodPro Alkaline Protease, Dupont genencor)는 Bacillus licheniformis에서 유래한 단백질분해효소이고, 프로테아제 엠(Protease M, Amano)은 Aspergillus oryzae에서 유래한 단백질분해효소이다.

이들 두 효소를 사용하는 과정을 더욱 자세하게 설명하자면, 젤라틴 혼합물을 3.5~5 Brix로 맞춘 뒤 푸드프로 알칼린 프로테아제를 젤라틴 고형분 무게 대비 0.1~0.2%를 첨가하여 1~2시간 동안 가수분해한 후, 곧바로 프로테아제 엠을 젤라틴 고형분 무게 대비 0.1~0.2%를 첨가하여 1~2시간 동안 추가적인 가수분해를 실시하는 것이다.

상기 젤라틴 가수분해 단계는 바람직하게 45℃에서 진행되었으며, 결과적으로 총 3~4시간 동안 진행될 수 있다. 상기 젤라틴 가수분해 단계에서 pH의 설정은 푸드프로 알칼린 프로테아제의 경우 pH 6.0~8.0에서, 프로테아제 엠의 경우 pH 4.0~6.0로 설정하는 것이 좋다. 이때, 상기 젤라틴 용액은 일반적으로 pH가 7.0 근방이므로, 상기 젤라틴 효소 가수분해 단계에서 푸드프로 알칼린 프로테아제 효소는 추가적인 산·염기 첨가 없이 이용될 수 있고, 프로테아제 엠 효소는 상기 젤라틴 용액에 1 N-HCL을 첨가하여 pH 4.0~6.0으로 조정한 후 이용하는 것이 좋다.

젤라틴 용액에 대해 두 가지 효소를 병행하여 사용하는 것은, 효소의 기질 위치를 다양하게 해줌으로써, 고분자의 젤라틴으로부터 다양한 저분자 펩타이드를 생성할 수 있어, 결과적으로 피부 광노화 방지 및 주름억제의 기능을 상승시킬 수 있기 때문이다.

상기 단백질가수분해 단계는 완료 후 효소 불활성화 단계를 추가로 진행하는 것이 바람직하다. 상기 효소 불활성화단계는 상기 가수분해로부터 얻어진 가수분해물을 90~100℃에서 10~20분간 가열하여 상기 효소의 가수분해를 정지시킬 수 있다.

젤라틴을 단백질분해효소로 가수분해하는 과정은 당나귀 사골 젤라틴을 저분자로 세분화하는 과정이며, 저분자 펩타이드 제조 단계에서 우수한 기능성을 나타내는 저분자 펩타이드 분해물의 수율을 향상시킬 수 있다.

<단계 (c): 저분자펩타이드 분리>

본 단게는 상기 단계 (b)의 가수분해 후, 3 kDa 이하의 저분자펩타이드 분리하는 단계이다. '3 kDa 이하의 저분자펩타이드라 함'은 아미노산이 2개 이상 결합되어 형성된 펩타이드로서, 3 kD 이하의 크기를 갖는 저분자펩타이드를 의미한다.

본 단계의 상기 3 kDa 이하의 저분자펩타이드는 바람직하게 가수분해물을 여과막에 통과시킴으로써 분리하는 것이 좋다.

상기 효소 불활성화 단계를 거친 가수분해물은 다양한 분자량을 갖는 펩타이드를 함유할 수 있는데, 맴브레인 필터막 (3 kDa 통과)을 통과시킴으로써, 3 kDa 이하의 저분자 펩타이드를 분리할 수 있다. 이후, 동결건조를 실시함으로써 제품화된 저분자 펩타이드 분말을 제조할 수 있다.

상기의 과정으로부터 저분자 펩타이드의 형태를 갖는 저분자 분해물로써, 당나귀 사골 젤라틴을 이용한 피부 광노화 방지 및 주름 억제용 화장료 조성물의 제조가 완료되며, 동결건조의 과정을 통해 분말형태로 보관하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 당나귀 사골로부터 저분자 펩타이드의 수득]

당나귀 사골 1 kg을 찬물에 침수하고 12시간 이상 4℃에 방치하여, 혈액을 제거한 후, 흐르는 물에 수세하였다. 그 후, 끓는 물에서 15~25분간 가열한 뒤 지방층을 제거하고, 흐르는 물에 다시 수세하여, 사골 표면에 존재하는 살점, 불순물을 제거하였다. 그 후, 전처리 된 당나귀 사골 400 g을 물 600 mL과 혼합하고, 오토클레이브를 이용하여 고온고압조건인 121℃, 1.5 kgf/cm²에서 1시간 동안 추출시켜, 젤라틴을 수득하였다.

추출이 완료된 후, 150마이크로미터 필터 장치를 이용하여 이물질이 제거된 젤라틴 용액을 얻었다. 그 후, 150마이크로미터 필터 장치로 걸러진 당나귀 사골은 다시 물 600 mL과 혼합하여 2번 더 추출과정을 반복하여 젤라틴을 추출하였다. 3번의 추출과정을 통해 얻어진 젤라틴 용액은 혼합하여 Brix 3.5~5로 맞춘 뒤, 45℃ 인큐베이터에서 방치하였다.

젤라틴 용액의 온도가 45℃ 되었을 때, 푸드프로 알칼린 프로테아제를 젤라틴 고형분 무게 대비 0.1~0.2%(v/w) 첨가하여 1~2시간 동안 1차 효소분해를 실시하였다. 그 후, 1N-HCl을 첨가하여 pH 4.0~6.0으로 조정한 후 프로테아제 엠을 젤라틴 고형분 무게 대비 0.1~0.2%(w/w) 첨가하여 1시간 30분 동안 2차 효소분해를 실시하였다.

효소분해가 완료된 젤라틴 가수분해물을 85~95℃에서 10~20분간 가열하여 효소를 불활성화한 뒤 저온에서 냉각하였으며, 3 kDa 분자량을 통과시키는 멤브레인 필터를 통과시킴으로써, 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드를 얻었다.

회수된 저분자 펩타이드는 동결건조 후 분말상태로 제조하여 하기 실험에서 사용하였다.

[ 실험예 1: 추출 횟수에 따른 당나귀 사골 젤라틴의 성분 분석]

본 실험에서는 추출 횟수에 따른 당나귀 사골 젤라틴의 수율, 고형분함량, 단백질함량, 콜라겐함량을 분석하였다. 수율, 고형분 함량, 단백질 함량, 콜라겐 함량은 다음과 같은 방법으로 계산 및 측정하였다.

수율(%)은 '동결건조 후 젤라틴 분말의 무게 (g) / 당나귀 사골 무게 (g) × 100'으로 나타내었다. 고형분 함량 (g/100g)은 굴절당도계를 이용하여 나타내었다. 단백질 함량 (mg/g)은 BCA kit를 이용하여 나타내었다.

한편, 콜라겐 함량(mg/100g)은 하기에 기술한 방법으로 측정하였다. 우선, 당나귀 사골 1~6차 추출물을 각각 4g씩 테스트 튜브 (test tube)에 넣고 7N 황산과 반응시켜 105℃에서 16시간 동안 가수분해를 하였다. 그 후 No. 4 필터페이퍼에 여과한 다음 증류수를 첨가하여 최종 부피 500 mL로 희석함으로써 시료 전처리를 완료하였다.

전처리가 완료된 시료 1 mL은 클로라민-T(Chloramine-T)와 혼합하여 암실에서 20분간 반응시켰으며, 반응이 완료된 후 발색시약(17.5 mL perchloric acid 60%, 5 g 4-methylaminobenzaldehyde, 32.5 mL 2-propanal) 0.5 mL을 첨가하여 50℃에서 15분간 추가 반응시켰다.

반응이 완료된 시료는 3분간 냉각하고, 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 558 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 추출물의 콜라겐 함량은 하이드록시프롤린(hydroxyproline)을 표준물질로 하여 단위 'g/100 g'로 나타내었다.

하기 표 1은 상기의 방법으로 측정한, 추출 횟수에 따른 당나귀 사골 젤라틴의 수율, 고형분 함량, 단백질 함량, 콜라겐 함량 결과이다.

추출 횟수에 따른 당나귀 사골 젤라틴의 수율, 고형분 함량, 단백질 함량, 콜라겐 함량

추출횟수	1차	2차	3차	4차	5차	6차	SEM
수율(%)	4.38	4.00	3.01	2.19	1.56	0.80	-
고형분 함량(g/100g)	3.60	4.00	2.60	1.75	1.15	0.60	-
단백질 함량(mg/g)	294.80^a	288.46^a	283.24^a	263.50^b	250.87^b	255.44^b	3.933
콜라겐 함량(mg/100g)	986.34^b	1262.68^a	992.62^b	532.35^c	427.14^d	222.64^e	5.092

추출 수율은 1차 추출에서 가장 높았으나, 재추출되는 횟수에 따라 그 수치가 감소하였다. 고형분 함량은 2차 추출에서 4.0 g/100 g으로 가장 높았으나, 3차 추출 이후 추출 횟수가 증가함에 따라 감소하였다.

추출물의 단백질 함량은 1차에서 294.80 mg/g으로 가장 높았으며, 2차, 3차 추출물과는 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 하지만, 4차 추출부터 추출 횟수에 따라 단백질 함량이 감소하였는데, 1~3차 추출물의 단백질 함량이 4~6차 추출물의 단백질 함량에 비해 유의적으로 높았다 (p<0.05).

콜라겐 함량은 2차 추출물에서 유의적으로 가장 높았으며 (p<0.05), 그 뒤로 1차 추출, 3차 추출에서 콜라겐 함량이 높았다. 1차~3차 추출물의 콜라겐 함량은 1262.68~986.34 mg/100 g 범위를 나타내었으나, 4차 추출물의 콜라겐 함량이 532.35 mg /100 g으로 약 2배가량 감소하기 시작하여 6차 추출에서의 콜라겐 함량은 222.64 mg /100 g으로 현저하게 낮아졌다. 따라서, 고온고압추출법을 이용한 당나귀 사골 젤라틴을 효율적으로 추출하기 위해선 1~3차 추출이 적합한 것으로 나타났다.

[ 실험예 2: 당나귀 사골 젤라틴 가수분해물의 분해도 및 저분자 펩타이드 분말의 수율 측정]

본 실험에서는 당나귀 사골 젤라틴 가수분해물의 분해도 및 저분자 펩타이드 분말의 수율을 측정하였다.

가수분해도(%)는 '10% TCA에 용해될 수 있는 샘플의 단백질 함량 / 샘플 내 존재하는 총 단백질 함량 × 100'으로 측정하였다. 저분자 펩타이드 분말의 수율(%)은 '저분자 펩타이드 분획물의 동결건조 후 무게 (g) / 가수분해 전 젤라틴 분말의 무게 (g) × 100'으로 측정하였다.

하기 표 2는 상기의 방법으로 측정한 당나귀 사골 젤라틴 가수분해물의 분해도 및 저분자 펩타이드 분말의 수율 측정 결과이다.

당나귀 사골 젤라틴 가수분해물의 분해도 및 저분자 펩타이드 분말의 수율 측정 결과

젤라틴 효소분해물 가수분해도(%)	저분자 펩타이드 분말 수율(%)
87.11	20.29

젤라틴 가수분해물의 분해도는 87.11%로 높은 수치를 나타내었다. 이는 단백질분해효소가 효과적으로 당나귀 사골 젤라틴을 가수분해한 것을 의미한다. 저분자 펩타이드 분말의 수율의 경우 20.29%를 나타내었다.

[ 실험예 3: 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 항산화 활성 측정]

본 실험에서는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 항산화 활성을 확인하고자, DPPH, FRAP, ORAC 분석을 실시하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성은 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 분말을 5 mg/mL로 희석하여 분석하였으며, 96 웰 플레이트 (96 well plate)에 시료와 DPPH 용액을 각각 100 μL 씩 넣어 혼합한 뒤, 암소 상온에서 30분간 반응시킨 후, 분광광도계(Spectrophotometer)를 사용하여 517 nm에서 혼합물의 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 트롤록스(Trolox)를 표준물질로 하여 μM Trolox equivalent로 나타내었다.

FRAP 항산화 활성은 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 분말을 5 mg/mL로 희석하여 분석하였으며, FRAP 반응 시약은 300 mM 아세테이트 버퍼(Acetate buffer, pH 3.6), 40 mM HCl에 녹인 10 mM TPTZ(2, 4, 6-tris(2-pyridyl)-s-triazine), 20 mM FeCl₃₂O를 각각 10:1:1의 비율로 섞어 37℃에 방치하여 사용하였다. 그 후, 각각의 시료 25 μL와 FRAP 반응시약 175 μL을 각각 96 웰 플레이트 (96 well plate) 넣고 혼합하여 암실에서 5분간 방치하였다. 그 후, 혼합물의 흡광도는 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 590 nm 흡광도에서 측정하였다. FRAP 항산화 활성은 트롤록스(Trolox)를 표준물질로 하여 μM Trolox equivalent로 나타내었다.

ORAC 항산화 활성은 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 분말을 0.1 mg/mL로 희석하여 분석하였으며, 시료 25 μL와 80 nM 플루오르세인(Fluorescein) 150 μL를 블랙 96 웰 플레이트(Black 96 well plate)에 넣고, 혼합한 뒤 37℃에서 15분간 방치하였다. 그 후, 150 mM AAPH(2, 2′-Azobis(2-Amidinopropane) Dihydrochloride) 25 μL를 넣고, 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 37℃에서 여기 파장(excitation wavelength) 485 nm과 방사 파장(emission wavelength) 520 nm에서 60분 동안 1분 간격으로 측정하였다. ORAC 항산화 활성은 트롤록스(Trolox)를 표준물질로 하여 μM Trolox equivalent로 나타내었다.

하기 표 3은 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 항산화 활성 측정 결과이다.

당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 항산화 활성 측정 결과

항산화 분석 항목
	DPPH	FRAP	ORAC
(μTE/g)	13.09	7.46	212.9

당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 DPPH 라디칼 소거 활성은 13.09 μM TE/g을 나타내었으며, FRAP 항산화 활성은 7.46 μM TE/g을 나타내었다. ORAC 항산화 활성은 212.9 μM TE/g을 나타내었다.

이상의 결과로부터 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드는 모든 항산화 분석에서 그 활성을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다.

[ 실험예 4: 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 엘라스테이스 , 콜라게네이스 저해 활성 측정]

본 실험에서는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 엘라스테이스, 콜라게네이스 저해 활성 분석을 통해, 피부 주름 생성 억제 효과를 확인하고자 하였다.

엘라스테이스 저해 활성은 하기의 방법으로 측정하였다. 우선, 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 분말을 100 mg/mL로 희석한 후, 시료 100 μL를 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) 120 μL, 1.0mM SANA(N-succinyl-(Ala)₃-p-nitroanilide) 20 μL와 혼합하고, 25℃에서 10분간 배양하였다. 그 후, 1 U/mL의 농도인 돼지 췌장으로부터 분리된 엘라스테이스(Porcine pancreas elastase) 20 μL를 넣고, 20분간 반응시킨 후, 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로서 100 μg/mL의 우르솔산(Ursolic acid)을 이용하였다. 엘레스테이스 저해 활성(%)은 '{1-(샘플 O.D.- 블랭크 O.D.)/(대조군 O.D.-블랭크 O.D.)}×100'으로 측정하였다.

하기 표 4는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 엘라스테이스 저해 활성 측정 결과이다.

당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 엘라스테이스, 콜라게네이스 저해 활성 측정 결과

	엘라스테이스 저해 활성(%)
당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 (100mg/mL)	52.37
우르솔산 (100μg/mL)	33.33

한편, 콜라게네이스 저해 활성은 하기의 방법으로 측정하였다. 우선, 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 분말을 1 mg/mL로 희석한 후, 시료 0.1 mL과 0.3 mg/mL 콜라게네이스 발색단(Collagenase Chromophore) 기질 0.25 mL, 0.2 mg/mL 콜라게네이스(Collagenase) 0.15 mL을 혼합하여 20분간 반응하였다. 그 후, 6% 시트릭산(Citric acid) 0.5 mL을 첨가하였으며, 혼합물의 상등액은 분광광도계를 이용하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게네이스 저해 활성은 '{1-(샘플 O.D.-블랭크 O.D.)/(대조군 O.D.-블랭크 O.D.)}×100'으로 측정하였다.

하기 표 5는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 콜라게네이스 저해 활성 측정 결과이다.

당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 콜라게네이스 저해 활성

	콜라게네이스 저해 활성(%)
당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 (1mg/mL)	71.24

이상에서 살펴본 바와 같이, 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드의 엘라스테이스 저해 활성은 33.33%를 나타내었으며, 콜라게네이스 저해 활성은 71.24%를 나타내어, 피부 주름 생성 억제 효과가 확인되었다.

[ 실험예 5: 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한 피부세포 내 독성 실험]

본 실험에서는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한 피부세포 내 세포독성 유무를 확인하고자 하였으며, 다음과 같은 방법으로 분석하였다.

48 웰 플레이트(48 well plate)에 인간 섬유아 세포를 4 x 10⁴ Cells/well 의 농도로 분주한 후, 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 각 well에 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 분말을 희석하여 최종농도 10, 50, 100, 250, 500 μg/mL로 고정한 후, 다시 24시간 배양하였다. 그 후, MTT(Methylthiazol-2, 5 diphenyltetrazolium bromide) 시약을 최종농도 0.5 mg/mL로 하여 첨가한 후, 4시간 동안 배양하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 배지를 제거하고 생성된 포르마잔 크리스탈(Formazan crystals)을 DMSO(dimetyl sulfoxid)에 용출하여 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 첨가에 따른 세포생존률은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 모든 농도의 시료에서 세포생존률이 90%로 나타나 세포독성을 나타내지 않았으며, 대조군과도 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 도 2는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한 피부세포 내 독성 실험 측정 결과이다.

[ 실험예 6: 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한 자외선 조사에 따른 세포 회복률 측정]

본 실험은 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한 자외선(UVB) 조사에 따른 피부세포 내 세포회복률을 분석하고자 하였으며, 다음과 같은 방법으로 분석하였다.

24 웰 플레이트(24 well plate)에 인간 섬유아세포를 2 x 10⁵ Cells/well 의 농도로 분주한 후, 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 100 mJ/cm² UVB 조사를 한 다음, PBS로 세척을 하고, serum free 배지로 교체하였다. 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 분말을 희석하여 최종농도 10, 50, 100, 250, 500 μg/mL 로 각 웰에 고정한 후 다시 24시간 배양하였다. 그 후, MTT(Methylthiazol-2, 5 diphenyltetrazolium bromide) 시약을 최종농도 0.5 mg/mL로 하여 첨가 후 4시간 동안 배양하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 배지를 제거하고, 생성된 포르마잔 크리스탈(Formazan crystals)을 DMSO(dimetyl sulfoxid)에 용출하여 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 첨가에 따른 세포 회복률은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

실험 결과, 도 3에서 보듯이, 인간섬유아세포 내 시료 처리 농도가 증가함에 따라 세포 회복률이 농도 의존적으로 증가함을 나타내었다 (p<0.05). 특히, 처리 농도 100 μg/mL에서, 62.62%의 세포생존율을 나타내어, 자외선(UVB)를 조사한 음성 대조군의 세포생존율 48.01%에 비해 유의적으로 높게 나타났다. 시료 처리 농도 500 μg/mL에서는 76.07%를 나타내어 자외선(UVB)를 조사한 음성대조군에 비해 세포생존율이 약 28% 증가하였다(p<0.05).

이러한 결과는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드가 자외선(UVB)에 대해 세포 회복률을 상승시키는 것을 의미하는 것으로, 자외선에 대한 피부 광노화 억제 효과가 확인된 것이다. 도 3은 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한 자외선 조사에 따른 세포 회복률 측정 결과이다.

[ 실험예 7: 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한 자외선 조사에 따른 피부세포의 형태학적 특성 관찰]

본 실험은 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한 자외선(UVB) 조사에 따른 피부세포의 형태학적 관찰을 진행하고자 하였으며, 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

24 웰 플레이트(24 well plate)에 인간 섬유아세포를 2 x 10⁵ Cells/well 의 농도로 분주한 후, 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 100 mJ/cm² UVB 조사를 한 다음, PBS로 세척을 하고 serum free 배지로 교체하였다. 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드 분말을 희석하여 최종농도 10, 50, 100, 250, 500 mg/mL로 각 웰에 고정한 후, 다시 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 배지를 제거하고 현미경으로 세포 형태를 관찰하였다 (배율 = X100).

관찰 결과, 도 4에서 보듯이 대조군에 비해 자외선을 조사한 음성대조군은 피부 섬유아세포가 사멸하거나 손상되었음을 관찰할 수 있었다. 하지만, 시료를 농도별로 처리한 처리군은 시료 처리 농도에 따라 자외선(UVB)조사에 따른 피부 섬유아세포가 형태학적으로 개선됨을 육안으로 확인할 수 있었다. 이는 시료 처리가 자외선에 대한 피부 광노화 억제에 효과를 보이는 것을 의미한다. 도 4는 당나귀 사골 젤라틴 저분자 펩타이드에 의한 자외선 조사에 따른 피부세포의 형태학적 특성 관찰 결과이다.

Claims

당나귀 사골로부터 젤라틴을 추출하는 단계 (a);
상기 단계 (a)에서 추출한 젤라틴에 단백질분해효소를 첨가하여 가수분해하는 단계 (b);
상기 단계 (b)의 가수분해 후, 3 kDa 이하의 저분자펩타이드 분리하는 단계 (c);를 포함하는 과정으로부터 분리된 저분자펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부주름생성억제용 화장료 조성물.
당나귀 사골로부터 젤라틴을 추출하는 단계 (a);
상기 단계 (a)에서 추출한 젤라틴에 단백질분해효소를 첨가하여 가수분해하는 단계 (b);
상기 단계 (b)의 가수분해 후, 3 kDa 이하의 저분자펩타이드 분리하는 단계 (c);를 포함하는 과정으로부터 분리된 저분자펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부광노화방지용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 단계 (a)는,
동일한 당나귀 사골에 대해 반복해서 수행하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 가수분해는,
서로 다른 종류의 단백질분해효소를 사용하여 복수 회 수행하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 단계 (b)는,
가수분해 후, 단백질분해효소를 불활성화시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 당나귀 사골은,
물에 담궈 놓아 핏물을 제거한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 젤라틴 추출은,
당나귀 사골에 물을 첨가한 후, 100℃ 이상의 온도에서, 1 kgf/cm² 이상의 압력을 가하여 추출하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 단계 (a)에서 추출한 젤라틴은,
단백질분해효소 첨가 전에 농도를 3.5~5.0 brix로 조정하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 3 kDa 이하의 저분자펩타이드는,
가수분해물을 여과막에 통과시킴으로써 분리하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 단백질분해효소는,
푸드프로알칼린프로테아제(FoodPro Alkaline Protease, Dupont genencor) 및 프로테아제엠(Protease M, Amano)의 2종류 효소를 사용하되, 먼저 푸드프로알칼린프로테아제 효소를 처리하고, 그 후, 프로테아제엠 효소를 처리하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제6항에 있어서,
상기 당나귀 사골은,
핏물을 제거한 후, 가열하여 지방을 제거한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.