KR102096444B1 - 미강 단백질을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 미백, 피부 재생 또는 항산화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 미강 추출물에서 유래한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

Description

미강 단백질을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물{A COSMETIC COMPOSITON COMPRISING RICE BRAN PROTEIN}

본 발명은 미강 추출물에서 유래한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부환경과 접촉하여 외부 자극으로부터 신체를 보호하는 가장 기초적인 방어 기관이며, 외적인 아름다움을 표현하는 중요한 기관이다.

사람들의 외부 활동량이 증가함에 따라 태양광선에 장기간 노출되면서 자외선에 의해 피부가 손상된다. 피부가 자외선에 장기간 노출되면 피부노화가 진행되고, 자외선으로부터 피부 내층을 보호하기 위해 생성된 멜라닌 색소로 인해 피부가 검게 변색된다.

따라서 현대사회에서 피부를 관리하는 방법으로 기능성 화장품의 소비가 증가하고 있으며, 백옥같이 하얗고 깨끗하면서 젊고 탄력이 있는 피부를 선호하기 때문에 화장품 산업에서는 미백효과와 노화방지에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다.

화장품의 미백 효과는 사용자의 피부를 희게 하는 것을 말하며, 대부분의 미백 화장품은 멜라닌의 생성을 억제하는 기능을 한다. 멜라닌은 표피 내 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)에 의해 생성되며, 멜라노사이트의 활동성과 분포는 사람의 피부색을 결정한다.

멜라노사이트 내부에 함유되어 있는 타이로시나제(tyrosinase)라는 효소에 의해 아미노산의 일종인 타이로신(tyrocine)이 도파(DOPA, dihydroxy phenylalanine)로 전환되고, 도파퀴논(dopaquinone)과 도파크롬(dopachrome) 등을 거치는 일련의 산화과정을 통해 최종적으로 중합체인 멜라닌이 생성된다. 따라서 대부분 미백 화장품은 멜라닌 생성의 주요 효소인 타이로시나제의 활성을 저해함으로써 멜라닌의 생성을 억제시키는 원리로 미백 효과가 발휘된다.

화장품의 노화방지는 피부노화를 촉진하는 원인들을 차단하거나 제거하는 것이다. 상기 피부노화는 나이가 들면서 자연스럽게 나타나는 현상이 아닌 태양광에 의한 광노화를 의미한다.

상기 광노화는 자외선에 의해 과잉의 활성산소종이 생성되고, 체내의 항산화효소와 비타민 E, C, 글루타티온 및 유비퀴놀 등의 항산화제가 감소되어 산화와 항산화의 불균형으로 인해 야기된다.

광노화가 진행됨에 따라 멜라닌 생성반응이 촉진될 뿐 아니라 지질 과산화, 단백질 산화, 단백질 분해효소의 활성화, 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히알루론산 사슬절단, DNA 산화 등에 의해 생체 구성성분들의 손상을 가져오고 결국에는 피부탄력감소, 주름 및 기미, 주근깨 생성 등의 피부노화가 일어나게 된다.

따라서 타이로시나제의 활성을 저해함과 동시에 항산화 효과를 가지는 화장료 조성물이 피부의 미백 효과를 효과적으로 유도하면서 피부노화를 방지할 수 있다.

종래에 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 식물 추출물 등이 타이로시네이즈 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되었다.

하지만, 상기 성분들은 화장품 제형 중에서 안정성이 미흡하여, 분해되어 착색되거나 이취를 유발할 수 있으며, 생체 내에서 안전성 또는 효능이 불명확하여 그 사용이 제한되고 있다.

화장품 업계는 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 다수의 제품을 개발하고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 점차 증가하고 있다.

한편, 미강(Rice bran)은 쌀의 도정과정에서 발생하는 부산물로서 이에 대한 활용 및 처리방안이 부족한 상황이다. 따라서 미강의 재활용에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

본 발명자들은 미강의 활용 가능성과 활용 방안을 면밀히 검토한 결과, 미강으로부터 추출한 펩타이드의 기능성을 확인하였으며, 이를 천연 기능성 화장품 소재로 활용하고자 하였다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 미강 추출물에서 유래한 펩타이드를 함유하여 기능성뿐만 아니라 생체 안정성이 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 미강(Rice bran) 추출물에서 유래한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드의 크기가 1.4 kDa 이하일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 개수가 13 개 이하일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 미강에 효소를 처리하여 수득될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 효소는 발효 식품에서 분리된 균주에서 수득될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 균주는 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus) 및 아스퍼질러스(Aspergullus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 미백, 피부 재생 또는 항산화용일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물은 천연 원료의 유효성분을 함유하므로 피부 건강에 유익할 뿐만 아니라 피부 미백, 피부 재생 및 항산화 효과가 우수하다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 수득한 펩타이드의 분자량을 측정한 SDS-PAGE 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 미강(Rice bran) 추출물에서 유래한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 “미강(Rice bran)”은 벼에서 왕겨를 뽑고 난 다음 현미를 백미로 도정하는 공정에서 분리된 고운 속겨를 말하며, 탄수화물 34-52%, 단백질 12-16%, 식이섬유 20-25%와 지방 18-22%로 구성되어 영양학적으로 매우 우수한 것으로 알려져 있다.

또한 비타민(A, B₁, B₆, E), 철분 및 미네랄 등 다양한 영양소들이 함유하고 있고 γ오리자놀과 β시토스테롤 등을 포함한다고 알려져 있으며, 생리활성 물질인 페놀 화합물(phenolic compounds), 페룰린산(ferulic acid), 감마 오리자놀(gamma-oryzanol), GABA, 세라마이드(ceramide), 토코트리에놀(tocotrienol), 식물성 스테롤(phytosterols) 등의 천연 항산화 물질이 풍부한 것으로 알려져 있다.

상기 “유효 성분으로 포함하는”은 피부 개선 효과를 구현할 수 있는, 예컨대, 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성, 탄력 개선 또는 피부 미백, 피부 자극 완화, 피부 진정 효과 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.

상기 “추출물”은 용매와 추출 원료를 특정 조건 하에서 접촉시킴으로써 추출 원료에 함유된 유효성분이 전이된 용매를 지칭하는 것으로, 천연물로부터 원료에 함유된 성분을 분리해낸 물질이라면, 추출 방법이나 성분의 종류와 무관하게 모두 포함할 수 있다. 예컨대, 물이나 유기용매를 이용하여 천연물로부터 용매에 용해되는 성분을 추출한 것, 천연물의 특정 성분, 예컨대 오일과 같은 특정 성분만을 추출하여 얻어진 것 등을 모두 포함할 수 있다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 석유에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출될 수 있고, 바람직하게는 에탄올에 의해 추출될 수 있다.

상기 원료에 포함된 유효성분은 용매의 극성에 따라 추출 비율이 상이해질 수 있으며, 상기 에탄올은 천연 원료의 생리 활성 물질 추출에 있어서 선택성이 뛰어나므로 상기 에탄올 추출에 의해 최적의 피부 개선 효과가 구현될 수 있다.

상기 추출물은 추출 원료를 물로 수세한 후 건조 및 분쇄하여, 원료 중량의 8 내지 12 배에 달하는 부피의 용매로 약 1 내지 24 시간 동안 환류 순환 추출, 가압 추출, 초음파 추출 등 통상적인 방법으로 추출 및 여과하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 감압 증류 또는 동결 건조 등과 같은 추가적인 공정에 의해 분말 상태로 수득할 수 있다.

상기 추출물은 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추출물은 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물을 포함할 수 있다.

상기 “펩타이드”는 2개 이상의 아미노산이 α-카르복시기와 α-아미노기로 사슬모양 또는 고리모양으로 결합하여 형성된 화합물이다. 상기 펩타이드는 아미노산의 결합수에 따라서 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드 혹은 올리고펩타이드나 폴리펩타이드로 분류된다. 상기 올리고펩타이드(결합 아미노산수 2~10개)나 폴리펩타이드(10~50개인 아미노산)의 수는 반드시 결정되어 있지는 않다.

상기 펩타이드의 크기는 1.4 kDa 이하일 수 있고, 상기 펩타이드의 아미노산 개수가 13개 이하일 수 있다.

상기 펩타이드의 크기가 1.4 kDa 이하거나, 아미노산의 개수가 13개 이하인 경우, 분자의 크기가 작기 때문에 피부 흡수율이 증대될 수 있으며 화장품 제품으로 적용하였을 때 기능성이 개선될 수 있다.

상기 미강 추출물에서 유래한 펩타이드는 미강을 분쇄하고, 동결건조하는 전처리 단계; 분말화된 미강과 단백질 분해효소를 포함하는 효소액을 혼합하는 펩타이드화 단계; 및 혼합물을 여과하고 원심분리로 펩타이드를 수득하는 펩타이드 분리 단계;로 구성된 펩타이드 제조 방법으로 수득할 수 있다.

상기 제조 방법의 전처리 단계에서 미강을 분쇄하고, 용매(산/염기/유기용매)에 침전하여 단백질을 선택적으로 추출하는 단백질 고함량화 단계가 더 추가될 수 있다. 상기 단백질 고함량화 단계로 인해 미강에서 단백질만 선택적으로 효소 분해할 수 있기 때문에, 펩타이드 제조 효율이 향상될 수 있다.

상기 제조 방법의 전처리 단계에서 동결건조는 water wapor의 부분압을 낮춤으로써, 얼음을 직접 증기로 만드는 승화에 의해 실시된다. 상기 동결건조를 통해 잔여 수분이 2% w/w 이하로 유지되면, 유용물질의 손실 없이 안정적으로 분쇄물을 저장 및 수송할 수 있다.

상기 제조 방법의 펩타이드화 단계에서 상기 단백질 분해효소는 단백질을 가수분해하는 효소이고, 파쇄된 미강 분쇄물과 일정시간 혼합하여 효소분해를 진행한다.

상기 분해효소는 상업적으로 이용되는 알카레이즈(Alcalase), 프로타멕스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 플라보르자임(Flavourzyme), 펩신(Pepsin) 및 트립신(Trypsin)와 같은 효소를 사용할 수 있다. 상기 펩신(Pepsin) 및 트립신(Trypsin)은 동물에서 유래한 것을 사용할 수 있다.

또한, 상기 분해효소는 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 페니실리움(Penicillium), 프사리움(Fusarium), 피키아(Pichia), 캔디다(Candida), 싸가로마이세스(Saccharomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 씨테로마세스(Citeromyces), 및 아스퍼질러스(Aspergullus)와 같은 미생물에서 유래한 효소를 사용할 수 있으며, 그 외에 Fusarium illudens, F. lateritium, F. solani, Paecilomyces sp., Penicillium aurantiogriseum Dierckx, P. brevicompactum, P. citrinum, P. chrysogenum, P. corylophilum, P. crustosum, P. expansum, P. fellutanum, P. implicatum, P. roqueforti, P. solitum 및 P. Waksman에서 유래할 수도 있다.

상기 미생물은 청국장, 된장, 나또, 간장, 김치 등에서 분리된 식품유래 식품 안전균으로, 상업적으로 사용되는 발효균주일 수 있으며, 펩타이드를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

상기 균주에서 단백질 분해효소를 생산하기 위해, 액상 또는 고상의 효소 생산용 배지를 사용한다. 상기 효소생산용 배지에, 상기 균주를 10 % v/v로 접종하고, 25 내지 30 ℃에서 24시간 배양한 다음, 20 분간 1,300 x g 속도로 원심분리한 후 상등액을 회수하여 효소액으로 사용할 수 있다.

상기 제조 방법의 펩타이드화 단계에서 미강 분쇄물과 효소액은 1:30 비율로 혼합하고, 온도 조건은 20 내지 60 ℃이며, 반응시간은 2 내지 24 시간이다. 분쇄물과 효소액을 혼합하고, 진탕배양기에서 효소분해 반응이 실시될 수 있으며, 반응이 끝나면, 95 ℃ 물에 10 분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후, 20 분간 3,000 x g 속도로 원심분리하여 펩타이드 상등액을 수득할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 피부 미백, 피부 재생 또는 항산화용일 수 있다.

상기 “미백”은 피부색에 영향을 미치는 멜라닌, 산화-환원 헤모글로빈, 카로틴, 멜라노이드 등 다양한 생체 분자의 생성을 억제함으로써 잡티, 주근깨, 기미 등의 피부 색소 침착 현상을 완화시키고, 피부 누런기, 붉은기를 완화시켜 피부 밝기 및 균일도를 향상시키는 효과를 의미한다. 특히, 멜라닌 색소 생성 효소인 타이로시네이즈의 활성을 억제함으로써 피부 톤을 개선할 수 있다.

상기 “피부 재생”은 피부 노화를 방지하는 것으로, 피부 주름 방지 및 개선과 같은 효과를 의미한다. 피부 주름은 콜라겐의 분해에 의해 발생되며, 콜라겐 분해효소인 콜라게네이즈를 억제함으로써 피부 주름을 개선할 수 있다.

상기 “화장료 조성물”은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션으로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 : 미강 단백질 추출

시중에서 유통되는 미강(Rice bran)을 5 ℃에서 냉장보관하고 60 ℃에서 12 시간 건조시킨 후 분쇄기로 파쇄하여 30 내지 70 ℃의 저온에서 단백질을 추출하였다. 상기 단백질을 동결건조하여 수용성 다공성 고형물을 수득하였다.

실시예

제조예에서 수득한 고형물을 분해하여 펩타이드를 제조하였다.

고형물 1g과 분해효소인 청국장균 유래 효소 바실러스 테퀼렌시스(Bacillus tequilensis) SM-16을 1 : 30(w/v) 비율로 혼합하고, 진탕배양기(SIB-05RH, Jeongbio, Korea)에 200 rpm 조건으로 8시간 동안 반응하였다.

반응이 끝나면, 95 ℃ 물에 10 분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후, 20 분간 3,000 x g속도로 원심분리하여 상등액을 수득하였다.

수득한 상등액은 여과하여 불순물을 제거하고, 동결건조하여 고상의 시료를 수득하였다.

비교예 1

제조예에서 수득한 고형물을 분해하여 펩타이드를 제조하였다.

고형물 1 g과 6 mol HCL을 1 : 30(w/v) 비율로 혼합하고, 진탕배양기(SIB-05RH, Jeongbio, Korea)에 50 ℃ 200 rpm 조건으로 8시간 동안 반응하였다.

반응이 끝나면, 95℃ 물에 10분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후, 20 분간 3,000 x g속도로 원심분리하여 상등액을 수득하였다.

수득한 상등액은 여과하여 불순물을 제거하고, 동결건조하여 고상의 시료를 수득하였다.

비교예 2

본 발명의 비교예 2에서는 산분해 대신 1mol NaOH로 염기분해 하는 것을 제외하고는 비교예 1과 동일하게 실시하였다.

비교예 3

본 발명의 비교예 3에서는 6 mol HCL 대신 1 mol H₂SO₄로 110 ℃ 24시간 산분해 하는 것을 제외하고는 비교예 1과 동일하게 실시하였다.

비교예 4

본 발명의 비교예 4에서는 분해효소로 프로타멕스(Protamex)를 사용하는 것을 제외하고는 실시예와 동일하게 실시하였다.

비교예 5

본 발명의 비교예 5에서는 분해효소로 뉴트라제(Neutrase)를 사용하는 것을 제외하고는 실시예와 동일하게 실시하였다.

비교예 6

본 발명의 비교예 6에서는 분해효소로 플라보르자임(Flavourzyme)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예와 동일하게 실시하였다.

실험예 1 : 피부 안전성 시험

실시예 및 비교예의 시료에 대한 피부 안전성을 검증하기 위해, 섬유아세포(HDF), 멜라닌형성세포(B16F10), 각질세포(HaCaT)에 대한 MTT assay 실험을 수행하였다.

실시예 및 비교예의 시료를 정제수에 농도별(50 mg/L)로 각각 현탁한 후, 세포 생존율을 측정하였다.

세포 독성은 MTT{3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide} 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 모스만(Mosmann)의 방법을 변형하여 수행하였다.

섬유아세포(HDF), 멜라닌형성세포(B16F10), 및 각질세포(HaCaT)를 각각 96-웰 플레이트에 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 37 ℃, 5 % CO₂ 에서 48 시간 동안 배양하였다.

배양 배지를 제거하고 시료를 농도별로 처리한 배지에 48 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS(Phosphate buffered saline)로 반복 세척하였다.

MTT를 5 mg/mL 로 PBS에 녹여 50 L 첨가하고 37 ℃, 5 %의 CO₂ 에서 24 시간 동안 배양하였다. DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 한 웰(well) 당 100L 넣고, 10 분 동안 교반한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

표 1을 참조하면, 각 실시예 시료의 모든 농도에서 세포 독성은 확인되지 않았다. 비교예 1 내지 3의 시료는 염기분해 또는 산분해로 수득되었기 때문에 세포 독성이 높았다.

상기 결과는 상기 실시예의 시료가 인체에 무해할 뿐만 아니라 인체 안전성이 우수함을 시사한다.

구분	세포활성(%)
대조군	98.3%
산분해(HCl)	68.4%
염기분해(NaOH)	47.2%
효소분해(Protamex)	96.7%
청국장균 유래 효소	97.8%

실험예 2 : 펩타이드 분자량 측정

실시예 및 비교예의 시료에 함유된 펩타이드 분자량을 측정하기 위해, SDS-PAGE를 사용하였다.

SDS-PAGE는 12 내지 16.5 % separating gel과 5 % stacking gel로 구성된 겔을 사용하였다.

staining buffer는 0.1 % Coomassie brilliant blue R-250, 45 % methanol and 10 % acetic acid을 혼합하여 사용하고, de-staining buffer는 10 % acetic acid and 45 % methanol를 혼합하여 사용하였다.

대조군은 미강 분쇄물을 5× SDS-sample buffer(0.25 mol Tris-HCl buffer, pH 6.8, containing 10% SDS, 4% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.05% bromo-phenol blue and 10 mM EDTA)와 혼합하여 100℃에서 5분간 열수추출한 것이다.

표준 분자량 marker는 SDS-PAGE molecular weight standards(Biorad, USA), polypeptide SDS-PAGE molecular weight standards을 사용하였다.

전기영동장치를 이용하여 전기영동 후 겔은 staining buffer를 이용하여 2시간 이상 염색된 후, destaining buffer로 탈색하여 펩타이드 분자량을 측정하였다(도 1).

도 1을 참조하면, 대조군 및 비교예 2 내지 6은 10 내지 170 kDa 부근에서 밴드를 확인할 수 있었으나, 비교예 1에서는 단백질 밴드를 확인할 수 없었다.

이는 비교예 1에서 단백질이 단일 아미노산 수준으로 분해되어 그 분자량이 10 kDa 이하의 크기로 존재하므로 SDS-PAGE 상에서 밴드가 나타나지 않았음을 시사한다.

한편 실시예는 30 kDa 부근에서 밴드가 확인되었으나, 이는 바실러스 테퀼렌시스 SM-16의 분해활성을 증가시키기 위해 첨가한 25 내지 30 kDa의 분자량을 가진 카제인(casein)으로 판단되며, 15 kDa 부근에서 밴드가 확인되었다.

실험예 3 : 타이로시네이즈 저해 활성 시험

실시예 및 비교예의 추출물의 타이로시나제 억제 활성(tyrosinase inhibition activity)을 평가하였다.

타이로시나제는 타이로신과 반응하여 멜라닌을 형성하는 효소로, 타이로시나제가 억제되면 멜라닌의 생성이 저해되기 때문에 미백 효과가 나타난다.

실시예 및 비교예의 타이로시네이즈 저해 효과를 측정하고자 도파산화효소(DOPA Oxidase) 방법을 변형하여 사용하였다.

Buffer는 67 mmol sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.4 mL와 기질액 10 mmol 3,4-dihydroxy phenylanin(L-dopa)용액 0.2 mL의 혼합액에 125 unit/mL mushroom tyrosinase(Sigma-Aldrich Co, Louis, MO, USA) 0.1 mL와 시료 0.2 mL를 첨가하였다.

37℃ 에서 20분간 반응시키고 475 nm 파장에서 반응액 중 생성된 도파크롬(DOPAchrome)의 양을 측정하였다.

시료 미첨가군은 시료 대신 증류수를 0.2 mL 첨가하고 37℃에서 20 분간 반응시켜 분광광도계(UV-1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 475 nm에서 측정하였다.

타이로시네이즈 저해활성은 하기 수학식에 따라 시료 미첨가군과의 비율로 산출하였다(표 2).

[수학식]

타이로시네이즈 저해 활성(%) = 100 x (1 - (각 시료 첨가군의 흡광도 / 시료 미첨가군의 흡광도))

구분	타이로시네이즈 저해 활성(%)
실시예	40.8
비교예 1	33.8
비교예 2	16.4
비교예 3	29.6
비교예 4	30.5
비교예 5	25.2
비교예 6	27.0
대조군	0
아스코르빈산(ascorbic acid)	34.9

표 2를 참조하면, 실시예는 강산 또는 강염기로 분해된 비교예 1 내지 3 대비 타이로시네이즈 저해활성이 높았으며, 산업 분해효소를 사용한 비교예 4 내지 6과 비교하더라도 우수한 타이로시네이즈 저해 활성을 보였다.상기 결과는 미강 추출물에서 청국장 균주 효소액을 이용해 수득된 펩타이드의 미백 효과가 우수함을 시사한다.

실험예 4 : 콜라게네이즈 저해 활성 시험

실시예 및 비교예의 추출물의 콜라게네이즈 저해 활성(collagenase inhibition activity)을 평가하였다. 콜라게네이즈 저해 활성이 높을수록 피부 재생 효과가 우수하다.

0.1 M tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하여, 0.3 mg/mL의 4-phenylazobenzyl oxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(sigma, U.S.A)를 녹인 기질액 125 μL에 시료 50 μL를 혼합하였다.

혼합액에 1 mg/mL collagenase from Clostridium histolyticum(Sigma-Aldrich Co, Louis, MO, USA) 0.075 mL를 첨가하였다.

시료 미첨가군은 시료 대신 증류수를 50 μL 첨가하고 실온에서 20 분간 방치한 후, 6 % citric acid 0.5 mL를 넣어 반응을 정지시키고, ethyl acetate 2 mL을 첨가하여 분광광도계(UV-1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 320 nm에서 흡광도를 측정하였다.

콜라게네이즈 저해활성은 하기 수학식에 따라 시료 미첨가군과의 비율로 산출하였다(표 3).

[수학식]

콜라게네이즈 저해 활성(%) = 100 x (1 - (각 시료 첨가군의 흡광도 / 시료 미첨가군의 흡광도))

구분	콜라게네이즈 저해 활성(%)
실시예	60.2
비교예 1	34.0
비교예 2	16.5
비교예 3	18.8
비교예 4	41.9
비교예 5	31.8
비교예 6	21.6
대조군	11.2

표 3을 참조하면, 산 분해물인 비교예 1에서 콜라게네이즈 저해 활성이 우수하였으나, 염산은 화장품 원료로서 적합하지 않은 문제점이 있다.산업 분해효소를 사용한 비교예 4 내지 6은 콜라게네이즈 활성 저해율이 21.6 내지 41.9 %로 모두 우수하였으나, 실시예의 경우, 60.2 %의 콜라게네이즈 활성 저해율을 보여 콜라게네이즈 저해 활성이 가장 우수하였다.

상기 결과는 미강 추출물에서 청국장 균주 효소액을 이용해 수득된 펩타이드는 산/염기를 이용해 수득된 펩타이드보다 생체 안전성이 우수하며, 상업용 효소를 이용해 수득된 펩타이드보다 피부 재생 효과가 현저하게 우수함을 시사한다.

실험예 5 : 항산화 활성 시험

실시예 및 비교예의 발효 추출물이 함유하는 폴리페놀의 함량을 측정하였다. 폴리페놀은 체내 라디칼의 제거 활성 및 항산화 활성이 우수하고, 타이로시나제 및 멜라닌 생성과 활성을 효과적으로 억제하므로 피부 미백 효과가 우수하다.

폴리페놀의 정량은 AOAC에 준하여 수행하였다. 실시예 및 비교예의 시료를 100배 희석한 시료용액 3 mL에 1NFolin-Ciocalteu phenol reagent 시약 1 mL를 첨가하였다.

1 N HCl 0.2 mL을 투입하고 포화 Na₂CO₃ 용액 1 mL를 첨가하여 혼합한 후 1 시간 실온에서 방치하였다. 640 nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 타닌산(tannic acid)으로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다(표 4).

구분	폴리페놀 함량(mg GAE/g DW)
실시예	14.51
비교예 1	8.20
비교예 2	9.99
비교예 3	7.56

표 4를 참조하면, 실시예 시료의 폴리페놀 함량은 비교예 1 내지 3과 비교하여 현저하게 높은 수준으로 평가되었다.상기 결과는 미강 추출물을 청국장 균주 효소액으로 발효하는 과정에서 다량의 폴리페놀을 생성되며, 이로 인해 미강 추출물에서 청국장 균주 효소액을 이용해 수득된 펩타이드의 항산화 활성 및 미백 활성을 현저히 증대시킬 수 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

1. 바실러스 테퀼렌시스(Bacillus tequilensis)를 25~30℃에서 배양 후 원심분리하여 수득한 상등액을 효소액으로 하여,
   상기 효소액을 미강 추출물에 혼합 처리하여 수득한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드의 크기가 1.4 kDa 이하인 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드의 아미노산 개수가 13 개 이하인 화장료 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   피부 미백, 피부 재생 또는 항산화용인 화장료 조성물.

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